CN112961799B - 一株梭菌及利用其制备生物丁醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物能源生产技术领域，公开了一株梭菌及利用其制备生物丁醇的方法。该梭菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No:61493。该制备生物丁醇的方法是采用丁酸水解海藻，结合本发明提供的梭菌进行发酵，其中该梭菌能够耐受高浓度丁酸，并将丁酸和糖类转化为丁醇，底物转化率高，丁醇产率高，产生的副产物量少，利用丁醇的纯化；本发明提供的方法能够避免强酸的使用，水解条件温和，无需特殊的耐酸容器，生产成本低；且该方法操作简单，危险性低，可持续性强。

Description

一株梭菌及利用其制备生物丁醇的方法

技术领域

本发明属于生物能源生产技术领域，具体涉及一株梭菌及利用其制备生物丁醇的方法。

背景技术

现阶段，由于化石资源的日益枯竭及其燃料造成的温室气体排放的问题，全世界正极力寻找并建立可以帮助减少碳排放的可再生和可持续能源体系，并以此来平衡环境和经济之间的矛盾。不同于风力、太阳等其他新资源，生物质能是唯一可用于转化固体，液体和气体等不同类型生物燃料的可再生资源，其主要能够通过光合作用将太阳能转变为化学能的形式进行存储，因此具有许多环境优势如丰富的碳储量和可再生性。而在众多可转化的生物燃料中，生物丁醇因其燃烧值高、腐蚀性小、不易吸水、挥发性低且便于管道运输等优点，成为了未来理想的生物燃料燃油替代品。

目前，生产正丁醇最常用的方法是基于石油来源进行羰基化学合成法，但是石油原料的缺点限制了丁醇的可持续性能力，因此许多研究开始关注利用微生物转化合成生物丁醇的方法。依据所涉及的生物质类型不同，生物质能的发展已经历经三代，分别包括以粮食作物为主（小麦和玉米等）的第一代生物质能，以木质纤维素为主（木材和农业废料等）的第二代生物质能和以海洋藻类（大型藻类等）为主的第三代生物质能。与前两代生物质相比，海藻生物质一方面不作为人类的主要粮食资源，不会出现“与粮竞争”的问题，另外海洋占据地球表面的七成以上的面积，这使得可持续收获大量藻类作为能源转化材料成为可能。此外，大多数藻类生物质中都几乎没有木质素，相比木质纤维素类生物质可进一步降低了预处理成本，而且藻细胞中富含以琼脂，卡拉胶、木聚糖、水溶性硫酸化半乳聚糖等组成的多糖类碳水化合物，可以通过合适的处理手段即可释放大量可供微生物利用的寡糖甚至是单糖物质。

在众多生物质前处理方法中，酸水解是生物质水解研究中使用最广泛的方法之一，与其他水解方法相比，该方法成本效益较高，消耗的能量相对较低，且反应时间短，糖产量高。而在酸水解法中，虽然利用硫酸、盐酸等稀强酸水解的方法相对高效，但却有以下几方面缺陷：（1）强酸水解条件的不断变化不仅会影响还原糖的产量，还会产生对微生物有毒害作用的副产物，如5-羟甲基糠醛、糠醛、乙酰丙酸和甲酸，而且水解过程中产生的酸根离子无法被利用，也可能影响后续发酵过程。（2）强酸本身具有一定的毒性，腐蚀性以及操作方面的危险性，对反应器建造需求高，必须使用耐酸材料，这也进一步增加了生产成本，而且后续排放问题也容易对环境产生了负面影响。

因此，亟需提供一种不采用强酸水解，水解条件温和的制备生物丁醇的方法。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一株梭菌，利用其制备生物丁醇，能够不使用强酸，水解条件温和，生产成本低。

为了实现上述的目的，采用如下的技术方案：

本发明构思：本发明采用丁酸水解海藻，水解过程中由丁酸提供的氢离子，结合高温高压的作用有效地破坏海藻的细胞壁，释放出可供本发明提供的梭菌利用的糖类；且所述梭菌能够耐受高浓度丁酸，并将丁酸和糖类转化为丁醇。本发明提供的梭菌，以及制备生物丁醇的方法能够避免强酸的使用，水解条件温和，生产成本低，丁醇产率高。

一株梭菌，其命名为Clostridium sp.WK，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61493，保藏时间为2021年2月1日，保藏单位地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

利用微生物转化合成生物丁醇的过程中，其发酵过程分为产酸（0-48小时）和产醇（>48小时）两个阶段。在产醇阶段中，一般的产醇梭菌（例如拜氏梭菌或者丙酮丁醇梭菌）无法完全重吸收自身所产生的丁酸、丁酸盐，也无法耐受高浓度丁酸或丁酸盐。而本发明提供的梭菌不仅可以耐受高浓度丁酸或丁酸盐（30 g/L），还可以重吸收自身产生的甚至是培养基中额外添加的丁酸或丁酸盐，并转化为丁醇。

一种制备生物丁醇的方法，采用所述梭菌进行发酵。

具体的，所述制备生物丁醇的方法，包括以下步骤：

（1）制备海藻水解液：将海藻粉碎，加入丁酸，水解，离心，得上清液即为所述海藻水解液；

（2）制备发酵液：向步骤（1）制得的所述海藻水解液中，加入培养液，灭菌，制得所述发酵液；

（3）梭菌发酵：向步骤（2）制得的所述发酵液中加入所述梭菌，发酵，纯化，得到所述生物丁醇。

优选的，在步骤（1）中，所述海藻为红藻、褐藻或绿藻中的至少一种；进一步优选的，所述海藻为红藻；更优选的，所述海藻为石花菜（Gelidium amansii）。

优选的，在步骤（1）中，所述水解的温度为80-150 ℃；所述水解的压力为0.10-0.50 atm；所述水解的时间为10-60 min；进一步优选的，在步骤（1）中，所述水解的温度为100-130 ℃；所述水解的压力为0.10-0.30 atm；所述水解的时间为20-30 min。

优选的，在步骤（1）中，所述丁酸的浓度为15-200 g/L；进一步优选的，所述丁酸的浓度为19.2-192 g/L。

优选的，在步骤（2）中，所述培养液中包含酵母提取物、氨基酸、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐和微量元素盐。

优选的，所述微量元素盐选自铁盐、钴盐、锰盐、锌盐、铜盐、硼盐或镍盐中的至少三种。

优选的，在步骤（3）中，所述发酵液中所述丁酸的起始浓度为1-20 g/L；进一步优选的，所述发酵液中所述丁酸的起始浓度为1-16 g/L。发酵时，丁酸或丁酸盐的起始浓度应控制在20g/L以内，同时若丁酸盐浓度高于20 g/L会对梭菌Clostridium sp.WK有明显的抑制作用。

优选的，在步骤（3）中，所述梭菌在发酵前先进行活化，所述活化过程为将所述梭菌接种到培养液中，于35-40 ℃、100-200 rpm的转速下培养，至菌液OD600nm达到1.8-2.0，得到活化菌液。

进一步优选的，在步骤（3）中，加入所述梭菌的过程为：加入所述发酵液的体积的0.5-5%的所述活化菌液；更优选的，在步骤（3）中，加入所述梭菌的过程为：加入所述发酵液的体积的1-3%的所述活化菌液。

优选的，在步骤（3）中，所述发酵的温度为20-35 ℃，所述发酵时间为48-240 h；进一步优选的，所述发酵的温度为25-33 ℃，所述发酵时间为72-240 h；更优选的，所述发酵的温度为28-32 ℃，所述发酵时间为96-168 h。

更具体的，所述制备生物丁醇的方法，包括以下步骤：

（1）制备海藻水解液

将海藻样品清洗去除海盐和杂质，烘干至恒重，冷却后研磨成粉，过120目筛，得海藻粉，备用；向所述海藻粉中加入纯水和丁酸（浓度为15-200 g/L），密封；于高压灭菌锅内，80-150℃运行10-60 min，运行结束后将水解体系取出自然降至室温，得水解液。采用DNS法（NY/T2742-2015）测定其还原糖浓度，评估水解效率。

海藻水解率（%）=（水解液中还原糖浓度（g/L）/水解前海藻底物浓度（g/L））×100%

（2）制备发酵液

将上述步骤所得水解液放入离心机，离心，将离心上清液与纯水混合，得混合液，备用；

在所述混合液中，按比例和顺序分别加入酵母提取物、氨基酸、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐和微量元素盐，待完全溶解后定容，在此过程中保持N₂的持续通入，最后依次加入除氧剂；L-半胱氨酸，DL-二硫苏糖醇，并用调节pH值至弱酸性，封装，灭菌，得发酵液，备用。

（3）梭菌发酵

取出保藏的梭菌菌株Clostridium sp.WK（菌株保藏编号：GDMCC No:61493），置于85 ℃水浴热激，在厌氧工作台中准确吸取培养基体积的1-5%种子量，接种至含30 g/L葡萄糖的50 mL活化培养基中，将所述梭菌按1-3%的接种量接种到活化培养基中，于35-40 ℃、100-200 rpm的转速下培养，至菌液OD₆₀₀ nm达到1.8-2.0，得活化菌液，可以进行接种发酵或传代培养；

在厌氧工作台中准确吸取所述发酵液0.5-5%体积的所述活化菌液接种到所述发酵液中，于20-35 ℃、100-300 rpm恒温发酵48-240 h，期间进行取样，测定还原糖及生物溶剂产量，记录整个发酵过程。

所述梭菌在制备生物醇中的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明采用丁酸水解海藻，结合本发明提供的梭菌进行发酵，其中所述梭菌能够耐受高浓度丁酸，并将丁酸和糖类转化为丁醇，底物转化率高，丁醇产率高，产生的副产物量少，利用丁醇的纯化；本发明提供的方法能够避免强酸的使用，水解条件温和，无需特殊的耐酸容器，生产成本低；且该方法操作简单，危险性低，可持续性强。

附图说明

图1为本发明实施例提供的制备生物丁醇的流程图；

图2为实施例中石花菜的水解率对比图；

图3为实施例中方案1制得的水解液的发酵情况图；

图4为实施例中方案2制得的水解液的发酵情况图；

图5为实施例中方案9制得的水解液的发酵情况图。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

实施例

藻类细胞壁富含多种多糖物质，可以水解成可发酵的寡糖或单糖物质，本发明主要以红藻石花菜为例，其细胞壁主要由琼脂、卡拉胶、木聚糖和水溶性硫酸化半乳聚糖等组成，主要的储存多糖是支链淀粉样葡聚糖。在本发明中，采用丁酸进行水解，在水解过程中由丁酸提供的氢离子，结合高温高压的作用可以更有效地破坏细胞壁的链内和链间氢键网络，随机释放出可供微生物利用的寡糖。在利用本发明提供的梭菌进行发酵，该梭菌能够耐受高浓度丁酸，并将糖类和丁酸转化为丁醇。

一种制备生物丁醇的方法，其流程图见图1，包括以下步骤：

（1）制备石花菜水解液：

将石花菜样品（购自江苏省连云港市）进行泡发，用纯净水清洗去除海盐及附着的杂质，随后送入鼓风干燥箱内，于60 ℃恒温烘干至恒重，冷却后使用研磨机将其打磨成粉，并过120目筛，得石花菜粉；向血清瓶中加入纯水、丁酸和石花菜粉，用量比见表1，用丁基胶塞和铝盖封口；将上述血清瓶放入全自动高压灭菌锅内，130 ℃运行30 min，取出自然降至室温，得石花菜水解液。

表1石花菜丁酸水解方案

方案编号	石花菜粉（g）	丁酸（mL）	纯水（mL）	丁酸终浓度（g/L）
					对照1	5.0	0	50.0	0
1	5.0	1.0	49.0	19.2
					2	5.0	1.5	48.5	28.8
3	5.0	2.5	48.0	48.0
					4	5.0	5.0	45.0	96.0
5	5.0	10.0	40.0	192.0
					对照2	10.0	0	50.0	0
6	5.0	1.0	49.0	19.2
					7	5.0	1.5	48.5	28.8
8	10.0	2.5	47.5	48.0
					9	10.0	5.0	48.5	96.0
10	10.0	10.0	40.0	192.0

（2）制备发酵液

将上述步骤所得石花菜水解液放入离心机，11000 rpm离心10 min，将离心上清液与纯水混合（其中方案1、方案2中石花菜水解液与纯水按体积比1:1混合；方案9中石花菜水解液与纯水按体积比1:4混合），得混合液；向混合液中，按比例和顺序分别加入以下组分：NaHCO₃，2.52 g/L；酵母提取物，10g/L；盐溶液母液(含NaCl，1.0 g/L；MgCl₂·6H₂O，0.5 g/L；KH₂PO₄，0.2 g/L；NH₄Cl，0.3 g/L；KCl，0.3 g/L；CaCl₂·2H₂O，0.015 g/L)，10 mL/L；微量元素母液(含FeCl₂·4H₂O，1.5 g/L；CoCl₂·6H₂O，0.19 g/L；MnCl₂·4H₂O，0.1 g/L；ZnCl₂，0.07 g/L；H₃BO₃，0.006 g/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.036 g/L；NiCl₂·6H₂O，0.024 g/L；CuCl₂·2H₂O，0.002 g/L) 1 mL/L；2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)，1.952 g/L；待物料完全溶解后定容至1000 mL，在此过程中保持N₂的持续通入，最后依次加入除氧剂Na₂S·9H₂O，0.048 g/L；L-半胱氨酸，0.0242 g/L和DL-二硫苏糖醇，0.077 g/L，并用HCl调节pH值至6.0，分别封装到厌氧培养用的血清瓶中，于115℃灭菌15 min后冷却，得发酵液，备用。

（3）梭菌发酵

取出保存于-80℃条件下的梭菌菌株Clostridium sp.WK（菌株保藏编号：GDMCCNo:61493），置于85℃水浴热激10 min，在厌氧工作台中准确吸取发酵液体积的2%体积的活化种子量，接种至含30g/L葡萄糖的50 mL活化培养基中，并置于37℃、150 rpm培养条件下活化培养12-24 h，待菌液OD600nm达到1.8-2.0后（总产气量为100-200 mL之间），得活化菌液，可以进行接种发酵或传代培养；

在厌氧工作台中准确吸取发酵液2%体积的活化菌液接种到含石花菜水解液的发酵液中，于30 ℃、150 rpm恒温发酵168 h。

产品效果测试

（1）测定石花菜水解率

取方案1-10以及对照1-2的石花菜水解液各5 mL，用NaOH调节至pH为6.0后，采用DNS法（NY/T2742-2015）测定其还原糖浓度，评估水解效率。

其中，石花菜水解率（%）=（水解液中还原糖浓度（g/L）/水解前石花菜底物浓度（g/L））×100%。

方案1-10以及对照1-2的水解率见图2，由图2可知，使用方案2水解率达到25.11%；使用方案9可以使水解率达到27.43%。

（2）测定生物丁醇产率

在发酵期间分别于0、12、24、48、72、96、120及168 h进行取样，测定还原糖、生物丁醇以及副产物的变化情况，记录整个发酵过程。

由于丁酸在此过程中为被消耗的底物，因此生物丁醇的产率按以下公式计算：

生物丁醇产率（g/g）=（生物丁醇总产量（g）/（消耗还原糖总量（g）+消耗丁酸盐总量（g））。

图3-5中，横坐标为发酵时间，左边纵坐标为底物浓度（还原糖、丁酸），右边纵坐标为生物溶剂（丁醇、丙酮和乙醇）浓度。从图3、图4可得，菌株可以利用培养基中的还原糖和丁酸盐，并产生生物丁醇。其中，方案1制作的石花菜水解液可以通过发酵产生4.45 g/L的生物丁醇，丁醇产率可以达到0.27 g/g；而方案2制作的石花菜水解液则可以产生4.12 g/L的生物丁醇，丁醇产率也达到了0.27 g/g。

而由图5可得，虽然菌株能够利用方案9制作的石花菜水解液培养基中的还原糖和丁酸盐，并产生2.18 g/L的生物丁醇，产率可以达到0.18 g/g。但是由于丁酸盐浓度过高，在一定程度上也对梭菌Clostridium sp.WK产生一定的抑制作用。

Claims (3)

1.一种梭菌，其特征在于，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCCNo:61493。

2.一种制备生物丁醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备石花菜水解液：

将石花菜样品进行泡发，用纯净水清洗去除海盐及附着的杂质，随后送入鼓风干燥箱内，于60 ℃恒温烘干至恒重，冷却后使用研磨机将其打磨成粉，并过120目筛，得石花菜粉；向血清瓶中加入纯水、丁酸和石花菜粉，用丁基胶塞和铝盖封口；将上述血清瓶放入全自动高压灭菌锅内，130 ℃运行30 min，取出自然降至室温，得石花菜水解液；

（2）制备发酵液：向步骤（1）制得的所述石花菜水解液中，加入培养液，灭菌，制得所述发酵液；

（3）梭菌发酵：向步骤（2）制得的所述发酵液中加入权利要求1所述的梭菌，发酵，纯化，得到所述生物丁醇；

在步骤（1）中，所述丁酸的浓度为19.2-192.0g/L；

在步骤（2）中，所述培养液中包含酵母提取物、氨基酸、钠盐、钾盐、镁盐、钙盐和微量元素；

在步骤（3）中，所述发酵液中所述丁酸的起始浓度为1-20g/L；

在步骤（3）中，所述发酵的温度为20-35℃，所述发酵时间为48-240h。

3.权利要求1所述的梭菌在制备生物丁醇中的应用。

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