CN116042666B - 过表达基因galK、galT及其工程菌 - Google Patents

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Abstract

本发明针对野生型菌株WK对半乳糖利用的局限性，发现了野生型菌株WK中调控半乳糖代谢的两个关键基因半乳糖激酶基因galK和UDP‑葡萄糖‑己糖‑1‑磷酸尿苷酰转移酶基因galT，并利用这两个关键基因对野生型菌株WK进行改造，得到工程菌WK‑Gal‑2、WK‑Gal‑3和WK‑Gal‑4。大幅提高对海藻生物质的利用效率。工程菌对半乳糖的利用效率与丁醇产量都有不同程度的提升，其中菌株WK‑Gal‑4的提升效果是最优的。因此，本发明不仅在一定程度上提升了产溶剂梭菌对海藻生物质中半乳糖的利用效率，也促进其转化生物丁醇的过程，为拓展产溶剂梭菌WK的底物范围提供了新方法。

Description

过表达基因galK、galT及其工程菌
技术领域
本发明涉及过表达基因galK和galT，及基于此构建工程菌WK-Gal-2、WK-Gal-3及WK-Gal-4在提升利用半乳糖转化生物丁醇效率的应用。
背景技术
在能源的可持续发展进程中，可再生的新能源逐渐替代化石类能源将是历史发展的必然。作为发展潜力巨大的生物燃料成员之一，生物丁醇以其较高的热能值、低挥发度、低腐蚀性等优势，被认为是继生物乙醇之后替代化石燃料的另一最佳选择。传统的生物丁醇生产方式是以产溶剂梭菌为出发菌株，通过丙酮-丁醇-乙醇(ABE)代谢途径经过厌氧发酵进行。然而，这个生产过程始终面临着原料成本高、丁醇产率低且副产物占比高等问题，这些均严重阻碍了生物丁醇的工业化生产进程。因此，现阶段比较迫切的任务是建立和完善一种经济且高效的产醇发酵体系，在提高丁醇产量并降低生产成本的同时，也为后续生物丁醇的真正落地与工业化提供理论与实践基础。
海藻生物质作为第三代生物质能源的重要组成之一，具有碳水化合物含量高、储量丰富、价格低廉等优势，特别是富含半乳糖、葡萄糖以及鼠李糖等可发酵糖的红藻是目前研究最为广泛的海洋生物质之一。但从菌株利用海藻生物质的效率来看，由于海藻生物质成分的多样性也给菌株利用带来了挑战，往往微生物偏好的碳源类型在海藻水解产物中可能占比不高，且葡萄糖阻遏效应的存在也可能干扰了菌株对其他单糖的利用效率造成底物浪费，而解决这一问题的有效途径之一则可以通过提升菌株对生物质中其他可发酵糖的利用。例如，Guamán等在“xylA和xylB的过表达是提蔗糖伯克霍尔德氏菌的木糖利用率和聚-3-羟基丁酸生产的成功策略”(Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology，2018，45(3)，165-173)一文中表明，通过在模式菌株Burkholderia sacchari中过表达编码木糖异构酶和木糖激酶的基因(xylA/xylB)，工程菌株的木糖消耗量提高了34％，聚-3-羟基丁酸酯的产量提高了25％，这项研究说明过表达木糖利用的相关基因是促进木糖利用及聚-3-羟基丁酸酯生产的有效策略。因此，采取相似策略，通过提升梭菌对海藻生物质中的其他可发酵糖类的利用效率，可以为后续整体促进梭菌菌株利用海藻生物质高产生物丁醇提供指导意义。
对于现有野生型菌株Clostridium sp.WK来说，其在发酵过程中以半乳糖为底物时丁醇产率较高，具有高产生物丁醇的潜力，但在糖利用方面存在明显的葡萄糖效应，菌株对半乳糖利用并不完全，这将限制其后续对红藻水解液(半乳糖含量达80％以上)的利用，造成成本增加、资源浪费等问题，不利于工业化生产。和其他微生物一样，产溶剂梭菌在发酵过程中都是将底物先转化成丙酮酸再进行ABE发酵，因此对底物的代谢过程进一步分析，通过获得该过程的关键限速酶信息，可为提升丁醇产量提供帮助。基于此，通过现有分析手段如RT-qPCR、同位素标记、转录组及蛋白组分析等，获取半乳糖利用的关键基因，在探究其利用机制的同时，运用过表达等基因工程技术，对野生型菌株进行改造，提升其底物的利用效率，促进生物丁醇等高附加值产品合成的同时进一步降低生产成本。
发明内容
本发明针对野生型菌株WK对半乳糖利用的局限性，发现了野生型菌株WK中调控半乳糖代谢的两个关键基因，并利用这两个关键基因对野生型菌株WK进行改造，得到的工程菌大幅提高对海藻生物质的利用效率。
本发明公开了一种半乳糖激酶基因galK，其编码的蛋白质序列如SEQ ID No.1所示。
上述的半乳糖激酶基因galK，其序列如SEQ ID No.2所示。
上述的半乳糖激酶基因galK在提高产溶剂梭菌Clostridium sp.WK产丁醇产量中的应用。
本发明还公开了一种UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因galT，其编码的蛋白质序列如SEQ ID No.3所示。
上述的UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因galT，其序列如SEQ ID No.4所示。
上述的UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因galT在提高产溶剂梭菌Clostridium sp.WK产丁醇产量中的应用。
本发明还公开了一种工程菌WK-Gal-2，为在产溶剂梭菌Clostridium sp.WK中过表达半乳糖激酶基因galK而成。
上述工程菌WK-Gal-2为将半乳糖激酶基因galK构建到梭菌-大肠杆菌穿梭载体pMTL83353中，形成过表达质粒pMTL-galK，将过表达质粒pMTL-galK转化到产溶剂梭菌Clostridium sp.WK中而成。
本发明还公开了工程菌WK-Gal-3或WK-Gal-4，为在产溶剂梭菌Clostridiumsp.WK中同时过表达半乳糖激酶基因galK和UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因galT而成。
其中工程菌WK-Gal-3，为将半乳糖激酶基因galK和UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因galT构建到梭菌-大肠杆菌穿梭载体pMTL83353中，形成同时含galK和galT基因的共表达质粒pMTL-Pthl-galK-Pthl-galT，其中galK和galT序列前均有Pthl启动子，将共表达质粒pMTL-Pthl-galK-Pthl-galT转化到产溶剂梭菌Clostridium sp.WK中而成。
其中工程菌WK-Gal-4，与WK-Gal-3基本相同，区别在于：galT序列前的启动子由Pthl换成了Pfdx。
本发明的有益效果：
本发明在野生型产溶剂梭菌Clostridium sp.WK中找到了两个调控半乳糖代谢的关键基因：半乳糖激酶基因(galK)和UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因(galT)，并且在此基础上对菌株进行分子改造以实现galK和galT的表达量增加。其中工程菌株WK-Gal-2，是在菌株WK的基础上过表达半乳糖激酶基因(galK)，采用Pthl启动子；所涉及的工程菌株WK-Gal-3，是在菌株WK的基础上同时过表达半乳糖激酶基因(galK)和UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因(galT)，采用的启动子均为Pthl；所涉及工程菌株WK-Gal-4，是在菌株WK-Gal-3的基础上将galT基因所用的启动子替换为Pfdx。与野生型菌株WK相比，工程菌株WK-Gal-2、WK-Gal-3、WK-Gal-4对半乳糖的利用效率与丁醇产量都有不同程度的提升，其中菌株WK-Gal-4的提升效果是最优的。因此，本发明不仅在一定程度上提升了产溶剂梭菌对海藻生物质中半乳糖的利用效率，也促进其转化生物丁醇的过程，为拓展产溶剂梭菌WK的底物范围提供了新方法。
附图说明
图1中(A)是本发明实施例1中构建的质粒pMTL-galK的图谱；(B)是本发明实施例2中构建的质粒pMTL-Pthl-galK-Pthl-galT的图谱；(C)是本发明实施例3中构建的质粒pMTL-Pthl-galK-Pfdx-galT的图谱。
图2是本发明实施例1中工程菌株WK-Gal-2的PCR鉴定分析图：其中泳道1～2为引物16s-F/16s-R分别以菌株WK和WK-Gal-2基因组作模板扩增的条带；泳道3为引物Primer1-F/Primer1-R以菌株WK基因组为模板扩增的条带；泳道4为引物Primer1-F/Primer1-R以菌株WK-Gal-2基因组为模板扩增的条带；泳道5为引物Primer1-F/Primer1-R以质粒pMTL-galK为模板扩增的条带。
图3是本发明实施例1中野生型菌株WK发酵过程中菌株生长曲线、半乳糖消耗及产物合成情况。
图4是本发明实施例1中工程菌株WK-Gal-2发酵过程中菌株生长曲线、半乳糖消耗及产物合成情况。
图5是本发明实施例2中工程菌株WK-Gal-3的PCR鉴定分析图：其中泳道1～2为引物16s-F/16s-R分别以菌株WK和WK-Gal-3基因组作模板扩增的条带；泳道3～4为引物Primer1-F/Primer1-R与Primer2-F/Primer2-R分别以菌株WK基因组为模板扩增的条带；泳道5～6为引物Primer1-F/Primer1-R与Primer2-F/Primer2-R分别以菌株WK-Gal-3基因组为模板扩增的条带；泳道7～8为引物Primer1-F/Primer1-R与Primer2-F/Primer2-R分别以质粒pMTL-Pthl-galK-Pthl-galT为模板扩增的条带。
图6是本发明实施例2中工程菌株WK-Gal-3发酵过程中菌株生长曲线、半乳糖消耗及产物合成情况。
图7是本发明实施例3中工程菌株WK-Gal-4的PCR鉴定分析图：其中泳道1～2为引物16s-F/16s-R分别以菌株WK和WK-Gal-4基因组作模板扩增的条带；泳道3～4为引物Primer1-F/Primer1-R与Primer2-F/Primer2-R分别以菌株WK基因组为模板扩增的条带；泳道5～6为引物Primer1-F/Primer1-R与Primer2-F/Primer2-R分别以菌株WK-Gal-4基因组为模板扩增的条带；泳道7～8为引物Primer1-F/Primer1-R与Primer2-F/Primer2-R分别以质粒pMTL-Pthl-galK-Pfdx-galT为模板扩增的条带。
图8是本发明实施例3中工程菌株WK-Gal-4发酵过程中菌株生长曲线、半乳糖消耗及产物合成情况。
图9是本发明实施例1-3中所涉及的野生型菌株WK及工程菌株WK-Gal-2、WK-Gal-3、WK-Gal-4在发酵各阶段半乳糖消耗速率的比较图。
具体实施方式
以下结合附图，通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。以下提供了本发明实施方案中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1.菌种及载体
(1)本发明所用穿梭质粒pMTL83353和野生型菌株Clostridium sp.WK(菌株保藏号：GDMCC61493，专利申请号：202110179660.0)均由态创生物科技(广州)有限公司保存；
(2)大肠杆菌Top10感受态细胞购买自生工生物工程(上海)股份有限公司；
(3)所涉及的工程菌株WK-Gal-2，是在菌株WK的基础上过表达半乳糖激酶基因(galK)，采用Pthl启动子；所涉及的工程菌株WK-Gal-3，是在菌株WK的基础上同时过表达半乳糖激酶基因(galK)和UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因(galT)，采用的启动子均为Pthl；所涉及工程菌株WK-Gal-4，是在菌株WK-Gal-3的基础上将galT基因所用的启动子替换为Pfdx。所有菌株现均由态创生物科技(广州)有限公司保存。
2.培养基配方及相关试剂的配制
(1)ACM厌氧培养基(1L)：酵母提取物，10g；NaHCO3，2.52g；2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)，2.132g；100×盐溶液10mL(每升包含NaCl，1.0g；MgCl2·6H2O，0.5g；KH2PO4，0.2g；NH4Cl，0.3g；KCl，0.3g；CaCl2·2H2O，0.015g)；1000×微量元素溶液1mL(每升包含FeCl2·4H2O，1.5g；CoCl2·6H2O，0.19g；MnCl2·4H2O，0.1g；ZnCl2，0.07g；H3BO3，0.006g；Na2MoO4·2H2O，0.036g；NiCl2·6H2O，0.024g；CuCl2·2H2O，0.002g)；以纯水配置，加入厌氧指示剂1mL(1g/L刃天青)；最后加入还原剂(二硫苏糖醇，0.077g；L-半胱氨酸，0.0242g；15.6g/L Na2S溶液，1mL/L)，调节pH至6.0，并向培养基中持续通入N2除氧，随后分装到厌氧培养的血清瓶中，用丁基胶塞和铝盖封口，于121℃灭菌20min。该培养基用于菌株的活化及发酵。
(2)LB培养基(1L)：NaCl，10g；胰蛋白胨，10g；酵母提取物，5g；以纯水配制，固体培养基需在此基础上额外添加1.5％(w/v)的琼脂，于121℃灭菌20min。该培养基用于含有目标质粒的大肠杆菌菌株的培养。
(3)YTG菌株复苏培养基(1L)：酵母提取物，10g；NaCl，5g；蛋白胨，16g；完全溶解后加入1mL厌氧指示剂(1g/L刃天青)，搅拌均匀后定容到950mL；定容后依次加入DTT0.077g、L-Cys 0.0242g、15.6g/L Na2S溶液1mL，并调节pH于6.0-7.0；连续通入N2至培养基完全除氧后，在通入N2的条件下按照所需量分装到20或100mL血清瓶中，并用丁基胶塞和铝盖封口后，121℃灭菌20min。该培养基用于工程菌株的复苏与培养。
(4)RCM梭菌增强培养基(1L)：RCM培养基粉末(购自美国BD公司)，38g；以纯水配制完全溶解后，固体培养基需额外加入1.5％(w/v)的琼脂，121℃灭菌20min。
(5)碳源母液：碳源选择葡萄糖或半乳糖，将葡萄糖或半乳糖配置成50％(w/v)的母液，分装至血清瓶中，并向其中持续通入N2除氧，115℃灭菌15min。
(6)电转缓冲液(10％甘油)：将10mL甘油与90mL ddH2O混溶，连续通入N2至氧气除尽，用丁基胶塞和铝盖封口后，121℃，20min灭菌，4℃保存。
(7)无氧壮观霉素溶液：壮观霉素粉末250mg/mL，溶于纯水中，0.22μm尼龙膜过滤，持续通入N2至氧气除尽，用丁基胶塞和铝盖封口，4℃保存。
(8)蛋白酶K溶液：准确称取32mg蛋白酶K粉末(购自SIGMA-ALDRICH公司)，溶于80mL pH 8.0的TE buffer溶液中，4℃保存。
实施例1重组菌株WK-Gal-2的构建及其ABE发酵过程
1.本实施例是基于已经转录水平分析确定的半乳糖代谢过程中的关键基因galK，设计构建基于梭菌的过表达体系，使菌株胞内的galK基因表达水平提高，进而提升其半乳糖利用能力。具体方法如下：
(1)设计特异性PCR引物：
galK-F：5’-GTGTTACATATGATGGAGAATATTAATGTATTAAAAA-3’(SEQ ID NO.5，下划线部分为NdeI酶切位点)
galK-R：5’-AGGATCCCCGGGTTATCCAATTTTTCTTGTTCC-3’(SEQ ID NO.6，下划线部分为XmaI酶切位点)；
(2)使用高保真酶从菌株WK的基因组中扩增目的片段，其反应体系设置为25μL体系，其中包括DNA模板(100ng)1μL、正反向引物(10μM)各1μL、dNTP 2μL、5×高保真酶反应缓冲液5μL、高保真聚合酶0.5μL；反应程序为：95℃预变性5min，95℃30s，60℃30s，72℃75s，35个循环，最后72℃延伸10min；
(3)将扩增得到的galK基因片段通过琼脂糖凝胶电泳检测，使用快速纯化试剂盒对基因片段进行纯化回收并测定浓度；
(4)采用限制性内切酶(NdeI、XmaI)分别对galK和梭菌-大肠杆菌穿梭载体pMTL83353进行酶切，酶切体系设置为50μL，其中包括目的DNA片段(1μg)、10×酶切通用Buffer 5μL、上下游核酸限制性内切酶(NdeI，20000U/mL；XmaI，10000U/mL)各1μL，于37℃条件下反应12h，通过琼脂糖凝胶电泳与DNA回收试剂盒回收酶切产物；
(5)将酶切后的基因片段galK和线性化载体pMTL83353进行连接反应，体系设置为10μL，其中包括载体片段0.03pmol、目的DNA片段0.3pmol、T4DNA连接酶(350U/μL)1μL、10×T4DNA反应Buffer 1μL，16℃条件下反应30min后转化至大肠杆菌Top10菌株，利用含250mg/mL壮观霉素抗性的LB琼脂平板筛选阳性克隆子，经菌落PCR与测序验证得到含galK基因的过表达质粒pMTL-galK(SEQ ID NO.7)，质粒图谱如图1(A)所示。
2.采用已优化的梭菌电转体系(以10％甘油作电转缓冲液，通过2mm电击杯和3.4ms的电击时间，电压1.5kV完成电转化过程)，将质粒pMTL-galK(8μg)导入预先活化的野生型菌株WK中。将经恢复的菌液涂布于含有250mg/mL壮观霉素的RCM琼脂平板上，于37℃培养过夜直至克隆子长出，挑选单菌落于YTG中扩培，待菌液长到一定数量后使用蛋白酶K预处理，进行菌液PCR，以验证目标质粒是否成功导入梭菌。同时以菌株WK的基因组为模板作为阴性对照，以质粒pMTL-galK为模板作阳性对照，验证结果如图2所示，最终得到一株阳性的工程菌株WK-Gal-2。该过程共用了两对引物进行验证，具体如下：
16s-F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.8)；
16s-R:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.9)；
Primer1-F:5’-TGCTATGGATGGCTAC-3’(SEQ ID NO.10)；
Primer1-R:5’-CTCTTCGCTATTACGC-3’(SEQ ID NO.11)。
3.获得稳定的过表达工程菌WK-Gal-2后，以40g/L半乳糖作为底物，以野生菌WK作为对照，分别在30℃、150rpm条件下对2株菌进行恒温发酵96h(工程菌发酵过程中除需额外添加250mg/mL壮观霉素外，其余条件均与野生菌一致)。发酵过程中每间隔12或24h进行排气取样，检测发酵过程中菌体生长曲线、半乳糖消耗情况以及发酵产物生成情况，结果如图3、4所示。
在整个发酵结束后，WK(野生菌)共消耗了25.55g/L的半乳糖(图3)，最大生物量达到9.4(OD600nm)，丁醇产量达到了7.97g/L，ABE产量为11.58g/L。而从图4可见，工程菌WK-Gal-2共消耗了34.06g/L半乳糖，比野生菌WK提升了33.31％。且在0到12h间，WK-Gal-2半乳糖消耗率最大，为0.97g/L/h(如图9)，即基因galK的主要作用时间在0到12h。整个发酵过程中(如图4)，WK-Gal-2的最大生物量达到11.04(OD600nm)，比野生菌WK升高了17.45％，在发酵结束后，WK-Gal-2丁醇产量为10.32g/L，ABE产量达到14.82g/L，与野生型菌株相比分别提升了29.49％和27.98％。这一结果表明本实施例已成功对现有产溶剂梭菌WK进行了分子改造，使galK基因表达水平提高，最终其底物利用效率及溶剂合成效率均显著优于野生型菌株WK(如表1所示)。
实施例2重组菌株WK-Gal-3的构建及其ABE发酵过程
1.本实施例是基于已经确定的半乳糖代谢过程中的关键基因galK和galT，设计构建基于梭菌的共表达体系，将菌株胞内的galK和galT基因的表达水平同时提高，探究其对梭菌WK利用半乳糖的影响。具体方法如下：
(1)从现有质粒pMTL-galK出发，以它为载体，以前期获得的过表达质粒pMTL-galT为模板，设计特异性引物，将galT及其前端的启动子Pthl用高保真酶扩增下来。引物序列如下所示：
galK+galT-F：5’-GGATAACCCGGGTTTTTAACAAAATAT-3’(SEQ ID NO.12，下划线部分为XmaI酶切位点)；
galK+galT-R：5’-CGTGACGTCGACTTATAATATATTTATAAATTTA-3’(SEQ ID NO.13，下划线部分为SalI酶切位点)；
(2)将扩增得到的galT及其前端的启动子Pthl片段通过琼脂糖凝胶电泳检测，使用快速纯化试剂盒对基因片段进行纯化回收并测定浓度；
(3)采用限制性内切酶(XmaI、SalI)分别对获得的基因片段和质粒pMTL-galK进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳与DNA回收试剂盒回收酶切产物。将酶切后的基因片段和线性化载体pMTL-galK进行连接反应，反应完成后转化至大肠杆菌Top10菌株，利用含250mg/mL壮观霉素抗性的LB琼脂平板筛选阳性克隆子，经菌落PCR与测序验证得到同时含galK和galT基因的共表达质粒pMTL-Pthl-galK-Pthl-galT(SEQ ID NO.14)，质粒图谱如图1(B)所示。
2.采用与实施例1中一致的电转及阳性克隆子筛选的方法，并对获得的阳性克隆子进行PCR，以验证目标质粒是否成功导入。以菌株WK的基因组为模板作为阴性对照，以质粒pMTL-Pthl-galK-Pthl-galT为模板作阳性对照，验证结果如图5所示，最终得到一株阳性的工程菌株WK-Gal-3(代表共表达galK和galT后的菌株)。该过程共用了3对引物进行验证，具体如下：
16s-F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.7)；
16s-R:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.8)；
Primer1-F:5’-TGCTATGGATGGCTAC-3’(SEQ ID NO.9)；
Primer1-R:5’-CTCTTCGCTATTACGC-3’(SEQ ID NO.10)；
Primer2-F:5’-TAGTAGCCTGTGAAAT-3’(SEQ ID NO.15)；
Primer2-R:5’-TAGTATTGATCCTCCA-3’(SEQ ID NO.16)。
3.同样地，获得稳定的共表达工程菌WK-Gal-3后，以40g/L半乳糖作为底物进行了发酵实验，并检测发酵过程中菌体生长曲线、半乳糖消耗情况以及发酵产物生成情况，发酵结果如图6所示。
从发酵结果来看(图6)，工程菌株WK-Gal-3的发酵效果并没有得到明显提升，在发酵终点时，工程菌株只消耗了27.60g/L半乳糖，仅比野生菌WK提升了8.02％，并且半乳糖消耗速率也只有少许提升，在12-24h时达最大值，即0.73g/L/h(如图9)。最大生物量为9.87(OD600nm)，与野生型相比仅提高了5％，与工程菌WK-Gal-2相比反而降低了10.60％。其丁醇产量为8.74g/L，ABE产量为12.12g/L，较野生型菌株分别提升了9.66％和4.66％；较工程菌WK-Gal-2分别降低了15.31％和18.35％。虽然与野生菌WK相比，WK-Gal-3各项发酵性能略有提升，但整体的发酵效果却远不及工程菌WK-Gal-2(如表1所示)。因此需对共表达载体进行进一步优化，以促进相关基因的共同表达，实现进一步促进半乳糖利用的目的。
实施例3重组菌株WK-Gal-4的构建及其ABE发酵过程
1.本实施例是基于实施例2中已构建的共表达体系pMTL-Pthl-galK-Pthl-galT，通过将galT基因前端强启动子Pthl更换为较弱的Pfdx来优化该共表达体系，使菌株胞内的galK和galT基因的表达水平同时提高，进一步实现促进半乳糖利用的目的。具体方法如下：
(1)在现有质粒pMTL-Pthl-galK-Pthl-galT的基础上，设计特异性引物，用高保真酶将启动子Pfdx基因片段和除该片段外的其余DNA片段扩增下来。引物序列如下所示：
Pfdx-F：5’-AGAAAAATTGGATAACCCGGGGTGTAGTAGCCTGTG-3’(SEQ ID NO.17，下划线部分为XmaI酶切位点)
Pfdx-R：5’-ATTTATATTTATCATCATATGTAACACACCTCCTTAAAAATTACACAAC-3’(SEQ IDNO.18，下划线部分为NdeI酶切位点)；
U-F：5’-TAAGGAGGTGTGTTACATATGATGATAAATATAAATCATGAAATAAAT-3’(SEQ IDNO.19，下划线部分为NdeI酶切位点)
U-R：5’-CACAGGCTACTACACCCCGGGTTATCCAATTTTTCT-3’(SEQ ID NO.20，下划线部分为XmaI酶切位点)
(2)将扩增得到的Pfdx片段通过琼脂糖凝胶电泳检测，使用快速纯化试剂盒对基因片段进行纯化回收并测定浓度；
(3)将回收的两个DNA片段，采用ClonExpress II One Step Cloning Kit(购自诺唯赞公司)，于37℃条件下反应30min，反应完成后转化至大肠杆菌Top10菌株，利用含250mg/mL壮观霉素抗性的LB琼脂平板筛选阳性克隆子，经菌落PCR与测序验证得到同时含galK和galT基因、且galT基因前端启动子更换为Pfdx的共表达质粒pMTL-Pthl-galK-Pfdx-galT(SEQ ID NO.21)，质粒图谱如图1(C)所示。
2.采用与实施例1中步骤2一致的电转及阳性克隆子筛选的方法，并对获得的阳性克隆子进行PCR，以验证目标质粒是否成功导入。以菌株WK的基因组为模板作为阴性对照，以质粒pMTL-Pthl-galK-Pfdx-galT为模板作阳性对照，验证结果如图7所示，最终得到一株阳性的工程菌株WK-Gal-4(代表优化共表达载体后共表达galK和galT的菌株)。该过程共用了3对引物进行验证，引物序列与实施例2的一致。
3.同样地，以40g/L半乳糖为底物，对工程菌WK-Gal-4进行了分批发酵实验，发酵结果如图8所示，并与野生菌WK、工程菌WK-Gal-2及WK-Gal-3的发酵结果进行了对比，结果如表1所示。
从图8可以看到，带有共表达质pMTL-Pthl-galK-Pfdx-galT的工程菌WK-Gal-4发酵结束时半乳糖消耗量达到38.25g/L，比野生菌WK的半乳糖消耗量(25.55g/L)高49.71％，比工程菌WK-Gal-2(34.06g/L)和WK-Gal-3(27.60g/L)的半乳糖消耗量分别高12.30％和38.59％。与工程菌WK-Gal-2和WK-Gal-3不同的是，WK-Gal-4半乳糖消耗速率在0到36h间一直保持在较高水平，最大半乳糖消耗速率为1.06g/L/h(如图9)。WK-Gal-4的最大生物量达到11.71(OD600nm)，分别比野生菌WK、工程菌WK-Gal-2和WK-Gal-3分别提升了24.57％，6.07％和18.64％。发酵结束后，WK-Gal-4丁醇及ABE产量分别达到了12.32g/L和17.03g/L，与野生菌WK相比分别提升了54.58％和47.06％；比工程菌WK-Gal-2分别提升了19.38％和14.91％；与工程菌WK-Gal-3相比分别提升了40.96％和40.51％。这一结果表明本实施例通过更换启动子已成功优化了共表达体系并对现有产溶剂梭菌WK进行了分子改造，使galK和galT基因表达水平同时提高，最终显著提升其底物利用效率及溶剂合成效率(如表1所示)。
表1 不同实施例的工程菌株发酵情况比较
注：**p<0.0001，与野生菌WK相比；*p<0.0005，与野生菌WK相比；##p<0.0001,与菌株WK-Gal-2相比；^^p<0.0001，与菌株WK-Gal-3相比。

Claims (7)

1.半乳糖激酶基因galK在提高产溶剂梭菌Clostridium sp. WK产丁醇产量中的应用，其中Clostridium sp. WK的菌株保藏号为GDMCC No.61493，半乳糖激酶基因galK编码的蛋白质序列如SEQ ID No.1所示。
2.UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因galT在提高产溶剂梭菌Clostridiumsp. WK产丁醇产量中的应用，其中Clostridium sp. WK的菌株保藏号为GDMCC No.61493，UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因galT编码的蛋白质序列如SEQ ID No.3所示。
3.一种工程菌WK-Gal-2，其特征在于：其是通过在产溶剂梭菌Clostridium sp. WK中过表达半乳糖激酶基因galK构建而成，所述产溶剂梭菌Clostridium sp. WK的菌株保藏号为GDMCC No.61493，所述半乳糖激酶基因galK编码的蛋白质序列如SEQ ID No.1所示。
4.根据权利要求3所述的工程菌WK-Gal-2，其特征在于：其是通过将半乳糖激酶基因galK构建到梭菌-大肠杆菌穿梭载体pMTL83353中，形成过表达质粒pMTL-galK，将过表达质粒pMTL-galK转化到产溶剂梭菌Clostridium sp. WK中构建而成。
5.一种工程菌，其特征在于：其是通过在产溶剂梭菌Clostridium sp. WK中同时过表达半乳糖激酶基因galK和UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因galT构建而成，所述产溶剂梭菌Clostridium sp. WK的菌株保藏号为GDMCC No.61493，所述半乳糖激酶基因galK编码的蛋白质序列如SEQ ID No.1所示，所述UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因galT编码的蛋白质序列如SEQ ID No.3所示。
6.根据权利要求5所述的工程菌，为工程菌WK-Gal-3，其特征在于：其是通过将半乳糖激酶基因galK和UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因galT构建到梭菌-大肠杆菌穿梭载体pMTL83353中，形成同时含galK和galT基因的共表达质粒pMTL-Pthl-galK-Pthl-galT，其中galK和galT序列前均有Pthl启动子，将共表达质粒pMTL-Pthl-galK-Pthl-galT转化到产溶剂梭菌Clostridium sp. WK中构建而成。
7.根据权利要求5所述的工程菌，为工程菌WK-Gal-4，其特征在于：其是通过将半乳糖激酶基因galK和UDP-葡萄糖-己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因galT构建到梭菌-大肠杆菌穿梭载体pMTL83353中，形成同时含galK和galT基因的共表达质粒pMTL-Pthl-galK-Pfdx-galT，其中galK序列前有Pthl启动子，galT序列前有Pfdx启动子，将共表达质粒pMTL-Pthl-galK-Pfdx-galT转化到产溶剂梭菌Clostridium sp. WK中构建而成。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US9284580B2 (en) * 2010-10-01 2016-03-15 Shang-Tian Yang Metabolic engineering of clostridium tyrobutyricum for butanol production
EP2774986A1 (en) * 2013-03-06 2014-09-10 Clariant Produkte (Deutschland) GmbH Improvement of clostridial butanol production by gene overexpression
CN112961799B (zh) * 2021-02-08 2022-10-14 汕头大学 一株梭菌及利用其制备生物丁醇的方法
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