CN117802185A - 一种全细胞催化制备nmnh的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种全细胞催化制备NMNH的方法。该方法是在含有3‑磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、脂肪醛脱氢酶和多聚磷酸激酶的全细胞催化作用下，将NMN转化为NMNH。本发明构建的全细胞可以直接将NMN转化为NMNH，几乎没有副产物产生，提升了原子经济利用性，反应条件温和，无污染，更适于工业化生产。
Description
技术领域：
本发明属于酶基因工程技术领域，具体涉及一种全细胞催化制备NMNH的方法。
背景技术：
还原态烟酰胺单核苷酸(NMNH)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的前体之一。出于全球抗衰需求的刚性增长，具有明确抗衰老机理的NAD+，被越来越多人关注，人们迫不及待寻求更优质的前体来补救体内缺失过半的NAD+。令人兴奋的是，NMNH已在实验室与权威学术圈得到证实：相对于NMN，NMNH是更有效的NAD+增强剂。
随着我国消费者健康意识和抗衰老需求的增长，人们对于NMN、NMNH的接受度将会越来越高并进一步扩大，我国是世界上老年人口最多的国家，60岁以上的老年人口超2.49亿，健康产业却只占GDP的4％～5％，远低于发达国家，抗衰老产品具有庞大的消费市场。
目前已有大量关于NMN的制备方法的报道，但是关于NMNH制备方法的报道相对较少，主要是以下几种。
第一种就是化学法合成，部分报道公开NMN可以在二氧化硫脲或连二亚硫酸钠等的作用下生成NMNH，但是收率比较低。
第二种就是酶法合成，University of Amsterdam在2021年报道利用NudC酶可以将NADH分解为NMNH，但同时会生成副产物AMP，产率在70％左右，但是底物NADH的价格相对昂贵，NudC酶的转化率也不高，这些都制约着NMNH的工业化应用。
因此，我们亟需寻找一种新的制备NMNH的方法。
发明内容：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，利用基因工程手段，提供一种新的全细胞催化制备NMNH的方法。
本发明公开的技术方案机理如Scheme1所示：
本发明公开了一种全细胞催化制备NMNH的方法，其包括：在含有3-磷酸甘油醛脱氢酶(GapN)、磷酸甘油酸激酶(PGAK)、脂肪醛脱氢酶(FALDH)和多聚磷酸激酶(PPK)的全细胞催化作用下，将NMN转化为NMNH。
进一步，先将3-磷酸甘油醛脱氢酶和磷酸甘油酸激酶构建到质粒pACYCDuet载体上的两个多克隆位点区域，通过抗性筛选获得含有上述两个基因的细胞。
更进一步，所述3-磷酸甘油醛脱氢酶来源于变异链球菌Streptococcus mutans，所述磷酸甘油酸激酶来源于假单胞菌Pseudomonas sp。
进一步，将脂肪醛脱氢酶和聚磷酸激酶通过基因工程技术连接到质粒CDFDuet载体上的两个多克隆位点区域，通过抗性筛选获得含有上述两个基因的细胞。
更进一步，所述脂肪醛脱氢酶来源于哈氏弧菌Vibrio harveyi，所述聚磷酸激酶来源于酿酒酵母saccharomyces cerevisiae。
进一步，将上述两个重组受体细胞培养后，提取重组质粒，将两种质粒等比例混合后，再次共转入感受态细胞，借助氯霉素和链霉素的抗性，筛选到含有上述四个基因的重组质粒细胞。
更进一步，所述感受态细胞选自大肠杆菌、酵母、枯草芽孢杆菌细胞，优选大肠杆菌。
进一步，将含有四个基因的重组细胞进行培养生长，在诱导剂IPTG的作用下表达出含有以上四种蛋白的全细胞。
进一步，利用能够表达出含有以上四种蛋白的全细胞作为催化剂，控制反应体系pH在6～10之间，缓冲液选自磷酸盐或Tris-HCl。
更进一步，所述缓冲液浓度在10-100mM之间。
更进一步，在催化反应中，全细胞浓度为10～50g/L。
更进一步，底物NMN的浓度为20～200mM。
本发明的有益效果在于，本发明针对现有技术的不足，实现了全细胞催化制备NMNH的方法，且在合成路径上实现了3-磷酸甘油醛的再生循环，再次利用细胞内自身的NAD还原酶，实现了辅酶NADH的再生。通过本发明构建的全细胞可以直接将NMN转化为NMNH，几乎没有副产物产生，提升了原子经济利用性，同时，此催化反应中条件温和，无污染，且成本低，更适于工业化生产。
附图说明
图1实施例1中GapN基因的鉴定结果图
图2实施例3中重组蛋白的表达结果图
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1基因工程构建重组质粒pACYCDuet-GapN-PGAK
本实施例所采用来源于变异链球菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶(GapN)，具体序列参考如下：
MTKQYKNYVNGEWKLSENEIKIYEPASGAELGSVPAMSTEEVDYVYASAKKAQPAWRALSYIERAAYLHKVADILMRDKEKIGAILSKEVAKGYKSAVSEVVRTAEIINYAAEEGLRMEGEVLEGGSFEAASKKKIAVVRREPVGLVLAISPSNYPVNLAGSKIAPALIAGNVIAFKPKTQGSISGLLLAEAFAEAGLPAGVFNTITGRGSEIEDYIVEHQAVNFINFTGSTGEGERIGKMAGMRPIMLELGGKDSAIVLEDADLELTAKNIIAGAFGYSGQRSTAVKRVLVMESVADELVEKIREKVLALTIGNPEDDADITPLIDTKRADYVEGLINDANDKGATALTEIKREGNLICPILFDKVTTDMRLAWEEPFGPVLPIIRVTSVEEAIEISNKSEYGLQASIFTNDFPRAFGIAEQLEVGTVHINNKTQRGTDNFPFLGAKKSGAGIQGVKYSIEAMTTVKSVVFDIK
经全基因合成后引入酶切位点NcoI和HindIII，利用设计的目的基因引物，将片段扩增复制，同时利用限制性内切酶NcoI和HindIII分别对合成的基因和质粒pACYDuet进行消化，将产生的粘性末端片段按照摩尔比例1:3，在连接酶试剂盒的作用下，16℃连接过夜，之后将连接溶液直接转入BL21(DE3)感受态中，实现了单个基因的构建，之后对含有氯霉素平板上的单克隆进行PCR鉴定，扩增引物采用通用引物ACYCDuetUP1 Primer和DuetDOWN1Primer，结果显示构建成功，见图1。
将上述筛选到的单克隆培养后，提取重组质粒pACYDuet-GapN，作为构建第二个基因的质粒受体。同理，亲本的磷酸甘油酸激采用假单胞菌(Pseudomonas sp)表达的蛋白，具体氨基酸序列如下：
MTVLKMTDLDLQGKRVLIREDLNVPVKDGVVTSDARILASLPTIKLALEKGAAVMVCSHLGRPTEGEFSAENSLKPVADYLSKALGREVPLVSDYLNGVDVKAGDIVLFENVRFNKGEKKNADELAKQYAALCDVFVMDAFGTAHRAEGSTHGVAKFAKVAAAGPLLAAELDALGKALGAPAKPMAAIVAGSKVSTKLDVLNSLSQICDLLIVGGGIADTFLAAAGHPVGKSLYEPDLLDTARAIAAKVNVPLPTDVVVAKEFAESAEATVKLIADVAADDMILDIGPQTAEHFAQLLKTSKTILWNGPVGVFEFDQFGNGTKVLAKAIADSAAFSIAGGGDTLAAIDKYGVADQISQISTGGGAFLEFVEGKVLPAVEVLESRAKA，通过外公司直接合成，并引入NdeI和XhoI酶切位点，利用设计好的引物进行复制，得到高浓度的复制片段。在限制性内切酶NdeI和XhoI酶的作用下，将消化后的pACYDuet-GapN片段和目的基因PGAK片段按照1:10混合，再次转入BL21(DE3)感受态细胞，经过再次抗性平板的筛选后获得单克隆细胞，分别对单克隆细胞进行验证，筛选到含有重组质粒pACYCDuet-GapN-PGAK的单克隆菌体。
实施例2基因工程构建重组质粒CDFDuet-FALDH-PPK
从NCBI的数据库中，选择来源于哈氏弧菌的脂肪醛脱氢酶，该酶的氨基酸序列如下：
MNPQTDNVFYATNAFTGEALPLAFPVHTEVEVNQAATAAAKVARDFRRLNNSKRASLLRTIASELEARSDDIIARAHLETALPEVRLTGEIARTANQLRLFADVVNSGSYHQAILDTPNPTRAPLPKPDIRRQQIALGPVAVFGASNFPLAFSAAGGDTASALAAGCPVIVKGHTAHPGTSQIVAECIEQALKQEQLPQAIFTLLQGNQRALGQALVSHPEIKAVGFTGSVGGGRALFNLAHERPEPIPFYGELGAINPTFIFPSAMRAKADLADQFVASMTMGCGQFCTKPGVVFALNTPETQAFIETAQSLIRQQSPSTLLTPGIRDSYQSQVVSRGSDDGIDVTFSQAESPCVASALFVTSSENWRKHPAWEEEIFGPQSLIVVCENVADMLSLSEMLAGSLTATIHATEEDYPQVSQLIPRLEEIAGRLVFNGWPTGVEVGYAMVHGGPYPASTHSASTSVGAEAIHRWLRPVAYQALPESLLPDSLKAENPLEIARAVDGKAAHS
将上述酶基因两端分别引入NcoI和HindIII酶切位点，通过限制性内切酶的消化和连接酶试剂盒的作用，实现FALDH基因克隆到载体CDFDuet上，通过在壮观霉素的抗性平板上筛选后，在通用引物ACYCDuetUP1 Primer和DuetDOWN1 Primer的扩增下，筛选到含有重组质粒CDFDuet-FALDH的细胞，并在37℃对该细胞培养后，提取重组质粒CDFDuet-FALDH，用于后期连接第二个基因PPK。多聚磷酸激酶采用来源于酿酒酵母的亲本序列，氨基酸信息如下：
MDTVNNYRVLEHKAAGHDGTLTDGDGLLIFKPAFPQELEFYKAIQVRDVSRRKSSADGDAPLCSWMPTYLGVLNEGAKIEQSGDAALLKIDERLSDSTDNLDSIPVKSEKSKQYLVLENLLYGFSKPNILDIKLGKTLYDSKASLEKRERMKRVSETTTSGSLGFRICGMKIQKNPSVLNQLSLEYYEEEADSDYIFINKLYGRSRTDQNVSDAIELYFNNPHLSDARKHQLKKTFLKRLQLFYNTMLEEEVRMISSSLLFIYEGDPERWELLNDVDKLMRDDFIDDDDDDDDNDDDDDDDAEGSSEGPKDKKTTGSLSSMSLIDFAHSEITPGKGYDENVIEGVETLLDIFMKF。
在合成PPK基因的过程中直接引入酶切位点NdeI和XhoI，利用连接试剂盒，将PPK基因引入到重组质粒CDFDuet-FALDH上，实现了两个基因在两个多克隆区域的构建，从而获得重组质粒CDFDuet-FALD-PPK。
实施例3重组蛋白的表达
将重组质粒CDFDuet-FALD-PPK和pACYCDuet-GapN-PGAK各取100ng，、混合后转入到BL21(DE3)感受态中，通过含有氯霉素和壮观霉素的双抗性平板进行筛选，经PCR扩增验证后，确定四个基因都已经转入细胞。取该细胞进行表达测试，将上述的细胞转入有氯霉素和壮观霉素双抗性的LB试管中，37℃下培养过夜。将种子液按照1.5％的接种量转接到含有对应双抗性的2YT培养基中，在37℃下培养细菌，待生物量OD600值达到0.6左右，进行IPTG诱导，温度降低到25℃，表达16h后收集菌体，并破碎细胞进行电泳分析，结果见图2，能够看到不同蛋白的条带，后续经过转化测试后，说明蛋白都有表达。
实施例4全细胞催化制备NMNH
将实施例3中得到的含有重组质粒CDFDuet-FALD-PPK和pACYCDuet-GapN-PGAK的细胞直接按照50g/L，称量5g，加入到含有100mM的磷酸钾盐缓冲液中，缓冲液浓度为100mM，pH控制在8.0，将NMN分批加入，每小时加入10g/L的量，连续加入2次，总共加入NMN约30g/L，反应在20℃下进行，反应24小时后取样分析，结果显示产物中主要是NMNH，底物有部分剩余，产物浓度在17.6g/L。
Claims (7)
1.一种全细胞催化制备NMNH的方法，其特征在于，所述方法为在含有3-磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、脂肪醛脱氢酶和多聚磷酸激酶的全细胞催化作用下，将NMN转化为NMNH。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述全细胞的制备方法主要包括以下步骤：1)将3-磷酸甘油醛脱氢酶和磷酸甘油酸激酶构建到质粒pACYCDuet载体上的两个多克隆位点区域，通过抗性筛选获得含有这两个基因的细胞；2)将脂肪醛脱氢酶和聚磷酸激酶构建到质粒CDFDuet载体上的两个多克隆位点区域，通过抗性筛选获得含有这两个基因的细胞；3)将前两步得到的两个重组受体细胞培养后，提取重组质粒，将两种质粒等比例混合后，共转入感受态细胞，筛选到含有上述四个基因的重组质粒细胞。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述3-磷酸甘油醛脱氢酶来源于变异链球菌Streptococcus mutans，所述磷酸甘油酸激酶来源于假单胞菌Pseudomonas sp，所述脂肪醛脱氢酶来源于哈氏弧菌Vibrio harveyi，所述聚磷酸激酶来源于酿酒酵母saccharomyces cerevisiae。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述感受态细胞选自大肠杆菌、酵母、枯草芽孢杆菌细胞。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，借助氯霉素和链霉素的抗性，筛选到含有四个基因的重组细胞。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述全细胞浓度为10～50g/L。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述NMN浓度为20～200mM。
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