CN111440752A - 一种葡萄糖代谢缺陷型菌株的构建方法及其混菌发酵产1，5-戊二胺 - Google Patents

一种葡萄糖代谢缺陷型菌株的构建方法及其混菌发酵产1，5-戊二胺 Download PDF

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许晟
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Abstract

本发明公开了一种葡萄糖代谢缺陷型菌株的构建方法及其混菌发酵产1，5‑戊二胺。先构建E.coli BL‑AST3葡萄糖代谢缺陷型菌株，再构建重组菌株E.coli BL‑pTrc99a‑DapA；选取重组菌株E.coli BL‑pTrc99a‑DapA和E.coli BL‑AST3加入发酵培养基中，以葡萄糖和甘油为碳源生产1，5‑戊二胺。与现有技术相比，利用混菌发酵的方式，大幅简化操作程序、降低生产成本，终产物1，5‑戊二胺的产量提高。相比于普通的E.coli BL‑AST3单细胞发酵，1，5‑戊二胺的摩尔收率提高了65%。

Description

一种葡萄糖代谢缺陷型菌株的构建方法及其混菌发酵产1，5- 戊二胺
技术领域
本发明涉及1，5-戊二胺制备技术领域，具体涉及一种葡萄糖代谢缺陷型菌株的构建方法及其混菌发酵产1，5-戊二胺。
背景技术
1,5-戊二胺又名1,5-二氨基戊烷，具有六氢吡啶的臭味。易溶于水、乙醇，微溶于乙醚，在常温下呈无色粘稠的发烟状液体，深度冷冻可凝固结晶。其广泛存在原核生物及真核生物中，具有多种生物活性，尤其在植物和微生物的生理活动中具有重要的调控作用。
食品中1,5-戊二胺的含量会随着生产工艺及储存条件的改变而产生变化，特别是在肉类、奶制品、豆制品、葡萄酒等发酵食物的加工过程被微生物污染时，其含量变化显著。因而，随着快速精确的检测方法研发，1,5-戊二胺可成为食品安全及质量控制的指标性检测物质。在医药领域，1,5-戊二胺可以降低铜绿假单胞菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性，且动物实验表明在给药2000ppm(180mg/kg体重/天)条件下没有观察到副作用，因而1,5-戊二胺是一种非常有潜力的抗生素佐剂。此外，1,5-戊二胺参与合成的铁载体desferrioxamine是临床上用来治疗急性铁中毒、血色素沉着病、慢性铁质沉积症，和抗疟疾药物。同时研究表明它在铝中毒、血浆铜蓝蛋白缺乏症及迟发性皮肤紫质症方面也有显著疗效。目前，通过补加1,5-戊二胺或其前体L-赖氨酸，以及调控1,5-戊二胺合成等方式发酵生产铁载体的研究也已展开，可以预见1,5-戊二胺在医药领域将会得到更多的应用。
目前合成1，5-戊二胺主要有两种方法，分别为化学法和生物法。化学法合成1,5-戊二胺主要是以戊二腈为原料，在催化剂作用下首先转为5-氨基戊腈，进而转化为戊二胺，反应通常在高压下进行。通过对催化剂的选择和改性，戊二腈的转化率可达到100％，1,5-戊二胺选择率达到66.8％。化学法产量较高，但其反应条件剧烈，对设备要求较高，环境污染较大，且最终反应产物中有一定量的副产物六氢吡啶，并不适合大规模推广。生物法合成1,5-戊二胺具有原料来源广、生产条件温和、环境友好等优势。在生物体中，1,5-戊二胺是经赖氨酸脱羧酶由L-赖氨酸直接脱羧生成的。但有研究表明，在3g L-1的1,5-戊二胺溶液中，赖氨酸脱羧酶的活力会降低50％。显著的产物抑制现象严重制约了纯酶催化生产1,5-戊二胺的应用，因而对于1,5-戊二胺的生物合成研究主要集中在利用微生物直接发酵生产或添加前体L-赖氨酸通过全细胞催化生产两个方面。在微生物直接发酵生产方面，目前研究广泛的赖氨酸生产菌种谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌是主要的基因工程改造出发菌。以高产L-赖氨酸的谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，通过异源表达大肠杆菌赖氨酸脱羧酶及敲除1,5-戊二胺分解代谢途径相关基因，目前已实现利用谷氨酸棒状杆菌发酵生产1,5-戊二胺103g L-1，最高生产强度达到2.2g L-1h-1。但以L-赖氨酸高产E.coli为出发菌株构建的1,5-戊二胺生产菌研究尚处于起始阶段。
目前为止，通过将L-赖氨酸合成基因DapA，DapB和有助于1,5-戊二胺合成基因pelB-CadB-CadA、pdxST分开表达在两个细胞中，利用混菌发酵的方式生产1，5-戊二胺的方法尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种葡萄糖代谢缺陷型菌株的构建方法及其混菌发酵产1，5-戊二胺，该方法适合大规模工业化生产1，5-戊二胺，且中间产物少。
一种葡萄糖代谢缺陷型菌株的构建方法，包括以下步骤：
第一步，选取第一引物，通过PCR复制枯草芽孢杆菌(B.subtilis NJ308)pdxST基因，再与质粒pTrc99A连接得到质粒pTrc99A-pdxST；选取第二引物，通过PCR复制大肠杆菌MG1655上赖氨酸/戊二胺双向转运蛋白基因(cadB),再与载体pETDuet连接得到pETD-CadB；选取第三引物，通过PCR复制大肠杆菌MG1655上扩增cadBA操纵子，再与载体pET28a连接得到质粒pET28a-CadBA；将pET28a-CadBA和pET22b分别用BglII和BamHI双酶切，将pET28a-CadBA酶切产物中203bp片段替换为pET22b酶切产物中194bp的片段，从而构建得到质粒pET28a-pelB-CadBA；选取第四引物，通过PCR扩增cadA基因以及用引物扩增cadB基因，cadA的扩增产物酶切连接至质粒pET22b，构建得到质粒pET22b-CadA；cadB的扩增产物连接至质粒pETDuet上，构建得到质粒pETDuet-CadB，而后将质粒pET22b-CadA的NotI和BglII酶切片段(pelB-cadA部分)克隆至质粒pETDuet-CadB的NotI–BglII位点间，构建得到质粒pETDuet-CadB-pelB-CadA，将质粒pTrc99A-pdxST经NcoI和SalI酶切后，将包含pdxST编码区的片段克隆至质粒pCWJ上获得质粒pCWJ-pdxST；
第二步，利用Crispr-Cas9编辑技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)的磷酸转移酶系统(PTS)ptsG、ptsH、ptsI、crr和glk基因编码的蛋白，将构建好的质粒pCWJ-pdxST和pETDuet-pelB-CadB-CadA共同转化至葡萄糖代谢缺陷型的BL21(DE3)的感受态中，即得E.coli BL-AST3葡萄糖代谢缺陷型菌株。
基于E.coli BL-AST3葡萄糖代谢缺陷型菌株的混菌发酵产1，5-戊二胺，包括以下步骤：
步骤1，构建重组菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA；
步骤2，选取重组菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-AST3加入发酵培养基中，同时供给葡萄糖和甘油为碳源，培养至OD约为0.8后用终浓度为1‰的IPTG诱导，继续培养发酵生产1，5-戊二胺。
作为改进的是，步骤1中E.coli BL-pTrc99a-DapA构建方法为：选取第五引物，通过PCR复制大肠杆菌MG1655上的二氢吡啶甲酸合酶，再与载体pTrc99a连接，并转入克隆载体Trans1-T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序。
作为改进的是，步骤2中所述将重组菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-AST3的细胞OD比例关系为3：1。
作为改进的是，步骤2中所述葡萄糖和甘油的添加的摩尔比为4：1。
作为改进的是，步骤2中所述诱导温度为30℃。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种葡萄糖代谢缺陷型菌株的构建方法及其混菌发酵产1，5-戊二胺的优势在于：
1、利用Crispr-Cas9技术敲除磷酸转移酶系统(PTS)ptsG、ptsH、ptsI、crr和glk基因编码的蛋白，实现L-赖氨酸不与1，5-戊二胺合成菌竞争葡萄糖，从而提高1，5-戊二胺的产量和减少副产物的生成。
2、目前1,5-戊二胺的代谢工程菌株发酵生产研究还处于起步阶段，相较于使用基因工程谷氨酸棒状杆菌，构建了能够利用L-赖氨酸高产1，5-戊二胺的大肠杆菌工程菌株E.coli BL-AST3。
3、混菌发酵方式对解除单一菌株的发酵瓶颈，在提高1，5-戊二胺的产量和产率方面具有显著的效果。相比于普通的E.coli BL-AST3单细胞发酵，1，5-戊二胺的摩尔收率提高了65％。
附图说明
图1为E.coli BL-AST3涉及相关质粒构建图谱；
图2为E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-AST3在OD600下OD接种比例优化情况；
图3为E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-AST3混菌培养初始葡萄糖和甘油的摩尔浓度比例优化情况；
图4为E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-AST3混菌培养的诱导温度优化情况。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
本实验中大肠杆菌MG1655，大肠杆菌Trans1-T1，大肠杆菌BL21(DE3)，B.subtilisNJ308质粒pTrc99a、pETDuet、pET28a、pET22b、pCWJ均为商业化物品，可以常规购买。
实施例1重组菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA的构建
以大肠杆菌MG1655全基因组为模板，选取第五引物
DapA-99a-F:cacacaggaaacagaccatgttcacgggaagtattgtcgc,
DapA-99a-R：cacacaggaaacagaccatgttcacgggaagtattgtcgc，
通过PCR复制大肠杆菌MG1655上的二氢吡啶甲酸合酶，得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段，再与载体pTrc99a连接，将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-pTrc99a-DapA并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。
将阳性菌株接种至5ml LB/Amp液体培养基，LB/Amp液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取质粒pTrc99a-DapA。取2μlpTrc99a-DapA质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂布在含有50mg/L氨苄青霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，得到重组菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA。实施例2E.coli BL-AST3葡萄糖代谢缺陷型菌株的构建
选取第一引物
PdxST-NcoI-F：catgccatggctcaaacaggtactgaacg，
PdxST-SalI-R：acgcgtcgacttatacaagtgccttttgcttatattcctcaacc，
通过PCR复制枯草芽孢杆菌(B.subtilis NJ308)pdxST基因，得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段，再与载体pTrc99A连接，将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-pTrc99A-pdxST并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。将阳性菌株接种至5ml LB/Amp液体培养基，LB/Amp液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取得到质粒pTrc99A-pdxST。
选取第二引物
CadB-BamHI-F：cgcggatcctatgagttctgccaagaagatcgg，
CadB-HindIII-ET-R：cccaagcttttaatgtgcgttagacg，
通过PCR复制大肠杆菌MG1655上赖氨酸/戊二胺双向转运蛋白基因(cadB),得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段，再与载体pETDuet连接，将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-pETDute-CadB并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。将阳性菌株接种至5ml LB/Amp液体培养基，LB/Amp液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取得到质粒pETDute-CadB；
选取第三引物
CadB-28a-BamHI-F：cgcggatccatgagttctgccaag，
CadA-28a-NotI-R：
agaatgcggccgcttagtggtggtggtggtggtgttttttgctttcttctttcaatacc，
通过PCR复制大肠杆菌MG1655上扩增cadBA操纵子，得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段，再与载体pET28a连接，将连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1。PCR筛选阳性菌株Trans1-T1-pET28a-CadBA并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。将阳性菌株接种至5ml LB/KanR液体培养基，LB/KanR液体培养基组成为蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。24小时后按照天根质粒提试剂盒操作说明提取得到质粒pET28a-CadBA；
将pET28a-CadBA和pET22b分别用BglII和BamHI双酶切，将pET28a-CadBA酶切产物中203bp片段替换为pET22b酶切产物中194bp的片段，从而构建得到质粒pET28a-pelB-CadBA；
选取第四引物
CadA-BamHI-pel-F：cgcggatcctatgaacgttattgca，
CadA-SacI-R：acgagctcttattttttgctttcttc，
通过PCR扩增cadA基因以及用第六引物
CadB-BamHI-ET-F：cgcggatcctatgagttctgccaag，
CadB-HindIII-ET-R：cccaagcttttaatgtgcgttagacg，
扩增cadB基因，cadA的扩增产物酶切连接至质粒pET22b，构建得到质粒pET22b-CadA；cadB的扩增产物连接至质粒pETDuet上，构建得到质粒pETDuet-CadB，而后将质粒pET22b-CadA的NotI和BglII酶切片段(pelB-cadA部分)克隆至质粒pETDuet-CadB的NotI–BglII位点间，构建得到质粒pETDuet-CadB-pelB-CadA。将质粒pCWJ-pdxST经NcoI和SalI酶切后，将包含pdxST编码区的片段克隆至质粒pCWJ上获得质粒pTrc99A-pdxST。
利用Crispr-Cas9编辑技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)的磷酸转移酶系统(PTS)ptsG、ptsH、ptsI、crr和glk基因编码的蛋白，得到葡萄糖代谢缺陷型菌株感受态细胞BL21(DE3)。各取2μl构建好的质粒pCWJ-pdxST和质粒pETDuet-pelB-CadB-CadA共同转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，并涂布在含有34mg/L氯霉素和50mg/L氨苄青霉素抗性的平板上，37℃过夜培养，即得E.coli BL-AST3葡萄糖代谢缺陷型菌株。
实施例3混菌发酵产1，5-戊二胺
将重组菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA的单菌落接种到含有50mg/L氨苄青霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，得到重组菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA的种子液；挑取重组菌株E.coli BL-AST31的单菌落接种到含有34mg/L氯霉素和50mg/L氨苄青霉素抗性的5mlLB摇管里，37℃培养6-8h后，得到重组菌株E.coli BL-AST3的种子液；
将E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-AST3细胞种子液在OD600条件下按照1:1至5：1比例添加(OD比例优化情况如图2所示，当E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-AST3的细胞OD比例关系为3：1时，其1，5-戊二胺产量最佳)，加入葡萄糖与甘油摩尔比例1:1至5：1(葡萄糖与甘油摩尔比例优化情况如图3所示，当葡萄糖和甘油的添加的摩尔比为4：1时，其1，5-戊二胺产量最佳)，培养至OD约为0.8后用终浓度为1‰的IPTG诱导,诱导温度为20℃～40℃(诱导温度优化情况如图4所示，当诱导温度为30℃时，其1，5-戊二胺产量最佳)时发酵生成1，5-戊二胺。(原始反应参数为E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-AST3细胞种子液OD比例为：2：1；葡萄糖与甘油摩尔比为2：1；IPTG诱导温度为30℃。每进行一个参数的优化实验时，其他的参数都是相同的。且本实施例中提及的优化手段均为本领域常规技术手段。
E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-AST3在细胞种子液OD比例为3：1，葡萄糖与甘油摩尔比为4：1，IPTG诱导温度为30℃的情况下发酵生产1，5-戊二胺情况相比于用E.coli BL-AST3单细胞利用L-赖氨酸发酵，降低了生产成本，1，5-戊二胺的摩尔收率提高了65％。
序列表
<110> 南京凯诺生物科技有限公司
<120> 一种葡萄糖代谢缺陷型菌株的构建方法及其混菌发酵产1，5-戊二胺
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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cacacaggaa acagaccatg ttcacgggaa gtattgtcgc 40
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cccaagcttt taatgtgcgt tagacg 26

Claims (6)

1.一种葡萄糖代谢缺陷型菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，选取第一引物，通过PCR复制枯草芽孢杆菌（B. subtilis NJ308）pdxST基因，再与质粒pTrc99A连接得到质粒pTrc99A-pdxST；选取第二引物，通过PCR复制大肠杆菌MG1655上赖氨酸/戊二胺双向转运蛋白基因（cadB）,再与载体pETDuet连接得到pETD-CadB；选取第三引物，通过PCR复制大肠杆菌MG1655上扩增cadBA操纵子，再与载体pET28a连接得到质粒pET28a-CadBA；将pET28a-CadBA和pET22b分别用BglII和BamHI双酶切，将pET28a-CadBA酶切产物中203bp片段替换为pET22b 酶切产物中194bp的片段，从而构建得到质粒pET28a-pelB-CadBA；选取第四引物，通过PCR扩增cadA基因以及用引物扩增cadB基因，cadA的扩增产物酶切连接至质粒pET22b，构建得到质粒pET22b-CadA；cadB的扩增产物连接至质粒pETDuet上，构建得到质粒pETDuet-CadB，而后将质粒pET22b-CadA的NotI和BglII酶切片段（pelB-cadA部分）克隆至质粒pETDuet-CadB的NotI–BglII位点间，构建得到质粒pETDuet-CadB-pelB-CadA，将质粒pTrc99A-pdxST经NcoI和SalI酶切后，将包含pdxST编码区的片段克隆至质粒pCWJ上获得质粒pCWJ-pdxST；
第二步，利用Crispr-Cas9编辑技术敲除大肠杆菌BL21（DE3）的磷酸转移酶系统(PTS) ptsG、ptsH、ptsI、crr和glk 基因编码的蛋白，将构建好的质粒pCWJ-pdxST和pETDuet-pelB-CadB-CadA共同转化至葡萄糖代谢缺陷型的BL21（DE3）的感受态中，即得E.coli BL-AST3葡萄糖代谢缺陷型菌株。
2.基于权利要求1所得E .coli BL-AST3葡萄糖代谢缺陷型菌株的混菌发酵产1，5-戊二胺，其特征在于，包括以下步骤，步骤1，构建重组菌株E .coli BL-pTrc99a-DapA；步骤2，选取重组菌株E.coli BL-pTrc99a-DapA和E.coli BL-AST3加入发酵培养基中，同时供给葡萄糖和甘油为碳源，培养至OD约为0.8后用终浓度为1‰的IPTG诱导，继续培养发酵生产1，5-戊二胺。
3.根据权利要求2所述的混菌发酵产1，5-戊二胺，其特征在于，步骤1中E .coli BL-pTrc99a-DapA构建方法为：选取第五引物，通过PCR复制大肠杆菌MG1655上的二氢吡啶甲酸合酶，再与载体pTrc99a连接，并转入克隆载体Trans1-T1，经过LB平板初筛后，挑点进行菌落PCR验证后测序。
4.根据权利要求2所述的混菌发酵产1，5-戊二胺，其特征在于，步骤2中所述将重组菌株E .coli BL-pTrc99a-DapA和E .coli BL-AST3的细胞OD比例关系为3：1。
5.根据权利要求2所述的混菌发酵产1，5-戊二胺，其特征在于，步骤2中所述葡萄糖和甘油的添加的摩尔比为4：1。
6.根据权利要求2所述的混菌发酵产1，5-戊二胺，其特征在于，步骤2中所述诱导温度为30℃。
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