CN116640711A - 重组大肠杆菌及其构建方法和应用以及生产β-丙氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，公开了重组大肠杆菌及其构建方法和应用以及生产β‑丙氨酸的方法，所述重组大肠杆菌含有同时过表达的细菌来源的L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶ADC的编码基因以及昆虫来源的L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶ADC的编码基因。该菌株能够利用价格低廉、简单易得的碳源进行发酵积累大量的β‑丙氨酸，反应条件温和、生产规模易放大，可有效减少碳排放，生产过程环保、温和，利于工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种重组大肠杆菌(Escherichia coli)、一种重组大肠杆菌的构建方法、所述构建方法构建得到的重组大肠杆菌、所述重组大肠杆菌在生产β-丙氨酸中的应用和一种生产β-丙氨酸的方法。
背景技术
β-丙氨酸(β-alanine，3-氨基丙酸C3H7NO2)，易溶于水，是自然界中唯一存在的β型氨基酸，它属于非蛋白氨基酸，可以用作多种高附加值药物的中间体，在医药食品化工等领域都有着广泛的应用。
目前在工业生产中，β-丙氨酸的主要合成方式包括丙烯酸氨化法、丙烯腈氨化法或β-氨基丙腈水解法，这些方法大多需要在高温、高压、强酸或强碱的条件下，而且产物纯化繁琐，存在环境污染问题。近年来越来越多的人开始研究酶转化法生产β-丙氨酸，CN109385415A利用突变后的天冬氨酸酶催化丙烯酸加氨反应得到β-丙氨酸，但也存在一些问题，如丙烯酸原料获得难度高、高浓度底物对菌的生长产生抑制、产物的产率较低、分离纯化的成本较高等。而微生物发酵法具有原料成本低，反应条件温和，容易实现大规模生产等优点。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在β-丙氨酸产量低等问题，提供一种重组大肠杆菌(Escherichia coli)及其构建方法，将所述重组大肠杆菌用于生产β-丙氨酸时能够获得高产量的β-丙氨酸，有利于β-丙氨酸的工业生产。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种重组大肠杆菌(Escherichiacoli)，所述重组大肠杆菌含有同时过表达的细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因以及昆虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因。
优选地，所述重组大肠杆菌中还过表达了PanD成熟因子的编码基因PanZ。
优选地，所述重组大肠杆菌还含有加强L-天冬氨酸积累的第一质粒。
本发明第二方面提供一种重组大肠杆菌的构建方法，该方法包括：向出发菌株中导入且同时过表达细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因以及昆虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因。
本发明第三方面提供如上所述的构建方法构建得到的重组大肠杆菌。
本发明第四方面提供如上所述的重组大肠杆菌在生产β-丙氨酸中的应用。
本发明第五方面提供一种生产β-丙氨酸的方法，该方法包括将如上所述的重组大肠杆菌接种到发酵培养基中进行发酵并生产β-丙氨酸。
与目前化学法和酶转化法生产β-丙氨酸相比，本发明构建了通过生物发酵法生产β-丙氨酸的微生物菌株，重组菌株首次将细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶的编码基因和昆虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶编码基因同时过表达，高效表达β-丙氨酸合成代谢途径；进一步优选过表达了PanD成熟因子的编码基因PanZ，还加强了L-天冬氨酸的代谢流，这使得构建的重组微生物菌株可以利用价格低廉、简单易得的碳源进行发酵积累大量的β-丙氨酸，反应条件温和、生产规模易放大，可有效减少碳排放，生产过程环保、温和，利于工业化生产。利用本发明的方法所构建的重组大肠杆菌，摇瓶水平利用葡萄糖发酵β-丙氨酸，其产量可高达27.012g/L，而未经本发明的方法改造的大肠杆菌β-丙氨酸的产量仅为0.004g/L。
而且本发明的菌株的构建过程无需复杂的基因敲除、敲降即可完成，便于构建。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供一种重组大肠杆菌(Escherichia coli)，所述重组大肠杆菌含有同时过表达的细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因以及昆虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因。
在本发明中，所述细菌来源的ADC可以来自于现有常见的细菌，优选地，所述细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC来自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，优选为来自枯草芽孢杆菌的BsADC(GenBank:NP_390122)。
优选地，BsADC的编码基因BsPanD的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
优选地，所述昆虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC为来自赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)的TcADC(GenBank:NP_001096055.1)。
优选地，TcADC的编码基因TcPanD的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC为来自枯草芽孢杆菌的BsADC，所述昆虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC为来自赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的TcADC。
优选地，所述重组大肠杆菌中还过表达了PanD成熟因子的编码基因PanZ。
优选地，所述PanZ为来自大肠杆菌的EcPanZ(GenBank:NP_417916)。
优选地，EcPanZ的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因、昆虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC编码基因以及PanD成熟因子的编码基因可以以本领域常规的方式存在于所述重组大肠杆菌中，比如可以存在于同一个或者不同的质粒中，优选地，所述细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因、昆虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC编码基因以及PanD成熟因子的编码基因存在于所述重组大肠杆菌的第二质粒中。
优选地，所述第二质粒中，BsPanD和EcPanZ串联表达，共用一个启动子和一个终止子。
优选地，所述第二质粒中，TcPanD单独使用一个启动子和一个终止子。
优选地，所述重组大肠杆菌还含有加强L-天冬氨酸积累的第一质粒。
优选地，所述第一质粒同时过表达了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶PEPC、L-天冬氨酸氨基转移酶AspC/AspB和天冬氨酸酶AspA的编码基因。
优选地，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、L-天冬氨酸氨基转移酶和天冬氨酸酶各自独立地选自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
优选地，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶为来自大肠杆菌的EcPPC(GenBank:NP_418391)。优选地，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，L-天冬氨酸氨基转移酶为来自谷氨酸棒杆菌的CgAspB(GenBank:CAF18811.1)。优选地，L-天冬氨酸氨基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地，天冬氨酸酶为来自枯草芽孢杆菌的BsAspA(GenBank:NP_390238)。优选地，天冬氨酸酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述第一质粒中，EcPPC的编码基因和CgAspB的编码基因串联表达，共用一个启动子和一个终止子。
优选地，所述第一质粒中，AspA的编码基因单独使用一个启动子和一个终止子。
优选地，第一质粒和第二质粒中基因过表达所使用的启动子各自独立地为强启动子。优选地，所述强启动子为Plac启动子、Ptac启动子或Ptrc启动子。
优选地，所述第一质粒和第二质粒中基因过表达所使用的终止子各自独立地为强终止子。优选地，所述强终止子为rrnB终止子或T7终止子。
所述第一质粒和第二质粒的骨架可以为本领域常规的骨架，通常它们携带不同的复制起始位点及不同的抗性基因，如pUC18/19、pBR322、pSTV28、pACYC184等。优选地，所述第一质粒和第二质粒的骨架各自独立地为pUC18/19、pBR322、pSTV28或pACYC184。优选地，所述第一质粒和第二质粒的骨架在大肠杆菌中能够独立复制且兼容。
优选地，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌标准菌株ATCC8739为出发菌株。
在上述优选的条件下，能够进一步提高重组大肠杆菌产β-丙氨酸的性能。
本发明第二方面提供一种重组大肠杆菌的构建方法，该方法包括：向出发菌株中转入且同时过表达细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因以及昆虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因。
优选地，所述出发菌株为大肠杆菌标准菌株ATCC8739。
在本发明中，转入出发菌株的基因可以通过分别插入到载体中从而构建表达相应蛋白的重组载体，然后再将构建的重组表达载体转化到出发菌株中，从而获得本发明的重组大肠杆菌。关于载体的构建和转入可以为本领域常规的方法，在此不再赘述。
优选地，所述过表达细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因以及昆虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因以第二质粒的形式转入所述出发菌株中。
优选地，该方法包括：向出发菌株中导入加强L-天冬氨酸积累的第一质粒。
优选地，所述第一质粒同时过表达了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶PEPC、L-天冬氨酸氨基转移酶AspC/AspB和天冬氨酸酶AspA的编码基因。
关于所述基因以及其他相关的内容均参见第一方面，在此不再赘述。
为了得到稳定表达目的基因的大肠杆菌阳性克隆，所述方法优选还包括对转入重组载体(第二质粒和可选的第一质粒)后的大肠杆菌进行筛选的步骤，所述筛选步骤可以按照本领域常规的方法进行，例如，可以先将转化后的大肠杆菌涂布于含有Ampr和Cmr的LB平板上进行单菌落菌株的培养，转化有重组载体的大肠杆菌能够获得Ampr和Cmr抗性，从而通过该步骤的筛选可得到转化有重组载体的大肠杆菌阳性克隆，也即，本发明所述的重组大肠杆菌。
本发明第三方面提供如上所述的构建方法构建得到的重组大肠杆菌。
本发明第四方面提供如上所述的重组大肠杆菌在生产β-丙氨酸中的应用。
本发明第五方面提供一种生产β-丙氨酸的方法，该方法包括将如上所述的重组大肠杆菌接种到发酵培养基中进行发酵并生产β-丙氨酸。
所述大肠杆菌可以以种子液的形式接种，所述种子液可以以本领域常规的方式制备，比如可以将重组大肠杆菌的菌株接种到添加了对应抗生素的LB液体培养基中，在36-38℃条件下培养12-30h，得到种子液。得到的种子液可以用于发酵，发酵可以在摇瓶或发酵罐中进行，本领域技术人员可以根据情况选择是否进行扩培。
所述种子液的接种量可以在较宽的范围内选择，优选为1-10体积％。
优选地，所述发酵的方式包括将重组大肠杆菌的种子液接种到发酵培养基中，并在35-39℃条件下培养至对数期(OD600优选为4-6)，然后在28-32℃以及IPTG(也即，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的存在下进行诱导培养并生产β-丙氨酸。
其中，IPTG的终浓度优选为0.1-1mM。
优选地，所述诱导培养的时间为40-80h。
优选地，所述发酵培养基包含40-80g/L葡萄糖，10-20g/L(NH4)2SO4，0.2-1g/LKCl，0.5-2g/L MgSO4·7H2O，0.5-1.5mM甜菜碱，0.01-0.1g/L FeSO4·7H2O，0.01-0.1g/LMnSO4·H2O，1-10g/L CaCO3，0.01-1mM CaCl2。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不应限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和分数按重量计算。
本发明实施例中所用的实验材料如无特殊说明均可从市售渠道获得。
抗生素简写及使用浓度：Ampr:氨苄青霉素，如无特殊说明，使用浓度为100mg/L。Cmr:氯霉素，如无特殊说明，使用浓度为25mg/L。
本发明中，以下实施例涉及的方法具体如下：
β-丙氨酸检测方法：
发酵液预处理方法：发酵液样品10000r/min离心2min，取上清液加入等体积10％(m/v)三氯乙酸，避光放置3h以上，稀释后用0.45μm滤膜过膜。
利用邻苯二甲醛(OPA)试剂在线衍生β-丙氨酸，用高效液相色谱(HPLC)分析β-丙氨酸的含量。色谱柱为Diamonsil C18柱(250cm×4.6mm，5μm)，流动相A配法为：先将4.52g无水醋酸钠(分析纯)溶于水，再加三乙胺200μL，四氢呋喃5mL，用水定容至1L，再用醋酸调节pH＝7.2；流动相B配法为：先将4.52g无水醋酸钠溶于水，然后定容至200mL，用醋酸调节pH＝7.2，再加400mL甲醇和400mL乙腈。采用梯度洗脱：0-27min，流动相B由8％上升到60％，流速为1mL/min；27-31.5min，流动相B由60％上升到100％，流速为1mL/min；31.5-34min，流动相B梯度不变，流速为1.2mL/min。34-35min，流动相B由100％下降到8％，流速为1mL/min。柱温为40℃，检测波长为338nm；进样量为10μL。
其中，本发明和以下实施例中使用的菌株和质粒见表1，引物信息见表2。
表1
表2
实施例1
本实施例用于说明第一质粒模块的构建。
以pBR322质粒为模板，利用引物pBR322M-F(SEQ ID NO:7)/pBR322M-R(SEQ IDNO:8)组合进行扩增，PCR产物清洁后，利用DpnI进行单酶切消化后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布至LB+Ampr的固体平板上，37℃培养过夜，在长出的转化子中随机挑取3个单克隆进行测序验证，得到质粒pBR322M质粒。
以质粒pUC57质粒作为模板，利用引物pBR322M-Pl-F(SEQ ID NO:9)/Plac-R(SEQID NO:10)组合扩增得到Plac的DNA片段；以大肠杆菌标准菌株ATCC8739细胞作为模板，利用引物Plac-Ecppc-F(SEQ ID NO:11)/CgAspB-Ecppc-R(SEQ ID NO:12)进行扩增，得到大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PPC编码基因Ecppc片段；以谷氨酸棒杆菌ATCC13032菌株细胞作为模板，利用引物Ecppc-CgAspB-F(SEQ ID NO:13)/T7t-CgAspB-R(SEQ ID NO:14)组合进行扩增，得到谷氨酸棒杆菌来源的天冬氨酸氨基转移酶AspB编码基因CgaspB及T7终止子序列CgaspB-T7t；Plac、Ecppc和CgaspB-T7t片段各取1μl作为模板，利用引物pBR322M-Pl-F(SEQ ID NO:9)/T7t-CgAspB-R(SEQ ID NO:14)组合进行融合PCR，得到Plac-Ecppc-CgaspB-T7t片段。利用HindIII和XbaI对pBR322M质粒骨架进行双酶切，PCR清洁试剂盒进行清洁获得双酶切线性化的质粒骨架。利用ClonExpress II One Step Cloning Kit(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)一步法连接试剂盒对HindIII和XbaI双酶切线性化的pBR322M质粒骨架和Plac-Ecppc-CgaspB-T7t片段进行连接，转化至大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，涂布至LB+Ampr的固体平板上，37℃培养过夜，对长出的转化子进行PCR验证，并将阳性转化子在LB+Ampr的试管中摇菌过夜，抽提质粒利用HindIII和XbaI双酶切验证，得到pBR322M-Plac-Ecppc-CgaspB-T7t质粒。
进一步，以pBR322M-Plac-Ecppc-CgaspB-T7t质粒作为出发质粒，利用XbaI进行单酶切后，PCR清洁试剂盒清洁获得单酶切线性化的质粒骨架。以pUC57质粒作为模板，利用引物T7t-Plac-F(SEQ ID NO:15)/Plac-R(SEQ ID NO:10)组合进行扩增，得到Plac启动子(T7t-)Plac片段；以枯草芽孢杆菌WB600菌株细胞作为模板，利用引物Plac-BsAspA-F(SEQID NO:16)/T7t-BsAspA-R(SEQ ID NO:17)进行扩增，得到枯草芽孢杆菌来源的L-天冬氨酸酶AspA编码基因BsaspA及T7终止子序列BsaspA-T7t。(T7t-)Plac片段和BsaspA-T7t各取1μL作为模板，利用引物T7t-Plac-F(SEQ ID NO:15)/T7t-BsAspA-R(SEQ ID NO:17)组合进行融合PCR，得到(T7t-)Plac-BsaspA-T7t片段。利用ClonExpress II One Step Cloning Kit一步法连接试剂盒对XbaI单酶切线性化的pBR322M-Plac-Ecppc-CgaspB-T7t质粒骨架和(T7t-)Plac-BsaspA-T7t片段进行连接，转化至大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，涂布至LB+Ampr的固体平板上，37℃培养过夜，对长出的转化子进行PCR验证，并将阳性转化子在LB+Ampr的试管中摇菌过夜，抽提质粒利用XbaI单酶切验证，得到pBR322M-Plac-Ecppc-CgaspB-T7t-Plac-BsaspA-T7t质粒，为第一质粒模块。
实施例2
本实施例用于说明第二质粒模块的构建。
(1)pSTV28-Plac-BspanD-rrnBT质粒的构建
以pSTV28质粒作为出发质粒，利用HindIII/SacI进行双酶切，获得线性化质粒骨架。以pUC57质粒作为模板，利用引物HindIII-Plac-F(SEQ ID NO:18)/Plac-R(SEQ ID NO:10)组合进行扩增，得到(HindIII)Plac片段；以枯草芽孢杆菌WB600菌株细胞作为模板，利用引物Plac-BsPanD-F(SEQ ID NO:19)/BsPanD-R(SEQ ID NO:20)组合进行扩增，得到枯草芽孢杆菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶BsPanD的编码基因BspanD片段；以质粒pkk223-3作为模板，利用引物rrnBT1-F(SEQ ID NO:21)/SacI-rrnBT2-R(SEQ ID NO:22)组合进行扩增，得到rrnB终止子片段rrnBT(SacI)。(HindIII)-Plac片段、BspanD片段和rrnBT(SacI)片段各取1μl作为模板，利用引物HindIII-Plac-F(SEQ ID NO:18)/SacI-rrnBT2-R(SEQ IDNO:22)组合进行融合PCR扩增，得到(HindIII)-Plac-BspanD-rrnBT片段。利用ClonExpressII One Step Cloning Kit一步法连接试剂盒对HindIII/SacI进行双酶切线性化的pSTV28质粒骨架和(HindIII)-Plac-BspanD-rrnBT片段进行连接，转化至大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，涂布至LB+Cmr的固体平板上，37℃培养过夜，对长出的转化子进行PCR验证，并将阳性转化子在LB+Cmr的试管中摇菌过夜，抽提质粒利用HindII/SacI双酶切验证，得到pSTV28-Plac-BspanD-rrnBT质粒，为第一种第二质粒模块。
(2)pSTV28-Plac-BspanD-EcpanZ-rrnBT的构建
以pSTV28-Plac-BspanD-rrnBT质粒作为出发质粒，利用KpnI进行单酶切线性化，得到KpnI单酶切线性化的质粒骨架；以大肠杆菌标准菌株ATCC8739细胞作为模板，利用引物EcPanZ-F(SEQ ID NO:23)/EcPanZ-R(SEQ ID NO:24)组合进行扩增，得到大肠杆菌来源的PanD成熟因子PanZ蛋白的编码基因EcpanZ片段。利用ClonExpress II One StepCloning Kit一步法连接试剂盒对KpnI单酶切线性化的pSTV28-Plac-BspanD-rrnBT质粒骨架和EcpanZ片段进行连接，转化至大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，涂布至LB+Cmr的固体平板上，37℃培养过夜，对长出的转化子进行PCR验证，并将阳性转化子在LB+Cmr的试管中摇菌过夜，抽提质粒利用KpnI单酶切验证，得到
pSTV28-Plac-BspanD-EcpanZ-rrnBT质粒，为第二种第二质粒模块。
(3)pSTV28-Plac-TcPanD-rrnBT-Plac-BspanD-EcpanZ-rrnBT质粒的构建
以pSTV28-Plac-BspanD-EcpanZ-rrnBT质粒作为出发质粒，利用HindIII进行单酶切线性化，得到HindIII单酶切线性化的质粒骨架。将昆虫赤拟谷盗来源L-天冬氨酸-α-脱羧酶TcADC编码基因委托苏州金唯智生物科技有限公司进行合成，按其基因序列按照大肠杆菌的密码子偏好性进行优化，优化后的TcADC基因如SEQ ID NO:6所示。基因合成后克隆至pUC-GW骨架上，返回pUC-GW-TcPanD质粒，以pUC-GW-TcPanD质粒作为模板，利用引物TcPanD-F(SEQ ID NO:25)/TcPanD-R(SEQ ID NO:26)组合进行扩增，得到TcPanD基因片段。以质粒pkk223-3作为模板，利用引物rrnBT1-F(SEQ ID NO:21)/HindIII-rrnBT2-R(SEQ IDNO:27)组合进行扩增，得到rrnB终止子片段rrnBT(HindIII)。(HindIII)-Plac片段、TcPanD片段以及rrnBT(HindIII)片段各取1μL作为模板，利用
HindIII-Plac-F(SEQ ID NO:18)/HindIII-rrnBT2-R(SEQ ID NO:27)进行融合PCR扩增，得到(HindIII)Plac-TcPanD-rrnBT(HindIII)片段，利用ClonExpress II OneStep Cloning Kit一步法连接试剂盒对HindIII单酶切线性化的pSTV28-Plac-BspanD-EcpanZ-rrnBT质粒骨架和(HindIII)Plac-TcPanD-rrnBT(HindIII)片段进行连接，转化至大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，涂布至LB+Cmr的固体平板上，37℃培养过夜，对长出的转化子进行PCR验证，并将阳性转化子在LB+Cmr的试管中摇菌过夜，抽提质粒利用HindIII单酶切验证，得到pSTV28-Plac-TcPanD-rrnBT-Plac-BspanD-EcpanZ-rrnBT质粒，为第三种第二质粒模块。
(4)pSTV28-Plac-EcpanD-EcpanZ-rrnBT质粒的构建
以pSTV28-Plac-BspanD-EcpanZ-rrnBT质粒作为模板，利用引物Plac-R(SEQ IDNO:10)和pSTV-KpnI-EcPanZ-R(SEQ ID NO:28)，得到线性化质粒骨架；以大肠杆菌ATCC8739细胞作为模板，利用引物plac-EcPanD-F(SEQ ID NO:29)和KpnI-EcPanD-R(SEQID NO:30)组合进行PCR扩增，得到EcPanD片段，利用ClonExpress II One Step CloningKit一步法连接试剂盒对线性化的质粒骨架和EcpanD片段进行连接，转化至大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，涂布至LB+Cmr的固体平板上，37℃培养过夜，对长出的转化子进行PCR验证，并将阳性转化子在LB+Cmr的试管中摇菌过夜，抽提质粒，得到
pSTV28-Plac-EcpanD-EcpanZ-rrnBT质粒，为第四种第二质粒模块。
(5)pSTV28-Plac-TcPanD-rrnBT-Plac-EcpanD-EcpanZ-rrnBT质粒的构建
以第四种第二质粒模块pSTV28-Plac-EcpanD-EcpanZ-rrnBT质粒作为出发质粒，利用HindIII进行单酶切线性化，得到HindIII单酶切线性化的质粒骨架。利用ClonExpressII One Step Cloning Kit一步法连接试剂盒对HindIII单酶切线性化的pSTV28-Plac-EcpanD-EcpanZ-rrnBT质粒骨架和(HindIII)Plac-TcPanD-rrnBT(HindIII)片段进行连接，转化至大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，涂布至LB+Cmr的固体平板上，37℃培养过夜，对长出的转化子进行PCR验证，并将阳性转化子在LB+Cmr的试管中摇菌过夜，抽提质粒利用HindIII单酶切验证，得到
pSTV28-Plac-TcPanD-rrnBT-Plac-EcpanD-EcpanZ-rrnBT质粒，为第五种第二质粒模块。
(6)pSTV28-Plac-TcPanD-rrnBT质粒的构建
以pSTV28质粒作为出发质粒，利用HindIII/SacI进行双酶切，获得线性化质粒骨架。以实施例2中制备好的(HindIII)-Plac片段、TcPanD片段以及rrnBT(SacI)片段各取1μL作为模板，利用HindIII-Plac-F(SEQ ID NO:18)/SacI-rrnBT2-R(SEQ ID NO:22)进行融合PCR扩增，得到(HindIII)Plac-TcPanD-rrnBT(SacI)片段，利用ClonExpress II One StepCloning Kit一步法连接试剂盒对HindIII/SacI单酶切线性化的pSTV28质粒骨架和(HindIII)Plac-TcPanD-rrnBT(SacI)片段进行连接，转化至大肠杆菌DH 5α感受态细胞中，涂布至LB+Cmr的固体平板上，37℃培养过夜，对长出的转化子进行PCR验证，并将阳性转化子在LB+Cmr的试管中摇菌过夜，抽提质粒利用HindIII/SacI双酶切验证，得到pSTV28-Plac-TcPanD-rrnBT质粒，为第六种第二质粒模块。
实施例3
本实施例用于说明重组大肠杆菌菌株的构建。
将实施例1制备的第一质粒模块和实施例2制备的六种第二质粒模块组合转化至大肠杆菌ATCC8739菌株的感受态细胞中，涂布于LB+Ampr+Cmr的抗性平板上，于37℃培养24小时，对长出的单克隆进行PCR验证，验证正确的克隆即为得到的各重组大肠杆菌菌株，组合方式如表3所示。
实施例4
本实施例用于说明各重组大肠杆菌菌株摇瓶发酵生产β-丙氨酸的性能评价。
对实施例3得到的各重组菌株进行种子和摇瓶发酵培养，以大肠杆菌标准菌株ATCC8739作为对照，首先随机挑取对照菌株和重组菌株的各三个单克隆至添加了对应抗生素的5ml LB培养基液体试管中，于37℃，170rpm摇菌培养24小时；进一步按5体积％的比例转接至500ml挡板摇瓶中的50ml发酵培养基中，于37℃，170rpm摇菌培养至OD600为5，加入终浓度为0.1mM的IPTG诱导并将温度降低至30℃继续培养至72小时。其中，发酵培养基组成为：60g/L葡萄糖，15g/L(NH4)2SO4，0.6g/L KCl，1.0g/L MgSO4·7H2O，1mM甜菜碱，0.05g/LFeSO4·7H2O，0.05g/L MnSO4·H2O，5g/L CaCO3，0.5mM CaCl2。
表3示出了重组菌株的质粒组合方式及各重组菌株摇瓶发酵生产β-丙氨酸的产量。从表3的结果可以看出，对照ATCC8739菌株的β-丙氨酸积累量只有0.004g/L的低水平；将第一质粒模块转化至ATCC8739菌株之后对β-丙氨酸的积累有一些帮助，但重组菌株CBA的β-丙氨酸积累量整体水平仍然较低，只有0.249g/L，说明虽然通过第一质粒模块的导入帮助了L-天冬氨酸的积累，但后续可能是由于将L-天冬氨酸转化为β-丙氨酸的代谢流受限，所以β-丙氨酸的产量无法提升至很高。
在CBA的基础上转入六种不同的第二质粒得到了CBAD、CBADZ、CBADZT、CBAEZ、CBAEZT和CBAT六种重组菌株，摇瓶发酵水平β-丙氨酸的积累量分别达到6.427g/L、15.655g/L、27.012g/L、6.223g/L、16.565g/L和7.442g/L。由此可以看出，相比于大肠杆菌来源的EcPanD(结合PanZ蛋白表达)，在加强了L-天冬氨酸代谢强度的菌株CBA基础上过表达枯草芽孢杆菌来源的BsPanD或赤拟谷盗来源的TcPanD可以有效促进代谢流从L-天冬氨酸流向β-丙氨酸；而进一步过表达大肠自身的EcPanZ蛋白编码基因的重组菌株又可以进一步提高β-丙氨酸的产量。另外，从表3还可以看出当CBADZT重组菌株同时过表达了TcPanD和BspanD之后，可以大幅度提高β-丙氨酸的积累量，达到了27.012g/L，转化率达到0.45g/g葡萄糖，具备放大的潜力(而含EcpanD的CBAEZT效果较差)。
表3
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID NO:1大肠杆菌Escherichia coli来源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶EcPPC核苷酸序列，2652bp
atgaacgaacaatattccgcattgcgtagtaatgtcagtatgctcggcaaagtgctgggagaaaccatcaaggatgcgttgggagaacacattcttgaacgcgtagaaactatccgtaagttgtcgaaatcttcacgcgctggcaatgatgctaaccgccaggagttgctcaccaccttacaaaatttgtcgaacgacgagctgctgcccgttgcgcgtgcgtttagtcagttcctgaacctggccaacaccgccgagcaataccacagcatttcgccgaaaggcgaagctgccagcaacccggaagtgatcgcccgcaccctgcgtaaactgaaaaaccagccggaactgagcgaagacaccatcaaaaaagcagtggaatcgctgtcgctggaactggtcctcacggctcacccaaccgaaattacccgtcgtacactgatccacaaaatggtggaagtgaacgcctgtttaaaacagctcgataacaaagatatcgctgactacgaacacaaccagctgatgcgtcgcctgcgccagttgatcgcccagtcatggcataccgatgaaatccgtaagctgcgtccaagcccggtagatgaagccaaatggggctttgccgtagtggaaaacagcctgtggcaaggcgtaccaaattacctgcgcgaactgaacgaacaactggaagagaacctcggctacaaactgcccgtcgaatttgttccggtccgttttacttcgtggatgggcggcgaccgcgacggcaacccgaacgtcactgccgatatcacccgccacgtcctgctactcagccgctggaaagccaccgatttgttcctgaaagatattcaggtgctggtttctgaactgtcgatggttgaagcgacccctgaactgctggcgctggttggcgaagaaggtgccgcagaaccgtatcgctatctgatgaaaaacctgcgttctcgcctgatggcgacacaggcatggctggaagcgcgcctgaaaggcgaagaactgccaaaaccagaaggcctgctgacacaaaacgaagaactgtgggaaccgctctacgcttgctaccagtcacttcaggcgtgtggcatgggtattatcgccaacggcgatctgctcgacaccctgcgccgcgtgaaatgtttcggcgtaccgctggtccgtattgatatccgtcaggagagcacgcgtcataccgaagcgctgggcgagctgacccgctacctcggtatcggcgactacgaaagctggtcagaggccgacaaacaggcgttcctgatccgcgaactgaactccaaacgtccgcttctgccgcgcaactggcaaccaagcgccgaaacgcgcgaagtgctcgatacctgccaggtgattgccgaagcaccgcaaggctccattgccgcctacgtgatctcgatggcgaaaacgccgtccgacgtactggctgtccacctgctgctgaaagaagcgggtatcgggtttgcgatgccggttgctccgctgtttgaaaccctcgatgatctgaacaacgccaacgatgtcatgacccagctgctcaatattgactggtatcgtggcctgattcagggcaaacagatggtgatgattggctattccgactcagcaaaagatgcgggagtgatggcagcttcctgggcgcaatatcaggcacaggatgcattaatcaaaacctgcgaaaaagcgggtattgagctgacgttgttccacggtcgcggcggttccattggtcgcggcggcgcacctgctcatgcggcgctgctgtcacaaccgccaggaagcctgaaaggcggcctgcgcgtaaccgaacagggcgagatgatccgctttaaatatggtctgccagaaatcaccgtcagcagcctgtcgctttataccggggcgattctggaagccaacctgctgccaccgccggagccgaaagagagctggcgtcgcattatggatgaactgtcagtcatctcctgcgatgtctaccgcggctacgtacgtgaaaacaaagattttgtgccttacttccgctccgctacgccggaacaagaactgggcaaactgccgttgggttcacgtccggcgaaacgtcgcccaaccggcggcgtcgagtcactacgcgccattccgtggatcttcgcctggacgcaaaaccgtctgatgctccccgcctggctgggtgcaggtacggcgctgcaaaaagtggtcgaagacggcaaacagagcgagctggaggctatgtgccgcgattggccattcttctcgacgcgtctcggcatgctggagatggtcttcgccaaagcagacctgtggctggcggaatactatgaccaacgcctggtagacaaagcactgtggccgttaggtaaagagttacgcaacctgcaagaagaagacatcaaagtggtgctggcgattgccaacgattcccatctgatggccgatctgccgtggattgcagagtctattcagctacggaatatttacaccgacccgctgaacgtattgcaggccgagttgctgcaccgctcccgccaggcagaaaaagaaggccaggaaccggatcctcgcgtcgaacaagcgttaatggtcactattgccgggattgcggcaggtatgcgtaataccggctaa
SEQ ID NO:2谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum来源的L-天冬氨酸氨基转移酶CgAspB的核苷酸序列，1281bp
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SEQ ID NO:3枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis来源的天冬氨酸酶BsAspA的核苷酸序列，1428bp
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SEQ ID NO:4枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶BsPanD的核苷酸序列，384bp
atgtatcgaacaatgatgagcggcaaacttcacagggcaactgttacggaagcaaacctgaactatgtgggaagcattacaattgatgaagatctcattgatgctgtgggaatgcttcctaatgaaaaagtacaaattgtgaataataataatggagcacgtcttgaaacgtatattattcctggtaaacggggaagcggcgtcatatgcttaaacggtgcagccgcacgccttgtgcaggaaggagataaggtcattattatttcctacaaaatgatgtctgatcaagaagcggcaagccatgagccgaaagtggctgttctgaatgatcaaaacaaaattgaacaaatgctggggaacgaaccagcccgtacaattttgtag
SEQ ID NO:5大肠杆菌Escherichia coli来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC成熟因子EcPanZ的核苷酸序列，384bp
atgaagctgaccatcattcgattagaaaaatttagcgaccaagaccggattgacctgcaaaagatctggccggagtattccccttcctcgttacaggttgacgataaccaccgtatctacgccgcgcgttttaacgagcgcctgctcgctgccgtgcgggtaaccttaagcggcaccgagggagcactggattccctgcgcgtgcgggaagtcacccgccgtcgcggtgtggggcaatatctgctggaagaggttttgcgtaacaatcctggcgtttcatgctggtggatggcggatgcaggcgtggaagatcgcggtgtgatgacggcgtttatgcaggcgctggggtttacggcacaacagggcggctgggagaagtgttaa
SEQ ID NO:6赤拟谷盗Tribolium castaneum来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶TcADC的核苷酸序列，按照大肠杆菌的密码子偏好性进行优化，1623bp
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Claims (10)
1.一种重组大肠杆菌(Escherichia coli)，其特征在于，所述重组大肠杆菌含有同时过表达的细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因以及昆虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其中，所述细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC来自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，优选为来自枯草芽孢杆菌的BsADC；优选地，BsADC的编码基因BsPanD的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；和/或
所述昆虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC为来自赤拟谷盗(Triboliumcastaneum)的TcADC；优选地，TcADC的编码基因TcPanD的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组大肠杆菌，其中，所述重组大肠杆菌中还过表达了PanD成熟因子的编码基因PanZ；
优选地，所述PanZ为来自大肠杆菌的EcPanZ；更优选地，EcPanZ的核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示；
优选地，所述细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因、昆虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC编码基因以及PanD成熟因子的编码基因存在于所述重组大肠杆菌的第二质粒中；
更优选地，所述第二质粒中，BsPanD和EcPanZ串联表达，共用一个启动子和一个终止子；TcPanD单独使用一个启动子和一个终止子。
4.根据权利要求1-3中任意一种所述的重组大肠杆菌，其中，所述重组大肠杆菌还含有加强L-天冬氨酸积累的第一质粒；
优选地，所述第一质粒同时过表达了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶PEPC、L-天冬氨酸氨基转移酶AspC/AspB和天冬氨酸酶AspA的编码基因；
优选地，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、L-天冬氨酸氨基转移酶和天冬氨酸酶各自独立地选自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)；
更优选地，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶为来自大肠杆菌的EcPPC，进一步优选地，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
更优选地，L-天冬氨酸氨基转移酶为来自谷氨酸棒杆菌的CgAspB，进一步优选地，L-天冬氨酸氨基转移酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
更优选地，天冬氨酸酶为来自枯草芽孢杆菌的BsAspA，进一步优选地，天冬氨酸酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
进一步优选地，所述第一质粒中，EcPPC的编码基因和CgAspB的编码基因串联表达，共用一个启动子和一个终止子，AspA的编码基因单独使用一个启动子和一个终止子。
5.根据权利要求1-4中任意一种所述的重组大肠杆菌，其中，第一质粒和第二质粒中基因过表达所使用的启动子各自独立地为强启动子，优选地，所述强启动子为Plac启动子、Ptac启动子或Ptrc启动子；和/或
所述第一质粒和第二质粒中基因过表达所使用的终止子各自独立地为强终止子；优选地，所述强终止子为rrnB终止子或T7终止子；和/或
所述第一质粒和第二质粒的骨架各自独立地为pUC18/19、PBR322、PSTV28或pACYC184；优选地，所述第一质粒和第二质粒的骨架在大肠杆菌中能够独立复制且兼容。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的重组大肠杆菌，其中，所述重组大肠杆菌以大肠杆菌标准菌株ATCC8739为出发菌株。
7.一种重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，该方法包括：向出发菌株中导入且同时过表达细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因以及昆虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因；
优选地，所述出发菌株为大肠杆菌标准菌株ATCC8739；
优选地，所述过表达细菌来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因以及昆虫来源的L-天冬氨酸-α-脱羧酶ADC的编码基因以第二质粒的形式转入所述出发菌株中；
优选地，该方法包括：向出发菌株中导入加强L-天冬氨酸积累的第一质粒；
更优选地，所述第一质粒同时过表达了磷酸烯醇丙酮酸羧化酶PEPC、L-天冬氨酸氨基转移酶AspC/AspB和天冬氨酸酶AspA的编码基因。
8.权利要求7所述的构建方法构建得到的重组大肠杆菌。
9.权利要求1-6和8中任意一项所述的重组大肠杆菌在生产β-丙氨酸中的应用。
10.一种生产β-丙氨酸的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求1-6和8中任意一项所述的重组大肠杆菌接种到发酵培养基中进行发酵并生产β-丙氨酸；
优选地，所述发酵的方式包括将重组大肠杆菌的种子液接种到发酵培养基中，并在35-39℃条件下培养至对数期，然后在28-32℃以及IPTG的存在下进行诱导培养并生产β-丙氨酸。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN202310381712.1A CN116640711A (zh) | 2023-04-11 | 2023-04-11 | 重组大肠杆菌及其构建方法和应用以及生产β-丙氨酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (1)
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Citations (3)
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-
2023
- 2023-04-11 CN CN202310381712.1A patent/CN116640711A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LEI WANG等: "Enhanced production of β-alanine through co-expressing two different subtypes of L-aspartate-α-decarboxylase", J IND MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 47, no. 6, 1 July 2020 (2020-07-01), pages 1 - 2 * |
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