CN118006651A - 一种合成苯酚的重组大肠杆菌的构建及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种合成苯酚的的重组大肠杆菌的构建及应用。以枯草芽孢杆菌为来源复制对羟基苯甲酸脱羧酶基因，并添加RBS序列加强该酶的表达，构建出苯酚合成路径；以大肠杆菌MG1655为来源，复制分支酸裂解酶基因并过表达以加强分支酸向苯酚前体的转化效率；以大肠杆菌MG1655为来源复制3‑磷酸莽草酸1‑羧乙烯基转移酶基因和莽草酸激酶基因并过表达，以增强莽草酸代谢途径，从而促进底物3‑脱氢莽草酸的消耗；最后将两个重组质粒转入大肠杆菌中，通过培养重组菌株进行合成苯酚的应用。本发明重组菌株生长良好，基因表达稳定，重组菌经破碎后得到的粗酶液有着良好的表达，并且可以实现催化3‑脱氢莽草酸合成苯酚，产量达131.5 mg/L。

Description

一种合成苯酚的重组大肠杆菌的构建及其应用
技术领域
本发明属于菌株代谢改造领域，具体涉及一种合成苯酚的重组大肠杆菌的构建及其应用。
背景技术
苯酚（英文：Phenol或phenyl hydroxide，俗称：石炭酸，carbolic acid），分子式为C6H6O，主要由异丙苯经氧化分解制得，是重要的有机化工原料，可用于生产酚醛树脂、双酚A等多种化工产品和中间体，也可用作溶剂、消毒剂。作为重要的商品化学品，苯酚具有公认的工业价值和巨大的全球市场。目前，苯酚生产严重依赖石化产品的利用，这往往会引起经济、环境和可持续性问题。因此，利用可再生且廉价的生物质原料生物合成苯酚的方法引起了广泛的研究兴趣。
近几年，随着合成生物学的发展，大肠杆菌可作为模式工业菌株，进行多种大宗化学品的生产，其中就包括苯酚。Kim等人（2014）在大肠杆菌中通过酪氨酸途径开发了一种葡萄糖到苯酚的从头生产途径（TPL途径）。该工程菌株在摇瓶中生成了419 mg/L苯酚，Miao等人（2015）通过莽草酸途径的代谢物分支酸和对-羟基苯甲酸建立了另一种苯酚生产途径（4HB途径）。该菌株在摇瓶实验中以葡萄糖作底物生成250 mg/L的苯酚。此外，Ren等人（2015）探索了第三种途径的生产潜力，即利用水杨酸盐作为中间体（SDC途径），以葡萄糖、甘油和酵母提取物为碳源，实现了472 mg/L的苯酚产量。
考虑到化学合成法的种种弊端，未来利用大肠杆菌合成苯酚的生物合成法将具有广泛的研究前景。不过目前还未有直接利用莽草酸代谢途径的中间体，即3-脱氢莽草酸合成苯酚的研究。相比于常规碳源的从头合成路径，3-脱氢莽草酸作为底物，催化合成苯酚，可以探究莽草酸代谢途径的代谢瓶颈并强化苯酚合成途径，便于与从头合成途径相结合实现高效合成苯酚。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种合成苯酚的重组大肠杆菌的构建及其在合成苯酚上的应用，该方法通过构建出苯酚合成路径，加强分支酸向苯酚前体的转化效率，以强化莽草酸代谢途径，从而促进底物3-脱氢莽草酸的消耗。增加下游前体的供应，提高苯酚产量。催化合成周期短，成本低，能够有效合成苯酚。
一种合成苯酚的重组大肠杆菌的构建，以枯草芽孢杆菌为来源复制对羟基苯甲酸脱羧酶基因yclB、yclC、yclD，在三基因之前分别插入RBS序列，构建人工型对羟基苯甲酸操纵子，加强对羟基苯甲酸脱羧酶的表达；再以大肠杆菌MG1655为来源，复制分支酸裂解酶基因ubiC、3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基转移酶基因aroA和莽草酸激酶基因aroK，并在大肠杆菌中以质粒形式过表达以上基因，即得催化3-脱氢莽草酸合成苯酚重组大肠杆菌BA-yclBCD-AK。
作为改进的是，选取引物，通过PCR复制枯草芽孢杆菌中的对羟基苯甲酸脱羧酶基因yclB、yclC、yclD，并在三者前分别插入RBS序列，构建人工型对羟基苯甲酸操纵子，通过PCR复制大肠杆菌MG1655上的分支酸裂解酶基因ubiC，再与载体pCWJ连接，构建出重组质粒pCWJ-ubiC-yclBCD；通过PCR分别复制大肠杆菌MG1655上的3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基转移酶基因aroA和莽草酸激酶基因aroK，与载体pTRC99a连接，构建出重组质粒pTRC99a-aroA-aroK；将重组质粒pCWJ-ubiC-yclBCD和重组质粒pTRC99a-aroA-aroK共转入大肠杆菌中得到催化3-脱氢莽草酸合成苯酚的重组大肠杆菌BA-yclBCD-AK。
作为改进的是，所述大肠杆菌为大肠杆菌K12、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌BA102、大肠杆菌BL21或大肠杆菌BL21（DE3）。
进一步改进的是，所述大肠杆菌为大肠杆菌BA102。
进一步改进的是，PCR复制yclB的上游引物带有Nco I 酶切位点与RBS序列，复制yclC和yclD的上游引物中带有RBS序列，复制yclD的下游引物带有Hind III 酶切位点，复制ubiC的上游引物带有Spe I 酶切位点，复制aroA的上游引物带有Nco I 酶切位点，复制aroK的下游引物带有EcoR I 酶切位点。
进一步改进的是，复制yclB的上游引物为SEQ ID NO.8，下游引物为SEQ ID NO.9；复制yclC的上游引物为SEQ ID NO.10，下游引物为SEQ ID NO.11；复制yclD的上游引物为SEQ ID NO.12，下游引物为SEQ ID NO.13；复制ubiC的上游引物为SEQ ID NO.14，下游引物为SEQ ID NO.15；复制aroA的上游引物为SEQ ID NO.18，下游引物为SEQ ID NO.19；复制aroK的上游引物为SEQ ID NO.20，下游引物为SEQ ID NO.21。
上述构建方法构建得到了合成苯酚的的重组大肠杆菌在合成苯酚上的应用。
本发明构建的重组大肠杆菌，以枯草芽孢杆菌为来源复制对羟基苯甲酸脱羧酶基因，并添加RBS序列加强该酶的表达，构建出苯酚合成路径；以大肠杆菌MG1655为来源，复制分支酸裂解酶基因并过表达以加强分支酸向苯酚前体的转化效率；以大肠杆菌MG1655为来源复制3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基转移酶基因和莽草酸激酶基因并过表达，以减弱莽草酸途径的代谢瓶颈，从而促进底物3-脱氢莽草酸的消耗；最后将两个重组质粒转入苯酚耐受性高的大肠杆菌BA102中，通过培养重组菌株进行合成苯酚的应用。
上述应用的步骤如下，培养重组大肠杆菌BA-yclBCD-AK至OD600至0.6~0.8时，加入IPTG 至终浓度0 .5‰~1‰，30℃下诱导表达14~18h后离心收菌，将菌体重悬在浓度为0.5g/L的3-脱氢莽草酸发酵液中，搅拌均匀后在pH6.5~7.5，30℃条件下反应30 h，实现全细胞催化反应合成苯酚。
作为改进的是，培养重组大肠杆菌BA-yclBCD-AK的具体操作为：挑选重组大肠杆菌BA102-BCD-ubiC至LB/AmpR+CmR 培养基中，在37℃、200rpm 条件下震荡至OD600≈1，然后转接至新鲜LB/AmpR+CmR 培养基中继续培养至OD600≈0.6~0.8。
有益效果
与现有技术相比，本发明一种合成苯酚的的重组大肠杆菌的构建及其应用，本发明以枯草芽孢杆菌为来源复制对羟基苯甲酸脱羧酶基因，并添加RBS序列加强该酶的表达，构建出苯酚合成路径；以大肠杆菌MG1655为来源，复制分支酸裂解酶基因并过表达以加强分支酸向苯酚前体的转化效率；以大肠杆菌MG1655为来源复制3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基转移酶基因和莽草酸激酶基因并过表达，以减弱莽草酸途径的代谢瓶颈，从而促进底物3-脱氢莽草酸的消耗；最后将两个重组质粒转入苯酚耐受性高的大肠杆菌BA102中，通过培养重组菌株进行合成苯酚的应用。
具体优势如下：
1、目前未有直接利用3-脱氢莽草酸合成苯酚的报道，本发明可以利用含有3-脱氢莽草酸的发酵液直接催化合成苯酚。
2、宿主菌株大肠杆菌BA102具有高的苯酚耐受性，菌株活性手苯酚毒性影响较小。
3、异源表达苯酚合成基因，即对羟基苯甲酸脱羧酶基因yclB、yclC、yclD，相比于天然型的基因组合，在这三基因前分别插入RBS序列的人工型组合，能够加强基因yclB、yclC、yclD的表达，显著提高中间体对羟基苯甲酸到苯酚的转化率。
4、过表达分支酸裂解酶基因，能够有效提高分支酸向苯酚直接前体的转化效率；过表达3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基转移酶基因与莽草酸激酶基因，可以减弱莽草酸途径代谢瓶颈，从而促进底物的消耗并增加合成苯酚的前体供应，促进苯酚的合成。
5、重组菌株培养后重悬于底物溶液中直接进行全细胞催化反应，减少了酶的纯化、分离等操作步骤，极大地简化了工艺。
附图说明
图1为大肠杆菌苯酚耐受性宿主筛选的生存曲线图，其中，（a）为BL21（DE3）在不同苯酚浓度条件下的生长曲线；（b）为不同种类大肠杆菌在1.25 g/L苯酚浓度条件下的生长曲线；
图2为重组蛋白表达情况；
图3为实施例6中增强对羟基苯甲酸脱羧酶基因表达后的催化产量对比图；
图4为本发明中HPLC检测苯酚的生成，其中，（a）为苯酚标准品，（b）为实施例7中的苯酚；
图5为实施例7中重组大肠杆菌BA-yclBCD-AK催化3-脱氢莽草酸合成苯酚情况，分别为底物消耗、中间体积累及产物产量的对比图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例中未提及到的技术均为本领域常规技术，另外，使用的大肠杆菌Trans1-T1、质粒pTRC99a等材料都是商业化产品，可直接购买。
实施例中所述的3-脱氢莽草酸、莽草酸、对羟基苯甲酸、苯酚的浓度均指的是该体系中的终浓度，检测方法为高效液相色谱法。
3-脱氢莽草酸和莽草酸测定方法：Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱，流动相为100% 8mM 硫酸，流速0.6 mL·min-1；紫外检测器，检测波长为210 nm。
苯酚和对羟基苯甲酸测定方法：Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱，流动相为15%乙腈和85% 5mM硫酸；流速0.8 mL·min-1；紫外检测器，检测波长为275 nm。
实施例1 大肠杆菌苯酚耐受性宿主筛选
以大肠杆菌BL21（DE3）为初始耐受菌株，考察其在不同苯酚浓度下的生长情况，拟筛选出大肠杆菌生长受苯酚影响出现明显生长抑制现象的浓度区间。
将BL21（DE3）甘油菌从-80 ℃冰箱取出，在平板上划线活化得到单菌落，挑取单菌落至5 mL 液体LB培养基中37 ℃ 200 rpm培养 8-12 h，再以1%的接种量将菌液分别转接至100 mL含有0 、0.5、1、1.5、2.0、2.5g/L苯酚的液体LB培养基中，于500 ml摇瓶中继续培养，每2 h取样测量菌株生长情况并绘制生长曲线。每种不同苯酚浓度的摇瓶3个为一组平行样。
如图1（a）所示，出现明显抑制现象的苯酚浓度区间为1.0~1.5 g/L，再以1.25 g/L苯酚浓度的培养体系，考察各种宿主菌株的耐受能力。
如图1（b）所示，野生型大肠杆菌BA102表现出卓越的苯酚耐受能力，远超其他几种菌，因此，选取其为产苯酚宿主菌株。
实施例2 重组质粒pCWJ-ubiC-yclBCD的构建
以来源于枯草芽孢杆菌的对羟基苯甲酸脱羧酶基因为模板进行PCR扩增获得yclB、yclC、yclD基因片段，以pCWJ质粒为载体，构建出重组质粒pCWJ-yclBCD；再以大肠杆菌MG1655为来源，PCR扩增获得分支酸裂解酶基因ubiC，以重组质粒pCWJ-yclBCD为载体，构建出催化合成苯酚的重组质粒pCWJ-ubiC-yclBCD。
质粒pCWJ的序列如SEQ ID NO.1所示：
CATGCAGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTACGCTCGGTCGTTCGACTGCGGCGAGCGGTGTCAGCTCACTCAAAAGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAAAGCCGGAAAGAACATGTGAGCAAAAAGCAAAGCACCGGAAGAAGCCAACGCCGCAGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGCCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTTGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCATTGGTAACTGATTTAGAGGACTTTGTCTTGAAGTTATGCACCTGTTAAGGCTAAACTGAAAGAACAGATTTTGGTGAGTGCGGTCCTCCAACCCACTTACCTTGGTTCAAAGAGTTGGTAGCTCAGCGAACCTTGAGAAAACCACCGTTGGTAGCGGTGGTTTTTCTTTATTTATGAGATGATGAATCAATCGGTCTATCAAGTCAACGAACAGCTATTCCGTTACTCTAGATTTCAGTGCAATTTATCTCTTCAAATGTAGCACCTGAAGTCAGCCCCATACGATATAAGTTGTAATTCTCATGTTAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATGTCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAATACTAGTTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATAGATCTCTGAAACCTCAGGCATTTGAGAAGCACACGGTCACACTGCTTCCGGTAGTCAATAAACCGGTAAACCAGCAATAGACATAAGCGGCTATTTAACGACCCTGCCCTGAACCGACGACCGGGTCGAATTTGCTTTCGAATTTCTGCCATTCATCCGCTTATTATCACTTATTCAGGCGTAGCACCAGGCGTTTAAGGGCACCAATAACTGCCTTAAAAAAATTACGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCACAGACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAATATTTGCCCATAGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAATCAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAACCCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCTTTCATTGCCATACGGAACTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGAATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAATATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGATAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGATCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAG
yclB序列如SEQ ID NO.2所示：
CATGGGCAAGCTGATTGTTGGTATGACCGGCGCCACCGGCGCCCCTTTAGGCGTTGCACTGCTGCAAGCCCTGCGTGAAATGCCGAATGTTGAAACCCATCTGGTTATGAGCAAATGGGCCAAAACCACCATTGAACTGGAAACCCCGTATAGTGCACGCGATGTTGCAGCCCTGGCCGATTTTAGCCATAATCCGGCAGATCAGGCAGCCATTATTAGCAGTGGTAGTTTTCGTACCGATGGCATGATTGTTATTCCGTGTAGCATGAAAACCCTGGCAGGTATTCGCGCAGGCTATGCCGATGGTCTGGTGGGCCGCGCAGCAGATGTGGTTCTGAAAGAAGGTCGCAAACTGGTTCTGGTGCCGCGCGAAATGCCGCTGAGCACCATTCATCTGGAAAATATGCTGGCCCTGAGTCGCATGGGTGTGGCAATGGTTCCGCCGATGCCGGCCTTTTATAATCATCCGGAAACCGTGGATGATATTGTGCATCATGTGGTTGCCCGTGTTCTGGATCAGTTTGGTCTGGAACATCCGCATGCCCGCCGCTGGCAGGGTCTGCCTCAGGCACGTAATTTTAGCCAGGAAAATGAATAA
yclC序列如SEQ ID NO.3所示：
ATGGCCTTTGATGATCTGCGCAGCTTTCTGCAAGCACTGGATGATCATGGTCAGCTGCTGAAAATTAGTGAAGAAGTTAATGCAGAACCGGATCTGGCCGCCGCAGCCAATGCCACCGGCAGAATTGGCGATGGCGCCCCGGCCCTGTGGTTTGATAATATTCGTGGTTTTACCGATGCACGTGTGGCAATGAATACCATTGGCAGTTGGCAGAATCATGCCATTAGTCTGGGCCTGCCGCCGAATGCCCCGGTTAAAAAACAGATTGATGAGTTTATTCGCCGTTGGGATAATTTTCCGATTGCACCGGAACGCCGTGCCAATCCGGCCTGGGCTCAGAATACCGTTGATGGCGATGAAATTAATCTGTTTGATATTCTGCCGCTGTTTCGTCTGAATGATGGCGATGGCGGCTTTTATCTGGATAAAGCCTGCGTTGTGAGTCGTGATCCGCTGGACCCTGATAATTTTGGTAAACAGAATGTTGGTATCTACCGTATGGAAGTGAAAGGCAAACGTAAACTGGGTCTGCAACCTGTTCCGATGCATGATATTGCACTGCATCTGCATAAAGCAGAAGAACGTGGTGAAGATTTGCCGATTGCAATTACCCTGGGTAATGATCCGATTATTACCCTGATGGGTGCCACCCCGCTGAAATATGATCAGAGCGAATATGAAATGGCAGGTGCCCTGCGTGAAAGCCCGTATCCGATTGCAACCGCACCGCTGACCGGCTTTGATGTTCCGTGGGGTAGCGAAGTTATTCTGGAAGGCGTGATTGAAAGCCGCAAACGCGAAATTGAAGGTCCGTTTGGCGAGTTTACTGGCCATTATAGCGGTGGTCGCAATATGACCGTTGTTCGTATTGATAAAGTGAGTTATCGTACCCGTCCGATTTTTGAAAGTCTGTATCTGGGCATGCCGTGGACCGAAATTGATTATCTGATGGGTCCGGCCACCTGTGTTCCGCTGTATCAGCAGCTGAAAGCAGAATTTCCGGAAGTTCAGGCAGTGAATGCCATGTATACCCACGGTCTGCTGGCCATTATTAGTACCAAAAAACGCTATGGCGGCTTTGCCCGCGCAGTTGGTCTGCGCGCAATGACCACCCCGCATGGTCTGGGTTATGTGAAAATGGTTATTATGGTGGATGAAGATGTTGATCCGTTTAATCTGCCGCAGGTTATGTGGGCCTTAAGCAGTAAAGTTAATCCGGCCGGCGATCTGGTTCAGCTGCCGAATATGAGCGTGCTGGAACTGGACCCTGGTAGTAGTCCGGCAGGCATTACCGATAAACTGATTATTGATGCAACCACCCCGGTTGCCCCGGATAATCGCGGCCATTATAGTCAGCCGGTGGTTGATCTGCCGGAAACCAAAGCCTGGGCAGAAAAACTGACCGCCATGCTGGCCGCACGTAAATAA
yclD序列如SEQ ID NO.4所示：
CATATGGGCATCTGTCCGCGCTGTGCAGATGAACAGATTGAAGTTATGGCAAAAAGCCCGGTTAAAGATGTTTGGACCGTGTATCAGTGCCAGCATTGTCTGTATACCTGGCGCGATACCGAACCGCTGCGCCGTACCAGCCGTGAACATTATCCGGAAGCCTTTCGCATGACCCAGAAAGATATTGATGATGCACCGATGGTGCCGAGTATTCCGCCGCTGCTGGTGGAAGGTAAACGC
ubiC序列如SEQ ID NO.5所示：
ATGGGCATGAGTCATCCGGCCCTGACCCAGCTGCGTGCACTGCGTTATTGCAAAGAAATTCCGGCACTGGATCCGCAGCTGCTGGATTGGCTGCTGCTGGAAGATAGTATGACCAAACGCTTTGAACAGCAGGGCAAAACCGTGAGCGTGACCATGATTCGTGAAGGTTTTGTGGAACAGAATGAAATTCCGGAAGAACTGCCGCTGCTGCCGAAAGAAAGTCGTTATTGGCTGCGTGAAATTCTGCTGTGTGCCGATGGTGAACCGTGGCTGGCAGGCCGTACCGTTGTTCCGGTTAGCACCCTGAGTGGCCCGGAACTGGCACTGCAGAAACTGGGCAAAACCCCGCTGGGTCGCTATCTGTTTACCAGCAGCACCCTGACCCGTGATTTTATTGAAATTGGCCGCGATGCAGGCCTGTGGGGCCGTAGAAGCCGTCTGCGCCTGAGTGGTAAACCGCTGCTGCTGACCGAACTGTTTCTGCCGGCAAGTCCGCTGTATTAA
yclB基因前插入的RBS序列如SEQ ID NO.6所示：AGGA。
yclC、yclD基因前插入的RBS序列如SEQ ID NO.7所示：AAGGAG。
yclB基因上游引物带有酶切位点Nco I和RBS序列，如SEQ ID NO.8所示：
CACACAGGAAACAGACCATGGGCAAGCTGATTGTTGG。
yclB基因下游引物序列如SEQ ID NO.9所示：
GCCATATGTATATCTCCTTCTTTTATTCATTTTCCTGGCTAAAATTACG。
yclC基因上游引物带有RBS序列，如SEQ ID NO.10所示：
GAAAATGAATAAAAGAAGGAGATATACATATGGCCTTTG。
yclC基因下游引物如SEQ ID NO.11所示：
GCCCATATGTATATCTCCTTCTTTTATTTACGTGCGGCCAGCATG。
yclD基因上游引物带有RBS序列，如SEQ ID NO.12所示：
CACGTAAATAAAAGAAGGAGATATACATATGGGCATCTGTCCGCGC。
yclD基因下游引物带有酶切位点Hind III，如SEQ ID NO.13所示：
GCCAAAACAGCCAAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGCG。
ubiC基因上游引物带有酶切位点SpeI，如SEQ ID NO.14所示：
ATTAGGAAATACTAGTTTGACAATTAATCATCCGGCTCGTATAATGT。
ubiC基因下游引物如SEQ ID NO.15所示：
TAATTGTCAAACTAGGGCTGAAAATCTTCTCTCATCCGC。
反应条件为：95℃ 2 min ，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 10 s，共30个循环；72℃5 min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将表达载体pCWJ用Takara 公司的NcoI 和Hind III酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1 μL，NcoI1 μL，Hind III 1 μL，载体质粒7 μL。酶切体系于37℃条件下反应1小时。酶切回收后的载体片段与目的序列片段yclB、yclC、yclD两两之间具有同源臂，使用诺唯赞公司的一步克隆试剂盒进行同源重组，反应体系为：Takara公司的5×CE II Buffer 2 μL，Exnase II 1 μL，表达载体片段1 μL，插入的序列片段各2 μL。反应体系37℃反应45 min。将连接产物转化到大肠杆菌 Trans1-T1中，PCR筛选阳性菌株进行DNA测序验证，验证重组质粒的构建正确，得到重组质粒pCWJ-yclBCD。
再以pCWJ-yclBCD为载体，用Takara 公司的Spe I酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1 μL，Spe I 2 μL，载体质粒7 μL。酶切体系于37℃条件下反应1小时。酶切回收的载体片段与目的序列片段ubiC之间具有同源臂，使用诺唯赞公司的一步克隆试剂盒进行同源重组，反应体系为：Takara公司的5×CE II Buffer 2 μL，Exnase II 1 μL，表达载体片段2 μL，插入的序列片段5 μL。反应体系37℃反应45 min。将连接产物转化到大肠杆菌Trans1-T1中，PCR筛选阳性菌株进行DNA测序验证，验证重组质粒的构建正确，得到催化合成苯酚的重组质粒pCWJ-ubiC-yclBCD。
以同样的方法构建出重组质粒pCWJ-ubiC-yclBCD*，其中yclB、yclC、yclD各基因前未插入RBS序列，为天然型基因组合。
实施例3 重组质粒pTRC99a-aroA-aroK的构建
以大肠杆菌MG1655全基因组为模板，PCR扩增获得3-磷酸莽草1-羧乙烯基转移酶aroA与莽草酸激酶aroK，以质粒pTRC99a为载体，构建出促进底物3-脱氢莽草酸消耗并增加下游前体供应的重组质粒pTRC99a-aroA-aroK。
aroA序列如SEQ ID NO .16所示：
ATGGAATCCCTGACGTTACAACCCATCGCTCGTGTCGATGGCACTATTAATCTGCCCGGTTCCAAGAGCGTTTCTAACCGCGCTTTATTGCTGGCGGCATTAGCACACGGCAAAACAGTATTAACCAATCTGCTGGATAGCGATGACGTGCGCCATATGCTGAATGCATTAACAGCGTTAGGGGTAAGCTATACGCTTTCAGCCGATCGTACGCGTTGCGAAATTATCGGTAACGGCGGTCCATTACACGCAGAAGGTGCCCTGGAGTTGTTCCTCGGTAACGCCGGAACGGCAATGCGTCCGCTGGCGGCAGCTCTTTGTCTGGGTAGCAATGATATTGTGCTGACCGGTGAGCCGCGTATGAAAGAACGCCCGATTGGTCATCTGGTGGATGCGCTGCGCCTGGGCGGGGCGAAGATCACTTACCTGGAACAAGAAAATTATCCGCCGTTGCGTTTACAGGGCGGCTTTACTGGCGGCAACGTTGACGTTGATGGCTCCGTTTCCAGCCAATTCCTCACCGCACTGTTAATGACTGCGCCTCTTGCGCCGGAAGATACGGTGATTCGTATTAAAGGCGATCTGGTTTCTAAACCTTATATCGACATCACACTCAATCTGATGAAGACGTTTGGTGTTGAAATTGAAAATCAGCACTATCAACAATTTGTCGTAAAAGGCGGGCAGTCTTATCAGTCTCCGGGTACTTATTTGGTCGAAGGCGATGCATCTTCGGCTTCTTACTTTCTGGCAGCAGCAGCAATCAAAGGCGGCACTGTAAAAGTGACCGGTATTGGACGTAACAGTATGCAGGGTGATATTCGCTTTGCTGATGTGCTGGAAAAAATGGGCGCGACCATTTGCTGGGGCGATGATTATATTTCCTGCACGCGTGGTGAACTGAACGCTATTGATATGGATATGAACCATATTCCTGATGCGGCGATGACCATTGCCACGGCGGCGTTATTTGCAAAAGGCACCACCACGCTGCGCAATATCTATAACTGGCGTGTTAAAGAGACCGATCGCCTGTTTGCGATGGCAACAGAACTGCGTAAAGTCGGCGCGGAAGTGGAAGAGGGGCACGATTACATTCGTATCACTCCTCCGGAAAAACTGAACTTTGCCGAGATCGCGACATACAATGATCACCGGATGGCGATGTGTTTCTCGCTGGTGGCGTTGTCAGATACACCAGTGACGATTCTTGATCCCAAATGCACGGCCAAAACATTTCCGGATTATTTCGAGCAGCTGGCGCGGATTAGCCAGGCAGCCTGA
aroK序列如SEQ ID NO .17所示：
ATGGCAGAGAAACGCAATATCTTTCTGGTTGGGCCTATGGGTGCCGGAAAAAGCACTATTGGGCGCCAGTTAGCTCAACAACTCAATATGGAATTTTACGATTCCGATCAAGAGATTGAGAAACGAACCGGAGCTGATGTGGGCTGGGTTTTCGATTTAGAAGGCGAAGAAGGCTTCCGCGATCGCGAAGAAAAGGTCATCAATGAGTTGACCGAGAAACAGGGTATTGTGCTGGCTACTGGCGGCGGCTCTGTGAAATCCCGTGAAACGCGTAACCGTCTTTCCGCTCGTGGCGTTGTCGTTTATCTTGAAACGACCATCGAAAAGCAACTTGCACGCACGCAGCGTGATAAAAAACGCCCGTTGCTGCACGTTGAAACACCGCCGCGTGAAGTTCTGGAAGCGTTGGCCAATGAACGCAATCCGCTGTATGAAGAGATTGCCGACGTGACCATTCGTACTGATGATCAAAGCGCTAAAGTGGTTGCAAACCAGATTATTCACATGCTGGAAAGCAACTAA
aroA基因上游引物带有Nco I 酶切位点，如SEQ ID NO .18所示：
ACAGACCATGGAATTATGGAATCCCTGACGTTACAACCC
aroA基因下游引物如SEQ ID NO .19所示：
TGCGTTTCTCTGCCATATGTATATCTCCTTCTTTCAGGCTGCCTGGCTAATCC
aroK基因上游引物如SEQ ID NO .20所示：
GGCAGCCTGAAAGAAGGAGATATACATATGGCAGAGAAACGCAATATCTTTCT
aroK基因下游引物带有EcoRI酶切位点，如SEQ ID NO .21所示：
TACCGAGCTCGAATTCTTAGTTGCTTTCCAGCATGTGAATAATCTGG
反应条件为：95℃ 2 min ，95℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 10 s，共30个循环；72℃5 min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将回收片段和表达载体pTRC99a分别用Takara 公司的限制性内切酶Nco I和EcoR I酶切，酶切反应体系为：10×buffer 1μL，Nco I 1 μL，EcoR I1 μL，载体质粒7 μL。酶切体系于37℃条件下反应1小时。酶切回收的载体片段与目的序列片段aroA、aroK两两之间具有同源臂，使用诺唯赞公司的一步克隆试剂盒进行同源重组，反应体系为：Takara公司的5×CE II Buffer 2 μL，Exnase II 1 μL，表达载体片段1 μL，插入的序列片段各3 μL。反应体系37℃反应45 min。将连接产物转化到大肠杆菌 Trans1-T1中，PCR筛选阳性菌株进行DNA测序验证，验证重组质粒的构建正确，验证正确后即可得到促进底物3-脱氢莽草酸消耗，并增加下游前体供应的重组质粒pTRC99a-aroA-aroK。
实施例4 BA-yclBCD-AK重组菌株的构建
使用天根质粒小提试剂盒提取上述实施例2和3中的两种克隆菌株中的重组质粒pCWJ-ubiC-yclBCD和pTRC99a-aroA-aroK，将提取出来的重组质粒一起导入苯酚耐受性高的大肠杆菌BA102的感受态中得到重组菌株BA-yclBCD-AK。
将pCWJ-ubiC-yclBCD和pCWJ-ubiC-yclBCD*分别导入苯酚耐受性高的大肠杆菌BA102的感受态中得到重组菌株BA-yclBCD、BA-yclBCD*。
大肠杆菌感受态制备的方法：
在LB平板上，挑取大肠杆菌BA102的单菌落，然后接入摇管（LB培养基），温度37℃，200rpm，培养10-12h。按以1%的接种量转接到500 mL摇瓶LB的液体培养基中，装液量为50ml，温度37 ℃，200rmp进行培养。待菌液光密度值OD 600生长至0.4-0.5，将摇瓶放到冰上冰浴20 min（停止生长活动）后，在已预冷的离心机中，4 ℃下，4000 rpm，离心10 min，去除上清后收集菌体。用10 mL 0.1mol/L预冷(4℃)的CaCl2（包含20%甘油）溶液重悬菌体，放置于冰上静置15 min，4 ℃下，4000 rpm，离心10 min（该步骤重复两次）。去除上清，最后添加1 mL提前放置冰箱预冷的含15%甘油的0.1 mol·L-1CaCl2溶液悬浮细胞，冰上放置5 min后，即得感受态细胞悬液，分装成80 μL/管的小份-80℃保存。
实施例5 对羟基苯甲酸脱羧酶和分支酸裂解酶的表达
将重组菌株BA-yclBCD在500 mL锥形瓶装液量100 mL的LB培养基中37℃，200 rpm培养，当OD600达到0.6~0.8时，添加1‰ IPTG诱导，诱导温度为30℃，培养18小时后收菌超声破碎，将破碎后的菌液离心上清和沉淀分离，对上清和沉淀跑蛋白胶验证对羟基苯甲酸脱羧酶和分支酸裂解酶的表达（图2）。
实施例6 增强对羟基苯甲酸脱羧酶表达对苯酚合成效率提高的验证
将重组菌株BA-yclBCD和重组菌株BA-yclBCD*分别培养至OD600至0.6~0.8时，加入IPTG 至终浓度0.5‰~1‰，30℃下诱导表达14~18h后离心收菌，将菌体重悬在浓度为4 g/L的对羟基苯甲酸溶液中，搅拌均匀后得到10 ml、OD600≈6、pH为6.5~7.5的反应体系，在30℃、200 rpm的条件下以对羟基苯甲酸为底物进行全细胞催化反应，取2、4、6、8、20 h时间点检测底物及苯酚的浓度。通过对比底物消耗量及苯酚产量，验证增强对羟基苯甲酸脱羧酶基因的表达对苯酚合成效率影响。
结果如图5所示，从图中可以看出重组菌株BA-yclBCD的苯酚产量以及底物消耗量都优于重组菌株BA-yclBCD*，这说明在对羟基苯甲酸脱羧酶基因yclB、yclC、yclD之前分别插入RBS序列的人工型组合要优于天然型无RBS序列的组合。
实施例7 重组菌株BA-yclBCD-AK催化3-脱氢莽草酸合成苯酚
分别培养重组大肠杆菌BA-yclBCD和BA-yclBCD-AK至OD600至0.6~0.8时，加入IPTG至终浓度0.5‰~1‰，30℃下诱导表达14~18h后离心收菌，将菌体重悬在浓度为0.5 g/L的3-脱氢莽草酸发酵液中，搅拌均匀后得到12 ml、OD600≈15、pH为6.5~7.5的反应体系，在30℃、200 rpm的条件下进行全细胞催化反应，取30 h终样检测底物3-脱氢莽草酸的消耗，中间体莽草酸的积累以及苯酚的产量，最终苯酚产量为131.5 mg/L。
综上所述，本发明一种催化3-脱氢莽草酸合成苯酚的的重组大肠杆菌及其应用，本发明以枯草芽孢杆菌为来源复制对羟基苯甲酸脱羧酶基因，并添加RBS序列加强该酶的表达，构建出苯酚合成路径；以大肠杆菌MG1655为来源，复制分支酸裂解酶基因并过表达以加强分支酸向苯酚前体的转化效率；以大肠杆菌MG1655为来源复制3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基转移酶基因和莽草酸激酶基因并过表达，以减弱莽草酸途径的代谢瓶颈，从而促进底物3-脱氢莽草酸的消耗；最后将两个重组质粒转入苯酚耐受性高的大肠杆菌BA102中，通过培养重组菌株进行合成苯酚的应用。

Claims (9)

1.一种合成苯酚的重组大肠杆菌的构建，其特征在于：以枯草芽孢杆菌为来源复制对羟基苯甲酸脱羧酶基因yclB、yclC、yclD，在三基因之前分别插入RBS序列，构建人工型对羟基苯甲酸操纵子，加强对羟基苯甲酸脱羧酶的表达；再以大肠杆菌MG1655为来源，复制分支酸裂解酶基因ubiC、3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基转移酶基因aroA和莽草酸激酶基因aroK，并在大肠杆菌中以质粒形式过表达以上基因，即得催化3-脱氢莽草酸合成苯酚重组大肠杆菌BA-yclBCD-AK。
2.根据权利要求1所述的一种合成苯酚的重组大肠杆菌的构建，其特征在于：选取引物，通过PCR复制枯草芽孢杆菌中的对羟基苯甲酸脱羧酶基因yclB、yclC、yclD，并在三者前分别插入RBS序列，构建人工型对羟基苯甲酸操纵子，通过PCR复制大肠杆菌MG1655上的分支酸裂解酶基因ubiC，再与载体pCWJ连接，构建出重组质粒pCWJ-ubiC-yclBCD；通过PCR分别复制大肠杆菌MG1655上的3-磷酸莽草酸1-羧乙烯基转移酶基因aroA和莽草酸激酶基因aroK，与载体pTRC99a连接，构建出重组质粒pTRC99a-aroA-aroK；将重组质粒pCWJ-ubiC-yclBCD和重组质粒pTRC99a-aroA-aroK共转入大肠杆菌中得到催化3-脱氢莽草酸合成苯酚的重组大肠杆菌BA-yclBCD-AK。
3.根据权利要求2所述的一种合成苯酚的重组大肠杆菌的构建，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌K12、大肠杆菌MG1655、大肠杆菌BA102、大肠杆菌BL21或大肠杆菌BL21（DE3）。
4.根据权利要求3所述的一种合成苯酚的重组大肠杆菌的构建，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌BA102。
5.根据权利要求2所述的一种合成苯酚的重组大肠杆菌的构建，其特征在于：PCR复制yclB的上游引物带有Nco I 酶切位点与RBS序列，复制yclC和yclD的上游引物中带有RBS序列，复制yclD的下游引物带有Hind III 酶切位点，复制ubiC的上游引物带有Spe I酶切位点，复制aroA的上游引物带有Nco I 酶切位点，复制aroK的下游引物带有Eco RI酶切位点。
6.根据权利要求5所述的一种合成苯酚的重组大肠杆菌的构建，其特征在于：复制yclB的上游引物为SEQ ID NO.8，下游引物为SEQ ID NO.9；复制yclC的上游引物为SEQ IDNO.10，下游引物为SEQ ID NO.11；复制yclD的上游引物为SEQ ID NO.12，下游引物为SEQID NO.13；复制ubiC的上游引物为SEQ ID NO.14，下游引物为SEQ ID NO.15；复制aroA的上游引物为SEQ ID NO.18，下游引物为SEQ ID NO.19；复制aroK的上游引物为SEQ ID NO.20，下游引物为SEQ ID NO.21。
7.基于权利要求1所述的构建方法构建的重组大肠杆菌在合成苯酚上的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，培养重组大肠杆菌BA-yclBCD-AK至OD600至0.6~0.8时，加入IPTG 至终浓度0 .5‰~1‰，30℃下诱导表达14~18h后离心收菌，将菌体重悬在浓度为0.5 g/L的3-脱氢莽草酸发酵液中，搅拌均匀后在pH6.5~7.5，30℃条件下反应30 h，实现全细胞催化反应合成苯酚。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，培养重组大肠杆菌BA-yclBCD-AK的具体操作为：挑选重组大肠杆菌BA102-BCD-ubiC至LB/AmpR+CmR 培养基中，在37℃、200rpm 条件下震荡至OD600≈1，然后转接至新鲜LB/AmpR+CmR 培养基中继续培养至OD600≈0.6~0.8。
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