CN115927142A - 一种高产β-丙氨酸的工程菌及其应用 - Google Patents
一种高产β-丙氨酸的工程菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高产β‑丙氨酸的工程菌及其应用，所述工程菌是以益生菌E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因、fumB1基因、aspC基因或pyk基因中的一种或多种，和/或过表达panD突变基因、aspB基因、aspA基因或ppC基因中的一种或多种构建获得的。本发明采用工程菌发酵生产β‑丙氨酸，发酵生产过程安全无污染，发酵液不仅可用于制备工业和食品级β‑丙氨酸化工原料，而且可直接用于养殖动物饲喂。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种高产高耐受β-丙氨酸的工程菌、构建方法以及该工程菌在微生物发酵制备β-丙氨酸中的应用。
(二)背景技术
β-丙氨酸是自然界中唯一存在的β型氨基酸，存在于某些植物和细菌中。动物的生理功能及代谢也需要其发挥作用，它是人和哺乳动物内源咪唑二肽合成的限制性氨基酸，具有增加肌肉中咪唑二肽含量，提高抗氧化能力以及抗疲劳等作用。在养殖畜牧业方面，β-丙氨酸可提高动物生产性能，调控肌肉生长和肌源活性肽含量，改善肉品质量。在医药方面，β-丙氨酸可用于合成泛酸、泛酸钙、肌肽、帕米膦酸钠和巴柳氮等。在化工方面应用于电镀、铅中毒解毒剂及合成甜味剂。在环境应用方面可合成絮凝剂，用于水的净化。β-丙氨酸主要通过化学法、酶法和发酵法合成。其中，化学法包括丙烯腈法、琥珀酰亚胺降解法、β-氨基丙腈法等，但存在工艺条件苛刻、副产物多、提取过程、环境不友好等不足。酶催化合成β-丙氨酸虽然条件温和、提取工艺简单等优点，但该方法工艺成本较高。采用廉洁易得的葡萄糖作为起始原料，具有生产成本低、高特异性和对环境污染小等优点，具有广阔的工业应用前景。
益生大肠杆菌Nissle 1917是公认的安全菌株，它不仅可以调节宿主肠道内的菌群组成以及调节菌群平衡，通过改善人和动物肠道粘膜的免疫预防功能，减轻肠道感染后的炎症反应，而且还具有保护肠道、抑制致病菌生长、调节免疫功能等作用。此外，Nissle1917生长速度快，符合工业生产底盘微生物所需的特性，适于工业发酵生产。通过代谢工程改造Nissle 1917生产工业产品的研究较少。
本发明以Nissle 1917为底盘菌开发了高产β-丙氨酸的益生菌。本发明首先通过筛选得到对高浓度β-丙氨酸有极强耐受性的一株益生菌，并通过敲除β-丙氨酸的转运蛋白关键基因cycA，进一步提高了Nissle 1917对β-丙氨酸的耐受能力。其次，通过在Nissle1917中表达自行筛选获得的β-丙氨酸合成酶突变体，提高了Nissle 1917产β-丙氨酸的能力。再次，通过代谢途径改造进一步增强了Nissle 1917合成β-丙氨酸的水平。最后，通过培养基优化和分批补料发酵条件优化，获得Nissle 1917工程菌的发酵小试生产工艺。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种高产β-丙氨酸的工程菌及其应用，所述工程菌不仅自身对高浓度β-丙氨酸有极强耐受性，且通过优化培养基配方以及分批补料等方式，使得工程菌实现β-丙氨酸的高产。所述工程菌能够安全用于微生物发酵制备β-丙氨酸，发酵液亦可作为益生菌营养物质用于动物养殖，改善动物肉品质量。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种高产β-丙氨酸的工程菌，所述工程菌是以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因、fumB1基因、aspC基因或pyk基因中的一种或多种，和/或过表达panD突变基因、aspB基因、aspA基因或ppC基因中的一种或多种构建获得的；所述panD突变基因是将panD基因编码蛋白第43位的赖氨酸突变为酪氨酸获得的编码基因。
优选的，cycA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4中1007-2419bp所示，fumB1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5中1004-2650bp所示，aspC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6中1022-2212bp所示，pyk基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7中987-2429bp所示，所述panD突变基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，panD突变基因编码蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；aspB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，aspA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；ppC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
优选的，所述panD突变基因(panDK43Y)为源自枯草芽孢杆菌panD基因的突变型，所述panD突变基因表达的蛋白是将源自枯草芽孢杆菌panD基因表达的蛋白第43位赖氨酸突变为酪氨酸，其序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述panD突变基因、aspB基因、aspA基因或ppC基因采用启动子PJ23100表达，所述启动子PJ23100核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述panD突变基因、aspB基因采用质粒pGLO进行过表达；所述aspA基因或ppC基因采用质粒pSU19进行过表达。
优选的，所述工程菌为下列之一：(1)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，采用质粒pGLO和启动子PJ23100过表达panD突变基因，即工程菌ECN-1；(2)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因，采用质粒pGLO和启动子PJ23100过表达panD突变基因，即工程菌ECN-2；(3)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因和fumB1基因，采用质粒pGLO和启动子PJ23100过表达panD突变基因，同时采用质粒pSU19和启动子PJ23100过表达aspA基因，即工程菌ECN-3；(4)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因、fumB1基因和aspC基因，采用质粒pGLO和启动子PJ23100过表达panD突变基因和aspB基因，同时采用质粒pSU19和启动子PJ23100过表达aspA基因，即工程菌ECN-4；(5)以E.coli Nissle1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因、fumB1基因、aspC基因和pyk基因，采用质粒pGLO和启动子PJ23100过表达panD突变基因和aspB基因，采用质粒pSU19和启动子PJ23100过表达aspA基因，即工程菌ECN-5；(6)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因、fumB1基因、aspC基因和pyk基因，采用质粒pGLO和启动子PJ23100过表达panD突变基因和aspB基因，采用质粒pSU19和启动子PJ23100过表达aspA基因和ppC基因，即工程菌ECN-6。
本发明最优选高产β-丙氨酸的工程菌ECN-6由如下方法构建而成：
(1)将来自Bacillus subtilis的panD基因以及J23100启动子利用一步克隆的方式与pGLO载体连接得到pGLO-PJ23100-panD；
(2)将质粒载体上Bacillus subtilis来源的panD基因编码的43号氨基酸利用PCR点突变，得到能够表达高酶活的L-天冬氨酸-α-脱羧酶的质粒pGLO-PJ2100-panDK43Y；
(3)应用λ-RED重组系统，将底盘菌E.coli Nissle 1917基因组中的cycA基因敲除，得到对胞内β-丙氨酸浓度耐受性增强的E.coli Nissle 1917ΔcycA；
(4)应用λ-RED重组系统，将E.coli Nissle 1917ΔcycA基因中的fumB1基因、aspC基因和pyk基因敲除，得到E.coli Nissle 1917ΔcycA ΔfumB1ΔaspCΔpyk；
(5)将来自E.coli的aspA基因以及J23100启动子利用一步克隆的方式与pSU19载体连接得到pSU19-PJ23100-aspA；
(6)将来自Corynebacterium glutamicum基因组上的ppC基因利用PCR得到的片段与pSU19-PJ23100-aspA通过一步克隆的方式连接，得到pSU19-PJ23100-aspA-ppC；
(7)将来自Corynebacterium glutamicum基因组上的aspB基因利用PCR得到的片段与载体pGLO-PJ2100-panDK43Y通过一步克隆的方式连接，得到pGLO-PJ23100-panDK43Y-aspB；
(8)将质粒pGLO-PJ2100-panDK43Y-aspB和质粒pSU19-PJ23100-aspA-ppC转入Nissle1917ΔcycAΔfumB1ΔaspCΔpyk感受态中，得到工程菌Nissle 1917ΔcycA ΔfumB1ΔaspCΔpyk/pGLO-PJ2100-panDK43Y-aspB/pSU19-PJ23100-aspA-ppC，即所述高产β-丙氨酸的工程菌。
本发明还提供一种所述高产β-丙氨酸的工程菌在发酵产β-丙氨酸中的应用，所述应用为：将所述工程菌接种至发酵培养基，在37℃、200～220rpm条件下摇瓶发酵培养12h以上，发酵结束后，得到含β-丙氨酸的发酵液；所述发酵培养基组成：甘油10g/L、K2HPO4·3H2O14g/L、KH2PO4 5.2g/L、MgSO4 0.3g/L、NH4Cl 1g/L、酵母粉1g/L，溶剂为ddH2O，pH值7.0，溶剂为水。
优选的，所述发酵采用发酵罐进行，先将工程菌接种至装有发酵罐培养基的发酵罐中，在37℃、pH 6-8、维持溶氧值20％-50％的条件下发酵10h后，以40-60mL/min的速度流加补料培养基，直至发酵结束，获得含β-丙氨酸的发酵液；
所述发酵罐培养基：50g/L葡萄糖、K2HPO4·3H2O 28g/L、KH2PO4 10.4g/L、NH4Cl4g/L、MgSO4 0.6g/L、胰蛋白胨2g/L、YEAST EXTRACT(酵母粉)4g/L、1mL 10×金属离子、1mL/L有机硅胶消泡剂，溶剂为水；10×金属离子配方：称取10g CaCl2，10g FeSO4·7H2O，1gZnSO4·7H2O，0.2g CuSO4和0.02g NiCl2·7H2O溶解到100mL ddH2O中；
所述补料培养基组成：葡萄糖250g/L、甘油250g/L、酵母提取物4g/L、KH2PO4 14g/L，NH4Cl 10g/L，MgSO4 0.3g/L，消泡剂1mL/L，消泡剂为有机硅胶消泡剂，溶剂为水。
所述补料培养基的添加量维持发酵液中葡萄糖残糖浓度3-4g/L。
优选的，所述工程菌发酵前先进行斜面活化和种子扩大培养，再将种子液以体积浓度1-2％的接种量接种至发酵培养基，具体如下：
(1)将所述工程菌接种在含有0.1mg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板上，在37℃培养箱中培养过夜；LB平板培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂2g/L，溶剂为水，pH值自然；(2)挑取步骤(1)单菌落接种至LB液体培养基中，以200rpm的转速在37℃培养箱中培养过夜，获得种子液；LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然；(3)将步骤(2)种子液以体积浓度1-5％的接种量接种至发酵培养基中，以200rpm的转速在37℃的培养箱中培养24小时，获得含β-丙氨酸的发酵液。
本发明首先用突变的panD基因克隆在高拷贝质粒pGLO上并利用J23100强启动子进行转录，从而提高胞内β-丙氨酸的量。通过敲除cycA基因，以增强对胞内β-丙氨酸浓度的高耐受。通过敲除fumB1基因，使富马酸得到积累并过表达aspA，从而提高L-天冬氨酸的量。过表达ppC基因，使得EMP途径中的PEP更多的流向间接前体。为了得到更多的L-Asp，通过敲除Nissle 1917基因组上的aspC基因，并替换成来自谷氨酸棒杆菌来源的aspB基因。过表达ppC基因是使得磷酸烯醇式丙酮酸更多的流向草酰乙酸。为了减少PEP的消耗，我们将PEP流向丙酮酸途径的pyk基因敲除，使得更多的PEP流向OAA。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：第一，本发明所采用的底盘菌E.coli Nissle 1917在发酵生产过程中耐受β-丙氨酸的能力高于其他常规大肠杆菌菌种；第二，本发明将表达高酶活PanDK43Y的重组质粒pGLO-PJ2100-panDK43Y导入该底盘菌中，并通过代谢工程改造(aspA途径和aspC途径)增强β-丙氨酸前体L-天冬氨酸供应量，进而提高β-丙氨酸产量。第三，本发明通过培养基成分和培养条件优化，将β-丙氨酸产量提高至原产量的2倍左右的水平，并建立了β-丙氨酸生产菌小试发酵生产工艺；第四，本发明采用工程菌发酵生产β-丙氨酸，发酵生产过程安全无污染，发酵液不仅可用于制备工业和食品级β-丙氨酸化工原料，而且可直接用于养殖动物饲喂。
(四)附图说明
图1为不同宿主在不同浓度β-丙氨酸下的生物量曲线图(A)及大肠杆菌Nissle1917中β-氨酸的合成代谢图(B)。
图2为实施例2中EcN菌株敲除cycA基因前后菌落PCR的检测电泳图；A代表EcN敲除cycA基因前后的菌落PCR验证胶图，泳道1代表5K Marker，泳道2代表底盘菌EcN，泳道3、4、5、6代表cycA基因敲除株；B代表菌落PCR消除EcN基因组上Kan抗性基因检验胶图，泳道1代表5K Marker，泳道2、3、4代表cycA敲除株基因组上Kan抗性消除；泳道5代表底盘菌EcN。
图3为实施例2中不同菌株生物量比较图；A代表底盘菌EcN敲除cycA基因前后在高浓度β-丙氨酸下的生物量；B代表工程菌EcN-1、EcN-2及底盘菌EcN的生物量和β-丙氨酸产量图。
图4为实施例3中工程菌EcN-3构建过程电泳图及生物量和β-丙氨酸产量图；A代表E.coli Nissle 1917ΔcycA敲除fumB1基因的菌落PCR验证胶图；泳道1代表5K Marker，泳道2代表底盘菌EcN，泳道3、4、5代表fumB1基因敲除株；B代表菌落PCR消除E.coli Nissle1917ΔcycAΔfumB1基因组上Kan抗性基因检验胶图，泳道1代表5K Marker，泳道2、3、4、5代表fumB1敲除株基因组上Kan抗性消除；C代表工程菌EcN-2、EcN-3的生物量和β-丙氨酸产量图。
图5为实施例4中工程菌EcN-4构建过程电泳图及生物量和β-丙氨酸产量图；A代表E.coli Nissle 1917ΔcycA ΔfumB1敲除aspC基因的菌落PCR验证胶图，泳道1代表5KMarker，泳道2、3、4、5、6、7代表aspC基因敲除株；B代表菌落PCR消除EcN基因组上Kan抗性基因检验胶图，泳道1代表5K Marker，泳道2代表底盘菌EcN，泳道3、4、5代表aspC敲除株基因组上Kan抗性消除；C代表重组质粒pGLO-PJ23100-panDK43Y-aspB构建过程及图谱，D代表工程菌EcN-3、EcN-4的生物量和β-丙氨酸产量图。
图6为实施例5中工程菌EcN-5构建过程电泳图及生物量和β-丙氨酸产量图；A代表E.coli Nissle 1917ΔcycA ΔfumB1ΔaspC敲除pyK基因的菌落PCR验证胶图，泳道1代表5K Marker，泳道2、3、4、5、6代表pyK基因敲除株；B代表菌落PCR消除EcN基因组上Kan抗性基因检验胶图，泳道1代表5K Marker，泳道2代表底盘菌EcN，泳道3、4、5、6代表pyK敲除株基因组上Kan抗性消除；C代表工程菌EcN-4、EcN-5的生物量和β-丙氨酸产量图。
图7为实施例6中工程菌EcN-6构建过程及生物量和β-丙氨酸产量图；A代表Psu19-PJ23100-aspA-ppC重组载体构建过程及图谱；B代表工程菌EcN-5、EcN-6的生物量和β-丙氨酸产量图。
图8为实施例7中不同菌株、不同条件下的生物量和β-丙氨酸产量图；A代表工程菌EcN-1、EcN-2、EcN-3、EcN-4、EcN-5、EcN-6在基本盐M9培养基中的生物量和β-丙氨酸产量图；B代表工程菌EcN-6在碳源优化培养基中β-丙氨酸产量；C代表工程菌EcN-6在氮源优化培养基中β-丙氨酸产量；D代表不同浓度β-丙氨酸标准品的高效液相色谱图；E代表工程菌EcN-6发酵液的高效液相色谱图；F代表底盘菌EcN与工程菌EcN-6在发酵培养基中的生物量及β-丙氨酸产量；G代表工程菌EcN-6在发酵培养基优化前后生物量及β-丙氨酸产量。
图9为实施例8中工程菌EcN-6发酵罐分批补料培养产β-丙氨酸图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
本发明所用E.coli Nissle 1917菌株购自杭州丰海生物科技有限公司，菌种经浙江天科高新技术发展有限公司鉴定。
LB培养基组成：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L，ddH2O，pH值自然。
LB平板培养基是在LB液体培养基中添加终浓度2g/L琼脂。
基本盐M9培养基组成：K2HPO4·3H2O 14g/L、KH2PO4 5.2g/L、(NH4)2SO4 2g/L、MgSO40.3g/L、胰蛋白胨1g/L，溶剂为ddH2O，pH值7.0，溶剂为水。
实施例1：构建增强β-丙氨酸合成代谢途径的重组质粒pGLO-PJ23100-PanDK43Y及相应的工程菌EcN-1
1、重组质粒pGLO-PJ23100-PanDK43Y的构建
panD基因编码的酶是L-天冬氨酸-α-脱羧酶，在β-丙氨酸的合成中是一个关键酶，用定点突变的方式以达到增强panD基因表达的目的，增强L-天冬氨酸-α-脱羧酶的活性。
人工合成GenBank中来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的panD基因(GeneID：939033)，利用一步克隆试剂盒(购自诺唯赞公司)与pGLO载体连接，得到重组质粒pGLO-PJ23100-panD，以重组质粒pGLO-PJ23100-panD为模板，采用表1引物进行PCR扩增，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测、用DpnI于37℃处理2h消模板，并纯化片段，得到重组质粒pGLO-PJ23100-panDK43Y(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)以及PJ23100启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)。
SEQ ID NO.1：
ATGTATCGAACAATGATGAGCGGCAAACTTCACAGGGCAACTGTTACGGAAGCAAACCTGAACTATGTGGGAAGCATTACAATTGATGAAGATCTCATTGATGCTGTGGGAATGCTTCCTAATGAATACGTACAAATTGTGAATAATAATAATGGAGCACGTCTTGAAACGTATATTATTCCTGGTAAACGGGGAAGCGGCGTCATATGCTTAAACGGTGCAGCCGCACGCCTTGTGCAGGAAGGAGATAAGGTCATTATTATTTCCTACAAAATGATGTCTGATCAAGAAGCGGCAAGCCATGAGCCGAAAGTGGCTGTTCTGAATGATCAAAACAAAATTGAACAAATGCTGGGGAACGAACCAGCCCGTACAATTTTGCACCACCACCACCACCACTGA。
SEQ ID NO.3：TTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTACAGTGCTAGC。
表1：引物序列
| 定点突变F | GAATGCTTCCTAATGAATACGTAC |
| 定点突变R | CACAATTTGTACGTATTCATTAGG |
PCR反应条件如下：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃240s，重复30个循环；72℃继续延伸10min。
2、工程菌EcN-1
(1)宿主菌的筛选
将E.coli Nissle 1917划线接种在LB平板上，在37℃培养箱中培养过夜，挑取单菌落接种至5ml的LB液体培养基中，并且以200rpm的转速在37℃培养箱中培养过夜，获得种子液。将1ml种子液接种至添加50ml基因盐M9培养基的250ml的摇瓶中，同时向摇瓶中添加0或100g/L的β-丙氨酸。然后摇瓶以200rpm的转速在37℃的培养箱中培养24小时，每隔2h从摇瓶中取1ml液体，测定OD600。
同样条件下，分别用E.coli BL21(购自全式金公司)、E.coli BW25113(购自Kirill A.Datsenko&Barry L.Wanner馈赠)、E.coli MC4100(Regine Hengge-Aronis馈赠)、E.coli ZK126(Steven Finkel馈赠)、E.coli W3110(马志博士馈赠)替换E.coliNissle 1917，检测OD600值，结果如图1中A所示，表明在没有添加β-丙氨酸的条件下，E.coliNissle 1917在对数时期的生长状况要优于其它宿主；在添加100g/L的β-丙氨酸的条件下，E.coli Nissle 1917的生长状况也是优于其它宿主，因此选择益生菌E.coli Nissle 1917为底盘菌，记为菌株EcN。
(2)工程菌EcN-1构建：
将步骤1制备的重组质粒pGLO-PJ23100-panDK43Y，导入E.coli DH5α感受态(购自全式金公司)，冰上放置30min，热激90s，吸取1mL LB液体在37℃，220rpm条件下孵育2h。
将孵育液涂至含0.1mg/mL的氨苄青霉素抗性的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落测序。测序结果通过BLAST序列比对确认panD基因定点突变成功获得，即如SEQ IDNO.2所示，氨基酸序列第43位的原赖氨酸突变为酪氨酸。
将测序正确的重组质粒pGLO-PJ23100-PanDK43Y导入大肠杆菌E.coli Nissle 1917，获得菌株E.coli Nissle 1917/pGLO-PJ23100-PanDK43Y，记为工程菌EcN-1。
实施例2：敲除野生型EcN基因组中cycA基因
参照图1中B，为了增强E.coli Nissle 1917菌株对β-丙氨酸的耐受能力，通过λ-RED重组系统敲除E.coli Nissle 1917菌株基因组中编码β-丙氨酸转运蛋白的cycA基因，以获得耐高浓度β-丙氨酸的菌株，具体步骤如下：
(1)目的基因及同源臂扩增：以E.coli Nissle 1917菌株基因组为模板，使用表2中引物cycA-UP-F、引物cycA-Down-R，PCR扩增E.coli Nissle 1917基因组中包括cycA目的基因及上、下游同源臂的片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示(1-1006bp为上游同源臂，1007-2419bp为cycA目的基因，2420-3212bp为下游同源臂)。采用TA克隆试剂盒(购自Takara公司)，将PCR产物进行TA克隆，并利用琼脂糖凝胶电泳检测，获得含cycA目的基因及上下游同源臂片段的重组质粒；
cycA目的基因：
ATGGTAGATCAGGTAAAAGTCGTTGCCGATGATCAGGCTCCGGCTGAACAGTCGCTACGGCGCAATCTCACAAACCGACATATTCAGCTTATTGCCATTGGCGGTGCCATTGGTACAGGGCTGTTTATGGGGTCCGGCAAAACGATTAGCCTTGCCGGGCCGTCGATCATTTTCGTTTATATGATCATCGGTTTTATGCTCTTTTTCGTGATGCGGGCAATGGGGGAATTGCTGCTTTCGAATCTGGAATACAAATCTTTTAGTGACTTCGCTTCCGATTTACTCGGGCCGTGGGCAGGATATTTCACCGGCTGGACTTACTGGTTCTGCTGGGTTGTAACCGGTATGGCAGACGTGGTTGCCATTACCGCCTATGCGCAATTCTGGTTCCCTGGGCTTTCTGACTGGGTTGCTTCGTTATCCGTGATCATTCTGTTACTGGTTCTAAACCTCGCCACGGTAAAAATGTTCGGTGAGATGGAGTTCTGGTTTGCGATGATCAAAATCGTCGCCATCGTGTCGCTGATTGTTGTCGGCCTGGTCATGGTGGCGATGCACTTTCAGTCACCGACCGGTGTGGAAGCATCATTTGCACATTTGTGGAATGACGGCGGCTGGTTCCCGAAAGGCTTAAGCGGCTTCTTTGCCGGATTCCAGATAGCGGTTTTCGCTTTCGTGGGGATTGAGCTGGTAGGTACAACAGCTGCGGAAACCAAAGATCCGGAGAAATCACTGCCACGCGCGATTAACTCCATTCCGATCCGTATCATTATGTTCTACGTCTTCTCGCTGATTGTGATTATGTCCGTGACGCCGTGGAGTTCGGTAGTCCCGGAGAAAAGCCCGTTCGTTGAACTGTTTGTGTTGGTAGGTTTGCCTGCGGCTGCCAGCGTGATCAACTTTGTGGTGCTGACCTCTGCGGCGTCTTCCGCTAACAGCGGTGTCTTCTCTACCAGCCGTATGCTGTTTGGCCTGGCCCAGGAAGGTGTGGCACCGAAAGCGTTCGCTAAACTCTCTAAGCGCGCAGTACCCGCGAAAGGGCTGACCTTCTCTTGTATCTGTCTGCTCGGCGGCGTGGTGATGTTGTATGTGAATCCCAGCGTGATTGGCGCGTTCACGATGATTACAACCGTTTCCGCGATTCTGTTTATGTTTGTCTGGACGATTATCCTTTGCTCGTACCTGGTGTATCGCAAACAGCGTCCTCATCTGCATGAGAAGTCGATCTACAAGATGCCACTCGGCAAGCTGATGTGCTGGGTATGTATGGCGTTCTTTGTGTTTGTTCTGGTGTTGTTGACACTGGAAGATGACACCCGCCAGGCGCTGCTGGTTACCCCGCTGTGGTTTATCGCGCTGGGGCTGGGCTGGCTGTTTATTGGTAAGAAACGGGCTGCTGAACTGCGGAAATAA。
PCR反应条件如下：95℃5min；95℃15s，57℃15s，72℃4min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。
(2)抗性片段扩增：以pKD4质粒(Kirill A.Datsenko&Barry L.Wanner馈赠)为模板，使用表2中引物cycA-Kan-F、引物cycA-Kan-R，PCR扩增pKD4质粒上带有FRT的卡那抗性片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其中FRT抗性核苷酸序列SEQ ID NO.11中27-60bp和1420-1453bp；Kan抗性核苷酸序列如SEQ ID NO.11中435-1229bp。
PCR反应条件如下：95℃5min；95℃15s，57℃15s，72℃4min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。
(3)抗性片段替换目的基因：采用一步克隆试剂盒(购自诺唯赞公司)，利用一步克隆的方式，用步骤(2)SEQ ID NO.11所示带有FRT的卡那抗性片段替换步骤(1)获得的重组质粒上的cycA基因，获得新的重组质粒；以新的重组质粒为模板，利用引物cycA-UP-F、引物cycA-Down-R进行PCR，最终得到含有上下游同源臂的Kan抗性基因片段。
(4)感受态细胞：通过电转化的方法，将pKD46质粒(Kirill A.Datsenko&BarryL.Wanner馈赠)转入E.coli Nissle 1917菌株，获得含pKD46质粒的E.coli Nissle 1917菌株，接种至含有0.1mg/mL的氨苄青霉素和30mM L-阿拉伯糖的LB培养基中，在30℃培养至OD600达到0.6，菌液9000rpm离心5min，沉淀用无菌蒸馏水洗涤四次，获得感受态细胞。
(5)敲除目的基因的菌株：将步骤(3)含有上下游同源臂的Kan抗性基因片段在1.8KV下电转化至步骤(4)感受态细胞，将电转化后的菌液在37℃孵育2h，每1mL菌液9000rpm离心1min弃900μL上清后，取沉淀50μL涂布至含有0.05mg/mL卡那霉素和0.1mg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物cycA-检测-F和引物Kan-R-检测进行PCR。同样条件下，以野生型E.coli Nissle 1917为对照，分别进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如2中A所示。观察到在1.0％琼脂糖凝胶中敲除株存在DNA条带，出发菌株没有条带，确认cycA基因的缺失。筛选得到敲除cycA基因的菌株E.coli Nissle1917ΔcycA。
(6)消除质粒：将步骤(5)敲除cycA基因的菌株E.coli Nissle 1917ΔcycA接种在含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB液体培养基，37℃条件下培养12h以消除pKD46，稀释涂布至含0.05mg/mL卡那霉素抗性的LB平板，37℃条件下培养12h，筛选得到消除pKD46质粒的敲除株，采用步骤(4)方法制备感受态细胞。
(7)消除卡那霉素抗性：采用电转化方法，将pCP20质粒(购自Kirill A.Datsenko&Barry L.Wanner馈赠)导入步骤(6)感受态细胞，并在含0.025mg/mL氯霉素抗性的LB平板上30℃培养12h，筛选得到转化子。将转化子于含0.025mg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基，42℃培养12h用于消除E.coli Nissle 1917基因组上的卡那霉素抗性，培养的菌液用LB液体培养基稀释104倍后涂布于含0.025mg/mL氯霉素抗性的LB平板上，30℃培养12h。得到的单菌落先划短线于含0.05mg/mL卡那霉素抗性和0.025mg/mL氯霉素抗性的LB双抗平板上，37℃培养12h；再挑取双抗平板上的单菌落继续在含0.025mg/mL氯霉素抗性的LB平板上划短线，30℃培养12h。挑取在双抗上不长，在单抗上长的菌落，利用引物cycA-UP-F和引物cycA-Down-R进行菌落PCR。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2中B所示。观察到在1.0％琼脂糖凝胶中敲除cycA株存在的DNA条带相较于野生型的条带大小刚好是缺少目的基因cycA的大小即为消除Nissle 1917基因组上的卡那霉素抗性。
(8)消除pCP20质粒(Kirill A.Datsenko&Barry L.Wanner馈赠)：将步骤(7)在双抗上不长，在单抗上长的菌落分别接种至含0.025mg/mL氯霉素抗性的LB平板和不含0.025mg/mL氯霉素抗性的LB平板，分别于37℃培养12h，挑取在含0.025mg/mL氯霉素抗性的LB平板上不生长但在不含氯霉素抗性的LB平板上生长的无抗性的敲除株，即为E.coliNissle 1917ΔcycA菌株，将敲除株制备感受态，通过电转化的方法将重组质粒pGLO-PJ23100-PanDK43Y导入到敲除株中，得到工程菌E.coli Nissle 1917ΔcycA/pGLO-PJ23100-PanDK43Y，记为工程菌EcN-2。
(9)生物量测定及β-丙氨酸产量
生物量：将E.coli Nissle 1917以及E.coli Nissle 1917ΔcycA划线接种在LB平板上，在37℃培养箱中培养过夜，挑取单菌落接种至5ml的LB液体培养基中，并且以200rpm的转速在37℃培养箱中培养过夜，获得种子液。将1ml种子液接种至添加50ml基本盐M9培养基的250ml摇瓶中，同时添加0或100g/L的β-丙氨酸。然后摇瓶以200rpm的转速在37℃的培养箱中培养24小时，每隔2h从摇瓶中取1ml液体，测定OD600，结果如图3中A所示。
β-丙氨酸产量：将工程菌EcN-2划线接种在LB平板上，在37℃培养箱中培养过夜，挑取单菌落接种至5ml的LB液体培养基中，以200rpm的转速在37℃培养箱中培养过夜，获得种子液；将1ml种子液接种至添加50ml的基本盐M9培养基的250ml摇瓶中，同时添加100g/L的β-丙氨酸，以200rpm的转速在37℃的培养箱中发酵培养24小时后，取样测OD600值，同时从摇瓶中取1ml液体，9000rpm离心1min，取上清，并将其衍生化，采用孔径45μm的有机膜过滤后，滤液通过HPLC分析发酵液中β-丙氨酸的含量。同样条件下，分别用E.coli Nissle 1917以及实施例1构建的工程菌EcN-1替换工程菌EcN-2，结果参见图3中B所示。结果表明敲除EcN-1中对β-丙氨酸耐受能力的cycA基因能进一步提高β-丙氨酸的产量，对比EcN-1提高了1.17倍，产量达到0.499g/L。
HPLC检测条件：皖仪高效液相仪；色谱柱：XB-C18色谱柱(250mm×4.6nm)；流动相为甲醇：0.05mol/L的乙酸、乙酸钠溶液(55：45)；流速：1.0mL/min；柱温为室温。样品的衍生化：取100μL样品，加100μL 0.5mol/L的NaHCO3水溶液和0.1mL 1％的2，4—二硝基氟苯水溶液乙腈溶解的，在60℃下避光反应30min后，再加700μL 0.2mol/L pH为7的磷酸缓冲液。
表2：引物序列
| cycA-检测-F | AGCCAGATATCGACCCATTG |
| cycA-UP-F | GGATTTGTCATCATTCCCGCGA |
| cycA-UP-R | GCTCCAGCCTACACAATCGGTACCTGTCTGTGTTGTTCAGG |
| cycA-Down-F | TTCCCATGTCAGCCGTTAAGGCAATGCCATCCAGCTTTT |
| cycA-Down-R | ACACGCTGGCAGTGAGTTA |
| cycA-Kan-F | CCTGAACAACACAGACAGGTACCGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| cycA-Kan-R | AAAAGCTGGATGGCATTGCCTTAACGGCTGACATGGGAA |
| Kan-R-检测 | GCTTCCATCCGAGTACGTG |
实施例3：敲除工程菌EcN-2中的fumB1基因以及过表达aspA基因
通过λ-RED重组系统敲除E.coli Nissle 1917ΔcycA菌株中的fumB1基因，阻断富马酸流向苹果酸途径，从而使得β-丙氨酸进一步积累，构建增强富马酸到L-天冬氨酸途径的产β-丙氨酸益生工程菌株EcN-3，具体步骤如下：
(1)目的片段的扩增：以E.coli Nissle 1917基因组为模板，使用引物fumB1-UP-F、引物fumB1-down-R进行PCR扩增，获得含fumB1基因及上、下游同源臂片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示(1-1003bp为上游同源臂，1004-2650bp为fumB1基因，2651-3669bp为下游同源臂)。PCR反应条件如下：95℃5min；95℃15s，57℃15s，72℃4min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。采用TA克隆试剂盒(购自Takara公司)，将PCR产物进行TA克隆，并利用琼脂糖凝胶电泳检测，获得含fumB1目的基因及上下游同源臂片段的重组质粒；
fumB1基因：
ATGTCAAACAAACCCTTTCATTATCAGGCTCCTTTTCCACTCAAAAAAGATGATACTGAGTATTACCTGCTAACCAGCGAACACGTTAGCGTATCTGAATTTGAAGGGCAGGAGATTTTGAAAGTCGCACCCGAAGCGTTAACTCTGTTGGCGCGTCAGGCGTTTCATGATGCGTCATTTATGCTGCGTCCGGCTCACCAACAACAGGTGGCCGACATTCTGCGTGACCCGGAGGCCAGCGAAAATGATAAATATGTGGCGCTGCAATTCCTGCGTAACTCCGACATCGCGGCAAAAGGCGTTCTGCCAACCTGTCAGGATACCGGCACCGCGATTATTGTTGGTAAAAAAGGGCAGCGTGTATGGACCGGTGGCGGTGATGAAGCGGCGCTGGCGCGCGGTGTCTATAACACTTATATCGAGGATAATCTGCGCTACTCGCAAAACGCGCCGCTGGATATGTATAAAGAGGTGAATACCGGCACCAACTTGCCAGCGCAGATCGATCTTTATGCCGTTGATGGCGACGAGTACAAATTCCTCTGTATCGCCAAAGGTGGCGGTTCGGCAAACAAGACGTATCTCTATCAGGAAACCAAAGCGTTACTGACGCCGGGAAAACTGAAAAATTACCTGGTTGAGAAGATGCGCACGCTGGGTACGGCGGCCTGTCCTCCGTATCATATTGCGTTCGTTATTGGTGGAACTTCTGCAGAAACGAATCTTAAAACGGTGAAACTCGCTTCCGCTAAATACTATGATGAACTGCCAACGGAAGGGAATGAGCACGGTCAGGCGTTCCGCGATGTGGAACTGGAAAAAGAATTGCTGATCGAAGCGCAAAATCTTGGTCTGGGTGCGCAGTTTGGTGGTAAATACTTCGCTCATGACATCCGCGTGATTCGCCTGCCACGTCACGGCGCATCCTGCCCGGTCGGTATGGGCGTCTCCTGTTCTGCTGACCGTAATATCAAAGCGAAGATCAACCGTCAGGGGATCTGGATCGAAAAACTGGAACATAATCCAGGCAAATATATCCCGGAAGAGCTGCGCAAAGCAGGAGAAGGCGAAGCGGTGCGCGTTGACCTTAACCGTCCGATGAAAGAGATCCTCGCACAGTTGTCGCAGTATCCCGTTTCTACACGCTTATCGCTTAACGGCACGATTATCGTCGGTCGTGATATTGCTCACGCCAAACTGAAAGAGCGGATGGATAACGGTGAAGGGCTGCCGCAGTACATTAAAGATCATCCGATTTACTACGCGGGTCCGGCCAAAACGCCGGAAGGTTATGCCTCCGGTTCTCTTGGCCCAACGACCGCCGGACGGATGGATTCTTATGTCGATCAACTGCAAGCGCAGGGCGGAAGTATGATCATGCTGGCGAAAGGCAACCGCAGCCAGCAGGTGACGGATGCCTGTAAAAAACACGGCGGCTTCTACCTCGGCAGTATCGGTGGTCCGGCAGCTGTATTGGCGCAGGGAAGTATTAAGAGCCTGGAATGTGTTGAATATCCGGAACTGGGAATGGAAGCCATCTGGAAAATTGAAGTGGAAGATTTCCCGGCGTTTATCCTTGTGGATGATAAAGGAAATGACTTCTTCCAGCAGATACAACTCACACAATGCACCCGCTGTGTGAAATAA。
(2)抗性片段的扩增：同实施例2，以pKD4质粒为模板，使用引物fumB1-Kan-F、引物fumB1-Kan-R进行PCR扩增，获得带有FRT的卡那抗性片段。PCR反应条件同步骤(1)。
(3)抗性片段替换目的基因：采用一步克隆试剂盒(购自诺唯赞公司)，利用一步克隆的方式，用步骤(2)带有FRT的卡那抗性片段替换步骤(1)获得的重组质粒上的fumB1基因，获得新的重组质粒；以新的重组质粒为模板，利用引物fumB1-UP-F、引物fumB1-Down-R进行PCR，最终得到含有上下游同源臂的Kan抗性基因片段。
(4)感受态细胞：采用实施例2方法，将pKD46质粒转入E.coli Nissle 1917ΔcycA菌株，并制备感受态细胞。
(5)敲除目的基因的菌株：将步骤(3)Kan抗性基因片段在1.8KV下电转化至步骤(4)感受态细胞，将电转化后的菌液在30℃孵育2h，每1mL菌液9000rpm离心1min弃900μL上清后，取沉淀50μL涂布至含有0.05mg/mL卡那霉素和0.1mg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物fumB1-检测-F和引物Kan-R-检测进行PCR。同样条件下，以底盘菌E.coli Nissle 1917为对照，分别进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图4中A所示。观察到在1.0％琼脂糖凝胶中敲除株存在DNA条带，底盘菌没有条带，确认fumB1基因的缺失。筛选得到敲除fumB1基因和cycA基因的菌株。
(6)消除质粒：将步骤(5)菌株接种在0.05mg/mL卡那霉素抗性LB液体培养基，37℃条件下培养12h以消除pKD46，再接种至含0.05mg/mL卡那霉素抗性0.1mg/L氨苄青霉素0.05mg/L卡那霉素抗性LB平板，37℃条件下培养12h，筛选得到消除pKD46质粒的敲除株。按实施例1方法制备成感受态。
(7)消除抗性：将pCP20质粒导入步骤(6)感受态中，并在0.025mg/mL氯霉素抗性的LB平板上30℃培养筛选得到转化子，将转化子于0.025mg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基42℃培养12h用于消除Nissle 1917基因组上的卡那霉素抗性，培养的菌液用LB液体培养基稀释104倍后涂布于含0.025mg/mL氯霉素抗性的LB平板上，30℃培养12h。得到的单菌落先划短线于含0.05mg/mL卡纳霉素抗性和0.025mg/mL氯霉素抗性双抗的LB平板上，30℃培养12h。挑取双抗平板菌落继续在0.025mg/mL氯霉素抗性的LB平板上划短线，30℃培养12h。挑取在双抗上不长，在单抗上长的菌落利用引物fumB1-UP-F和引物fumB1-down-R进行菌落PCR，结果如图4中B所示。观察到在1.0％琼脂糖凝胶中敲除株存在的DNA条带相较于底盘菌的条带大小刚好是缺少目的基因fumB1的大小即为消除Nissle 1917基因组上的卡那霉素抗性。
(8)消除pCP20质粒：同实施例2方法消除pCP20质粒，获得无抗敲除株E.coliNissle 1917 ΔcycA ΔfumB1。
(9)重组质粒pSU19-PJ23100-aspA
以EcN基因组为模板，采用引物片段aspA-F、引物片段aspA-R进行PCR扩增，获得aspA基因扩增产物，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用DpnI消模板，获得aspA基因的纯化PCR产物片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。PCR反应条件：预变性95℃5min，95℃30s，57℃30s，72℃3min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
SEQ ID NO.9
ATGTCAAACAACATTCGTATCGAAGAAGATCTGTTGGGTACCAGGGAAGTTCCAGCTGATGCCTACTATGGTGTTCACACTCTGAGAGCGATTGAAAACTTCTATATCAGCAACAACAAAATCAGTGATATTCCTGAATTTGTTCGCGGTATGGTAATGGTTAAAAAAGCCGCAGCTATGGCAAACAAAGAGCTGCAAACCATTCCTAAAAGTGTAGCGAATGCCATCATTGCCGCATGTGATGAAGTCCTGAACAACGGAAAATGCATGGATCAGTTCCCGGTAGACGTCTACCAGGGCGGCGCAGGTACTTCCGTAAACATGAACACCAACGAAGTGCTGGCCAATATCGGTCTGGAACTGATGGGTCACCAGAAAGGTGAATATCAGTACCTGAACCCGAACGACCATGTTAACAAATGTCAGTCCACTAACGACGCCTACCCGACCGGTTTCCGTATCGCAGTTTACTCTTCCCTGATTAAACTGGTAGATGCGATTAACCAACTGCGTGAAGGCTTTGAACGTAAAGCTGTCGAATTCCAGGACATCCTGAAAATGGGTCGTACCCAGCTGCAGGACGCAGTACCGATGACCCTCGGTCAGGAATTCCGCGCCTTCAGCATCCTGCTGAAAGAAGAAGTGAAAAATATCCAACGTACCGCTGAACTGCTGCTGGAAGTTAACCTTGGCGCAACAGCAATCGGTACTGGTCTGAACACGCCGAAAGAGTACTCTCCGCTGGCAGTGAAAAAACTGGCTGAAGTCACTGGCTTCCCATGCGTACCGGCTGAAGACCTGATCGAAGCGACCTCCGACTGCGGCGCTTATGTTATGGTTCACGGCGCGCTGAAACGCCTGGCTGTGAAGATGTCCAAAATCTGTAACGACCTGCGCTTGCTCTCTTCTGGTCCACGTGCCGGCCTGAACGAGATCAACCTGCCGGAACTGCAGGCAGGCTCTTCCATCATGCCAGCTAAAGTAAACCCGGTTGTTCCGGAAGTGGTTAACCAGGTATGCTTCAAAGTCATCGGTAACGACACCACTGTTACCATGGCAGCAGAAGCAGGTCAGCTGCAGTTGAACGTTATGGAGCCAGTCATTGGCCAGGCCATGTTCGAATCCGTTCACATTCTGACCAACGCTTGCTACAACCTGCTGGAAAAATGCATTAACGGCATCACTGCTAACAAAGAAGTGTGCGAAGGTTACGTTTACAACTCTATCGGTATCGTTACTTACCTGAACCCGTTCATCGGTCACCACAACGGTGACATCGTGGGTAAAATCTGTGCCGAAACCGGTAAGAGTGTACGTGAAGTCGTTCTGGAACGCGGTCTGTTGACTGAAGCGGAACTTGACGATATTTTCTCCGTACAGAATCTGATGCACCCGGCTTACAAAGCAAAACGCTATACTGATGAAAGCGAACAGTAA。
以pSU19载体(购自Rosemary Redfield馈赠)作为模板，采用表3中引物pSU19-载体-R、引物pSU19-载体-F进行PCR扩增。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用DpnI消模板，纯化PCR产物片段，获得pSU19线性化载体。
采用一步克隆试剂盒，利用一步克隆将psU19载体与aspA基因的纯化PCR产物片段进行连接，得到克隆重组质粒pSU19-PJ23100-aspA。以上重组质粒经过测序检验均为正确质粒。
(10)重组菌：将步骤(8)敲除株制备感受态，通过电转化的方法将重组质粒pGLO-PJ23100-PanDK43Y和pSU19-PJ23100-aspA导入到敲除株E.coli Nissle 1917ΔcycAΔfumB1中，获得工程菌E.coli Nissle 1917ΔcycAΔfumB1/pGLO-PJ23100-PanDK43Y/pSU19-PJ23100-aspA，记为菌株EcN-3。
采用实施例2方法进行菌株EcN-2和EcN-3生物量及β-丙氨酸产量的测定，结果如图4中C所示。结果表明EcN-2敲除fumB1基因积累富马酸并过表达aspA基因能使β-丙氨酸的产量提高，对比EcN-2菌株提高了1.2倍，产量达到0.595g/L。
表3：引物序列
实施例4：敲除工程菌EcN-3中的aspC基因并过表达aspB基因
为了使L-天冬氨酸的积累，需要使更多的OAA生成L-Asp，因此，通过λ-RED重组系统对E.coli Nissle 1917ΔcycAΔfumB1菌株中的aspC基因进行敲除并过表达来自谷氨酸棒杆菌来源的aspB，构建增强草酰乙酸到L-天冬氨酸途径的产β-丙氨酸的工程菌株EcN-4，具体步骤如下：
(1)目的基因扩增：以E.coli Nissle 1917基因组为模板，使用引物aspC-UP-F、引物aspC-down-R进行PCR扩增，获得含目的基因aspC及上下游同源臂片段，核苷酸序列如SEQID NO.6所示(1-1021bp为上游同源臂，1022-2212bp为目的基因aspC，2213-3236bp为下游同源臂)；将PCR产物纯化，采用一步克隆试剂盒(购自诺唯赞)进行TA克隆，获得重组质粒；PCR反应条件如下：95℃5min；95℃15s，57℃15s，72℃4min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。
基因aspC：
ATGTTTGAGAACATTACCGCCGCTCCTGCCGACCCGATTCTGGGCCTGGCCGATCTGTTTCGTGCCGATGAACGTCCCGGCAAAATTAACCTCGGGATTGGTGTCTATAAAGATGAGACGGGTAAAACCCCGGTACTGACCAGCGTGAAAAAGGCTGAACAGTATCTGCTCGAAAATGAAACCACCAAAAATTACCTCGGCATTGACGGCCTCCCTGAATTTGGTCGCTGCACTCAGGAACTGCTGTTTGGTAAAGGTAGCGCCCTGATCAATGACAAACGTGCTCGCACGGCACAGACTCCGGGTGGCACTGGCGCACTACGCGTGGCTGCCGATTTCCTGGCAAAAAATACCAGCGTTAAGCGTGTGTGGGTGAGCAACCCAAGCTGGCCGAACCATAAGAGCGTCTTTAACTCTGCAGGTCTGGAAGTTCGTGAATACGCTTATTATGATGCGGAAAATCACACTCTTGACTTCGATGCACTGATTAACAGCCTGAACGAAGCTCAGGCTGGCGACGTAGTGCTGTTCCATGGCTGCTGCCATAACCCAACCGGCATCGACCCTACGCTGGAACAATGGCAGACACTGGCACAACTCTCCGTTGAGAAAGGCTGGTTACCGCTGTTTGACTTCGCTTACCAGGGTTTTGCCCGTGGTCTGGAAGAAGATGCTGAAGGACTGCGCGCTTTCGCGGCTCTGCATAAGGAGCTGATTGTTGCCAGTTCCTACTCTAAAAACTTTGGCCTGTACAACGAGCGTGTTGGCGCTTGTACTCTGGTTGCTGCTGACAGTGAAACTGTTGAACGCGCATTCAGCCAAATGAAAGCGGCGATTCGTGCTAACTACTCTAACCCACCAGCACACGGCGCTTCTGTTGTTGCCACCATCCTGAGCAACGATGCGTTACGTGCGATTTGGGAACAAGAACTGACTGATATGCGCCAGCGTATTCAGCGTATGCGTCAGTTGTTCGTCAATACGCTGCAGGAAAAAGGCGCAAATCGCGACTTCAGCTTTATCATCAAACAGAACGGCATGTTCTCCTTCAGTGGCCTGACAAAAGAACAAGTGCTGCGTCTGCGCGAAGAGTTTGGCGTATATGCTGTTGCTTCTGGTCGCGTAAACGTAGCTGGGATGACACCAGATAACATGGCGCCGCTGTGCGAAGCGATTGTGGCAGTGCTGTAA。
(2)带有FRT的卡那抗性片段：采用实施例2方法，以pKD4质粒为模板，采用aspC-Kan-F、引物aspC-Kan-R引物进行PCR扩增，获得带有FRT的卡那抗性片段。PCR反应条件同步步骤(1)。
(3)抗性片段替换目的基因：采用一步克隆试剂盒(购自诺唯赞)，利用一步克隆的方式，用步骤(2)带有FRT的卡那抗性片段替换步骤(1)获得的重组质粒上的aspC基因，获得新的重组质粒；以新的重组质粒为模板，利用引物aspC-UP-F、引物aspC-Down-R进行PCR，最终得到含有上下游同源臂的Kan抗性基因片段。
(4)感受态细胞：采用实施例2方法，将质粒pKD46转入E.coli Nissle 1917ΔcycAΔfumB1，并制备感受态细胞。
(5)敲除目的基因的菌株：将步骤(3)Kan抗性基因片段在1.8KV下电转化至步骤(4)感受态细胞，将电转化后的菌液在37℃孵育2h，每1mL菌液9000rpm离心1min弃900μL上清后，取沉淀50μL涂布至含有0.05mg/mL卡那霉素和0.1mg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物aspC-检测-F和引物Kan-R-检测进行PCR。同样条件下，以底盘菌E.coli Nissle 1917为对照，分别进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如5中A所示。观察到在1.0％琼脂糖凝胶中敲除株存在DNA条带，底盘菌没有条带，确认aspC基因的缺失。筛选获得敲除cycA、fumB1和aspC的菌株。
(6)消除质粒：将步骤(5)菌株接种在含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB液体培养基，37℃条件下培养12h以消除pKD46，再接种至含0.05mg/mL卡那霉素抗性以及0.1mg/mL氨苄青霉素和0.05mg/mL卡那霉素双抗性LB平板，37℃条件下培养12h，筛选得到消除pKD46质粒的敲除株。按实施例2方法制备感受态。
(7)消除抗性：将pCP20质粒导入步骤(6)感受态中，并在0.025mg/mL氯霉素抗性的LB平板上30℃培养12h筛选得到转化子，将转化子于0.025mg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基42℃培养12h用于消除Nissle 1917基因组上的卡那霉素抗性，培养的菌液用LB液体培养基稀释104倍涂布于0.025mg/mL氯霉素抗性的LB平板上，30℃培养12h。得到的单菌落先划短线于0.05mg/mL卡那霉素抗性和0.025mg/mL氯霉素抗性双抗的LB平板上，30℃培养12h；挑取双抗平板菌落继续在0.025mg/mL氯霉素抗性的LB平板上划短线，30℃培养12h。挑取在双抗上不长，在单抗上长的菌落利用引物aspC-UP-F和引物aspC-down-R菌落PCR。同样条件下，以底盘菌E.coli Nissle 1917为对照，分别进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如5中B。观察到在1.0％琼脂糖凝胶中敲除株存在的DNA条带相较于野生型的条带大小刚好是缺少目的基因aspC的大小即为消除Nissle 1917基因组上的卡那霉素抗性。
(8)消除pCP20质粒：将步骤(7)挑取的菌株按实施例2方法消除pCP20质粒，筛选得到的无抗敲除株E.coli Nissle 1917 ΔcycA ΔfumB1ΔaspC。
(9)重组质粒pGLO-PJ23100-panDK43Y-aspB
以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum，张博馈赠)基因组为模板，采用引物片段aspB-F、引物片段aspB-R进行PCR扩增，获得aspB基因扩增产物(核苷酸序列如SEQID NO.8所示)，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用DpnI消模板，aspB基因的纯化PCR产物片段。PCR反应条件：预变性95℃5min，95℃30s，57℃30s，72℃3min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
以实施例1构建的pGLO-PJ23100-panDK43Y载体作为模板，采用引物aspB-载体-R、引物aspB-载体-F进行PCR扩增，获得pGLO-PJ23100-panDK43Y载体。
采用一步克隆试剂盒，利用一步克隆将pGLO-PJ23100-panDK43Y载体与aspB基因的纯化PCR产物片段进行连接，得到克隆重组质粒pGLO-PJ23100-panDK43Y-aspB(构建过程及图谱见图5中C)。以上重组质粒经过测序检验均为正确质粒。
(10)重组菌：将重组质粒pGLO-PJ23100-panDK43Y-aspB和pSU19-PJ23100-aspA导入E.coli Nissle 1917ΔcycA ΔfumB1 ΔaspC中，获得菌株E.coli Nissle 1917ΔcycA ΔfumB1ΔaspC/pGLO-PJ23100-panDK43Y-aspB/pSU19-PJ23100-aspA，记为工程菌EcN-4。
采用实施例2方法对工程菌EcN-3和EcN-4进行生物量及β-丙氨酸产量的测定，结果如图5中D所示。结果表明敲除EcN基因组上aspC基因并过表达来自谷氨酸棒杆菌来源的aspB基因能进一步提高β-丙氨酸的产量，对比EcN-3菌株提高了1.59倍，产量达到0.924g/L。
表4：引物序列
| 检测-F | ACGATCCGGGATATCTCGA |
| aspC-UP-F | TCGACCCAGGATTATTCGAC |
| aspC-UP-R | GCTCCAGCCTACACAATCGGTTAAAACCGATGAAGCCCG |
| aspC-Kan-F | CGGGCTTCATCGGTTTTAACCGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| aspC-Kan-R | GGACTTCCCTTCTGTAACCAACTTAACGGCTGACATGGGA |
| aspC-Down-F | TCCCATGTCAGCCGTTAAGTTGGTTACAGAAGGGAAGTCC |
| aspC-Down-R | CGGTTATGGTCAGTGGGAATA |
| aspB载体-F | GTGAATACAGCGGAGACAGAGAGTAGGGAACTGCCAG |
| aspB载体-R | TCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAACCTGCAGGTCGACTCTAGA |
| aspB片段-F | TTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGAAGAGTAGTGGCTTGAGGTCA |
| aspB片段-R | CTGTCTCCGCTGTATTCAC |
实施例5：敲除工程菌EcN-4中的pyk基因
为了使更多的草酰乙酸流向L-天冬氨酸，通过λ-RED重组系统对E.coli Nissle1917ΔcycA ΔfumB1ΔaspC/pGLO-PJ23100-panDK43Y-aspB菌株中PEP流向丙酮酸途径的相关基因pyk敲除，增强磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸代谢途径，构建增强磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸途径的产β-丙氨酸工程菌株EcN-5，具体步骤如下：
(1)以E.coliE.coli Nissle 1917基因组为模板，采用引物pyk-UP-F、引物pyk-down-R进行PCR扩增，获得目的基因pyk及上下游同源臂的片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示(1-986bp为上游同源臂，987-2429bp为目的基因pyk，2430-3553bp为下游同源臂)；将PCR产物纯化，采用TA克隆试剂盒进行TA克隆，获得重组质粒；PCR反应条件如下：95℃5min；95℃15s，57℃15s，72℃4min，重复30个循环；72℃继续延伸10min。
基因pyk：
ATGTCCAGAAGGCTTCGCAGAACTAAAATCGTTACCACGTTAGGCCCGGCAACAGATCGCGATAATAACCTTGAAAAAGTTATCGCGGCGGGTGCCAACGTTGTACGTATGAATTTTTCTCACGGCTCGCCTGAAGATCACAAAATGCGCGCGGATAAAGTTCGTGAGATTGCCGCAAAACTGGGGCGTCATGTGGCTATTCTGGGTGACCTCCAGGGGCCCAAAATCCGTGTATCCACCTTTAAAGAAGGCAAAGTTTTCCTCAATATTGGGGATAAATTCCTGCTCGACGCCAACCTGGGTAAAGGTGAAGGCGACAAAGAAAAAGTCGGTATCGACTACAAAGGCCTGCCTGCTGACGTTGTGCCTGGTGACATCCTGCTGCTGGACGATGGTCGCGTCCAGTTAAAAGTACTGGAAGTCCAGGGCATGAAAGTGTTCACCGAAGTGACCGTCGGTGGTCCCCTCTCCAACAATAAAGGTATCAACAAACTTGGCGGCGGTTTGTCAGCTGAAGCGCTGACCGAAAAAGACAAAGCAGACATTAAGACTGCGGCGTTGATTGGCGTAGATTACCTGGCTGTCTCCTTCCCACGCTGCGGCGAAGATCTGAACTATGCCCGTCGTCTGGCACGCGATGCAGGATGTGATGCGAAAATTGTTGCCAAGGTTGAACGTGCGGAAGCCGTTTGCAGCCAGGAGGCAATGGATGACATCATCCTCGCCTCTGACGTGGTAATGGTTGCTCGCGGCGACCTCGGTGTGGAAATTGGCGATCCGGAACTGGTCGGCATTCAGAAAGCGTTGATCCGTCGTGCGCGTCAGCTTAACCGCGCGGTAATCACGGCGACCCAGATGATGGAGTCAATGATTACTAACCCGATGCCGACGCGTGCAGAAGTCATGGACGTAGCAAACGCCGTTCTGGATGGTACTGACGCTGTGATGCTGTCGGCAGAAACTGCTGCTGGTCAATACCCGTCAGAAACTGTTGCAGCCATGGCGCGCGTTTGCCTGGGGGCGGAAAAAATCCCGAGCATCAACGTTTCTAAACACCGTCTGGACGTTCAGTTCGACAATGTGGAAGAAGCTATTGCCATGTCAGCAATGTACGCGGCTAACCACCTGAAAGGCGTTACGGCGATCATCACCATGACCGAATCGGGTCGTACCGCGCTGATGACCTCCCGTATCAGCTCTGGTCTGCCAATTTTCGCCATGTCACGCCATGAACGTACGCTGAACCTGACTGCTCTCTATCGCGGCGTTACGCCGGTGCACTTTGATAGCGCTAATGACGGTGTAGCAGCTGCCAGCGAAGCGGTTAATCTGCTGCGTGATAAAGGTTACTTGATGTCTGGTGACCTGGTGATTGTCACCCAGGGCGACGTGATGAGTACCGTGGGTTCTACTAATACCACGCGTATTTTAACGGTAGAGTAA。
(2)带有FRT的卡那抗性片段：采用实施例2方法，以pKD4质粒为模板，采用pyk-Kan-F、引物pyk-Kan-R引物进行PCR扩增，获得带有FRT的卡那抗性片段。PCR反应条件同步步骤(1)。
(3)抗性片段替换目的基因：采用一步克隆试剂盒，利用一步克隆的方式，用步骤(2)带有FRT的卡那抗性片段替换步骤(1)获得的重组质粒上的pyk基因，获得新的重组质粒；以新的重组质粒为模板，利用引物pyk-UP-F、引物pyk-Down-R进行PCR，最终得到含有上下游同源臂的Kan抗性基因片段。
(4)感受态细胞：采用实施例2方法，将质粒pKD46转入E.coli Nissle 1917 ΔcycA ΔfumB1 ΔaspC，并制备感受态细胞。
(5)敲除目的基因的菌株：将步骤(3)Kan抗性基因片段在1.8KV下电转化至步骤(4)感受态细胞，将电转化后的菌液在30℃孵育2h，每1mL菌液9000rpm离心1min弃900μL上清后，取沉淀50μL涂布至含有0.05mg/mL卡那霉素和0.1mg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板上，30℃培养过夜。挑取单菌落作为模板，以引物pyk-检测-F和引物Kan-R-检测进行PCR。同样条件下，以底盘菌E.coli Nissle 1917为对照，分别进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如6中A所示。观察到在1.0％琼脂糖凝胶中敲除株存在DNA条带，野生型没有条带确认pyk基因的缺失。筛选获得敲除cycA、fumB1、aspC、pyk的菌株。
(6)消除质粒：将步骤(5)菌株接种在含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB液体培养基，37℃条件下培养12h以消除pKD46，再接种至含0.05mg/mL卡那霉素抗性以及0.1mg/mL氨苄青霉素和0.05mg/mL卡那霉素双抗性LB平板，37℃条件下培养12h，筛选得到消除pKD46质粒的敲除株。按实施例1方法制备感受态。
(7)消除抗性：将pCP20质粒导入步骤(6)感受态中，并在0.025mg/mL氯霉素抗性的LB平板上30℃培养12h筛选得到转化子，将转化子于0.025mg/mL氯霉素抗性的LB液体培养基37℃培养12h用于消除Nissle 1917基因组上的卡那霉素抗性，培养的菌液用LB培养液稀释104倍涂布于0.025mg/mL氯霉素抗性的LB平板上，30℃培养12h。得到的单菌落先划短线于0.05mg/mL卡那霉素抗性和0.025mg/mL氯霉素抗性双抗的LB平板上，30℃培养12h；挑取双抗平板菌落继续在0.025mg/mL氯霉素抗性的LB平板上划短线，30℃培养12h。挑取在双抗上不长，在单抗上长的菌落利用引物pyk-UP-F和引物pyk-down-R菌落PCR。同样条件下，以底盘菌E.coli Nissle 1917为对照，分别进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如6中B所示。观察到在1.0％琼脂糖凝胶中敲除株存在的DNA条带相较于野生型的条带大小刚好是缺少目的基因pyk的大小即为消除Nissle 1917基因组上的卡那霉素抗性。
(8)消除pCP20质粒：将步骤(7)挑取的菌株按实施例2方法消除pCP20质粒，筛选得到的无抗敲除株E.coli Nissle 1917 ΔcycA ΔfumB1ΔaspCΔpyk，获得菌株E.coliNissle 1917 ΔcycA ΔfumB1ΔaspCΔpyk。将重组质粒pGLO-PJ23100-panDK43Y-aspB和pSU19-PJ23100-aspA导入E.coli Nissle 1917 ΔcycA ΔfumB1 ΔaspC Δpyk，获得工程菌E.coli Nissle 1917 ΔcycA ΔfumB1ΔaspCΔpyk/pGLO-PJ23100-panDK43Y-aspB/pSU19-PJ23100-aspA，记为工程菌EcN-5。
采用实施例2方法测定工程菌EcN-4和EcN-5的生物量及β-丙氨酸产量，结果如图6中C所示。结果表明阻断PEP流向丙酮酸的前提下，过表达谷氨酸棒杆菌来源的ppC基因能提高β-丙氨酸的产量，对比EcN-4菌株，提高了1.14倍，产量达到1.0g/L。
表5：引物序列
| 检测-F | GATCAATGGTGCGATTGTCC |
| pyk-UP-F | TCCAGTCTCAGCTGGAACAT |
| pyk-UP-R | GCTCCAGCCTACACAATCGCTGGACATGTAATACTCCGTTG |
| pyk-down-F | TCCCATGTCAGCCGTTAAGTAGTAAGTACGTTGCCGGATG |
| pyk-down-R | CCGAAACTGGAAAAGCATGG |
| pyk-Kan-F | CAACGGAGTATTACATGTCCAGCGATTGTGTAGGCTGGAGC |
| pyk-kan-R | CATCCGGCAACGTACTTACTACTTAACGGCTGACATGGGA |
实施例6：构建表达天冬氨酸解氨酶编码基因(aspA)和磷酸烯醇丙酮酸羧化酶编码基因(ppC)的重组质粒及相应工程菌EcN-6。
(1)以E.coli Nissle 1917基因组为模板，采用表6中引物aspA-F、引物aspA-R进行PCR扩增。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用DpnI消模板，纯化PCR产物片段，获得目的基因aspA片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)。
PCR反应条件：预变性95℃5min，95℃30s，57℃30s，72℃3min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
(2)以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)基因组为模板，采用表6中引物pSU19-载体-F和pSU19-载体-R进行PCR扩增。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用DpnI消模板，纯化PCR产物片段，获得目的基因ppC片段(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)。
SEQ ID NO.10
ATGACTGATTTTTTACGCGATGACATCAGGTTCCTCGGTCAAATCCTCGGTGAGGTAATTGCGGAACAAGAAGGCCAGGAGGTTTATGAACTGGTCGAACAAGCGCGCCTGACTTCTTTTGATATCGCCAAGGGCAACGCCGAAATGGATAGCCTGGTTCAGGTTTTCGACGGCATTACTCCAGCCAAGGCAACACCGATTGCTCGCGCATTTTCCCACTTCGCTCTGCTGGCTAACCTGGCGGAAGACCTCTACGATGAAGAGCTTCGTGAACAGGCTCTCGATGCAGGCGACACCCCTCCGGACAGCACTCTTGATGCCACCTGGCTGAAACTCAATGAGGGCAATGTTGGCGCAGAAGCTGTGGCCGATGTGCTGCGCAATGCTGAGGTGGCGCCGGTTCTGACTGCGCACCCAACTGAGACTCGCCGCCGCACTGTTTTTGATGCGCAAAAGTGGATCACCACCCACATGCGTGAACGCCACGCTTTGCAGTCTGCGGAGCCTACCGCTCGTACGCAAAGCAAGTTGGATGAGATCGAGAAGAACATCCGCCGTCGCATCACCATTTTGTGGCAGACCGCGTTGATTCGTGTGGCCCGCCCACGTATCGAGGACGAGATCGAAGTAGGGCTGCGCTACTACAAGCTGAGCCTTTTGGAAGAGATTCCACGTATCAACCGTGATGTGGCTGTTGAGCTTCGTGAGCGTTTCGGCGAGGGTGTTCCTTTGAAGCCCGTGGTCAAGCCAGGTTCCTGGATTGGTGGAGACCACGACGGTAACCCTTATGTCACCGCGGAAACAGTTGAGTATTCCACTCACCGCGCTGCGGAAACCGTGCTCAAGTACTATGCACGCCAGCTGCATTCCCTCGAGCATGAGCTCAGCCTGTCGGACCGCATGAATAAGGTCACCCCGCAGCTGCTTGCGCTGGCAGATGCAGGGCACAACGACGTGCCAAGCCGCGTGGATGAGCCTTATCGACGCGCCGTCCATGGCGTTCGCGGACGTATCCTCGCGACGACGGCCGAGCTGATCGGCGAGGACGCCGTTGAGGGCGTGTGGTTCAAGGTCTTTACTCCATACGCATCTCCGGAAGAATTCTTAAACGATGCGTTGACCATTGATCATTCTCTGCGTGAATCCAAGGACGTTCTCATTGCCGATGATCGTTTGTCTGTGCTGATTTCTGCCATCGAGAGCTTTGGATTCAACCTTTACGCACTGGATCTGCGCCAAAACTCCGAAAGCTACGAGGACGTCCTCACCGAGCTTTTCGAACGCGCCCAAGTCACCGCAAACTACCGCGAGCTGTCTGAAGCAGAGAAGCTTGAGGTGCTGCTGAAGGAACTGCGCAGCCCTCGTCCGCTGATCCCGCACGGTTCAGATGAATACAGCGAGGTCACCGACCGCGAGCTCGGCATCTTCCGCACCGCGTCGGAGGCTGTTAAGAAATTCGGGCCACGGATGGTGCCTCACTGCATCATCTCCATGGCATCATCGGTCACCGATGTGCTCGAGCCGATGGTGTTGCTCAAGGAATTCGGACTCATCGCAGCCAACGGCGACAACCCACGCGGCACCGTCGATGTCATCCCACTGTTCGAAACCATCGAAGATCTCCAGGCCGGCGCCGGAATCCTCGACGAACTGTGGAAAATTGATCTCTACCGCAACTACCTCCTGCAGCGCGACAACGTCCAGGAAGTCATGCTCGGTTACTCCGATTCCAACAAGGATGGCGGATATTTCTCCGCAAACTGGGCGCTTTACGACGCGGAACTGCAGCTCGTCGAACTATGCCGATCAGCCGGGGTCAAGCTTCGCCTGTTCCACGGCCGTGGTGGCACCGTCGGCCGCGGTGGCGGACCTTCCTACGACGCGATTCTTGCCCAGCCCAGGGGGGCTGTCCAAGGTTCCGTGCGCATCACCGAGCAGGGCGAGATCATCTCCGCTAAGTACGGCAACCCCGAAACCGCGCGCCGAAACCTCGAAGCCCTGGTCTCAGCCACGCTTGAGGCATCGCTTCTCGACGTCTCCGAACTCACCGATCACCAACGCGCGTACGACATCATGAGTGAGATCTCTGAGCTCAGCTTGAAGAAGTACGCCTCCTTGGTGCACGAGGATCAAGGCTTCATCGATTACTTCACCCAGTCCACGCCGCTGCAGGAGATTGGATCCCTCAACATCGGATCCAGGCCTTCCTCACGCAAGCAGACCTCCTCGGTGGAAGATTTGCGAGCCATCCCATGGGTGCTCAGCTGGTCACAGTCTCGTGTCATGCTGCCAGGCTGGTTTGGTGTCGGAACCGCATTAGAGCAGTGGATTGGCGAAGGGGAGCAGGCCACCCAACGCATTGCCGAGCTGCAAACACTCAATGAGTCCTGGCCATTTTTCACCTCAGTGTTGGATAACATGGCTCAGGTGATGTCCAAGGCAGAGCTGCGTTTGGCAAAGCTCTACGCAGACCTGATCCCAGATACGGAAGTAGCCGAGCGAGTCTATTCCGTCATCCGCGAGGAGTACTTCCTGACCAAGAAGATGTTCTGCGTAATCACCGGCTCTGATGATCTGCTTGATGACAACCCACTTCTCGCACGCTCTGTCCAGCGCCGATACCCCTACCTGCTTCCACTCAACGTGATCCAGGTAGAGATGATGCGACGCTACCGAAAAGGCGACCAAAGCGAGCAAGTGTCCCGCAACATTCAGCTGACCATGAACGGTCTTTCCACTGCGCTGCGCAACTCCGGCTAG。
PCR反应条件同步骤(1)。
(3)以pSU19载体(购自Rosemary Redfield馈赠)作为模板，采用表6中引物pSU19-载体-R、引物pSU19-载体-F进行PCR扩增。PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用DpnI消模板，纯化PCR产物片段，获得pSU19线性化载体。
(4)采用一步克隆试剂盒，利用一步克隆将步骤(3)pSU19载体与步骤(2)目的基因ppC片段进行连接，得到克隆重组质粒pSU19-Plac-ppC(构建过程及图谱参见图7中A)。
(5)以重组质粒pSU19-Plac-ppC为模板，利用表6中引物pSU19-ppC-F、引物pSU19-ppc-R进行PCR扩增，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用DpnI消模板，纯化PCR产物片段，获得线性化载体pSU19-Plac-ppC。
PCR反应条件：预变性95℃5min，95℃30s，57℃30s，72℃4min，共30个循环，最后72℃延伸10min。
(6)采用一步克隆试剂盒，利用一步克隆将步骤(5)片段与步骤(1)目的基因aspA片段连接，得到重组质粒pSU19-Plac-ppC-aspA(构建过程及图谱参见图7中A所示)。
(7)以重组质粒pSU19-Plac-ppC-aspA为模板，利用引物J23100-aspA+ppC-F、引物J23100-aspA+ppC-R进行PCR扩增，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测并用DpnI消模板，纯化PCR产物片段，得到克隆重组质粒pSU19-PJ23100-ppC-aspA。
PCR反应条件：预变性95℃5min，95℃30s，57℃30s，72℃4min，共30个循环，最后72℃延伸10min。以上重组质粒经过测序检验均为正确质粒。
(8)将重组质粒pSU19-PJ23100-ppC-aspA导入菌株E.coli Nissle 1917 ΔcycA ΔfumB1 ΔaspCΔpyk/pGLO-PJ23100-panDK43Y-aspB，获得菌株E.coli Nissle 1917 ΔcycA ΔfumB1 ΔaspCΔpyk/pGLO-PJ23100-panDK43Y-aspB/pSU19-PJ23100-ppC-aspA，记为工程菌EcN-6。
采用实施例2方法，检测工程菌EcN-5和EcN-6的生物量及β-丙氨酸产量，结果如图7中B所示。结果表明增强PEP到OAA途径能进一步提高β-丙氨酸的产量，对比EcN-5菌株，提高了1.2倍，产量达到1.19g/L。
表6：引物序列
实施例7：工程菌EcN-6摇瓶培养碳氮源优化以及发酵生产β-丙氨酸工艺。
1、不同工程菌产β-丙氨酸的能力
将底盘菌E.coli Nissle 1917(EcN)，实施例1-6构建的工程菌EcN-1、EcN-2、EcN-3、EcN-4、EcN-5、EcN-6分别在摇瓶中进行发酵实验测试，以比较各基因型菌株之间生产β-丙氨酸的能力，摇瓶发酵实验按如下方案进行：
将每个菌株划线接种在含有0.1mg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板上，在37℃培养箱中培养过夜，挑取单菌落接种至5ml的LB液体培养基中，并且以200rpm的转速在37℃培养箱中培养过夜，获得种子液。LB平板培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂2g/L，溶剂为水，pH值自然。LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然。
在250ml的摇瓶中添加50ml的基本盐M9培养基，并将1ml种子液接种至摇瓶的基本盐M9培养基中。然后摇瓶以200rpm的转速在37℃的培养箱中培养24小时，从摇瓶中取1ml液体，9000rpm离心1min，取上清，并将其衍生化，采用孔径0.45μm的有机膜过滤后，滤液通过实施例2所述HPLC分析发酵液中β-丙氨酸的含量，最终比较携带质粒的每种菌株获得β-丙氨酸的量，结果参见图8中A。
基本盐M9培养基组成：K2HPO4·3H2O 14g/L、KH2PO4 5.2g/L、(NH4)2SO4 2g/L、MgSO40.3g/L、胰蛋白胨1g/L，溶剂为ddH2O，pH值7.0，溶剂为水。
经发酵之后除底盘菌Nissle1917菌株检测不到产量外，其它改造菌株均具有生产β-丙氨酸的能力，而且对β-丙氨酸转运系统的改造明显提高了菌株对高浓度β-丙氨酸的耐受能力。经过改造后的菌株在生产β-丙氨酸的水平相较于原始菌株都有不同程度的提高。
2、碳源优化
碳源优化培养基：10g/L碳源、K2HPO4·3H2O 14g/L、KH2PO4 5.2g/L、(NH4)2SO4 2g/L、MgSO4 0.3g/L、胰蛋白胨1g/L，溶剂为ddH2O，pH值7.0，溶剂为水。
选取糊精、蔗糖、淀粉、甘油、果糖、乳糖、葡萄糖为碳源，在250ml的摇瓶中添加50ml碳源优化培养基。将1ml步骤1制备的种子液接种至碳源优化培养基的摇瓶中，以200rpm的转速在37℃的培养箱中培养24小时，从摇瓶中取1ml液体，9000rpm离心1min，取上清，采用步骤1方法分析发酵液中β-丙氨酸的含量，结果如图8中B所示，结果显示最优碳源为10g/L甘油。
3、氮源优化
氮源优化培养基：2g/L氮源、10g/L葡萄糖、K2HPO4·3H2O 14g/L、KH2PO4 5.2g/L、MgSO4 0.3g/L，溶剂为ddH2O，pH值7.0，溶剂为水。
选取2g/L尿素、2g/L氯化铵、2g/L硫酸铵、2g/L蛋白胨、2g/L酵母粉、1g/L尿素与1g/L蛋白胨、1g/L氯化铵+1g/L蛋白胨、1g/L硫酸铵+1g/L蛋白胨、1g/L尿素+1g/L酵母粉、1g/L氯化铵+1g/L酵母粉、1g/L硫酸铵+1g/L酵母粉为氮源。在250ml的摇瓶中添加50ml氮源优化培养基。将1ml种子液接种至摇瓶中，以200rpm的转速在37℃的培养箱中培养24小时，从摇瓶中取1ml液体，9000rpm离心1min，取上清，采用步骤1方法分析发酵液中β-丙氨酸的含量，结果如图8中C所示，最优氮源为NH4Cl+酵母粉组合。
因此，优化的发酵培养基组成为：甘油10g/L、K2HPO4·3H2O 14g/L、KH2PO4 5.2g/L、MgSO4 0.3g/L、NH4Cl 1g/L、酵母粉1g/L，溶剂为ddH2O，pH值7.0，溶剂为水。
4、优化培养基比较
分别将步骤1制备的EcN和EcN-6的1ml种子液接种至装有优化的发酵培养基的摇瓶中，以200rpm的转速在37℃的培养箱中培养24小时，从摇瓶中取1ml液体，9000rpm离心1min，取上清，采用步骤1方法分析发酵液中β-丙氨酸的含量，其中EcN-6发酵液的HPLC图见图8中E所示，不同浓度β-丙氨酸标准品的高效液相色谱图如8中D所示。
同样条件下，将优化的发酵培养基替换为步骤1中的基础M9培养基，检测β-丙氨酸的含量，结果如图8中G所示。
经过改造后性能最优的菌株EcN-6在优化后的发酵培养基中发酵生产β-丙氨酸的水平相比于底盘菌检测限以下提高到2.14±0.1g/L(参见图8中F)。
实施例8、工程菌EcN-6在5L发酵罐中的分批补料发酵培养。
(1)活化培养：
将-80℃甘油保藏的E.coli Nissle 1917ΔcycA ΔfumB1ΔaspCΔpyk/pGLO-PJ23100-panDK43Y-aspB/pSU19-PJ23100-aspA-ppC菌株划线于LB平板培养基上，培养箱中37℃活化培养过夜，得到活化菌；LB平板培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂2g/L，溶剂为水，pH值自然。
(2)种子培养：挑取步骤(1)新鲜活化菌，接种至LB液体培养基试管中，在37℃、摇床转速220r/min条件下培养过夜，再将培养液以体积浓度1％的接种量转接到含有50mL的LB液体培养基的250mL三角瓶中，在37℃、摇床转速220r/min条件下培养过夜，获得种子液。LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然。
(3)分批补料发酵培养：
按照体积浓度5％的接种量，将步骤(2)种子液接种至装液量为2L发酵罐培养基的5L发酵罐中，培养温度为37℃，pH7.0，维持溶氧值20％。在发酵10h后开始以50mL/min的速度流加补料培养基，维持发酵罐中葡萄糖残糖浓度3-4g/L，直至发酵结束，总发酵时间为60h，补料培养基总共消耗1L。补料过程中，每隔3h取样测细胞生长量OD600、葡萄糖残糖量(残糖分析仪)以及β-丙氨酸浓度(同实施例2HPLC)。如图9所示，OD600生长到16.6左右时，β-丙氨酸的产量达到12g/L。
发酵罐培养基：50g/L葡萄糖、K2HPO4·3H2O 28g/L、KH2PO4 10.4g/L、NH4Cl 4g/L、MgSO4 0.6g/L、胰蛋白胨2g/L、YEAST EXTRACT(酵母粉)4g/L、1mL 10×金属离子、1mL/L有机硅胶消泡剂，溶剂为水。
10×金属离子配方：称取10g CaCl2，10g FeSO4·7H2O，1g ZnSO4·7H2O，0.2gCuSO4和0.02g NiCl2·7H2O溶解到100mL ddH2O中。
补料培养基组成：葡萄糖250g/L、甘油250g/L、酵母提取物4g/L、KH2PO4 14g/L，NH4Cl 10g/L，MgSO4 0.3g/L，消泡剂1mL/L，消泡剂为有机硅胶消泡剂，溶剂为水。
Claims (10)
1.一种高产β-丙氨酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌是以益生菌E.coliNissle1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因、fumB1基因、aspC基因或pyk基因中的一种或多种，和/或过表达panD突变基因、aspB基因、aspA基因或ppC基因中的一种或多种构建获得的；所述panD突变基因是将panD基因编码蛋白第43位的赖氨酸突变为酪氨酸获得的编码基因。
2.如权利要求1所述的高产β-丙氨酸的工程菌，其特征在于，cycA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4中1007-2419bp所示，fumB1基因核苷酸序列如SEQ ID NO.5中1004-2650bp所示，aspC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.6中1022-2212bp所示，pyk基因核苷酸序列如SEQ IDNO.7中987-2429bp所示，所述panD突变基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；aspB基因核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，aspA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；ppC基因核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
3.如权利要求2所述的高产β-丙氨酸的工程菌，其特征在于，所述panD突变基因、aspB基因、aspA基因或ppC基因采用启动子PJ23100表达，所述启动子PJ23100核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。
4.如权利要求3所述的高产β-丙氨酸的工程菌，其特征在于，所述panD突变基因、aspB基因采用质粒pGLO进行过表达；所述aspA基因或ppC基因采用质粒pSU19进行过表达。
5.如权利要求1-4之一所述的高产β-丙氨酸的工程菌，其特征在于，所述工程菌为下列之一：(1)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，采用质粒pGLO和启动子PJ23100过表达panD突变基因，即工程菌ECN-1；(2)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因，采用质粒pGLO和启动子PJ23100过表达panD突变基因，即工程菌ECN-2；(3)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因和fumB1基因，采用质粒pGLO和启动子PJ23100过表达panD突变基因，同时采用质粒pSU19和启动子PJ23100过表达aspA基因，即工程菌ECN-3；(4)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因、fumB1基因和aspC基因，采用质粒pGLO和启动子PJ23100过表达panD突变基因和aspB基因，同时采用质粒pSU19和启动子PJ23100过表达aspA基因，即工程菌ECN-4；(5)以E.coli Nissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因、fumB1基因、aspC基因和pyk基因，采用质粒pGLO和启动子PJ23100过表达panD突变基因和aspB基因，采用质粒pSU19和启动子PJ23100过表达aspA基因，即工程菌ECN-5；(6)以E.coliNissle 1917为底盘菌，敲除基因组中cycA基因、fumB1基因、aspC基因和pyk基因，采用质粒pGLO和启动子PJ23100过表达panD突变基因和aspB基因，采用质粒pSU19和启动子PJ23100过表达aspA基因和ppC基因，即工程菌ECN-6。
6.一种权利要求1所述高产β-丙氨酸的工程菌在发酵产β-丙氨酸中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用为：将所述高产β-丙氨酸的工程菌接种至发酵培养基，在37℃、200～220rpm条件下摇瓶发酵培养12h以上，发酵结束后，得到含β-丙氨酸的发酵液；所述发酵培养基组成：甘油10g/L、K2HPO4·3H2O 14g/L、KH2PO4 5.2g/L、MgSO4 0.3g/L、NH4Cl 1g/L、酵母粉1g/L，溶剂为ddH2O，pH值7.0，溶剂为水。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述发酵采用发酵罐进行，先将所述高产β-丙氨酸的工程菌接种至发酵罐培养基中，在37℃、pH 6-8、维持溶氧值20％-50％的条件下发酵10h后，以40-60mL/min的速度流加补料培养基，直至发酵结束，获得含β-丙氨酸的发酵液；
所述发酵罐培养基：50g/L葡萄糖、K2HPO4·3H2O 28g/L、KH2PO4 10.4g/L、NH4Cl 4g/L、MgSO40.6g/L、胰蛋白胨2g/L、酵母粉4g/L、1mL/L 10×金属离子、1mL/L有机硅胶消泡剂，溶剂为水；10×金属离子配方：10g CaCl2，10g FeSO4·7H2O，1g ZnSO4·7H2O，0.2g CuSO4和0.02g NiCl2·7H2O溶解到100mL ddH2O中；
所述补料培养基组成：葡萄糖250g/L、甘油250g/L、酵母提取物4g/L、KH2PO4 14g/L，NH4Cl10g/L，MgSO4 0.3g/L，消泡剂1mL/L，消泡剂为有机硅胶消泡剂，溶剂为水。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述补料培养基的添加量维持发酵液中葡萄糖残糖浓度3-4g/L。
10.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述工程菌发酵前先进行斜面活化和种子扩大培养，再将种子液以体积浓度1-2％的接种量接种至发酵培养基：
(1)将所述工程菌接种在含有0.1mg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板上，在37℃培养箱中培养过夜；LB平板培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂2g/L，溶剂为水，pH值自然；
(2)挑取步骤(1)单菌落接种至LB液体培养基中，以200rpm的转速在37℃培养箱中培养过夜，获得种子液；LB液体培养基：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L，溶剂为水，pH值自然。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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