CN117486984A - 转运蛋白KefG在提高L-肌肽产量中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种转运蛋白KefG应用于提高L‑肌肽的产量，本发明属于基因工程领域。本发明还提供KefG或其编码基因在生产L‑肌肽中的应用。本发明还提供了一种基因工程菌株在生产L‑肌肽中的应用。所述的L‑肌肽为过表达KefG转运蛋白的重组菌株发酵生产L‑肌肽。本发明发现过表达KefG转运蛋白的重组菌株发酵生产的L‑肌肽的产量和对照组比较提高了0.59倍。

Description

转运蛋白KefG在提高L-肌肽产量中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及转运蛋白KefG在提高L-肌肽产量中的应用。

背景技术

L-肌肽(β-丙氨酰-L-组氨酸)是氨基酸β-丙氨酸和L-组氨酸的二肽，研究报道它们高度集中在脊椎动物的骨骼肌和中枢神经系统中。L-肌肽在体内具有许多关键的生理功能，包括抗氧化、抗糖基化、细胞质缓冲和自由羟基自由基消除，并且在临床上用于高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡、抗肿瘤、促进伤口愈合等方面的辅助治疗。因此，L-肌肽作为一种生物活性化合物引起了人们的关注，广泛应用于医药、保健、卫生、化妆品、食品添加剂等领域。

L-肌肽的化学合成已被广泛报道，成为目前生产L-肌肽的商业方式。化学生产过程需要与受保护的氨基酸和剧毒试剂进行许多复杂的反应。此外，恶劣的反应条件和高能耗也使该过程对环境不友好等诸多不利因素。

近年来，国内外有研究者开始致力于利用酶或者细胞在温和的条件下合成L肌肽。Heyland Jan^[1]等人开发了一种大肠杆菌DmpAsyn细胞可以直接用作合成L-肌肽的全细胞生物催化剂，从而避免耗时且材料密集型的蛋白质纯化，但是该方法不能够直接催化廉价的β-丙氨酸和L-组氨酸合成L-肌肽。L-肌肽酶是存在于细胞内和细胞外的二肽酶。其中人源血清肌肽酶(CN1)可催化Xaa-His二肽的水解，以维持血清中肌肽的平衡。Chiaki Inaba等人^[2]以非受保护氨基酸为底物合成肌肽，利用人源肌肽酶CN1基因，与α-凝集素的细胞壁粘附域连接，构建了基于酿酒酵母细胞表面展示技术的全细胞一步法合成L-肌肽的催化体系，可以轻松的合成L-肌肽，但是，由于合成L-肌肽是L-肌肽酶催化水解二肽的逆反应，为避免水分子的影响，该合成过程需要在有机溶剂或者疏水离子液体中进行。尽管如此，该细胞展示体系的L-肌肽合成效率仅有5％，与商业化应用还存在较大的距离。

KefB和KefC是大肠杆菌中研究较为详细的质子逆向转运蛋白-2(Cpa2)家族成员，是一种谷胱甘肽门控的钾离子外排蛋白，在胞质酸化和保护细胞抵御活性亲电物质方面具有重要作用。KefG和KefF是辅助蛋白质，它们是外周膜蛋白，与各自的转运蛋白KefB和KefC一起编码在操纵子中，是最佳外排活性所必需的^[3]。

目前并没有关于KefG可以转运L-肌肽的相关现有技术的公开。

[1]Heyland J,Antweiler N,Lutz J,et al.Simple enzymatic procedure forL-carnosine synthesis:whole-cell biocatalysis and efficient biocatalystrecycling[J].Microb Biotechnol.2010Jan；3(1):74-83.

[2]Inaba C,Higuchi S,Morisaka H,et al.Synthesis of functionaldipeptide carnosine from nonprotected amino acids using carnosinase-displaying yeast cells[J].Appl Microbiol Biotechnol.2010May；86(6):1895-902.

[3]Fujisawa M,Ito M,Krulwich TA.Three two-component transporters withchannel-like properties have monovalent cation/proton antiport activity[J].Proc Natl Acad Sci U S A.2007Aug 14；104(33):13289-94.

发明内容

针对上述不足，本发明提供了一种KefG转运蛋白，经验证，KefG能够显著提高重组菌株发酵生产L-肌肽的产量，本发明是关于KefG可以转运L-肌肽的首次报道。

本发明中KefG转运蛋白简称为KefG，其编码基因为kefG。

本发明的技术方案包括：

一方面，本发明提供了一种KefG转运蛋白或其编码基因在转运L-肌肽中的应用，所述的KefG的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

具体地，所述的转运蛋白用于促进L-肌肽向胞外转运。

具体地，所述的编码基因通过在L-肌肽的生产菌株中过表达发挥作用。

进一步具体地，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步具体地，所述的过表达为构建过表达质粒。

优选地，所述的过表达质粒为pEZ07-kefG。

进一步具体地，所述的表达L-肌肽的菌株基因工程菌株。

优选地，所述的基因工程菌株为大肠杆菌菌株。

进一步优选地，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.27382。

另一方面，本发明提供了一种KefG或其编码基因在生产L-肌肽中的应用，所述KefG的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

具体地，所述应用为提高L-肌肽产量。

又一方面，本发明提供了一种KefG编码基因，所述KefG编码基因kefG核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

又一方面，本发明提供了一种表达质粒的构建方法，包括以下步骤：

S1扩增kefG基因片段，获得目的基因；

S2将目的基因与酶切载体片段进行克隆构建；

S3转化细胞，筛选阳性克隆，提取质粒验证，得到含有KefG转运蛋白的表达质粒。

优选地，步骤S1以大肠杆菌W3110基因组为模板，利用引物对扩增kefG基因片段。

优选地，步骤S1中所述的引物对为pTR116-F/pTR116-R；所述的引物pTR116-F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述的引物pTR116-R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步优选地，所述步骤S1中的KefG氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，KefG编码基因序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，步骤S2中所述的载体为pEZ07载体。

进一步优选地，步骤S2中所述的目的基因与酶切载体片段的纳摩尔比为1：2。

优选地，步骤S2中所述的酶为NcoI限制性内切酶和/或XhoI限制性内切酶。

优选地，步骤S3中所述转化细胞为加入感受态细胞，进行热击转化。

进一步优选地，步骤S3所述的感受态细胞选自TG1感受态细胞、DH 5α感受态细胞、JM109感受态细胞中的一种或多种。

进一步优选地，步骤S3所述的感受态细胞为TG1感受态细胞。

优选地，步骤S3中所述的加入感受态细胞后，包括将其混匀放置42℃热击2min，冰浴2min的步骤。

优选地，步骤S3所述的壮观霉素浓度为80 150mg/L。

进一步优选地，步骤S3所述的壮观霉素浓度为100mg/mL。

又一方面，本发明提供了一种L-肌肽的生产方法，所述生产方法包括构建过表达kefG编码基因的基因工程菌株。

具体地，所述的kefG编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO：2，所述的基因工程菌株为保藏编号为CGMCC No.27382的大肠杆菌菌株。

由此，本发明同时提供了保藏编号为CGMCC No.27382的大肠杆菌菌株及其在生产L-肌肽中的应用，具体为提高L-肌肽产量中的应用。

所述菌株于2023年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCC No.27382，分类命名为大肠埃希氏菌。

具体地，所述菌株为L-肌肽基因工程菌株为SHK20C/pHD641。

具体地，所述基因工程菌株的出发菌株为大肠杆菌W3110(ATCC 27325)。

进一步具体地，所述大肠杆菌W3110的基因型为F-mcrAmcrB IN(rrnD-rrnE)1lambda-。

具体地，所述菌株的制备包括以下步骤：大肠杆菌W3110为基础出发菌株，对L-肌肽的降解、摄取基因进行敲除，同时整合解除反馈抑制的L-肌肽合成操纵子，改良其反馈抑制和弱化调控等改造，获得L-肌肽基因工程菌株SHK20C/pHD641。

具体地，所述生产方法还包括构建重组菌株。

进一步具体地，所述重组菌株为上述构建得到的含有KefG转运蛋白的表达质粒转化L-肌肽基因工程菌株SHK20C/pHD641，分别得到含KefG转运蛋白的重组菌株。

优选地，所述重组菌株用于发酵生产L-肌肽，生产方法包括以下步骤：

(1)将重组菌株接入含相应抗生素的LB培养基进行培养，得到种子液；

(2)将步骤(1)的种子液转入发酵培养基中进行培养；

(3)加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，培养过夜，得到含有L-肌肽的发酵液。

优选地，步骤(1)中所述的LB培养基为每1L包括：酵母粉5g，氯化钠10g，蛋白胨10g。

优选地，步骤(2)中所述的发酵培养基为每1L包括：葡萄糖30g、5N-5倍的盐溶液200mL、TM3溶液1mL、柠檬酸铁10mg、七水硫酸镁246mg、氯化钙111mg和硫胺素1μg。

具体地，所述的5N-5倍的盐溶液包括：十二水合磷酸氢二钠75.6g/L、磷酸二氢钾15g/L、氯化钠2.5g/L和氯化铵25g/L。

具体地，所述的TM3溶液为每1L包括：四水氯化锌2.0g、六水氯化钙2.0g、两水钼酸钠2.0g、五水硫酸铜1.9g、硼酸0.5g和盐酸100mL。

优选地，所述的发酵过程中，还包括对上述的发酵培养基进行高压蒸汽灭菌步骤。

进一步优选地，所述的灭菌温度为121℃，时间20-30min。

优选地，步骤(3)中所述的IPTG的终浓度为1mM。

优选地，所述L-肌肽的靠目测方法为高效液相色谱法(HPLC)

具体地，所述的检测方法包括以下步骤：发酵液用灭菌水稀释至2倍，离心(1200rpm，1min)，过0.22μm滤膜，上清液用HPLC检测。

HPLC的参数如下：

采用Ultimate AQ-C18，4.6*250*5μm；

流动相A为：乙腈；

流动相B为：10mM辛烷磺酸钠+50mM磷酸二氢钾溶液，磷酸调pH至3.0；

流动相A：流动相B为15：85；

柱流量为1ml/min，柱温为30℃；

波长为210nm，进样量为5μL(稀释2倍后)；

检测时间为13min；

利用紫外检测器检测波长210nm，初始流动相的流速为1.0mL/min，发酵液的上样量5μL，柱温30℃。

本发明的有益效果为：

(1)本发明发现过表达KefG转运蛋白的重组菌株发酵生产的L-肌肽的产量明显高于对照组。

(2)目前并没有关于KefG可以转运L-肌肽的相关现有技术的公开，本专利是关于KefG转运L-肌肽的技术首次公开。

保藏说明

生物材料(菌株名称)：SHK20C/pHD641；

分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli；

保藏编号：CGMCC No.27382；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏时间：2023年5月18日；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1为HPLC测定L-肌肽的图谱。

图2为转运蛋白重复发酵的结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行说明，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明，以使本发明技术方案更易于理解掌握。下属实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明均可从商业途径获得。

基础实验例1：摇瓶发酵验证重组菌株生产L-肌肽的方法

1、试剂：

(1)LB培养基：每升培养基中含酵母粉5g，氯化钠10g，蛋白胨10g，去离子水定容至1L。

上述溶液进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，时间20-30min。

(2)发酵培养基(每升)：葡萄糖30g，5N-5倍的盐溶液200mL，TM3溶液1mL，柠檬酸铁10mg，七水硫酸镁246mg，氯化钙111mg，硫胺素1μg，以无菌去离子水定容至1L。

其中5N-5倍的盐溶液为十二水合磷酸氢二钠75.6g，磷酸二氢钾15g，氯化钠2.5g，氯化铵25g，以离子水定容至1L。

TM3溶液为四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠2.0g，五水硫酸铜1.9g，硼酸0.5g，盐酸100mL，去离子水定容至1L。

上述溶液进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，时间20-30min。同时准备空摇瓶，每瓶按照称取0.4g碳酸钙，使碳酸钙最终浓度为20g/L。

2、仪器：

恒温摇床培养箱。

3、方法：

摇瓶发酵过程：

(1)接种重组菌株至含有壮观霉素的3mL的LB培养基中，置37℃摇床250rpm培养16h后得种子液。

(2)取种子液200μL转移至2mL含有壮观霉素的LB液体培养基，于37℃摇床250rpm培养4h。

(3)将2mL二级种子全部转入装有18mL发酵培养基的摇瓶中，置37℃摇床中，250rpm培养4h。

(4)添加IPTG使其终浓度1mM，调节摇床温度至34℃，继续培养20h左右，取0.5mL发酵液和0.5mL水混匀离心后(12000rpm，1min)，取上清检测，检测方法详见基础实验例2。

基础实验例2：HPLC测定发酵液中的L-肌肽

基础实验例步骤(4)的上清离心(1200rpm，1min)，过0.22μm的滤膜，用高效液相色谱(HPLC)检测。

HPLC的参数如下：

采用Ultimate AQ-C18，4.6*250*5μm；

流动相A为：乙腈；

流动相B为：10mM辛烷磺酸钠+50mM磷酸二氢钾溶液，磷酸调pH至3.0；

流动相A：流动相B体积比为15：85；

柱流量为1mL/min，柱温为30℃；

波长为210nm，进样量为5μL；

检测时间为13min；

利用紫外检测器检测波长210nm，初始流动相的流速为1.0mL/min。

实验结果：

HPLC测定L-肌肽的图谱如图1，从图1中可以看出，L-肌肽的出峰时间为10分钟。

实施例1转运蛋白表达库的初筛

本发明通过搜索查询和比对，筛选出167个转运蛋白，分别设计引物通过无缝克隆构建到低拷贝载体pEZ07(载体pEZ07同中国专利申请号：201510093004.3中)上，得到167个转运蛋白表达质粒pTR001-pTR167。以转运蛋白表达质粒pTR116(即pEZ07-kefG)构建为例介绍转运蛋白表达质粒构建过程，具体步骤如下：

(1)以大肠杆菌W3110(ATCC 27325)基因组为模板，利用引物对扩增kefG基因片段，引物对序列见表1，得到大小为617bp的片段且电泳无杂带。

表1pEZ07-kefG构建引物

表1中，F和R为扩增引物，其中：F表示正向引物，R表示反向引物。

(2)步骤(1)得到的片段直接进行过柱回收纯化，使用捷瑞胶回收纯化试剂盒(购自上海捷瑞生物工程技术有限公司，货号GK2043)，得到纯化片段。

(3)步骤(2)得到的纯化片段以纳摩尔比1:2与NcoI/XhoI酶切回收的pEZ07载体片段进行EZ克隆构建，使用GBclonart无缝克隆试剂盒(购自苏州神洲基因有限公司，货号GB2001-48)。

所述NcoI/XhoI酶切回收pEZ07载体片段的步骤为：

pEZ07提取质粒后，取50μL质粒加入30μL水，分别加入5μL FastDingest NcoI、5μLFastDingest XhoI的酶10X FastDingest Buffer 10μL混匀后37℃放置3h后进行载体回收。

所述的EZ克隆构建包括以下步骤：

重组克隆反应液于45℃水浴锅温浴30min，然后转移到冰上放置5min，加入TG1化转感受态细胞，混匀放置5min，42℃热击2min，冰浴2min后加入800μL复苏培养基LB，复苏培养1h后，离心(8000rpm，1min)，涂布含100mg/L壮观霉素的LB平板，次日挑取克隆培养过夜，提取质粒进行酶切验证，最终构建得到质粒，编号pTR116。

酶切验证步骤为：质粒提取成功后10μL体系：取质粒5μL、水2.6μL、0.7μLFastDigest MssI与0.7μL FastDigest HindIII、10X FastDigest green Buffer1μL混匀后37℃放置1h后进行电泳跑胶25min看条带是否正确。

(4)上述构建得到的转运蛋白库相关质粒pTR001-pTR167分别转化宿主SHK20C/pHD641(保藏号CGMCC No.27382)，分别得到含不同转运蛋白的重组菌株。将含不同转运蛋白的重组菌株及对照菌SHK20C/pEZ07(SHK20C/pHD641整合空载体pEZ07)分别接种克隆到含100mg/L壮观霉素的LB试管，取培养过夜的种子200μL转移至2mL含有抗生素的LB液体培养基，于37℃摇床250rpm培养4h后全部转入装有18mL发酵培养基的摇瓶中，置37℃摇床中，250rpm培养4h，加IPTG诱导34℃培养过夜，继续培养20h左右，取0.5mL发酵液加0.5mL的离子水稀释2倍，12000rpm离心1min后取上清检测，检测方法详见基础实验例2。每个菌株挑取3个克隆进行平行发酵，结果取平均值，测定结果如下：

表2转运蛋白初筛发酵结果

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以上数据表明，67.66％(113/167)的转运蛋白过表达后L-肌肽的产量明显降低，只有4.19％(7/167)的转运蛋白过表达后L-肌肽的产量提高20％-60％。KefG能够显著提高L-肌肽的产率，L-肌肽的产量与对照相比提高了58.62％，具有显著提高。

实施例2转运蛋白表达库的复筛

将实施例1中初筛L-肌肽产量明显提高的菌株KefG，按照实施例1进行摇瓶发酵复筛，经过2轮摇瓶复筛发酵，验证结果如图2所示。

转运蛋白KefG过表达L-肌肽的产量接近2g/L，与对照组相比，L-肌肽产量有明显的提高。将转运蛋白KefG再次进行摇瓶发酵重复，结果类似，说明转运蛋白KefG表达结果比较稳定。KefG不仅可以稳定提高L-肌肽的产量，而且增加比例更显著，这是首次发现转运蛋白KefG可以明显提高L-肌肽的产量。

上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围。应当指出的是，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附要求为准。

Claims (10)

1.一种KefG转运蛋白或其编码基因在转运L-肌肽中的应用，其特征在于，所述KefG的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的转运蛋白用于促进L-肌肽向胞外转运；所述的编码基因通过在表达L-肌肽的菌株中过表达发挥作用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的过表达为构建过表达质粒；所述的过表达质粒为pEZ07-kefG。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的表达L-肌肽的菌株为基因工程菌株；所述的基因工程菌株为大肠杆菌菌株，保藏编号为CGMCCNo.27382。

6.一种KefG转运蛋白或其编码基因在生产L-肌肽中的应用，其特征在于，所述KefG的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

7.一种KefG编码基因，其特征在于，所述KefG编码基因kefG核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

8.一种L-肌肽的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括构建过表达编码基因kefG的基因工程菌株，所述编码基因kefG的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，所述的基因工程菌株为保藏编号为CGMCC No.27382的大肠杆菌菌株。

9.一种基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株于2023年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，保藏编号为CGMCCNo.27382，分类命名为大肠埃希氏菌。

10.权利要求9所述的基因工程菌株的应用，其特征在于，所述应用为在生产L-肌肽中的应用。