CN116515918A - MdtL的色氨酸转运应用及生产方法和菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种MdtL的L‑色氨酸(L‑Trp)转运应用及生产方法和菌株，涉及微生物技术领域。本发明还提供了MdtL在生产色氨酸中的应用。所述的生产色氨酸为过表达MdtL转运蛋白的重组菌株发酵生产色氨酸。本发明发现过表达MdtL转运蛋白的重组菌株摇瓶发酵的L‑色氨酸的产量较对照组高，且副产物莽草酸的含量降低。并且本发明首次公开了MdtL向胞外转运色氨酸中的应用。

Description

MdtL的色氨酸转运应用及生产方法和菌株

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及MdtL的色氨酸转运应用及生产方法和菌株。

背景技术

L-色氨酸(L-tryptophan,L-Trp)是人和动物所需的8种必需氨基酸之一，对人和动物的生命活动、生长发育及其新陈代谢起着重要的作用。自然界中L-色氨酸只能在微生物或植物中合成。L-色氨酸的生产方法主要包括蛋白水解法、化学合成法、酶催化法、微生物转化法、直接发酵法。蛋白水解法以蛋白质为原料，通过碱水解或酶水解制备色氨酸，但蛋白水解法制备的色氨酸的产品得率低、原材料昂贵。化学合成法涉及有机或化学合成等反应，其工艺复杂、存在化学试剂残留。酶催化法成本高、酶难以重复利用。微生物转化法的主要技术未添加合成色氨酸所需的前体物，但微生物转化法的生产成本高。直接发酵法生产L-色氨酸，主要是通过传统化学或物理诱变方式得到L-色氨酸的生产菌株，但传统诱变得到的菌株存在容易退化、工业生产不稳定等问题。

目前报道的以大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌为出发基础菌株，得到一系列的基因工程菌株，但是由于L-色氨酸生物合成途径复杂，涉及的合成参与蛋白很多，而且存在产物和中间产物的多种调控，如反馈抑制，前馈抑制等，而且L-Trp也参与多个过程的调控，因此目前工业生产仍存在L-色氨酸产量低、糖酸转化率偏低，且工业化生产控制难度较大的问题。在大多数氨基酸生产中，将目标氨基酸输出到胞外，从而减少胞内的含量来弱化其引起的各类调控，进一步提高目标氨基酸的产量是得到高产氨基酸菌株的关键措施之一。

目前报道的在大肠杆菌细胞内，L-色氨酸主要会通过Arop、Mtr和TnaB向胞内运输。其中Arop酶可摄取L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸，Mtr酶和TnaB分别是高亲和力和低亲和力L-色氨酸摄取蛋白。因此，大多数L-色氨酸构建菌株会选择性敲除这些摄取蛋白，在L-色氨酸产量达到一定含量考虑过表达其他转运蛋白，如大多文献报道的YddG等来提高L-色氨酸的产量(Liu Qian,Cheng Yongsong,Xie Xixian,Xu Qingyang,Chen Ning*.Modification of tryptophan transport system and its impact on production ofL-tryptophan in Escherichia coli.Bioresource Technol.2012,114:549-554)。

此外，关于氨基酸转运的报道也比较多，比如文献(Doroshenko,V.,Airich,L.,Vitushkina,M.,Kolokolova,A.,Livshits,V.,Mashko,S.,2007.YddG from Escherichiacoli promotes export of aromatic amino acids.FEMS Microbiol.Lett.275,312-318)公开了大部分芳香族氨基酸生产菌株通过yddG过表达进行胞外输出。美国专利US PatNo.5 972663公开了过表达大肠杆菌等各种菌株的基因如mex、bmr、qacA等来提高L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸等的生产能力。欧洲专利No.1016710公开了过表达大肠杆菌属菌来源yahN、yeaS、yfiK、yggA等基因来提高L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸等的生产能力。专利US Pat No.0064681公开了过表达大肠杆菌来源的yicL、ydiN、ydhK、aaeB、yeeA、rhtC和emrD等基因都有助于提高各类L-氨基酸的产量。L-色氨酸生物合成途径存在多个步骤多重调控，因此为了提高L-色氨酸的产量，需要找到合适的高效的转运蛋白，将L-色氨酸尽可能的运输到胞外，减少其在胞内的各种调控来进一步提高其产量。

当前现有技术中公开了MdtL在药物转运中的应用，但药物转运与L-色氨酸转运机制完全不同。药物的转运主要包括被动转运和主动转运，被动转运是药物借助细胞膜两侧存在的药物浓度梯度，从高浓度侧向低浓度侧扩散。主动转运是药物从低浓度一侧跨膜向高浓度一侧的转运，消耗能量，需要载体，转运有饱和、竞争性抑制现象。

目前还未有关于MdtL向胞外转运L-色氨酸的相关报道，因此本专利是关于MdtL向胞外转运L-色氨酸的首次报道。

发明内容

本发明的术语和声明：

1、如本文所用，冠词“一个”、“一种”和“所述”：除非以其它方式明确地限定到一个(种)对象，否则包括复数的对象。

2、如本文所用，术语L-色氨酸(L-tryptophan,L-Trp)，化学名称为α-氨基-β-吲哚基丙酸，属芳香族氨基酸，分子式为C₁₁H₁₂O₂N₂，相对分子质量为204.21。L-色氨酸在常温条件下呈白色晶体或结晶性粉末，无味，熔点为289℃，常温下在水中溶解度为11.4g/L，微溶于乙醇，不溶于氯仿，在碱性溶液中比较稳定。

3、如本文所用，数值范围：除非以其他方式明确指出，本文中公开的所有范围或比率将会被理解为包括其中包含的任何和所有的子范围或子比率。例如，声明的1至30的范围或比率应当被认为包含在最小值1和最大值30之间，并且包括断端点在内的任何子范围或子比率、整数、小数或由整数或小数构成的子范围或子比率。

4、如本文所用，术语蛋白质：是指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。该术语还包括蛋白质的表达后修饰，如糖基化、乙酰化、磷酸化等。该术语还包括指对天然蛋白质或多肽的氨基酸序列的修饰如缺失、替换、插入后所得的变体。

5、如本文所用，术语载体：是指可以在宿主细胞中自主复制的载体，其优选为多拷贝载体。此外，载体通常具有用于选择转化体的抗生素抗性基因等标志物。此外，载体可以具有用于表达引入的基因的启动子和/或终止子。载体可以是例如病毒载体，源自细菌质粒的载体，源自酵母质粒的载体，源自噬菌体的载体，粘粒，噬菌粒等。基因工程载体是指使得目的基因能够在细胞中表达的载体，并通常为包括编码蛋白质或多肽的多核苷酸并且可操作地连接至表达控制序列的直链或环状DNA分子。

6、如本文所用，术语mdtL编码efflux pump，是Drug:H+Antiporter-1(12Spanner)(DHA1)家族的异源，属于MFS超家族(Major Facilitator Superfamily)成员。

本发明技术方案包括：

第一方面，本发明提供了MdtL在向胞外转运色氨酸中的应用。

具体地，所述的mdtL的基因序列如SEQ ID NO:3所示，所述的MdtL的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

具体地，所述的色氨酸为L-色氨酸。

第二方面，本发明提供了MdtL在生产色氨酸中的应用。

具体地，所述的色氨酸为L-色氨酸。

具体地，所述的生产L-色氨酸为过表达MdtL转运蛋白的重组菌株发酵生产L-色氨酸。

优选地，所述的重组菌株的构建为将表达质粒转化到菌株SHA151KC；所述的菌株SHA151KC的保藏编号为CGMCC No.26347。

优选地，所述的表达质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1)以W3110基因组为模板，利用引物对pTR36-F和pTR36-R扩增mdtL基因片段，获得目的基因；

(2)将目的基因mdtL与酶切回收的载体片段进行克隆构建；

(3)加入感受态细胞，进行42℃热击转化，加入培养基进行复苏培养1h，然后离心涂布含壮观霉素的LB平板，第二天挑取克隆培养过夜，提取质粒进行酶切验证，得到含有转运蛋白的表达质粒；

所述的引物pTR36-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述的引物pTR36-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的mdtL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述的MdtL的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

进一步优选地，步骤(2)中所述的目的基因mdtL与pEZ07载体片段的纳摩尔比为1-10:1。

再进一步优选地，步骤(2)中所述的目的基因mdtL与pEZ07载体片段的纳摩尔比为3:1。

优选地，步骤(2)中所述的酶选自NcoⅠ限制性内切酶、KpnⅠ限制性内切酶中的一种或多种。

优选地，步骤(2)中所述的克隆构建反应液包括将克隆反应液于45℃水浴锅温浴30min，然后转移到冰上放置5min。

优选地，步骤(2)中载体为pEZ07载体。

优选地，步骤(3)中所述的感受态细胞选自TG1感受态细胞、DH-5α感受态细胞、JM109感受态细胞中的一种或多种。

进一步优选地，步骤(3)中所述的感受态细胞为TG1感受态细胞。

优选地，步骤(3)中所述的加入感受态细胞后包括将其混匀放置5min，42℃热击2min，冰浴2min的步骤。

优选地，步骤(3)中所述的壮观霉素的浓度为80-150mg/L；

进一步优选地，步骤(3)中所述的壮观霉素的浓度为100mg/L。

优选地，所述的重组菌株发酵生产L-色氨酸的生产方法，包括以下步骤：

(1)将重组菌株进行培养，得到种子液；

(2)将步骤(1)的种子液转入发酵培养基中进行发酵，培养；

(3)加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，培养，得到含有L-色氨酸的发酵液。

优选地，步骤(1)中所述的培养的培养基选自LB培养基、TB培养基、SOB培养基中的至少一种；

进一步优选地，步骤(1)中所述的培养的培养基为LB培养基。

优选地，步骤(2)中所述的发酵培养基包括：葡萄糖30g/L、5N-5倍的盐溶液200mL、TM3溶液1mL、柠檬酸铁10mg、七水硫酸镁246mg、氯化钙111mg和硫胺素1μg。

具体地，所述的5N-5倍的盐溶液包括：十二水合磷酸氢二钠75.6g/L、磷酸二氢钾15g/L、氯化钠2.5g/L和氯化铵25g/L。

具体地，所述的TM3溶液包括：四水氯化锌2.0g/L、六水氯化钙2.0g/L、两水钼酸钠2.0g/L、五水硫酸铜1.9g/L、硼酸0.5g/L和盐酸100mL。

优选地，所述的发酵过程中，还包括对上述的发酵培养基进行高压蒸汽灭菌步骤；

进一步优选地，所述的灭菌的温度为120-130℃；灭菌的时间为20-30min。

再进一步优选地，所述的灭菌的温度为121℃。

优选地，步骤(3)中所述的IPTG的终浓度为0.1-1mM；

进一步优选地，步骤(3)中所述的IPTG的终浓度为1mM。

具体地，上述的培养基为在摇瓶中使用L-色氨酸基因工程菌株发酵生产L-色氨酸。

优选地，所述的L-色氨酸的检测方法为高效液相色谱法(HPLC)。

具体地，所述的检测方法包括以下步骤：

发酵液用甲酸水稀释至2-80倍，离心，过0.22μm的滤膜，用高效液相色谱检测。

优选地，所述的甲酸水的浓度为0.2％。

HPLC的参数如下：

采用SB-AQ色谱柱，4.6*150mm，5um；

流动相A：磷酸二氢钾0.02mol/L，pH为3.3；

流动相B：甲醇，初始比例为A:B＝100:0；

柱流量为1ml/min，柱温为30℃；

波长为209nm，进样量为2ul；

检测时间为15min。

洗脱梯度为：

流动相比例0.1-2分钟，甲醇比例为0；

2-9分钟甲醇比例由0上升到35％，维持到11分钟；

11-11.5分钟甲醇比例由35％降到0；

利用紫外检测器检测波长209nm。

又一方面，本发明提供了上述的MdtL在提高色氨酸的产量中的应用。

又一方面，本发明提供了一种生产色氨酸的菌株，所述的菌株于2022年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.26347，保藏地址为中国北京，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。

具体地，所述的基因工程菌株过表达mdtL基因；

优选地，所述的工程菌株的出发菌株为大肠杆菌W3110(ATCC27325)；

具体地，所述的大肠杆菌W3110的基因型为F-mcrAmcrB IN(rrnD-rrnE)1lambda-。

具体地，所述的色氨酸为L-色氨酸。

又一方面，本发明提供了上述菌株在生产色氨酸中的应用。

又一方面，本发明提供了上述的菌株在提高色氨酸的产量中的应用。

本发明的有益效果为：

(1)本发明发现过表达MdtL转运蛋白的重组菌株摇瓶发酵的L-色氨酸的产量和对照比较提高2倍左右，且副产物莽草酸的含量降低40％。

(2)目前并没有关于MdtL可以向胞外输出L-色氨酸的相关报道，因此本专利是关于MdtL转运L-色氨酸的首次报道。

保藏说明

菌株名称：大肠埃希氏菌；

分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli；

保藏编号：CGMCC No.26347；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏时间：2022年12月27日；

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1为HPLC测定L-色氨酸的图谱。

图2为转运蛋白重复发酵结果图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。

实验方法1摇瓶发酵验证重组菌株生产L-色氨酸的方法

1、试剂

(1)LB培养基：每升培养基中含酵母粉5g，氯化钠10g，蛋白胨10g，去离子水定容至1L。

上述溶液进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，时间20-30min。

(2)发酵培养基(每升)：葡萄糖30g，5N-5倍的盐溶液200mL，TM3溶液1mL，柠檬酸铁10mg，七水硫酸镁246mg，氯化钙111mg，硫胺素1μg，以无菌去离子水定容至1L。

其中5N-5倍的盐溶液包括十二水合磷酸氢二钠75.6g，磷酸二氢钾每升15g，氯化钠2.5g，氯化铵25g，以离子水定容至1L。

TM3溶液包括四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠2.0g，五水硫酸铜1.9g，硼酸0.5g，盐酸100mL，去离子水定容至1L。

上述溶液进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，时间20-30min。同时准备空摇瓶，每瓶按照称取0.6g碳酸钙，使碳酸钙最终浓度为30g/L。

2、仪器：恒温摇床培养箱。

3、方法：

摇瓶发酵过程：

(1)接种重组菌株至含有100mg/L壮观霉素的4mL的LB培养基中，置37℃摇床250rpm培养。

(2)取培养16h后的种子300μL转移至2mL含有100mg/L抗生素的LB液体培养基，于37℃摇床250rpm培养4h。

(3)将2.3mL二级种子全部转入装有18mL发酵培养基的摇瓶中，置37℃摇床中，250rpm培养4h。

(4)添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为1mM，调节摇床温度至34℃，继续培养20h左右，取1mL发酵液或用0.2％甲酸水稀释到4-10倍，于12000rpm条件下离心1min，离心后，取上清检测，检测方法详见实验方法2。

实验方法2HPLC测定发酵液中的L-色氨酸

高效液相色谱法测定发酵液中的L-色氨酸包括以下步骤：

发酵液用0.2％甲酸水稀释至合适的倍数，离心，离心时的转速为12000rpm，离心的时间为1min，过0.22μm的滤膜，用高效液相色谱(HPLC)检测。

HPLC的参数如下：

采用SB-AQ色谱柱，4.6*150mm，5um；

流动相A：磷酸二氢钾0.02mol/L，取磷酸二氢钾2.73g用水稀释到1L，用磷酸调节pH为3.3；

流动相B：甲醇，初始比例为A:B＝100:0；

柱流量为1ml/min，柱温为30℃；

波长为209nm，进样量为2ul(稀释4倍后)；

检测时间为15min。

洗脱梯度为：

流动相比例0.1-2分钟，甲醇比例为0；

2-9分钟甲醇比例由0上升到35％，维持到11分钟，然后11到11.5分钟甲醇比例由35％降到0，利用紫外检测器检测波长209nm；

初始流动相的流速为1.0mL/min，发酵液的上样量2μL，柱温30℃。

实验结果：

HPLC图谱如图1所示，从图1中可以看出，L-色氨酸的出峰时间为8.0分钟，莽草酸的出峰时间为2.7分钟。

实施例1

本发明通过NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索查询和比对，筛选出122个转运蛋白，分别设计引物通过无缝克隆构建到低拷贝载体pEZ07(载体pEZ07同中国专利申请号：201510093004.3中)上，得到122个转运蛋白表达质粒pTR01-pTR122。

以转运蛋白表达质粒pTR36(即pEZ07-mdtL)构建为例介绍转运蛋白过表达质粒构建过程：

(1)以W3110基因组为模板，利用引物对pTR36-F/pTR36-R扩增mdtL基因片段，引物对序列见表1，得到大小为1226bp的片段且电泳无杂带。

(2)步骤(1)得到的片段直接进行过柱回收纯化，使用捷瑞胶回收纯化试剂盒(购自上海捷瑞生物工程技术有限公司，货号为GK2043)。

(3)步骤(2)纯化后得到的片段以纳摩尔比1:2与NcoI/KpnI酶切回收的pEZ07载体片段进行EZ克隆构建(GBclonart无缝克隆试剂盒，苏州神洲基因有限公司，货号为GB2001-48)。

所述的EZ克隆构建包括以下步骤：

重组克隆反应液于45℃水浴锅温浴30min，然后转移到冰上放置5min，加入TG1化转感受态细胞，混匀放置5min，42℃热击2min，冰浴2min后加入800μL复苏培养基LB，复苏培养1h后离心涂布含100mg/L壮观霉素的LB平板，次日挑取克隆培养过夜，提取质粒后进行酶切验证，得到预期大小的目标条带，确认最终构建得到质粒pEZ07-mdtL，编号pTR36。

其中，mdtL的基因序列是SEQ ID NO：3，MdtL的氨基酸序列是SEQ ID NO 4，最终构建得到pTR01-pTR122共122个转运蛋白表达质粒，将这些表达质粒转化SHA151KC感受态细胞，得到含不同转运蛋白的重组菌株。

所述的酶切验证包括以下步骤：取提取质粒6ul，加2.5ul去离子水、1ul buffer和0.5ul的限制性内切酶等混匀，于37℃酶切1h，点核酸胶进行检测。

表1pTR36构建引物

本发明以大肠杆菌W3110(ATCC27325)(基因型：F-mcrAmcrB IN(rrnD-rrnE)1lambda-)为基础出发菌株，对L-色氨酸的降解基因tnaA、摄取基因aroP、tnaB等进行敲除，同时整合3个拷贝抗反馈抑制的L-色氨酸合成操纵子Ptrc-trpE^S40F-trpDCBA以及1个拷贝分支酸合成路径相关基因等，减少其反馈抑制和弱化调控等改造，获得L-色氨酸基因工程菌株SHA151KC，其分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，该菌株已于2022年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No.26347。

上述构建的转运蛋白库相关质粒pTR01-pTR122分别转化宿主SHA151KC，分别得到含不同转运蛋白的重组菌株，将这些菌株连同对照菌株SHA151KC/pEZ07一起进行摇瓶初筛和复筛，筛选有助于提高Trp产量提高的转运蛋白。

实施例2转运蛋白表达库的初筛和复筛

按照实验方法1摇瓶发酵比较的方式对转运蛋白进行初筛：

将含不同转运蛋白的重组菌株及对照菌SHA151KC/pEZ07分别接种克隆到含100mg/L壮观霉素的LB试管，每个菌株接种3个平行样，取培养过夜的种子300μL转移至2mL含有100mg/L壮观霉素的LB液体培养基，于37℃摇床250rpm培养4h后全部转入装有18mL发酵培养基的摇瓶中，置37℃摇床中，250rpm培养4h，加IPTG诱导34℃培养过夜，继续培养20h左右，取0.2mL发酵液加0.8mL的0.2％甲酸水稀释4倍，12000rpm离心1min后取上清检测，检测方法详见实验方法3。每个菌株挑取3个克隆进行平行发酵，结果取平均值。

通过8个批次的初筛发酵筛选，结果见汇总表2，结果显示，55.7％(68/122)的转运蛋白过表达后L-色氨酸的产量明显降低，有的甚至不产L-色氨酸；32.7％(40/122)的转运蛋白表达L-色氨酸的产量和对照差不多或者提高最高到37％；9.8％(12/122)的转运蛋白过表达后L-色氨酸的产量和对照比至少提高40％-128％。

随后，将初筛L-色氨酸产量提高40％-128％的重组菌株按照实验方法1进行摇瓶发酵复筛，复筛结果如图2所示，MdtL、YeeA、EmrD和EamB等4个转运蛋白过表达且L-色氨酸的产量都达到3g/L以上，和对照相比有明显的提高，其他转运蛋白则效果不明显；将这4个转运蛋白再次进行摇瓶发酵重复，结果类似，说明这几个转运蛋白比较稳定，此外除了色氨酸产量明显提高，EamB和MdtL过表达菌株莽草酸含量和对照比降低一半左右，而YeeA过表达菌株莽草酸含量反而增加，说明这些转运蛋白还可能转运其他某些物质，但是其转运色氨酸的效果也很明显，目前没有关于MdtL向胞外转运色氨酸的相关报道。

表2转运蛋白初筛发酵结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.MdtL在向胞外转运色氨酸中的应用。

2.MdtL在生产色氨酸中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的mdtL的基因序列如SEQ ID NO:3所示，所述的MdtL的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的色氨酸为L-色氨酸。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的生产L-色氨酸为过表达mdtL转运蛋白的重组菌株发酵生产L-色氨酸。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的重组菌株的构建为将表达质粒转化到菌株SHA151KC；所述的菌株SHA151KC的保藏编号为CGMCCNo.26347。

7.MdtL在提高色氨酸产量中的应用。

8.一种生产色氨酸的菌株，其特征在于，所述的菌株于2022年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.26347，保藏地址为中国北京，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli。

9.根据权利要求8所述的菌株在生产色氨酸中的应用。

10.根据权利要求8所述的菌株在提高色氨酸产量中的应用。