WO2021125493A1 - 다중약물 수송체의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 미생물, 및 그를 이용한 트립토판 대사체의 생산 방법 - Google Patents

다중약물 수송체의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 미생물, 및 그를 이용한 트립토판 대사체의 생산 방법 Download PDF

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WO2021125493A1
WO2021125493A1 PCT/KR2020/011315 KR2020011315W WO2021125493A1 WO 2021125493 A1 WO2021125493 A1 WO 2021125493A1 KR 2020011315 W KR2020011315 W KR 2020011315W WO 2021125493 A1 WO2021125493 A1 WO 2021125493A1
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gene
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violacein
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류규리
전애지
배현애
장재우
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씨제이제일제당(주)
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    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
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    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/165—Heterorings having nitrogen atoms as the only ring heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)

Definitions

  • the present application relates to a recombinant microorganism comprising a genetic modification to increase the activity of the multidrug transporter A (Multidrug efflux system subunit A: MdtA).
  • MdtA Multidrug efflux system subunit A
  • Two L-tryptophan can form an imine dimer, from which various useful substances can be synthesized.
  • violacein and deoxyviolacein have various physiological activities such as anticancer, antiulcer, antibacterial, antifungal, antiprotozoan, antiviral, etc. It is known to be effective, especially Staphylococcus aureus and other various Gram-positive bacteria with strong antibacterial action, acting as a new antibiotic against multidrug-resistant bacteria, as a dye for dyeing various fabrics such as cotton, nylon, rayon, and polyester It can be used and it is very useful.
  • Patent Document 0001 Republic of Korea Patent No. 10-1602772
  • the present application includes a genetic modification that increases the activity of the multidrug transporter A (Multidrug efflux system subunit A: MdtA), and provides a recombinant microorganism having an increased ability to produce tryptophan metabolites compared to an unmodified strain do.
  • MdtA Multidrug efflux system subunit A
  • the present application includes the steps of culturing the recombinant microorganism; and recovering the target product from the medium or the microorganism, wherein the target product is a tryptophan metabolite, and provides a method for producing the target product.
  • the term “enhancement” of protein activity means that the activity of the protein is increased compared to the intrinsic activity.
  • the "intrinsic activity” refers to the activity of a specific protein originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before the transformation when the trait is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This may be used interchangeably with “pre-modification activity”.
  • pre-modification activity When the activity of a protein is "increased" compared to the intrinsic activity, it means that the activity of a specific protein is improved compared to the original activity of the parent strain or the unmodified microorganism before transformation.
  • the "increase in activity” can be achieved by introducing an exogenous protein or enhancing the activity of an intrinsic protein, but specifically, it may be achieved through enhancing the activity of an intrinsic protein. Whether or not the activity of the protein is enhanced can be confirmed from an increase in the activity level, expression level, or amount of a product produced from the protein.
  • the enhancement of the activity of the protein may be applied by various methods well known in the art, and may not be limited as long as the activity of the target protein can be enhanced than that of the microorganism before modification.
  • the method is not limited thereto, but may be one using genetic engineering or protein engineering.
  • the method for enhancing protein activity using the genetic engineering is, for example,
  • the method for enhancing protein activity using the protein engineering may be performed by, for example, selecting an exposed site by analyzing the tertiary structure of the protein and modifying or chemically modifying it, but is not limited thereto.
  • the increase in the intracellular copy number of the gene encoding the protein can be performed by any method known in the art, for example, the gene encoding the protein can be replicated and functioned independently of the host, to which the gene encoding the protein is operably linked. It can be carried out by introducing the vector into a host cell. Alternatively, it may be carried out by introducing a vector capable of inserting the gene into a chromosome in the host cell, to which the gene is operably linked, into the host cell, but is not limited thereto.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing a polynucleotide sequence encoding a protein of interest in a suitable host in a form operably linked to regulatory sequences suitable for expressing the protein of interest.
  • the expression control sequence may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation.
  • the vector After transformation into a suitable host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
  • the vector used in the present application is not particularly limited as long as it is capable of replication in a host cell, and any vector known in the art may be used. Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages in a natural or recombinant state.
  • pWE15, M13, ⁇ MBL3, ⁇ MBL4, ⁇ IXII, ⁇ ASHII, ⁇ APII, ⁇ t10, ⁇ t11, Charon4A, and Charon21A can be used as phage vectors or cosmid vectors, and pDZ-based, pBR-based, pUC-based plasmid vectors , pBluescript II-based, pGEM-based, pTZ-based, pCL-based, pET-based and the like can be used.
  • the vector usable in the present application is not particularly limited, and a known expression vector may be used.
  • the term "transformation” refers to introducing a recombinant vector including a polynucleotide encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the transformed polynucleotide it may include all of them regardless of whether they are inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome.
  • operably linked may mean that a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding a target protein of the present application and the gene sequence are functionally linked.
  • the method of replacing a gene expression control sequence on a chromosome encoding a protein with an expression control sequence with strong activity is any method known in the art, for example, a nucleic acid sequence to further enhance the activity of the expression control sequence. may be performed by inducing a mutation in the sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, or by replacing it with a nucleic acid sequence having a stronger activity.
  • the expression control sequence is not particularly limited thereto, but may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, a sequence for controlling the termination of transcription and translation, and the like.
  • the method may specifically be to link a strong heterologous promoter instead of the original promoter, but is not limited thereto.
  • Examples of known strong promoters include CJ7 promoter (Korean Patent No. 10-0620092), CJ1 promoter (Korean Patent No. 10-0620092), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, T7 promoter, araBAD promoter , lambda phage PR promoter, PL promoter and tet promoter, but are not limited thereto.
  • the method of modifying the nucleotide sequence of the protein initiation codon or 5'-UTR region is any method known in the art, for example, the protein expression rate is lower than the intrinsic start codon of the protein compared to the intrinsic start codon. It may be substituted with another higher start codon, but is not limited thereto.
  • the method of modifying the polynucleotide sequence on the chromosome to increase the protein activity is any method known in the art, for example, deletion, insertion, ex vivo of the nucleic acid sequence to further enhance the activity of the polynucleotide sequence. It can be carried out by inducing a mutation in the expression control sequence by total or conservative substitution or a combination thereof, or by replacing the polynucleotide sequence with an improved polynucleotide sequence to have stronger activity. The replacement may specifically be to insert the gene into the chromosome by homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the vector used may further include a selection marker for confirming whether or not the chromosome is inserted.
  • the selection marker is used to select cells transformed with the vector, that is, to determine whether the gene to be introduced is inserted, and selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or surface protein expression. Markers to be given may be used, but the present invention is not limited thereto. In an environment treated with a selective agent, only the cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so that the transformed cells can be selected.
  • the introduction of the foreign polynucleotide exhibiting the activity of the protein can be performed by any method known in the art, for example, a foreign polynucleotide encoding a protein exhibiting the same/similar activity as the protein, or a codon optimization thereof It can be carried out by introducing the variant polynucleotide into a host cell.
  • the foreign polynucleotide may be used without limitation in origin or sequence as long as it exhibits the same/similar activity as the protein.
  • the introduced foreign polynucleotide can be introduced into the host cell by optimizing its codon so that the optimized transcription and translation are performed in the host cell.
  • the introduction can be performed by appropriately selecting a known transformation method by those skilled in the art, and the introduced polynucleotide is expressed in a host cell to produce a protein and increase its activity.
  • Such enhancement of protein activity may be that the activity or concentration of the corresponding protein is increased based on the activity or concentration of the protein expressed in the wild-type or pre-modified microbial strain, or the amount of product produced from the protein may be increased.
  • the present invention is not limited thereto.
  • the term "pre-transformation strain” or "pre-transformation microorganism” does not exclude a strain containing a mutation that can occur naturally in a microorganism, it is a natural strain itself, or genetic variation caused by natural or artificial factors means the strain before the trait is changed.
  • the transformation may be enhanced activity of a multi-drug transporter.
  • pre-modified strain or "pre-modified microorganism” may be used interchangeably with “unmodified strain”, “unmodified strain”, “unmodified microorganism”, “unmodified microorganism” or “reference microorganism”.
  • the term "gene” refers to a nucleic acid fragment that expresses a specific protein, and includes a 5'-non coding sequence and/or a 3'-non coding sequence. sequence) may or may not contain a regulatory sequence.
  • sequence identity of a nucleic acid or polypeptide refers to the degree of the same degree of nucleotides or amino acid residues between sequences after aligning both sequences to the maximum extent in a specific comparison region. Sequence identity is a value measured by optimally aligning and comparing two sequences in a specific comparison region, and a portion of the sequence in the comparison region may be added or deleted compared to a reference sequence. Percent sequence identity can be determined by, for example, comparing two optimally aligned sequences throughout the comparison region, determining the number of positions in both sequences where the same amino acid or nucleotide appears, to obtain the number of matched positions.
  • the percent sequence identity may be determined using a known sequence comparison program, and examples of the program include BLASTN (NCBI), BLASTP (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc), etc. have.
  • sequence identity can be used to identify polypeptides or polynucleotides that have the same or similar function or activity of different species. For example, 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more. sequence identity including greater than, greater than 98%, greater than 99%, or greater than 100%.
  • genetic modification includes artificially altering the composition or structure of a cell's genetic material.
  • the term “increase in productivity” may mean an increase in production, production efficiency, or productivity of a target product.
  • One aspect includes a genetic modification to increase the activity of the multidrug transporter A (Multidrug efflux system subunit A: MdtA), and provides a recombinant microorganism having an increased production capacity of tryptophan metabolites compared to the unmodified strain do.
  • MdtA Multidrug efflux system subunit A
  • the multi-drug transporter may refer to a system that discharges various drugs and toxic compounds to the outside of cells.
  • MdtA may refer to a protein constituting a multidrug transporter together with MdtB, MdtC, and TolC, an outer membrane channel.
  • the MdtA may be of bacterial origin.
  • the MdtA may be exogenous or endogenous to the recombinant microorganism.
  • the mdtA is Escherichia (Escherichia) derived from genus Bacillus (Bacillus) derived from genus Pseudomonas (Pseudomonas) in origin, Mycobacterium (Mycobacterium) in origin, Xi Momo Nas (Zymomonas) derived from genus, Acinetobacter (Acinetobacter ) may be derived from the genus, or from the genus Vibrio.
  • the MdtA is Escherichia coli (E.coli), for example, may be derived from E. coli W3110 strain, but even other microbial origin is expressed in a host cell which is introduced is not limited as long as showing the same enzymatic activity.
  • a 'polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1' may belong to a 'polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1' if it has the same or corresponding activity.
  • the protein having the activity of MdtA in the present application does not exclude the addition of meaningless sequences before and after the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or mutations that may occur naturally, or silent mutations thereof, and SEQ ID NO: 1 It may be apparent to those skilled in the art that if the protein has the same or corresponding activity as the protein comprising the amino acid sequence of , it corresponds to the protein having the MdtA activity of the present application.
  • the MdtA may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the MdtA may be a polypeptide having 90% or more, 95% or more, or 100% sequence identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the gene encoding the MdtA may be a polynucleotide having 90% or more, 95% or more, or 100% sequence identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • tryptophan metabolite refers to a substance produced in the pathway for biosynthesis of violacein from tryptophan, for example, L-tryptophan, intermediates and/or substances that may be produced by modification. substances can be referred to.
  • the tryptophan metabolite is a substance known in the art, for example, indole-3-acetic acid (Indole-3-acetic acid), indole-3-pyruvic acid (IPA), indole-3 -Indole-3-pyruvic acid imine (IPA imine), indole-3-carbaldehyde, indole-3-carboxylic acid, indole-3-lactic acid (Indole-3-lactic acid), 5-hydroxytryptophan (5-hydroxytryptophan), 6-hydroxytryptophan (6-hydroxytryptophan), N-carbobenzoxy (Cbz)-dehydrotryptophan (N-carbobenzoxy (Cbz) )-dehydrotryptophan), oxyviolacein, deoxyviolacein, pseudoviolacein, pseudodeoxyviolacein, prodeoxyviolacein, prodioxyviolacein , protoviolaceinic acid, protodeoxyviolaceinic acid, chromopyr
  • tryptophan metabolites may also include substances that will be identified as tryptophan metabolites in the future.
  • violacein and/or deoxyviolacein is a substance synthesized in the tryptophan metabolic pathway, so the microorganism having an increased production ability of violacein and/or deoxyviolacein from tryptophan is violacein or deoxyviolacein from tryptophan.
  • the intermediate produced in the synthesis pathway, that is, the tryptophan metabolite production capacity may be increased microorganisms.
  • the genetic modification to increase the activity of MdtA may be to increase the expression of a gene encoding MdtA, but is not limited thereto.
  • a specific activity enhancing method reference may be made to the above.
  • the microorganism may belong to the genus Chromobacterium , the genus Janthinobacterium , the genus Escherichia , or the genus Duganella .
  • the microorganism may or may not have an intrinsic tryptophan metabolism pathway, or an intrinsic violacein biosynthesis pathway. If the microorganism does not have an intrinsic tryptophan metabolic pathway or an intrinsic violacein biosynthetic pathway, it may be a microorganism transformed to have a tryptophan metabolic pathway or a violacein biosynthetic pathway by molecular biological methods known in the art.
  • the microorganism may be E. coli , for example, E. coli W3110 strain, but is not limited as long as it is a microorganism capable of producing a tryptophan metabolite by the genetic modification.
  • the microorganism may have a gene for biosynthesis of violacein or deoxyviolacein.
  • the violacein or deoxybiolacein biosynthesis gene may be endogenous or exogenous, and specifically, a vioABCDE gene or a vioABCDE gene in which the vioD gene is mutated or deleted from the vioABCDE gene may be a vioABCD*E or vioABCE gene.
  • the violacein or deoxyviolacein biosynthesis gene may include a gene encoding at least one amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 7.
  • the recombinant microorganism may include an exogenous violacein or deoxyviolacein biosynthesis gene by including a genetic modification in which the activity of the gene clusters vioABCDE , vioABCD*E or vioABCE is enhanced.
  • the genetic modification may be one into which the gene clusters vioABCDE , vioABCD*E or vioABCE are introduced, for example, those introduced through a vehicle such as a vector.
  • the vioABCDE , vioABCD * E or vioABCE is a Chromobacterium genus, for example, Chromobacterium violaceum ) It may be derived from, but the same enzyme is expressed in the introduced host cell even if it is derived from another microorganism. There is no limitation as long as it shows activity
  • the polypeptides encoded by the Chromobacterium violaceum- derived genes vioA , vioB , vioC , vioD and vioE may each consist of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 3 to 7.
  • the gene cluster vioABCDE , vioABCD*E or vioABCE may function to participate in the biosynthesis of violacein in microorganisms.
  • Another aspect includes a genetic modification to increase the activity of the multidrug transporter A (Multidrug efflux system subunit A: MdtA), and culturing a recombinant microorganism having an increased ability to produce tryptophan metabolites compared to the unmodified strain to do; and recovering the target product from the medium or the microorganism, wherein the target product is a tryptophan metabolite, and provides a method for producing the target product.
  • MdtA Multidrug efflux system subunit A
  • the recombinant microorganism and tryptophan metabolite are as described above.
  • the culture of the microorganism may be made according to a suitable medium and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used according to the selected microorganism.
  • the method of culturing may include one or more culturing selected from the group consisting of batch, continuous, and fed-batch culture.
  • the medium used for the culture may be a medium that can satisfy the requirements of a specific microorganism.
  • the medium may be a medium selected from the group consisting of a carbon source, a nitrogen source, a trace element component, and a combination thereof.
  • the carbon source may be a carbon source selected from the group consisting of carbohydrates, fats, fatty acids, alcohols, organic acids, and combinations thereof.
  • the carbohydrate may be glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, and combinations thereof.
  • the fat may be soybean oil, sunflower oil, pajama oil, coconut oil, and combinations thereof.
  • the fatty acid may be palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, or a combination thereof.
  • the alcohol may be glycerol or ethanol.
  • the organic acid may include acetic acid.
  • the nitrogen source may include an organic nitrogen source, an inorganic nitrogen source, or a combination thereof.
  • the organic nitrogen source may be selected from the group consisting of peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor (CSL), soybean wheat, and combinations thereof.
  • the inorganic nitrogen source may be selected from the group consisting of urea, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate, ammonium nitrate, and combinations thereof.
  • the medium may include one selected from the group consisting of phosphorus, metal salts, amino acids, vitamins, precursors, and combinations thereof.
  • the source of phosphorus may include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • the metal salt may be magnesium sulfate or iron sulfate.
  • the medium or individual components constituting it may be added in a batch, continuous, or fed-batch culture.
  • the pH of the culture can be adjusted. Adjustment of the pH may be made by adding ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, or sulfuric acid to the culture.
  • the culturing method may include suppression of bubble production. The suppression of the foaming can be achieved through the use of an antifoaming agent.
  • the antifoaming agent may include a fatty acid polyglycol ester.
  • the culture method may include injection of gas into the culture.
  • the gas may include any gas for maintaining the aerobic state of the culture.
  • the gas may be oxygen or an oxygen-containing gas.
  • the oxygen-containing gas includes air.
  • the temperature of the culture may be 20 to 45 °C, for example, 22 to 42 °C, or 25 to 40 °C. The incubation period may be continued until a desired amount of tryptophan metabolite produced is obtained.
  • it may further comprise the step of recovering a tryptophan metabolite from the culture medium.
  • the produced tryptophan metabolite can be recovered from the culture by, for example, treating the culture solution with sulfuric or hydrochloric acid, followed by anion exchange chromatography, concentration, crystallization, and isoelectric point precipitation.
  • Another aspect provides a method for producing a microorganism having an increased tryptophan metabolite-producing ability, comprising the step of introducing a genetic modification that increases the activity of multidrug transporter A (Multidrug efflux system subunit A: MdtA) do.
  • multidrug transporter A Multidrug efflux system subunit A: MdtA
  • the recombinant microorganism According to the recombinant microorganism according to an aspect, it can be used to produce tryptophan metabolites with high efficiency.
  • the method for producing the target product it is possible to efficiently produce the target product, tryptophan metabolite.
  • the method for producing a microorganism having an increased tryptophan metabolite-producing ability it is possible to efficiently prepare a microorganism having an increased tryptophan metabolite-producing ability.
  • a recombinant microorganism comprising a genetic modification that increases the activity of a multidrug transporter, and a method for producing a tryptophan metabolite using the same may enable mass production of the tryptophan metabolite.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of pCC1BAC-Ptrc-MdtA, an mdtA gene overexpression vector prepared by a method according to an aspect.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of pCL-Ptrc-MdtA, which is an mdtA gene overexpression vector prepared by a method according to an aspect.
  • Example 1-1 Violacein biosynthesis gene cluster for the production of strains having violacein and deoxyviolacein-producing ability vioABCDE Construction of overexpression vectors
  • vioABCDE a violacein biosynthetic gene cluster
  • genomic DNA derived from Chromobacterium violaceum ATCC 12472.
  • a primer having an NdeI restriction site inserted into the 5' end region (SEQ ID NO: 8) and a primer with a BamHI restriction enzyme site inserted at the 3' end region (SEQ ID NO: 9) were synthesized, and this primer pair was used as a primer and amplified the violacein biosynthesis gene cluster vioABCDE (SEQ ID NO: 10) through a polymerase chain reaction (PCR) using genomic DNA derived from Chromobacterium violaceum ATCC 12472 as a template.
  • PCR polymerase chain reaction
  • PCR conditions were denaturation at 94°C for 5 minutes, denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 10 minutes were repeated 30 times, followed by polymerization at 72°C for 7 minutes.
  • a strong promoter a trc promoter (SEQ ID NO: 11) in which a KpnI restriction site was inserted at the 5' end and an NdeI restriction site was inserted at the 3' end was synthesized.
  • the vioABCDE gene cluster fragment amplified by PCR as described above was digested with restriction enzymes NdeI and BamHI, and the synthesized trc promoter fragment was digested with restriction enzymes KpnI and NdeI to obtain each DNA fragment.
  • This was ligated to the overexpression vector pECCG117 (Biotechnology letters vol. 13, No.10, p.721-726 (1991) or Korean Patent Publication No. 92-7401) having restriction enzymes KpnI and BamHI ends, and then transformed into E. coli DH5 ⁇ .
  • Plasmids were obtained from each transformed E. coli DH5 ⁇ using a commonly known plasmid extraction method.
  • the plasmid isolated from the purple colony was named pECCG117-Ptrc-vioABCDE.
  • Example 1-2 Violacein biosynthesis gene cluster for the production of strains having deoxyviolacein-producing ability vioABCE Construction of overexpression vectors
  • vioABCE overexpression vector for the construction of a strain having deoxybiolacein- producing ability
  • vioABC and vioE except for vioD in the violacein biosynthesis gene cluster from genomic DNA derived from Chromobacterium violaceum ATCC 12472 were amplified.
  • a primer having an NdeI restriction site inserted into the 5' end region (SEQ ID NO: 8) and a primer with an NheI restriction enzyme site inserted into the 3' end region (SEQ ID NO: 12) were synthesized and , PCR was performed in the same manner as described in Example 1-1, except that this primer pair was used as a primer.
  • a strong promoter for the gene a trc promoter (SEQ ID NO: 13) in which a KpnI restriction site was inserted at the 5' end and an NdeI restriction site was inserted at the 3' end was synthesized.
  • a primer having an NdeI restriction site inserted into the 5' end region (SEQ ID NO: 14) and a primer with a BamHI restriction enzyme site inserted into the 3' end region (SEQ ID NO: 15) were synthesized, PCR was performed in the same manner as described in Example 1-1, except that this primer pair was used as a primer.
  • a strong promoter for the gene a trc promoter (SEQ ID NO: 16) in which an NheI restriction site was inserted at the 5' end and an NdeI restriction site was inserted at the 3' end was synthesized.
  • the vioABC gene amplified by PCR as described above was digested with restriction enzymes NdeI and NheI, and the vioE gene was digested with restriction enzymes NdeI and BamHI.
  • the synthesized trc promoter fragment (SEQ ID NO: 13) was digested with restriction enzymes KpnI and NdeI, and the trc promoter fragment (SEQ ID NO: 16) was digested with restriction enzymes NheI and NdeI to obtain each DNA fragment. This was added to the overexpression vector pECCG117 (Biotechnology letters vol 13, No.10, p.721-726 (1991) or Korean Patent Publication No.
  • plasmid was obtained by culturing in the same manner as described in Example 1-1, except that it was linked and transformed into E. coli DH5 ⁇ . It was confirmed that the colony color of the transformed E. coli DH5 ⁇ was mostly indigo, and the plasmid isolated from the indigo colony was named pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE.
  • the violacein biosynthesis gene cluster overexpression vectors pECCG117-Ptrc-vioABCDE and pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE prepared in Example 1 were transformed into Escherichia coli W3110 strain according to a known method, respectively, and kanamycin was administered at 25 mg/L Transformation was confirmed by growth in LB medium containing The finally produced strains were named W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE and W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE, respectively.
  • each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of titer medium containing kanamycin at a concentration of 25 mg/L, 1 platinum each, and cultured with shaking at 37° C. for 30 hours at 200 rpm. did.
  • the composition of the titer medium is glucose 40 g/L, calcium carbonate 30 g/L, ammonium sulfate 10 g/L, potassium monophosphate 1 g/L, magnesium sulfate 1.5 g/L, and yeast extract 4 g/L.
  • strain name OD (660 nm absorbance) Violacein (mg per liter of culture) Deoxyviolacein (mg per liter of culture) W3110 15.8 0 0 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 29.7 521.2 78.1 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE 32.1 0 617.4
  • the wild-type E. coli W3110 strain did not produce violacein and deoxyviolacein at all, but when pECCG117-Ptrc-vioABCDE was transformed into the E. coli W3110 strain, violacein and deoxyviolacein were approximately It was confirmed that it was produced in a ratio of 8:2, and when pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE was transformed, it was confirmed that only deoxyviolacein was produced.
  • MdtA For the purpose of enhancing the activity of MdtA, a representative polypeptide among the polypeptides constituting the multidrug transporter Mdt, the MdtA-encoding gene mdtA was amplified using E. coli W3110 genomic DNA, and the mdtA gene overexpression vector pCC1BAC-Ptrc-MdtA was used. produced.
  • a primer having an NdeI restriction site inserted into the 5' end region (SEQ ID NO: 17) and a primer with a BamHI restriction enzyme site inserted at the 3' end region (SEQ ID NO: 18) were synthesized, and this mdtA (SEQ ID NO: 19) was amplified by PCR using the primer pair as a primer and Escherichia coli K-12 W3110 genomic DNA as a template. PCR was performed under the same conditions as those described in Example 1-1.
  • a trc promoter SEQ ID NO: 20
  • SEQ ID NO: 20 with an EcoRI restriction enzyme site inserted at the 5' end and an NdeI restriction enzyme site inserted at the 3' end was synthesized.
  • the mdtA gene fragment amplified by PCR as described above was digested with restriction enzymes NdeI and BamHI, and the synthesized trc promoter fragment was digested with restriction enzymes EcoRI and NdeI to obtain each DNA fragment.
  • This was ligated to vector pCC1BAC (GenBank No. EU140750.1) having restriction enzymes EcoRI and BamHI ends, then transformed into E. coli DH5 ⁇ , and plated on LB solid medium containing 25 mg/L chloramphenicol. Colony formation was confirmed by culturing in the same manner as described in Example 1-1.
  • Colonies transformed with the vector into which the desired gene was inserted were selected through PCR, and a plasmid was obtained from each transformed E. coli DH5 ⁇ using a commonly known plasmid extraction method, and this plasmid was named pCC1BAC-Ptrc-MdtA. .
  • the mdtA overexpression vector pCC1BAC-Ptrc-MdtA prepared in Example 3 was transferred to the violacein and deoxyviolacein-producing strains W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE and W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE prepared in Example 2 above.
  • empty vector pCC1BAC was also transformed into W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE and pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE strains, respectively, and W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCC1BAC and pECCG117- It was named Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCC1BAC and used as a control.
  • the vector has both kanamycin and chloramphenicol resistance, so the transformation was confirmed by growth in LB medium containing 25 mg/L of kanamycin and chloramphenicol, respectively.
  • violacein and violacein and chloramphenicol were used in the same manner as described in Experimental Example 1, except that a titer medium containing kanamycin and chloramphenicol at a concentration of 25 mg/L was used, and the strains prepared in Example 4 were inoculated Deoxyviolacein production ability was evaluated and the results are shown in Table 2.
  • strain name OD (660 nm absorbance) Violacein (mg per liter of culture) Deoxyviolacein (mg per liter of culture) W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCC1BAC 32.4 558.5 105.7 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCC1BAC 35.6 0.0 640.2 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCC1BAC-Ptrc-MdtA 33.8 619.4 120.5 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCC1BAC-Ptrc-MdtA 34.0 0.0 755.4
  • MdtA which is a representative polypeptide among the polypeptides constituting the multidrug transporter Mdt
  • a vector capable of expressing a gene with a higher copy number than the mdtA gene overexpression vector prepared in Example 3 was used.
  • An mdtA gene overexpression vector pCL-Ptrc-MdtA was constructed.
  • a primer having an NdeI restriction site inserted into the 5' end region (SEQ ID NO: 21) and a primer with a BamHI restriction enzyme site inserted at the 3' end region (SEQ ID NO: 22) were synthesized, and this mdtA (SEQ ID NO: 23) was amplified by PCR using the primer pair as a primer and Escherichia coli K-12 W3110 genomic DNA as a template. PCR was performed under the same conditions as those described in Example 1-1.
  • trc promoter (SEQ ID NO: 24) in which a Hind III restriction enzyme site was inserted at the 5' end and an NdeI restriction enzyme site was inserted at the 3' end was synthesized.
  • the mdtA fragment amplified by PCR as described above was digested with restriction enzymes NdeI and BamHI, and the synthesized trc promoter fragment was digested with restriction enzymes HindIII and NdeI to obtain each DNA fragment.
  • This was ligated to vector pCL1920 (GenBank No. AB236930) having restriction enzymes Hind III and BamHI terminus, transformed into E. coli DH5 ⁇ , and plated on LB solid medium containing 25 mg/L spectinomycin except that it was plated Colony formation was confirmed by culturing in the same manner as described in Example 1-1.
  • Colonies transformed with the vector into which the desired gene was inserted were selected through PCR, and a plasmid was obtained from each transformed E. coli DH5 ⁇ using a commonly known plasmid extraction method, and this plasmid was named pCL-Ptrc-MdtA. .
  • the mdtA overexpression vector pCL-Ptrc-MdtA prepared in Example 5 was transferred to the violacein and deoxyviolacein-producing strains W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE and W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE prepared in Example 2 above. Each was transformed by a known method, and the prepared strains were named W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-Ptrc-MdtA and W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-Ptrc-MdtA, respectively.
  • empty vector pCL1920 was also transformed into W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE and pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE strains, respectively, and W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL1920 and pECCG117- It was named Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL1920 and used as a control.
  • the vector has both kanamycin and spectinomycin resistance, so the transformation was confirmed by growth in LB medium containing 25 mg/L of kanamycin and spectinomycin, respectively.
  • strain name OD (660 nm absorbance) Violacein (mg per liter of culture) Deoxyviolacein (mg per liter of culture) W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL1920 30.8 614.4 116.3 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL1920 33.8 0.0 650.0 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-Ptrc-MdtA 40.6 767.9 153.5 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-Ptrc-MdtA 40.8 0.0 864.5
  • Example 7 mdtA Construction of a strain in which the promoter of the gene was substituted with a strong promoter
  • a chloramphenicol acetyltransferase gene which confer resistance to chloramphenicol, was used as a selection marker for confirming the insertion of the trc promoter into the chromosome, and for this, a pUCprmfmloxC vector containing a chloramphenicol acetyltransferase gene (Korean Patent Publication No. 2009-0075549) was used.
  • a trc promoter (SEQ ID NO: 25) in which a KpnI restriction site was inserted at the 5' end and an EcoRV restriction site was inserted at the 3' end was synthesized and treated with restriction enzymes KpnI and EcoRV to obtain a DNA fragment.
  • Primers of SEQ ID NOs: 26 and 27 were synthesized to amplify the trc promoter fragment to be inserted into the self-promoter locus of the mdtA gene, and PCR was performed using this primer pair using the pmlox-Cm-Ptrc plasmid as a template. . PCR conditions were repeated 30 times of denaturation at 94°C for 5 minutes, denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 2 minutes, followed by polymerization at 72°C for 5 minutes. The PCR-amplified DNA fragment was named Cm-Ptrc-mdtA, and its base sequence is shown in SEQ ID NO: 28.
  • Example 7-2 mdtA Construction of a strain in which the promoter of the gene was replaced with a strong promoter
  • a strain in which the self promoter of the mdtA gene was substituted with the trc promoter was prepared using the Cm-Ptrc-mdtA and recombinant enzyme prepared above.
  • each strain was cultured in 20 ml of LB medium containing 5 mM arabinose. When the amount of cells grew to 5 x 10 8 cells/ml, the cells were recovered by centrifugation and washed three times with a cold 10% glycerol solution.
  • the DNA fragment Cm-Ptrc-mdtA was introduced into each of the above strains by electroporation. Since the DNA fragment is a fragment including 80 bp of the same sequence as the nucleotide sequence around the mdtA gene's self-promoter locus at the 5' and 3' ends, respectively, gene recombination occurs at the mdtA auto-promoter locus by lambda red recombinase, resulting in chloramphenicol
  • the resistance gene and the trc promoter may be substituted for the mdtA autopromoter locus.
  • the strain that has undergone genetic recombination has chloramphenicol resistance, it was selected through growth in LB medium containing chloramphenicol at 25 mg/L. In the selected strain, it was confirmed that the Cm-Ptrc-mdtA fragment was inserted into the self-promoter locus of the mdtA gene through PCR using the primers of SEQ ID NOs: 29 and 30. PCR conditions were repeated 30 times of denaturation at 94°C for 5 minutes, denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 2 minutes, followed by polymerization at 72°C for 5 minutes.
  • each strain was cultured at 40° C. or higher to remove the pKD46 vector from the cells, which is an LB containing 25 mg/L of ampicillin. It was confirmed that the strain selected from the medium did not grow. Then, the pJW168 plasmid (Beatriz Palmeros et al., Gene, 247, 255-264, 2000) was introduced into each strain in order to remove the gene exhibiting resistance to chloramphenicol using Cre-recombinase. .
  • strains finally confirmed through the above process are violacein and deoxyviolasein producing strains in which the self-promoter of the mdtA gene is substituted with the trc promoter, W3110/Ptrc-mdtA/pECCG117-Ptrc-vioABCDE and W3110/Ptrc-mdtA, respectively. It was named /pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE.
  • the violacein and deoxybiolacein-producing ability was evaluated in the same manner as described in Experimental Example 1, except that the strains prepared in Example 7 were used, and the results are shown in Table 4.
  • the W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE and W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE strains overexpressed with the violacein biosynthesis gene cluster prepared in Example 2 were used.
  • strain name OD (660 nm absorbance) Violacein (mg per liter of culture) Deoxyviolacein (mg per liter of culture) W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 32.4 553.1 81.0 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE 35.6 0.0 657.0 W3110/Ptrc-mdtA/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 32.5 647.2 95.6 W3110/Ptrc-mdtA/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE 33.7 0.0 781.8

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Abstract

다중약물 수송체 A(Multidrug efflux system subunit A: MdtA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물에 관한 것이다. 다중약물 수송체의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 재조합 미생물, 및 그를 이용한 트립토판 대사체를 생산하는 방법은 트립토판 대사체의 대량 생산을 가능하게 할 수 있다.

Description

다중약물 수송체의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 미생물, 및 그를 이용한 트립토판 대사체의 생산 방법
본 출원은 다중약물 수송체 A(Multidrug efflux system subunit A: MdtA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물에 관한 것이다.
두 개의 L-트립토판은 이민 다이머(imine dimer)를 형성할 수 있고, 이로부터 다양한 유용물질들이 합성될 수 있다. 예를 들면, L-트립토판으로부터 생성될 수 있는 트립토판 대사체들 중에서 비올라세인(violacein) 및 디옥시비올라세인(deoxyviolacein)은 항암, 항궤양, 항균, 항진균, 항원생동물, 항바이러스 등 다양한 생리활성 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 기타 다양한 그람양성균에 대한 강력한 항생 작용으로 다제내성균에 대한 새로운 항생제로서의 역할, 면, 나일론, 레이온, 폴리에스테르 등 다양한 직물에 염색하는 염료로서 이용될 수 있어 활용도가 높다.
비올라세인 및 디옥시비올라세인 외에도, L-트립토판으로부터 생성될 수 있는 다양한 트립토판 대사체 또는 중간물질에 대한 관심이 높아지고 있으며, 이들을 수득하기 위해, 유전적으로 변형된 재조합 미생물을 제조하는 방법이 연구되고 있다. 하지만, 공지되어 있는 방법으로 제조된 미생물이 제조하는 목적 산물의 양이나 수율이 낮아, 트립토판 대사체를 상업적으로 대량 생산할 수 없다는 문제점이 있다.
따라서, L-트립토판으로부터 생성되는 다양한 대사체들을 대량 생산할 수 있는 미생물에 관한 연구가 수행될 필요가 있으며, 본 출원의 발명자들은 미생물 내 특정 단백질의 활성을 조절하여, 상기 대사체의 생산량을 크게 증가시킬 수 있었다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 0001) 대한민국 등록특허 제10-1602772호
본 출원은 다중약물 수송체 A(Multidrug efflux system subunit A: MdtA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하고, 비변형 균주에 비하여 트립토판 대사체의 생산능이 증가된 재조합 미생물을 제공한다.
본 출원은 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 배지 또는 상기 미생물로부터 목적산물을 회수하는 단계를 포함하고, 상기 목적산물은 트립토판 대사체인, 목적산물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 출원에서 용어, 단백질 활성의 "강화"는, 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 의미한다. 이는 "변형전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 "활성 증가"는 외래의 단백질을 도입하거나, 내재적인 단백질의 활성 강화를 통해 달성할 수 있으나, 구체적으로는 내재적인 단백질의 활성 강화를 통해 달성하는 것일 수 있다. 상기 단백질의 활성의 강화 여부는 해당 단백질의 활성 정도, 발현량 또는 해당 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 단백질의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 단백질의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않을 수 있다. 상기 방법은 이로 제한되는 것은 아니나, 유전자 공학 또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있다.
상기 유전자 공학을 이용하여 단백질 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면,
1) 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가,
2) 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 발현 조절 서열로 교체하는 방법,
3) 상기 단백질의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법,
4) 상기 단백질 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법,
5) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는
6) 상기 방법들의 조합 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질 공학을 이용하여 단백질 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면, 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가는, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 해당 단백질을 코딩하는 유전자가 작동 가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터를 숙주세포 내에 도입함으로써 수행될 수 있다. 또는, 상기 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 유전자를 삽입시킬 수 있는 벡터를 숙주세포 내에 도입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 목적 단백질을 발현시키기에 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 형태로 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.
본 출원에서 용어, "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다.
또한, 상기에서 용어, "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미할 수 있다.
상기 2) 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 발현 조절 서열로 교체하는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 상기 방법은 구체적으로 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터를 연결시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ7 프로모터 (대한민국 등록특허 제10-0620092호), CJ1 프로모터 (대한민국 등록특허 제10-0620092호), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, araBAD 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터 및 tet 프로모터가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 단백질의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 단백질의 내재적 개시코돈을 상기 내재적 개시코돈에 비해 단백질 발현율이 더 높은 다른 개시코돈으로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 상기 단백질 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 상기 유전자를 염색체내로 삽입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 도입하고자 하는 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
상기 5) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
마지막으로, 6) 상기 방법들의 조합은 상기 1) 내지 5) 중 어느 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.
이와 같은 단백질 활성의 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 변형전 미생물 균주에서 발현된 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원에서 용어, "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미한다. 본 출원에 있어서, 상기 형질 변화는 다중약물 수송체의 활성 강화일 수 있다. 상기 "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물", "비변형 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에 있어서 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드가 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN(NCBI), BLASTP(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어서 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전적 변형 (genetic modification)"이란 세포의 유전물질의 구성 또는 구조를 인위적으로 변경시키는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "생산능(productivity)의 증가"는 목적산물의 생산량, 생산효율, 또는 생산성 등이 증가된 것을 의미할 수 있다.
일 양상은 다중약물 수송체 A(Multidrug efflux system subunit A: MdtA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하고, 비변형 균주에 비하여 트립토판 대사체의 생산능이 증가된 재조합 미생물을 제공한다.
본 명세서에서 다중약물 수송체(Mdt)는 다양한 약물과 독성화합물을 세포 외부로 배출하는 시스템을 지칭할 수 있다. MdtA는 MdtB와 MdtC 그리고 외막채널(outer membrane channel)인 TolC와 함께 다중약물 수송체를 구성하는 단백질을 지칭할 수 있다. 상기 MdtA는 박테리아 유래의 것일 수 있다. 상기 MdtA는 상기 재조합 미생물에 대하여 외인성(exogenous) 또는 내인성(endogenous)인 것일 수 있다. 상기 mdtA는 에세리키아(Escherichia) 속 유래, 바실러스(Bacillus) 속 유래, 슈도모나스(Pseudomonas)　속 유래, 마이코박테리움(Mycobacterium) 속 유래, 자이모모나스(Zymomonas) 속 유래, 아시네토박터(Acinetobacter)　속 유래, 또는 비브리오(Vibrio) 속 유래인 것일 수 있다. 상기 MdtA는 대장균(E.coli), 예를 들면, 대장균 W3110 균주 유래인 것일 수 있으나, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 제한되지 않는다.
본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명할 수 있다. 예를 들어, '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'는, 이와 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'에 속할 수 있음은 자명할 수 있다. 따라서, 본 출원에서의 MdtA 의 활성을 갖는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 또는 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 MdtA 활성을 갖는 단백질에 해당됨은 당업자에게 자명할 수 있다.
상기 MdtA는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 MdtA는 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 MdtA를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열과 90% 이상, 95% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "트립토판 대사체(tryptophan metabolite)"는 트립토판, 예를 들면, L-트립토판으로부터 비올라세인이 생합성되는 경로에서 생산되는 물질, 중간체 및/또는 상기 물질이 변형되어 생성될 수 있는 물질을 지칭할 수 있다. 상기 트립토판 대사체는 당업계에 공지되어 있는 물질, 예를 들면, 인돌-3-아세트산(Indole-3-acetic acid), 인돌-3-피루브산(Indole-3-pyruvic acid: IPA), 인돌-3-피루브산 이민(Indole-3-pyruvic acid imine: IPA 이민), 인돌-3-카르발데히드(Indole-3-carbaldehyde), 인돌-3-카르복시산(Indol-3-carboxylic acid), 인돌-3-락트산(Indole-3-lactic acid), 5-히드록시트립토판(5-hydroxytryptophan), 6-히드록시트립토판(6- hydroxytryptophan), N-카르보벤즈옥시(Cbz)-데히드로트립토판(N-carbobenzoxy(Cbz)-dehydrotryptophan), 옥시비올라세인(oxyviolacein), 디옥시비올라세인(deoxyviolacein), 슈도비올라세인(pseudoviolacein), 슈도디옥시비올라세인(pseudodeoxyviolacein), 프로비올라세인(proviolacein), 프로디옥시비올라세인(prodeoxyviolacein), 프로토비올라세인산(protoviolaceinic acid), 프로토디옥시비올라세인산(protodeoxyviolaceinic acid), 크로모피롤산(chromopyrrolic acid: CPA), 아르시리아루빈 A(arcyriarubin A), 크로모아제피논 A(chromoazepinone A), 크로모아제피논 B(chromoazepinone B), 크로모아제피논 C(chromoazepinone C), 인디고(indigo), 크로모비리단스(chromoviridans), 또는 디옥시크로모비리단스(deoxychromoviridans), 옥시크로모비리단스(oxychromoviridans)일 수 있다. 또한, 미래에 트립토판 대사체로 밝혀질 물질 또한 포함할 수 있다. 인돌(indole)기, 또는 두 개의 인돌이 연결된 비스-인돌(bis-indole)기를 갖는, 상기 트립토판 대사체들 중 일부는, 유사한 전기화학적 특성 또는 유사한 분자 크기를 가질 수 있다.
상기 미생물에서, 비올라세인 및/또는 디옥시비올라세인은 트립토판 대사 경로에서 합성되는 물질이므로 트립토판으로부터 비올라세인 및/또는 디옥시비올라세인의 생산능이 증가된 미생물은 트립토판으로부터 비올라세인 또는 디옥시비올라세인이 합성되는 경로에서 생산되는 중간체, 즉 트립토판 대사체의 생산능이 증가된 미생물일 수 있다.
상기 미생물에 있어서, MdtA의 활성을 증가시키는 유전적 변형은 MdtA를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 구체적인 활성 강화 방법은 전술된 사항을 참고할 수 있다.
상기 미생물은 크로모박테리움(Chromobacterium) 속, 잔티노박테리움(Janthinobacterium)속, 에세리키아(Escherichia) 속, 또는 두가넬라(Duganella)속에 속하는 것일 수 있다. 상기 미생물은 내재적(intrinsic) 트립토판 대사 경로(tryptophan metabolism pathway), 또는 내재적 비올라세인 생합성 경로를 가지고 있거나 가지고 있지 않은 것일 수 있다. 상기 미생물은 내재적 트립토판 대사 경로, 또는 내재적 비올라세인 생합성 경로를 가지고 있지 않은 것일 경우, 당업계에 공지된 분자생물학적 방법에 의해 트립토판 대사 경로 또는 비올라세인 생합성 경로를 갖도록 형질전환된 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 대장균(E.coli), 예를 들면, 대장균 W3110 균주일 수 있으나, 상기 유전적 변형에 의해 트립토판 대사체를 생산할 수 있는 미생물이라면 제한되지 않는다.
상기 미생물은 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자를 가지고 있는 것일 수 있다. 상기 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자는 내인성 또는 외인성일 수 있고, 구체적으로, vioABCDE 유전자, 또는 vioABCDE 유전자 중 vioD 유전자가 변이 또는 결실된 vioABCD*E 또는 vioABCE 유전자일 수 있다. 상기 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자는, 서열번호 3 내지 7의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 재조합 미생물은 유전자 클러스터 vioABCDE, vioABCD*E 또는 vioABCE의 활성이 강화된 유전적 변형을 포함하는 것에 의해 외인성 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 유전자 클러스터 vioABCDE, vioABCD*E 또는 vioABCE가 도입된 것, 예를 들면 벡터와 같은 비히클을 통하여 도입된 것일 수 있다. 상기 vioABCDE, vioABCD*E 또는 vioABCE는 크로모박테리움(Chromobacterium) 속, 예를 들면 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum) 유래일 수 있으나, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 제한이 없다. 일 구체예에서, 상기 크로모박테리움 비올라세움 유래 유전자 vioA, vioB, vioC, vioD 및 vioE에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 각각 서열번호 3 내지 7의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다. 상기 유전자 클러스터 vioABCDE, vioABCD*E 또는 vioABCE는 미생물에서 비올라세인 생합성에 관여하는 기능을 할 수 있다.
다른 양상은 다중약물 수송체 A(Multidrug efflux system subunit A: MdtA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하고, 비변형 균주에 비하여 트립토판 대사체의 생산능이 증가된 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 배지 또는 상기 미생물로부터 목적산물을 회수하는 단계를 포함하고, 상기 목적산물은 트립토판 대사체인, 목적산물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법에서, 재조합 미생물, 트립토판 대사체에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 미생물의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지 및 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양의 방법은 회분식, 연속식, 및 유가식 배양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양을 포함할 수 있다.
상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소 성분, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
상기 탄소원은 탄수화물, 지방, 지방산, 알코올, 유기산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소원일 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스, 및 이들의 조합일 수 있다. 상기 지방은 대두유, 해바라기유, 파자마유, 코코넛유, 및 이들의 조합일 수 있다. 상기 지방산은 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 알코올은 글리세롤 또는 에탄올일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산을 포함할 수 있다.
상기 질소원은 유기 질소원, 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 유기 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 대두밀, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 무기 질소원은 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄, 및 이들의 조 합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 배지는 인, 금속염, 아미노산, 비타민, 전구체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 상기 인의 공급원은 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 또는 이들에 상응하는 소듐-함유염을 포함 할 수 있다. 상기 금속염은 황산마그네슘 또는 황산철일 수 있다.
상기 배지 또는 이를 이루는 개별 성분은 회분식, 연속식, 또는 유가식 배양으로 첨가될 수 있다.
상기 배양 방법에 있어서, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 상기 pH의 조정은 상기 배양물에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 또는 황산을 첨가하여 이루어질 수 있다. 또한, 상기 배양 방법은 기포 생성 억제를 포함할 수 있다. 상기 기포 생성 억제는 소포제의 사용을 통하여 이루어질 수 있다. 상기 소포제는 지방산 폴리글리콜 에스테르를 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양 방법은 배양물 내로 기체의 주입을 포함할 수 있다. 상기 기체는 배양물의 호기 상태를 유지하기 위한 어떤 기체도 포함할 수 있다. 상기 기체는 산소 또는 산소 함유 기 체일 수 있다. 상기 산소 함유 기체는 공기를 포함한다. 상기 배양에 있어서, 배양물의 온도는 20 내지 45℃, 예를 들면, 22 내지 42℃, 또는 25 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 원하는 트립토판 대사체의 생성량을 획득할 때까지 지속될 수 있다.
상기 방법에서, 배양액으로부터 트립토판 대사체를 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.
생산된 트립토판 대사체는 예를 들면, 배양액을 황산 또는 염산 처리한 후에 음이온 교환 크로마토그래피, 농축, 정석, 등전점 침전 등의 공정을 병용하여 배양물로부터 회수될 수 있다.
다른 양상은 다중약물 수송체 A(Multidrug efflux system subunit A: MdtA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 도입하는 단계를 포함하는 트립토판 대사체 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
일 양상에 따른 재조합 미생물에 의하면, 트립토판 대사체를 고효율로 생산하는데 사용할 수 있다.
다른 양상에 따른 목적산물을 제조하는 방법에 의하면, 목적산물인 트립토판 대사체를 효율적으로 생산할 수 있다.
다른 양상에 따른 트립토판 대사체 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법에 의하면, 트립토판 대사체 생산능이 증가된 미생물을 효율적으로 제조할 수 있다.
다중약물 수송체의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 재조합 미생물, 및 그를 이용한 트립토판 대사체를 생산하는 방법은 트립토판 대사체의 대량 생산을 가능하게 할 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 방법으로 제작된 mdtA 유전자 과발현 벡터인 pCC1BAC-Ptrc-MdtA의 모식도이다.
도 2는 일 양상에 따른 방법으로 제작된 mdtA 유전자 과발현 벡터인 pCL-Ptrc-MdtA의 모식도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터의 제작
실시예 1-1. 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 갖는 균주의 제작을 위한 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 vioABCDE 과발현 벡터의 제작
비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터를 제작하기 위하여 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum) ATCC 12472 유래의 게놈 DNA로부터 비올라세인 생합성 유전자 클러스터인 vioABCDE를 증폭하였다.
구체적으로, 5' 말단 영역에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 8)와 3' 말단 영역에 BamHⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 9)를 합성하고, 이 프라이머 쌍을 프라이머로 하고 크로모박테리움 비올라세움 ATCC 12472 유래의 게놈 DNA를 주형으로 한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 vioABCDE(서열번호 10)를 증폭하였다. PCR 조건은 94℃에서 5 분간 변성 후, 94℃ 30 초 변성, 60℃ 30 초 어닐링, 72℃ 10 분 중합을 30 회 반복한 후, 72℃에서 7 분간 중합반응을 수행하였다. 또한 강한 프로모터로서, 5' 말단에 KpnⅠ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 11)를 합성하였다.
상기와 같이 PCR로 증폭된 vioABCDE 유전자 클러스터 단편을 제한효소 NdeⅠ와 BamHⅠ으로 절단하고, 상기 합성된 trc 프로모터 단편을 제한효소 KpnⅠ과 NdeⅠ로 절단하여 각각의 DNA 절편을 획득하였다. 이를 제한효소 KpnⅠ과 BamHⅠ 말단을 가지는 과발현 벡터 pECCG117(Biotechnology letters vol. 13, No.10, p.721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 카나마이신이 25 ㎎/L로 포함된 LB(Luria Bertani, 리터 당 트립톤 10 g, 효모추출물 5 g, NaCl 10 g, Agar 12 g, pH 7.0) 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16 시간 동안 배양하여 콜로니가 형성되는 것을 확인하였다.
PCR을 통해 목적한 유전자 클러스터가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하기 전, 이미 형질전환된 대장균 DH5α의 콜로니 색상이 대부분 보라색을 띠는 것을 확인하였다. 각각의 형질전환된 대장균 DH5α로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 보라색 콜로니로부터 분리된 플라스미드를 pECCG117-Ptrc-vioABCDE로 명명하였다.
실시예 1-2. 디옥시비올라세인 생산능을 갖는 균주의 제작을 위한 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 vioABCE 과발현 벡터의 제작
디옥시비올라세인 생산능을 갖는 균주의 제작을 위한 vioABCE 과발현 벡터를 제작하기 위하여, 크로모박테리움 비올라세움 ATCC 12472 유래의 게놈 DNA로부터 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 중 vioD를 제외한 vioABC 및 vioE를 증폭하였다.
구체적으로, 유전자 vioABC를 증폭하기 위하여, 5' 말단 영역에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 8)와 3' 말단 영역에 NheⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 12)를 합성하고, 이 프라이머 쌍을 프라이머로 한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 상기 유전자에 대한 강한 프로모터로서, 5' 말단에 KpnⅠ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 13)를 합성하였다.
또한, 유전자 vioE를 증폭하기 위하여, 5' 말단 영역에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 14)와 3' 말단 영역에 BamHⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 15)를 합성하고, 이 프라이머 쌍을 프라이머로 한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 상기 유전자에 대한 강한 프로모터로서, 5' 말단에 NheⅠ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 16)를 합성하였다.
상기와 같이 PCR로 증폭된 vioABC 유전자를 제한효소 NdeⅠ과 NheⅠ으로 절단하고, vioE 유전자를 제한효소 NdeⅠ와 BamHⅠ으로 절단하였다. 또한, 상기 합성된 trc 프로모터 단편(서열번호 13)을 제한효소 KpnⅠ과 NdeⅠ으로 절단하고, trc 프로모터 단편(서열번호 16)을 제한효소 NheⅠ과 NdeⅠ으로 절단하여 각각의 DNA 절편을 획득하였다. 이를 제한효소 KpnⅠ과 BamHⅠ 말단을 가지는 과발현 벡터 pECCG117(Biotechnology letters vol 13, No.10, p.721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)에 trc-vioABC-trc-vioE 순서로 연결하여 대장균 DH5α에 형질전환한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양하여 플라스미드를 획득하였다. 형질전환된 대장균 DH5α의 콜로니 색상은 대부분 남색을 띠는 것을 확인하였으며, 남색 콜로니로부터 분리된 플라스미드를 pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE로 명명하였다.
실시예 2. 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터를 도입한 균주의 제작
상기 실시예 1에서 제조한 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터 pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE를 각각 공지된 방법에 따라 대장균 W3110 균주에 형질전환하고, 카나마이신이 25 ㎎/L로 포함된 LB 배지에서의 생장여부를 통해 형질전환을 확인하였다. 최종적으로 제작된 균주를 각각 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE로 명명하였다.
실험예 1. 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터를 도입한 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능 평가
상기 실시예 2에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 카나마이신이 25 ㎎/L의 농도로 포함된 역가 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 1 백금이씩 접종하고, 37℃에서 30 시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 역가 배지의 조성은 포도당 40g/L, 탄산칼슘 30g/L, 황산 암모늄 10g/L, 일인산칼륨 1g/L, 황산마그네슘 1.5g/L, 및 효모엑기스 4g/L이다. 비올라세인 및 디옥시비올라세인을 정량하기 위하여 각 세포가 포함된 배양물을 에탄올에 30배 희석하여 1 시간 동안 진탕 추출하고 13,000 rpm에서 5 분간 원심분리한 후 상층액을 HPLC로 분석하였다. 이 결과를 표 1에 나타내었다.
균주명 OD(660 ㎚ 흡광) 비올라세인(배양액 리터당 ㎎) 디옥시비올라세인(배양액 리터당 ㎎)
W3110 15.8 0 0
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 29.7 521.2 78.1
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE 32.1 0 617.4
상기 표 1에 나타낸 것과 같이, 야생형 대장균 W3110 균주는 비올라세인 및 디옥시비올라세인을 전혀 생산하지 못하였으나, 대장균 W3110 균주에 pECCG117-Ptrc-vioABCDE를 형질전환한 경우 비올라세인과 디옥시비올라세인이 약 8:2의 비율로 생산되는 것을 확인하였으며, pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE를 형질전환한 경우 디옥시비올라세인만 생산되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. mdtA 유전자 과발현 벡터 (1)의 제작
다중약물 수송체 Mdt를 구성하는 폴리펩티드 중 대표적인 폴리펩티드인 MdtA의 활성을 강화하고자 하는 목적으로, 대장균 W3110 게놈 DNA를 이용하여 MdtA를 코딩하는 유전자 mdtA를 증폭하고, mdtA 유전자 과발현 벡터 pCC1BAC-Ptrc-MdtA를 제작하였다.
구체적으로, mdtA를 증폭하기 위하여 5' 말단 영역에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 17)와 3' 말단 영역에 BamHⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 18)를 합성하고, 이 프라이머 쌍을 프라이머로 하고 Escherichia coli K-12 W3110 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR을 통해 mdtA(서열번호 19)를 증폭하였다. PCR은 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 조건으로 수행하였다. 또한 강한 프로모터로서, 5' 말단에 EcoRⅠ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 20)를 합성하였다.
상기와 같이 PCR로 증폭된 mdtA 유전자 단편을 제한효소 NdeⅠ과 BamHⅠ으로 절단하고, 상기 합성된 trc 프로모터 단편을 제한효소 EcoRⅠ과 NdeⅠ으로 절단하여 각각의 DNA 절편을 획득하였다. 이를 제한효소 EcoRⅠ과 BamHⅠ 말단을 가지는 벡터 pCC1BAC(GenBank No. EU140750.1)에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 클로람페니콜이 25 ㎎/L로 포함된 LB 고체배지에 도말한 것을 제외하고는 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양하여 콜로니 형성을 확인하였다.
PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하여 각각의 형질전환된 대장균 DH5α로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pCC1BAC-Ptrc-MdtA로 명명하였다.
실시예 4. mdtA 유전자 과발현 벡터 (1)이 도입된 균주의 제작
상기 실시예 3에서 제조한 mdtA 과발현 벡터 pCC1BAC-Ptrc-MdtA를 실시예 2에서 제작된 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산 균주 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE에 공지된 방법으로 각각 형질전환 하였고, 제작된 균주를 각각 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCC1BAC-Ptrc-MdtA 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCC1BAC-Ptrc-MdtA로 명명하였다.
항생제에 대한 영향성을 최소화하여 비교하고자, 공벡터 pCC1BAC 또한 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE 균주에 각각 형질전환하여 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCC1BAC 및 pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCC1BAC로 명명하고 대조군으로 사용하였다. 벡터가 형질전환될 경우 카나마이신과 클로람페니콜 내성을 모두 가지게 되므로 카나마이신과 클로람페니콜이 각각 25 ㎎/L로 포함된 LB 배지에서의 생장여부를 통해 형질 전환을 확인하였다.
실험예 2. mdtA 유전자 과발현 벡터 (1)이 도입된 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능 평가
상기 실시예 4에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 카나마이신과 클로람페니콜이 각각 25 ㎎/L의 농도로 포함된 역가 배지를 사용하고, 실시예 4에서 제조한 균주들을 접종한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.
균주명 OD(660 ㎚ 흡광) 비올라세인(배양액 리터당 ㎎) 디옥시비올라세인(배양액 리터당 ㎎)
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCC1BAC 32.4 558.5 105.7
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCC1BAC 35.6 0.0 640.2
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCC1BAC-Ptrc-MdtA 33.8 619.4 120.5
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCC1BAC-Ptrc-MdtA 34.0 0.0 755.4
상기 표 2에 나타낸 것과 같이, mdtA 유전자 과발현 벡터 (1)이 도입된 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 각각의 대조군과 비교하였을 때, 비올라세인 생산능은 대조군 대비 약 11% 증가하였고, 디옥시비올라세인 생산능은 대조군 대비 약 14 내지 18% 증가하였다.
실시예 5. mdtA 유전자 과발현 벡터 (2)의 제작
다중약물 수송체 Mdt를 구성하는 폴리펩티드 중 대표적인 폴리펩티드인 MdtA의 활성을 강화하고자 하는 목적으로, 상기 실시예 3에서 제작한 mdtA 유전자 과발현 벡터에 비하여 보다 많은 카피 수로 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터를 이용하여 mdtA 유전자 과발현 벡터 pCL-Ptrc-MdtA를 제작하였다.
구체적으로, mdtA를 증폭하기 위하여 5' 말단 영역에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 21)와 3' 말단 영역에 BamHⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 22)를 합성하고, 이 프라이머 쌍을 프라이머로 하고 Escherichia coli K-12 W3110 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR을 통해 mdtA(서열번호 23)를 증폭하였다. PCR은 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 조건으로 수행하였다. 또한 강한 프로모터로서, 5' 말단에 Hind Ⅲ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 24)를 합성하였다.
상기와 같이 PCR로 증폭된 mdtA 단편을 제한효소 NdeⅠ과 BamHⅠ으로 절단하고, 상기 합성된 trc 프로모터 단편을 제한효소 Hind Ⅲ와 NdeⅠ으로 절단하여 각각의 DNA 절편을 획득하였다. 이를 제한효소 Hind Ⅲ와 BamHⅠ 말단을 가지는 벡터 pCL1920(GenBank No. AB236930)에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 스펙티노마이신이 25 ㎎/L로 포함된 LB 고체배지에 도말한 것을 제외하고는 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양하여 콜로니 형성을 확인하였다.
PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하여 각각의 형질전환된 대장균 DH5α로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pCL-Ptrc-MdtA로 명명하였다.
실시예 6. mdtA 유전자 과발현 벡터 (2)가 도입된 균주의 제작
상기 실시예 5에서 제조한 mdtA 과발현 벡터 pCL-Ptrc-MdtA를 실시예 2에서 제작된 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산 균주 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE에 공지된 방법으로 각각 형질전환 하였고, 제작된 균주를 각각 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-Ptrc-MdtA 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-Ptrc-MdtA로 명명하였다.
항생제에 대한 영향성을 최소화하여 비교하고자, 공벡터 pCL1920 또한 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE 균주에 각각 형질전환하여 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL1920 및 pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL1920으로 명명하고 대조군으로 사용하였다. 벡터가 형질전환될 경우 카나마이신과 스펙티노마이신 내성을 모두 가지게 되므로 카나마이신과 스펙티노마이신이 각각 25 ㎎/L로 포함된 LB 배지에서의 생장여부를 통해 형질 전환을 확인하였다.
실험예 3: mdtA 유전자 과발현 벡터 (2)가 도입된 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능 평가
상기 실시예 6에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 카나마이신과 스펙티노마이신이 각각 25 ㎎/L의 농도로 포함된 역가 배지를 사용하고, 실시예 6에서 제조한 균주들을 접종한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하여 그 결과를 표 3에 나타내었다.
균주명 OD(660 ㎚ 흡광) 비올라세인(배양액 리터당 ㎎) 디옥시비올라세인(배양액 리터당 ㎎)
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL1920 30.8 614.4 116.3
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL1920 33.8 0.0 650.0
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/ pCL-Ptrc-MdtA 40.6 767.9 153.5
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-Ptrc-MdtA 40.8 0.0 864.5
상기 표 3에 나타낸 것과 같이, mdtA 유전자 과발현 벡터 (2)가 도입된 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 각각의 대조군과 비교하였을 때, 비올라세인 생산능은 대조군 대비 약 25% 증가하였고, 디옥시비올라세인 생산능은 대조군 대비 약 32 내지 33% 증가하였다. 상기 생산능 증가 효과가 실시예 4에서 제조한 균주들에 비하여 높은 것으로 보아, 균주에서 발현되는 mdtA 유전자의 카피 수 증가에 따라 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능이 더욱 증가된 것임을 알 수 있었다.
실시예 7. mdtA 유전자의 프로모터를 강한 프로모터로 치환한 균주의 제작
실시예 7-1. 프로모터 치환을 위한 DNA 단편 제작
mdtA 유전자의 프로모터를 보다 강한 프로모터로 치환하여 mdtA 발현을 강화하기 위해, mdtA 자가프로모터 좌에 trc 프로모터를 유전자 재조합효소(recombinase)를 이용하여 치환하기 위한 DNA 단편을 준비하였다.
구체적으로, 염색체 내부로의 trc 프로모터 삽입을 확인하기 위한 선별 마커로 클로람페니콜에 저항성을 부여하는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyltransferase) 유전자를 이용하였으며, 이를 위해 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 유전자를 포함하는 pUCprmfmloxC 벡터(대한민국 공개특허 제2009-0075549호)를 이용하였다. 5' 말단에 KpnⅠ 제한효소 부위를 삽입하고, 3' 말단에 EcoRV 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 25)를 합성하고, 이를 제한효소 KpnⅠ 및 EcoRⅤ로 처리하여 DNA 절편을 획득하였다. 이를 제한효소 KpnⅠ과 SmaⅠ 말단을 가지는 pUCprmfmloxC 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 형질전환된 대장균을 클로람페니콜이 25 ㎎/L로 포함된 LB 고체배지에 도말한 것을 제외하고는 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양하여 콜로니 형성을 확인하고, PCR로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, 플라스미드를 획득하여 pmlox-Cm-Ptrc로 명명하였다.
mdtA 유전자의 자가프로모터 좌에 삽입하기 위한 trc 프로모터 단편을 증폭하기 위하여 서열번호 26 및 27의 프라이머를 합성하였고, 이 프라이머 쌍을 이용하여 상기 제작한 pmlox-Cm-Ptrc 플라스미드를 주형으로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 5 분간 변성 후, 94℃ 30 초 변성, 55℃ 30 초 어닐링, 72℃ 2 분 중합을 30 회 반복한 후, 72℃에서 5 분간 중합반응을 수행하였다. 상기 PCR로 증폭된 DNA 단편을 Cm-Ptrc-mdtA로 명명하였으며 그 염기서열을 서열번호 28에 나타내었다.
실시예 7-2. mdtA 유전자의 프로모터를 강한 프로모터로 치환한 균주의 제작
상기 제조한 Cm-Ptrc-mdtA 및 유전자재조합효소를 이용하여 mdtA 유전자의 자가프로모터가 trc 프로모터로 치환된 균주를 제작하였다.
구체적으로, 람다 레드 재조합효소(lamda Red recombinase)를 이용한 1단계 유전자 불활성화 기법(one-step inactivation)을 응용하였다(Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97:6640-45). 람다 레드 재조합효소를 발현하는 벡터인 pKD46 플라스미드를 실시예 2에서 제작된 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산 균주 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE에 각각 형질 전환하고, 암피실린이 25 ㎎/L로 포함된 LB 배지에서의 생장여부를 통해 형질전환된 균주를 선별하였다. 선별한 균주에서 람다 레드 재조합효소의 발현을 유도하기 위하여 5 mM의 아라비노즈(arabinose)를 포함한 20 ㎖의 LB 배지에서 각 균주들을 배양하였다. 균체의 양이 5 x 108 cells/㎖로 자랐을 때 원심분리하여 균체를 회수하고 이를 차가운 10% 글리세롤(glycerol) 용액으로 3회 세척하였다.
상기 각 균주에 전기천공법(electroporation)을 이용하여 DNA 단편 Cm-Ptrc-mdtA를 도입하였다. 상기 DNA 단편은 5' 및 3' 말단에 각각 mdtA 유전자의 자가프로모터 좌 주변의 염기서열과 같은 서열을 80 bp 포함하는 단편조각이므로, 람다 레드 재조합효소에 의해 mdtA 자가프로모터 좌에서 유전자 재조합이 일어나 클로람페니콜 저항성 유전자와 trc 프로모터가 mdtA 자가프로모터 좌에 치환될 수 있다. 유전자 재조합이 일어난 균주는 클로람페니콜 내성을 가지게 되므로 클로람페니콜이 25 ㎎/L로 포함된 LB 배지에서의 생장여부를 통해 선별하였다. 선별한 균주에서 서열번호 29 및 30의 프라이머를 이용한 PCR을 통해서 mdtA 유전자의 자가프로모터 좌에 Cm-Ptrc-mdtA 단편이 삽입된 것을 확인하였다. PCR 조건은 94℃에서 5 분간 변성 후, 94℃ 30 초 변성, 55℃ 30 초 어닐링, 72℃ 2 분 중합을 30 회 반복한 후, 72℃에서 5 분간 중합반응을 수행하였다.
다음으로, pKD46 벡터는 온도에 민감한 복제기점(replication origin)을 가지고 있기 때문에, 상기 각 균주를 40℃ 이상에서 배양하여 균체 내에서 pKD46 벡터를 제거하였고, 이는 암피실린이 25 ㎎/L로 포함된 LB 배지에서 선별한 균주가 자라지 않는 것을 통해서 확인하였다. 이후, Cre 재조합효소(Cre-recombinase)를 이용하여 클로람페니콜에 대한 저항성을 나타내는 유전자를 제거하기 위하여 pJW168 플라스미드(Beatriz Palmeros et al., Gene, 247, 255-264, 2000)를 상기 각 균주에 도입하였다. 플라스미드 도입을 확인하고, Cre 재조합효소를 발현시키기 위하여 25 ㎎/L의 암피실린 및 이소프로필 1-티오-β-D-갈락토피라노시드(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)가 포함된 LB 고체배지에 각 균주를 도말하여 선별하였다. 선별된 균주에서 Cre 재조합효소에 의해 mloxP 위치에서 유전자 재조합이 일어나 클로람페니콜에 대한 저항성 유전자가 제거되었음을 서열번호 31 및 32의 프라이머를 이용한 PCR을 통해서 확인하였다.
상기 과정을 통하여 최종적으로 확인된 균주는 mdtA 유전자의 자가프로모터가 trc 프로모터로 치환된 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산 균주로, 각각 W3110/Ptrc-mdtA/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 W3110/Ptrc-mdtA/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE로 명명하였다.
실험예 4. mdtA 유전자의 프로모터를 강한 프로모터로 치환한 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능 평가
상기 실시예 7에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 실시예 7에서 제조한 균주들을 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하여 그 결과를 표 4에 나타내었다. 대조군으로는, 상기 실시예 2에서 제작한 비올라세인 생합성 유전자 클러스터가 과발현된 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE 균주를 사용하였다.
균주명 OD(660 ㎚ 흡광) 비올라세인(배양액 리터당 ㎎) 디옥시비올라세인(배양액 리터당 ㎎)
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 32.4 553.1 81.0
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE 35.6 0.0 657.0
W3110/Ptrc-mdtA/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 32.5 647.2 95.6
W3110/Ptrc-mdtA/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE 33.7 0.0 781.8
상기 표 4에 나타낸 것과 같이, mdtA 유전자의 프로모터가 강한 프로모터로 치환된 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 각각의 대조군과 비교하였을 때, 비올라세인 생산능은 대조군 대비 약 17% 증가하였고, 디옥시비올라세인 생산능은 대조군 대비 약 18 내지 19% 증가하였다.
따라서, 염색체 상의 mdtA가 과발현된 형질전환체 혹은 mdtA 자가프로모터가 trc 프로모터로 치환되어 mdtABCD 오페론의 발현이 강화된 형질전환체를 이용하여 비올라세인 또는 디옥시비올라세인을 생산할 경우, 생산능이 유의적으로 증가하는 것을 알 수 있다.

Claims (11)

  1. 다중약물 수송체 A(Multidrug efflux system subunit A: MdtA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하고, 비변형 균주에 비하여 트립토판 대사체의 생산능이 증가된, 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 트립토판 대사체는 인돌-3-아세트산(Indole-3-acetic acid), 인돌-3-피루브산(Indole-3-pyruvic acid: IPA), 인돌-3-피루브산 이민(Indole-3-pyruvic acid imine: IPA 이민), 인돌-3-카르발데히드(Indole-3-carbaldehyde), 인돌-3-카르복시산(Indol-3-carboxylic acid), 인돌-3-락트산(Indole-3-lactic acid), 5-히드록시트립토판(5-hydroxytryptophan), 6-히드록시트립토판(6-hydroxytryptophan), N-카르보벤즈옥시(Cbz)-데히드로트립토판(N-carbobenzoxy(Cbz)-dehydrotryptophan), 옥시비올라세인(oxyviolacein), 디옥시비올라세인(deoxyviolacein), 슈도비올라세인(pseudoviolacein), 슈도디옥시비올라세인(pseudodeoxyviolacein), 프로비올라세인(proviolacein), 프로디옥시비올라세인(prodeoxyviolacein), 프로토비올라세인산(protoviolaceinic acid), 프로토디옥시비올라세인산(protodeoxyviolaceinic acid), 크로모피롤산(chromopyrrolic acid: CPA), 아르시리아루빈 A(arcyriarubin A), 크로모아제피논 A(chromoazepinone A), 크로모아제피논 B(chromoazepinone B), 크로모아제피논 C(chromoazepinone C), 인디고(indigo), 크로모비리단스(chromoviridans), 디옥시크로모비리단스(deoxychromoviridans), 및 옥시크로모비리단스(oxychromoviridans)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자를 포함하는, 미생물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자는 크로모박테리움(Chromobacterium) 속 유래인, 미생물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자는 vioABCDE, 또는 vioABCE 유전자인, 미생물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 다중약물 수송체 A는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 미생물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자는, 서열번호 3 내지 7의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 것인, 미생물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 다중약물 수송체 A의 활성을 증가시키는 유전적 변형은,
    1) 상기 다중약물 수송체 A를 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가,
    2) 상기 다중약물 수송체 A를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 강한 활성을 갖는 발현 조절 서열로 교체하는 방법,
    3) 상기 다중약물 수송체 A의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법,
    4) 상기 다중약물 수송체 A의 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법,
    5) 상기 다중약물 수송체 A의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는
    6) 상기 방법들의 조합을 포함하는, 미생물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 에세리키아(Escherichia) 속에 속하는 것인 미생물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것인 미생물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 미생물을 배양하는 단계; 및
    배지 또는 상기 미생물로부터 목적산물을 회수하는 단계를 포함하고,
    상기 목적산물은 트립토판 대사체인, 목적산물을 제조하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116515918A (zh) * 2023-03-23 2023-08-01 苏州华赛生物工程技术有限公司 MdtL的色氨酸转运应用及生产方法和菌株

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011527183A (ja) * 2008-07-11 2011-10-27 ツィンファ ユニバーシティ デオキシビオラセインを産生する組み換え細菌及びその使用
WO2013096475A1 (en) * 2011-12-19 2013-06-27 Joule Unlimited Technologies, Inc. Extracellular transport of biosynthetic hydrocarbons and other molecules
CN105543155A (zh) * 2016-01-19 2016-05-04 江南大学 一种提高重组大肠杆菌产l-丙氨酰-l-谷氨酰胺能力的方法
KR20190005707A (ko) * 2017-07-07 2019-01-16 울산과학기술원 디옥시바이오라세인 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 그를 이용한 디옥시바이오라세인을 생산하는 방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101223444B (zh) * 2005-04-20 2013-04-24 嘉吉有限公司 在体内分泌莫纳甜的方法
KR101602772B1 (ko) 2014-03-05 2016-03-14 대한민국 비올라세인을 생산하는 마실리아 속 신규 미생물 ｅｐ１５２２４

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011527183A (ja) * 2008-07-11 2011-10-27 ツィンファ ユニバーシティ デオキシビオラセインを産生する組み換え細菌及びその使用
WO2013096475A1 (en) * 2011-12-19 2013-06-27 Joule Unlimited Technologies, Inc. Extracellular transport of biosynthetic hydrocarbons and other molecules
CN105543155A (zh) * 2016-01-19 2016-05-04 江南大学 一种提高重组大肠杆菌产l-丙氨酰-l-谷氨酰胺能力的方法
KR20190005707A (ko) * 2017-07-07 2019-01-16 울산과학기술원 디옥시바이오라세인 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 그를 이용한 디옥시바이오라세인을 생산하는 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Protein GenPept; ANONYMOUS: "MULTISPECIES: multidrug efflux RND transporter subunit MdtA [Enterobaceae]", XP055824462, retrieved from NCBI *
HIRAKAWA HIDETADA ET AL: "Indole induces the expression of multidrug exporter genes in Escherichia coli", MOLECULAR MICROBIOLOGY, WILEY-BLACKWELL PUBLISHING LTD, GB, vol. 55, no. 4, 1 February 2005 (2005-02-01), GB, pages 1113 - 1126, XP002426859, ISSN: 0950-382X, DOI: 10.1111/j.1365-2958.2004.04449.x *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116515918A (zh) * 2023-03-23 2023-08-01 苏州华赛生物工程技术有限公司 MdtL的色氨酸转运应用及生产方法和菌株
CN116515918B (zh) * 2023-03-23 2024-03-19 苏州华赛生物工程技术有限公司 MdtL的色氨酸转运应用及生产方法和菌株

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