CN105543155A - 一种提高重组大肠杆菌产l-丙氨酰-l-谷氨酰胺能力的方法 - Google Patents

一种提高重组大肠杆菌产l-丙氨酰-l-谷氨酰胺能力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高含有重组DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统活性的方法，该重组大肠杆菌携带的重组质粒具有能够催化L-谷氨酰胺与L-丙氨酸甲酯盐酸盐生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的氨基酸酯酰基转移酶编码基因(SAET)以及能够将L-丙氨酰-L-谷氨酰胺从胞内转运至胞外的多药外排转运蛋白编码基因(ydeE)，两者共表达可以有效地改善菌种的稳定性，提高菌种的产量与转化率。其中的重组质粒是通过将SAET以及ydeE重组到同一质粒上，或将分别含有两个基因的不同抗性的两种重组质粒共转化得到的。该重组菌的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺产量提高到了原来的3.33倍。

Description

一种提高重组大肠杆菌产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺能力的方法
技术领域
一种提高重组大肠杆菌产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺能力的方法，属于微生物基因工程领域。
背景技术
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine)是一种由L-丙氨酸与L-谷氨酰胺两种氨基酸脱水缩合形成的一种二肽，简称丙谷二肽。L-谷氨酰胺作为一种条件必需氨基酸在医药行业中应用极其广泛。L-谷氨酰胺可作为糖异生和尿素合成的原料，神经递质的前体物质，同时还是体内生化代谢途径的重要中间体。由于具有不同于L-谷氨酰胺的理化性质，丙谷二肽克服了L-谷氨酰胺的溶解度低、热不稳定性等缺点，因此常常被用作L-谷氨酰胺的替代品以注射液的形式而应用于临床。
目前主要通过化学合成法来生产丙谷二肽，化学合成法通常需要添加与去除有毒的保护基这一过程，该方法通常存在合成过程复杂、生产成本高、易生成副产物、目的产物提纯困难、合成条件苛刻、所用试剂有害等缺点，所以化学合成法不能大规模应用于商业领域。针对上述现状，本实验室率先在国内开展了有关微生物酶法产丙谷二肽的研究。来源于S.siyangensis的α-氨基酸酯酰基转移酶(α-aminoacidesteracyltrasferase,AET)能以丙氨酸甲酯盐酸盐和谷氨酰胺为底物催化生成丙谷二肽。实验室前期已经构建了含α-氨基酸酯酰基转移酶编码基因SAET的表达载体。
尽管我们研究室目前具有丙谷二肽的生产菌种，并且已经可以实现丙谷二肽的微生物酶法制备，但我们仍面临着丙谷二肽生产菌种不稳定、产量低、底物转化率低等问题。有研究报道，二肽是一些环状抗生素的类似物，二肽在胞内的过量积累会影响细胞自身的生长代谢，从而使菌种变得不稳定。除此之外，对于二肽生产菌种而言，二肽自身在胞内的积累也不利于酶催化反应的正常进行。KazuhikoTabata等人研究了E.coli自身基因组中的多药外排转运蛋白家族，该蛋白家族位于细胞膜上，可以专一有效的将一些寡肽从胞内转运至胞外。经过34种蛋白的筛选试验，有四种转运蛋白是具有转运丙谷二肽能力的，而ydeE又是这四种中转运效果最为理想的。
针对我们研究室面临的问题并参考相关报道，可以通过ydeE基因与SAET基因的共表达来改善丙谷二肽生产菌种的稳定性，并进一步提高菌种的产量与底物转化率。
发明内容
本研究室目前已经具有了可以生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的重组大肠杆菌以及若干相关的大肠杆菌基因敲除菌，但是这些生产菌种仍面临一些缺陷。本发明要解决的问题主要是通过多药外排转运蛋白编码基因ydeE与氨基酸酯酰基转移酶编码基因SAET在大肠杆菌中共表达，从而提高L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生产菌种的生产能力，底物利用能力与自身稳定性。
本发明通过将ydeE与SAET共表达，多药外排转运蛋白可以将氨基酸酯酰基转移酶编码催化产生L-丙氨酰-L-谷氨酰胺专一有效的从胞内转运至胞外，从而可以显著提高底物转化率与产量，工业应用前景广阔。
本发明所述的重组大肠杆菌由如下方法构建：将ydeE以及SAET重组到一个载体上，或者，将含有ydeE的重组质粒以及含有SAET的重组质粒共同转化至微生物细胞中，实现两种基因的共表达。
本发明所述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生产方法主要通过以下两个阶段实现：(1)将重组大肠杆菌接种于特定的发酵培养基上，经特定条件下的培养以期获得大量菌体；(2)将上述所获得的菌体当做粗酶源，添加入特定条件下的底物体系中进行酶催化反应从而获得L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
本发明中的两种基因均含有独立的启动子。SAET含有磷酸盐调控的启动子phoC，从已有的重组载体上酶切获得。ydeE含有其自身的启动子，通过PCR扩增获得。
为了实现两种基因的共表达，有两种策略：一是将ydeE和SAET整合到同一个载体上，使用各自的高效启动子表达；另一个是把含有ydeE的重组质粒和含有SAET的重组质粒共转化同一宿主，使用双质粒表达系统在宿主细胞中表达。
作为表达载体，要能够在宿主细胞中独立复制，例如有pAMP、pUC19、pET-28a、pET-21a、pKYP10、pBR322等。
作为双质粒表达的载体，两种要能够稳定的共存于同一宿主中，且各自的复制互不影响，可以是含有相同复制子的质粒，也可是含有不同复制子的质粒。
作为双质粒表达系统的载体，为了稳定共存，两种载体要含有不同的抗生素筛选标记，例如pET-28a与pAMP，pET-28a与pET-21a等。
作为宿主细胞，要能够表达目的基因，除了使用大肠杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌、芽孢杆菌、酵母菌等菌株，也可以使用动物细胞作为宿主。
本发明可以应用于L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生产中，培养重组菌的培养基要含有微生物可以利用的碳源、氮源、无机盐等，可以是天然培养基，也可以是合成培养基。
作为微生物可以利用的碳源，可以是糖类诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖和可溶性淀粉，醇类包括乙醇、山梨醇和甘油，有机酸及其盐包括柠檬酸、琥珀酸、乙酸和丙酸，碳氢化合物包括石蜡及其混合物。
作为微生物可以利用的氮源，可以是氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐类或其他含氮化合物，还可以有酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、豆粕等有机氮源。
作为微生物可以利用的无机盐，有磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、氯化钙等。
重组菌的培养需要震荡或搅拌以维持菌体生长所需的氧气量。培养温度在20-37℃，培养时间12-72小时。
本发明的方法首先是通过重组大肠杆菌发酵获得大量菌体，然后以获得的菌体作为粗酶源，一边进行酶催化反应生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，一边将L-丙氨酰-L-谷氨酰胺从胞内转运至胞外，可显著提高酶催化效率、底物利用率、产量，具有重要的工业应用价值。
附图说明
图1是表达载体pET28a-NydeE的构建。
图2是含双质粒表达载体菌株的获得。
图3是单一表达载体pET21a-NydeE-phoC-SAET的构建。
图4是含单一表达载体菌株的获得。
具体实施方式
一般性说明：具体实施方式中所用到的酶全部从TaKaRa公司购买，sanprep柱式质粒DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均购自上海生工，每个操作完全按照试剂盒的说明。细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京天根，每个操作完全按照试剂盒的说明。
种子培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl10g/L，pH7.0-7.2。
发酵培养基：葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，胰蛋白胨10g/L，(NH4)2SO45g/L，KH2PO43g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L。
Kan抗性平板：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl，1.5％琼脂粉，硫酸卡那霉素50μg/mL。
Amp抗性平板：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl，1.5％琼脂粉，，氨苄青霉素钠50μg/mL。
Amp、Kan双抗平板：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl，1.5％琼脂粉，硫酸卡那霉素50μg/mL，氨苄青霉素钠50μg/mL。
5×KCM(大肠杆菌转化缓冲液)：0.5MKCl，0.15MCaCl2，0.25MMgCl2。
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的催化生产：取一定量发酵液，进行离心倒掉上清液保留菌体，加入含有一定浓度与特定pH条件下的底物体系溶液，混匀后置恒温水浴锅中反应一定时间，结束后立即在较大转速下离心反应体系终止反应，将上清小心取出妥善保存以待检测。
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的产量测定：将上述反应液稀释一定倍数后，进行OPA在线衍生用高效液相色谱法定量测定。
实施例1：多药外排转运蛋白编码基因的获得
多药外排转运蛋白(ydeE)可以专一有效的将L-丙氨酰-L-谷氨酰胺从胞内转运至胞外，根据发表在NCBI中的ydeE基因序列(GeneID:946083)设计一对引物P1(TTTGAATTCTTTAGCCCCCATACGACCAC)，P2(TTTGGATCCTCAACAAAGCGCGGGCTGCC)，以大肠杆菌基因组为模板进行PCR扩增得到目的基因ydeE及其自身启动子。将目的基因ydeE及其自身启动子命名为NydeE。P1引物包含EcorI酶切位点，P2引物包含BamHI酶切位点，便于后续的酶切连接构建载体。大肠杆菌基因组通过购自北京天根的细菌基因组DNA提取试剂盒获得。
实施例2：含有NydeE的重组质粒pET28a-NydeE的获得
将实施例1获得的NydeE目的片段与pET28a质粒同时进行EcorI与BamHI双酶切。双酶切体系如下：
双酶切3h之后，电泳，切胶回收目的片段，16℃下T4连接酶连接12-16h。连接体系如下：
16℃过夜连接后，将3μL的连接液转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中。转化过程为：将3μL连接液加入至50μL的JM109感受态细胞中，然后再加入10μL的5×KCM缓冲液，混匀后，于冰上预冷30min后，42℃热激90s，在于冰上静置5min后，加入500μL的LB培养基，37℃，220rpm复苏60min后。复苏结束后，取适量复苏液涂布于Kan抗性平板上，于37℃培养12h后，挑取单菌，过夜培养，提取质粒进行单双酶切验证。将单双酶切验证正确的质粒送上海生工测序进一步验证。从而得到构建好的pET28a-NydeE重组质粒。
实施例3：含有SAET的重组质粒pET21a-phoC-SAET的获得
取实验室保存的含有目的质粒的菌株JM109/pET21a-phoC-SAET活化，于37℃，220rpm培养12-16小时。取培养后的菌液提取质粒，所有操作均严格按照说明书进行。
实施例4：含有两种基因的单一表达载体pET21a-NydeE-phoC-SAET及重组菌的获得
将实施例1获得的NydeE目的片段与实施例3获得的pET21a-phoC-SAET质粒同时进行EcorI与BamHI双酶切。双酶切体系等同于实施例2，只需将pET28a质粒替换为pET21a-phoC-SAET质粒。双酶切3h之后，电泳，切胶回收目的片段，16℃下T4连接酶连接12-16小时。连接体系等同于实施例2，只需将pET28a质粒替换为pET21a-phoC-SAET质粒。
16℃过夜连接后，将3μL的连接液转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中。转化过程等同于实施例2。涂布至Kan抗性平板上，于37℃培养12h后，挑取单菌，过夜培养，提取质粒进行单双酶切验证。复苏结束后，取适量复苏液涂布于Amp抗性平板上，于37℃培养12h后，挑取单菌，过夜培养，提取质粒进行单双酶切验证。将单双酶切验证正确的质粒送上海生工测序进一步验证。从而得到构建好的pET21a-NydeE-phoC-SAET重组质粒。
将测序正确的pET21a-NydeE-phoC-SAET重组质粒转化入大肠杆菌JM109中，从而得到重组大肠杆菌JM109/pET21a-NydeE-phoC-SAET。
实施例5：含有双基因的双表达载体重组菌JM109/pET21a-phoC-SAET+pET28a-NydeE的获得
将实施例3获得的pET21a-phoC-SAET与实施例2获得的pET28a-NydeE等量共转化入大肠杆菌JM109，于Amp、Kan双抗性平板中筛选出转化后的单菌落培养、提取质粒进行酶切验证，酶切验证正确的单菌即为含有两种基因的双表达载体重组菌大肠杆菌JM109/pET21a-phoC-SAET+pET28a-NydeE。
实施例6：重组菌株的发酵以及酶催化生产实验
将实验室保藏得重组大肠杆菌JM109/pET21a-phoC-SAET(Amp抗性)与实施例5获得的重组大肠杆菌JM109/pET21a-phoC-SAET+pET28a-NydeE(Amp、Kan双抗性)以及实施例4获得的重组大肠杆菌JM109/pET21a-NydeE-phoC-SAET(Amp抗性)分别接种于对应各自抗性的LB液体培养基中。在30℃、220rpm条件下培养8h后，按4％接种量接种于25mL发酵培养基中，在旋转式摇床中25℃、220rpm培养36h。发酵结束后，取一定量体积的发酵液离心去上清保留菌体以获得粗酶源进行酶催化生产。L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的测定方法详见实施方式一般性说明。测定结果显示，重组大肠杆菌JM109/pET21a-phoC-SAET的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺产量达到1.95g/L，底物摩尔转化率达到8.98％。重组大肠杆菌JM109/pET21a-phoC-SAET+pET28a-NydeE的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺产量达到1.89g/L，底物摩尔转化率达到8.70％，与对照菌JM109/pET21a-phoC-SAET相比，产量与转化率没有相对改观。而重组大肠杆菌JM109/pET21a-NydeE-phoC-SAET的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺产量达到6.50g/L，底物摩尔转化率达到29.93％，与对照菌JM109/pET21a-phoC-SAET相比该重组菌的产量提高到了原来的3.33倍，转化率也相应提高到了原来的3.33倍。结果说明，NydeE的过表达确实可以大幅度提高L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生产菌的产量与底物转化率，而双基因单表达载体的共表达方式相比于双基因双表达载体的共表达方式优势更为明显。

Claims (9)

1.一种提高含有重组DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统活性的方法，其中含有重组DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统是通过将氨基酸酯酰基转移酶的编码基因SAET与多药外排转运蛋白的编码基因ydeE重组到载体上并转入微生物细胞共表达，得到具有显著提高L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物活性的重组微生物。
2.权利要求1所述的重组微生物中的两个基因共表达策略，可以是重组于同一个载体上的两个基因的共表达，也可以是分别重组于两个不同抗性载体的两个基因的共表达。
3.权利要求1所述的重组微生物中，编码多药外排转运蛋白的基因是来自大肠杆菌的ydeE基因。
4.权利要求1所述的增强L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统活性的方法，其特征在于通过导入ydeE以及SAET并增加重组微生物中两个基因的拷贝数来实现的。
5.权利要求4所述的增加ydeE以及SAET在重组微生物中的拷贝数的方法，其特征是将两个基因连接重组到一个或两个多拷贝质粒上来实现。
6.权利要求2、5所述的载体、多拷贝质粒包括但不局限于pAMP、pET-28a、pUC19、pET-21a等。
7.L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的生产方法，其特征是将权利要求1、2、3、4、5所述的重组微生物在培养基上培养，将得到的培养物、菌体或者它们的处理物作为酶源，在一定pH值的水溶液中，作用于游离的L-谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯盐酸盐，生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，再从该水性介质中提取生成的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
8.权利要求1、2、3、4、5所述的重组微生物包括但不局限于大肠杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌、酵母菌等。
9.权利要求8所述的大肠杆菌属包括但不局限于正常大肠杆菌与其基因敲除菌。
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