CN104561072A - 一种利用重组大肠杆菌发酵生产l-脯氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用重组大肠杆菌发酵生产L-脯氨酸的方法，该重组大肠杆菌携带具有点突变的γ-谷氨酸激酶基因以及色氨酸串联启动子的重组质粒。其中重组质粒是通过将克隆得到的γ-谷氨酸激酶基因，以及实验室的色氨酸串联启动子连接到同一质粒上并进行全质粒PCR定点突变得到的。本发明还公开了所述大肠杆菌在L-脯氨酸生产中的应用。

Description

一种利用重组大肠杆菌发酵生产L-脯氨酸的方法

技术领域

一种利用重组大肠杆菌发酵生产L-脯氨酸的方法，属于微生物基因工程领域。

背景技术

在众多合成人体蛋白质的氨基酸中，L-脯氨酸是一种非极性氨基酸，其重要性体现在医药、农业、化工、食品等许多领域。在医药方面，L-脯氨酸是一些特殊药物的合成原料；农业中，L-脯氨酸的可以增强庄稼的抗逆性能力；在化工领域，L-脯氨酸和它的一些衍生物也是重要的手性分子，在一些反应中可以作为催化剂使用；L-脯氨酸在食品营养等方面也有重要作用。

最早的L-脯氨酸主要依靠水解蛋白质获得，由于繁杂的生产和纯化步骤，不仅最终的L-脯氨酸产量低、原料利用率很低，而且在生产过程中加入了大量的有毒化学试剂，污染环境，反应后的废水废渣也很难处理。对微生物资源的深入开发与利用，以及育种技术在现代技术领域中的不断提高，微生物发酵法以其成本低，污染少，杂质少，纯度高等优势在工业生产中日益占主导地位。早期，国内外L-脯氨酸生产菌株的选育主要是通过化学诱变、物理诱变等传统方式，从大量诱变产物中筛选获得具有营养缺陷型、结构类似物抗性等突变株。虽然利用传统的诱变方法也得到很多高产的L-脯氨酸生产菌株，但这些传统的方法有很多局限性。伴随着基因工程和分子克隆技术的迅速发展，人们不断探索新的技术手段来控制L-脯氨酸的代谢途径，如代谢工程，育种技术等，其目的都是为了提高L-脯氨酸的产量。

发明内容

本发明通过将经定点突变后的谷氨酸激酶基因与高效启动子连接后，在大肠杆菌中过量表达该谷氨酸激酶，并能在脯氨酸发酵培养基中以葡萄糖为碳源，来直接获得大量的L-脯氨酸，工业应用前景广阔。

本发明所述的方法主要是通过重组菌的发酵可以大量获得L-脯氨酸，其特征在于，所述的重组大肠杆菌由如下方法构建：将色氨酸串联启动子和γ-谷氨酸激酶基因重组到载体上并进行全质粒PCR定点突变，得到含有受脯氨酸反馈抑制作用显著降低的γ-谷氨酸激酶基因的重组质粒，将该重组质粒转化至微生物细胞中。培养该重组细胞，可积累产生大量的脯氨酸。

本发明中的γ-谷氨酸激酶基因(GenBank登录号：x00786.1)通过PCR克隆得到，该基因来源于Escherichia coli BL21(DE3)。色氨酸串联启动子从实验室已有的载体上酶切获得。

为了使γ-谷氨酸激酶基因在宿主细胞中表达，将克隆得到的目的基因与色氨酸串联启动子共同插入表达载体中，将该载体转入合适的宿主细胞中实现目的基因的表达。

作为表达载体，要能够在宿主细胞中独立复制，例如有pET-28a、pKYP10、pUC19、pAMP、pBR322 等。

作为宿主细胞，要能够表达目的基因，除了使用大肠杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌、芽孢杆菌、酵母菌等菌株，也可以使用动物细胞作为宿主。

本发明可以应用于L-脯氨酸的生产中，培养重组菌的培养基要含有微生物可以利用的碳源、氮源、无机盐等，可以是天然培养基，也可以是合成培养基。

作为微生物可以利用的碳源，有葡萄糖、淀粉、蔗糖、甘油等。

作为微生物可以利用的氮源，可以是氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐类或其他含氮化合物，还可以有酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、豆粕等有机氮源。

作为微生物可以利用的无机盐，有磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、氯化钙等。

重组菌的培养需要震荡或搅拌以维持菌体生长所需的氧气量。培养温度在20-37℃，培养时间12-72小时。

本发明的方法是通过重组大肠杆菌发酵生产L-脯氨酸，具有重要的工业应用价值。

附图说明

附图是重组载体pET28a-Ptrp2-proBA2构建图。

具体实施方式

一般性说明：具体实施方式中所用到的酶全部从TaKaRa公司购买，sanprep柱式质粒DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒由上海生工购买，每个操作完全按照试剂盒的说明。

种子培养基(LB)：胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0-7.2。

Kan抗性平板：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl，硫酸卡那霉素50μg/mL。

5×KCM(大肠杆菌转化缓冲液):0.5M KCl，0.15M CaCl₂，0.25M MgCl₂。

TE缓冲液(500mL，10mM Tris-HCl(pH 8.0),1mM EDTA(pH 8.0))：5mL 1M pH 8.0的Tris-HCl缓冲液(称取121.1g Tris置于1L烧杯中，加入适量去离子水，搅拌至完全溶解，再加入浓盐酸(约42mL)调节pH至8.0，容量瓶定容至1L，室温保存。)，1mL 0.5M pH＝8.0的EDTA溶液(于1L烧杯中准确称取146.1g EDTA，加入适量去离子水，搅拌溶解，然后加入NaOH(约20克)调节pH值为8(pH＝8的EDTA可完全溶解)，定容至1L，室温存放，加入去离子水混合均匀并定容500mL，室温存放。

裂解缓冲液(10mL)：9.34mL TE，600μL 10％SDS，60μL 20mg/mL的蛋白酶K，终浓度为1或5mg/mL的RNase。

重组菌生成的L-脯氨酸可通过以下方法测定：将发酵液离心后，取上清，适当稀释后取1mL于10mL试管中，加入1mL冰乙酸，摇匀后加入1mL酸性茚三酮(取冰乙酸60mL、2mol/L的磷酸溶液40mL， 加入2.5g茚三酮，70℃水浴加热溶解，用棕色试剂瓶保存冷却后的试剂。其中2mol/L磷酸溶液的配置为：称取9.22g 85％的H₃PO₄，加水至40mL。)摇匀后沸水浴1h，接着加入冰乙酸2mL，摇匀后冷水冷却，然后测定515nm波长处的吸光度值。

实施例1：谷氨酸激酶基因的获得

在脯氨酸的合成代谢中，谷氨酸激酶(proB)和谷氨酸脱氢酶(proA)总是相辅相成的，两者的表达与作用会相互影响，而且两者的基因也紧邻，因此本实施方式将二者作为一个整体来设计得到proBA基因片段，根据发表在NCBI中的proBA基因序列(GenBank登录号：x00786.1)设计一对引物P1(SEQ ID NO：3)、P2(SEQ ID NO：4)，PCR扩增得到目的基因proBA。

本实施方式中，PCR的模板为大肠杆菌基因组，提取方法：取1.5mL菌液(过夜培养)，12000rpm离心30s收集菌体；不影响细菌沉淀的情况下尽可能除去上清液；将菌体沉淀重悬于600μL裂解液(560μL TE缓冲液，40μL 10％SDS)，涡旋振荡混匀，37℃温育1h；加入198μL 5M NaCl，混匀，静置5min；12000rpm离心10min；取上清液于另一离心管中，加入等体积的苯酚颠倒混匀(避免剧烈振荡离心管，否则DNA容易断裂)，静置5min；12000rpm离心3min后，转移到另一个离心管(1mL的枪头剪短约2mm，可防止吸到界面杂质)，反复抽提至无白色蛋白；转移上清到一个新的离心管中，为了除去残留的苯酚加入等体积的氯仿，颠倒混匀，12000rpm离心3min；取一个新的离心管转移上清，加入2.5倍体积-20℃预冷的无水乙醇,轻轻混匀后可见DNA絮状沉淀，置于-20℃冰浴30min；12000rpm离心10min，弃去上清，用400μL 70％乙醇(室温)洗涤DNA沉淀2次；12000rpm离心2min，弃去上清，将DNA沉淀于室温晾干；溶解DNA使用50μL TE，-20℃保存；电泳鉴定。

实施例2：色氨酸串联启动子基因的获得

色氨酸串联启动子来源于大肠杆菌K12菌株的色氨酸操纵子，是一个适合工业生产应用的强启动子。由于两个色氨酸串联启动子串联起来可提高表达强度，因此实验室其他研究人员通过优化色氨酸串联启动子，然后全基因合成色氨酸串联启动子。

本实施方式中色氨酸串联启动子序列见SEQ ID NO:1。

实施例3：proBA表达质粒及重组菌的构建

先得到proBA基因，proBA基因需要通过PCR扩增得到，得到的proBA基因5’端序列带有HindⅢ(A^AGCTT)酶切位点，而3’端有XhoI(C^TCGAG)酶切位点，将proBA基因及质粒载体pET-28a分别用HindⅢ和XhoI消化处理，将双切酶后的proBA基因、pET-28a质粒载体用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后用T4DNA连接酶将proBA、pET-28a基因片段连接起来。16℃连接过夜后，将10μL的连接液转入大肠杆菌JM109。挑取转化后的单菌落培养提取质粒进行验证，然后进一步测序验证基因序列是否正确。从而得到了构建好的pET-28a-proBA重组质粒，同时获得重组大肠杆菌JM109/pET-28a-proBA。

由于色氨酸串联启动子基因序列5’端序列带有EcoRⅠ(G^AATTC)酶切位点，3’端有HindⅢ(A^AGCTT) 酶切位点，将色氨酸串联启动子、pET-28a-proBA用EcoRⅠ和HindⅢ两种限制性核酸内切酶双酶切，将双酶切后的色氨酸串联启动子、pET-28a-proBA质粒载体用琼脂糖凝胶试剂盒回收，然后用T4DNA连接酶将色氨酸串联启动子、pET-28a-proBA基因片段连接起来。16℃连接过夜后，将10μL的连接液体转入大肠杆菌JM109中。挑取转化后的单菌落培养提取质粒进行验证，从而得到了构建好的pET-28a-Ptrp2-proBA重组质粒，同时得到重组大肠杆菌JM109/pET-28a-Ptrp2-proBA。

实施例4：含有双突变目的基因proBA2基因的重组大肠杆菌的构建

使用设计好的突变引物P3(SEQ ID NO:5)、P4(SEQ ID NO:6)，以pET-28a-Ptrp2-proBA质粒为模板进行全质粒PCR定点突变；结束后用Dpn I消化产物除去模板；将10μL消化后的产物转入大肠杆菌JM109中。挑取单菌落培养提质粒测序，验证基因序列是否正确。从而得到了构建好的pET-28a-Ptrp2-proBA2重组质粒，同时获得重组大肠杆菌JM109/pET-28a-Ptrp2-proBA2。

本实施方式中proBA2基因序列见SEQ ID NO:2

实施例5：重组菌株的发酵实验

摇瓶培养：在Kan抗性平板上挑取重组大肠杆菌JM109/pET-28a-Ptrp2-proBA2单菌落，接种到LB液体培养基(含硫酸卡那霉素)中，37℃、220rpm过夜培养后，按6％接种量接入250mL摇瓶中的脯氨酸发酵培养基，在旋转式摇床中30℃、220rpm培养24h，然后取发酵液检测L-脯氨酸浓度。L-脯氨酸的测定方法详见实施例一般性说明。发酵结果显示，重组大肠杆菌JM109/pET-28a-Ptrp2-proBA2的L-脯氨酸产量达到4.44g/L。

Claims (8)

1.提高含有重组DNA的L-脯氨酸生物合成系统活性的方法，其中的含有重组DNA的L-脯氨酸生物合成系统是通过将编码γ-谷氨酸激酶的基因片段重组到载体上并转入微生物细胞，得到具有L-脯氨酸生物合成活性增强的重组微生物。

2.权利要求1所述的重组微生物中，编码γ-谷氨酸激酶的基因是来自大肠杆菌的proBA基因。

3.权利要求1所述的增强L-脯氨酸生物合成系统活性的方法，其特征在于通过导入受脯氨酸反馈抑制显著减少的γ-谷氨酸激酶基因，并增加重组微生物中的该γ-谷氨酸激酶基因的拷贝数来实现。

4.权利要求3所述的重组微生物中，受脯氨酸的反馈抑制显著减少的酶基因是来自大肠杆菌的proBA2基因。

5.权利要求3所述的增加γ-谷氨酸激酶基因在重组微生物中的拷贝数的方法，其特征是将γ-谷氨酸激酶基因连接到一个多拷贝质粒来实现。

6.权利要求3所述的多拷贝质粒包括但不局限于pET-28a、pKYP10等。

7.L-脯氨酸的生产方法，其特征是将权利要求1、2、3、4所述的重组微生物在培养基上培养，将得到的培养物、菌体或者它们的处理物作为酶源，在葡萄糖存在下，于水性介质中使葡萄糖转化为L-脯氨酸，再从该水性介质中提取生成的L-脯氨酸。

8.权利要求1、2、3、4、所述的重组微生物包括但不局限于大肠杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌、酵母菌等。