CN104928311A - 一种利用葡萄糖发酵产反式-4-羟脯氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用重组大肠杆菌在不添加外源L-脯氨酸的条件下，从葡萄糖发酵产反式-4-羟脯氨酸的方法，该重组大肠杆菌携带的重组质粒具有突变基因proBA2以及脯氨酸4-羟化酶基因(hyp)，其中proBA2的突变发生在谷氨酸激酶编码基因proB上，突变后的基因编码的谷氨酸激酶受L-脯氨酸的反馈抑制作用显著降低。proBA2与hyp共表达，可以直接利用葡萄糖发酵产反式-4-羟脯氨酸，不需要添加外源的L-脯氨酸。其中的重组质粒是将proBA2和hyp重组到同一个表达质粒上，或将分别含有两个基因的不同抗性的重组质粒共转化得到的。本发明还公开了所述大肠杆菌在羟脯氨酸生产中的应用。
Description
技术领域
一种利用重组大肠杆菌直接从葡萄糖发酵生产反式-4-羟脯氨酸的方法，属于微生物基因工程领域。
背景技术
反式-4-羟脯氨酸是一些化学合成药物的重要前体物，传统的生产方法主要是水解动物胶原蛋白获得，这种方法需要一套完整而复杂的纯化步骤，并且会产生大量的废弃物。随着生物技术的发展，目前多采用微生物发酵法来生产反式-4-羟脯氨酸，可以克服水解法的种种缺陷，提高生产效率、降低生产成本等等。
在微生物体内，脯氨酸羟化酶催化脯氨酸生成反式-4-羟脯氨酸，脯氨酸的合成则是以谷氨酸作为底物，经过γ-谷氨酸激酶、谷氨酸脱氢酶、Δˊ-二氢吡咯-5-羧酸还原酶这三个酶的依次催化生成脯氨酸。根据已有的对脯氨酸羟化酶的研究，对来源于指胞囊菌的脯氨酸羟化酶基因进行密码子优化后，其转化脯氨酸的能力相比于原始的基因有了很大提升，且适合在现有的宿主细胞中表达。而已有的关于脯氨酸的生物合成的研究中，大都采用定点突变对其合成途径中的限速酶γ-谷氨酸激酶进行研究，其中的一些突变可以得到脯氨酸高产菌株，尤其是含有两个氨基酸突变为点的双突变菌株，其脯氨酸产量较高，可以直接利用葡萄糖生成脯氨酸。
通过将脯氨酸羟化酶基因(hyp)和受脯氨酸反馈抑制作用降低的γ-谷氨酸激酶基因(proBA2)转入同一个宿主细胞，使两个基因共表达，在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中，实现从葡萄糖到脯氨酸再到反式-4-羟脯氨酸的连续转化，改变了传统的需要添加脯氨酸为底物以生产反式-4-羟脯氨酸的工业生产方法，工业应用前景广阔。
发明内容
本发明通过将proBA2与hyp共表达，在发酵培养基中以葡萄糖为碳源，在不额外添加脯氨酸的情况下通过生物发酵生产反式-4-羟脯氨酸，工业应用前景广阔。
本发明所述的方法主要是通过重组菌的发酵可以大量获得L-脯氨酸，并进一步转化得到反式-4-羟脯氨酸，其特征在于，所述的重组大肠杆菌由如下方法构建：将proBA2以及hyp重组到一个载体上，或者，将含有proBA2的重组质粒以及含有hyp的重组质粒共同转化至微生物细胞中，实现两种基因的共表达。培养该重组细胞，可积累产生羟脯氨酸。
本发明中的两种基因均含有独立的高效启动子-色氨酸串联启动子(Ptrp2)，从已有的重组载体上酶切获得。
为了实现两种基因的共表达，有两种策略：一是将proBA2和hyp整合到同一个载体上，使用各自的高效启动子表达；另一个是把含有proBA2的重组质粒和含有hyp的重组质粒共转化同一宿主，使用双质粒表达系统在宿主细胞中表达。
作为表达载体，要能够在宿主细胞中独立复制，例如有pET-28a、pKYP10、pUC19、pAMP、pBR322等。
作为双质粒表达的载体，两种要能够稳定的共存于同一宿主中，且各自的复制互不影响，可以是含有相同复制子的质粒，也可是含有不同复制子的质粒。
作为双质粒表达系统的载体，为了稳定共存，两种载体要含有不同的抗生素筛选标记，例如pET-28a与pUC19，pET-28a与pET-21a等。
作为宿主细胞，要能够表达目的基因，除了使用大肠杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌、芽孢杆菌、酵母菌等菌株，也可以使用动物细胞作为宿主。
本发明可以应用于反式-4-羟脯氨酸的生产中，培养重组菌的培养基要含有微生物可以利用的碳源、氮源、无机盐等，可以是天然培养基，也可以是合成培养基。
作为微生物可以利用的氮源，可以是氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐类或其他含氮化合物，还可以有酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨、玉米浆、豆粕等有机氮源。
作为微生物可以利用的无机盐，有磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、氯化钙等。
重组菌的培养需要震荡或搅拌以维持菌体生长所需的氧气量。培养温度在20-37℃，培养时间12-72小时。
本发明的方法是通过重组大肠杆菌发酵从葡萄糖直接生产反式-4-羟脯氨酸而不需要额外添加脯氨酸，具有重要的工业应用价值。
附图说明
图1是单一表达载体pET28a-PH的构建。
图2是含单一表达载体菌株的获得。
图3是含双质粒表达载体菌株的获得。
具体实施方式
一般性说明：具体实施方式中所用到的酶全部从TaKaRa公司购买，sanprep柱式质粒DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均购自上海生工，每个操作完全按照试剂盒的说明。
种子培养基(LB)：胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0-7.2。
发酵培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨8g/L，磷酸氢二钾3g/L，氯化钠2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸亚铁1mM，氯化钙0.015g/L。
Kan、Amp双抗平板：1％胰蛋白胨，0.5％酵母抽提物，1％NaCl，硫酸卡那霉素50μg/mL，氨苄青霉素钠50μg/mL。
5×KCM(大肠杆菌转化缓冲液)：0.5M KCl，0.15M CaCl2，0.25M MgCl2。
重组菌生成的反式-4-羟脯氨酸的测定方法采用氯胺T法：将发酵液离心后，取上清，稀释后取2.5mL于10mL试管中，加入1mL氯胺T(氯胺T溶液：将1.41g氯胺T溶于10mL水中，依次加入10mL正丙醇和80mL缓冲溶液，其中缓冲溶液配方为：将50g柠檬酸，26.3g NaOH和146.1g结晶乙酸钠溶于水至1L，然后与200mL水以及300mL正丙醇混合)，摇匀后在室温中放置20min；然后加入1mL显色剂(显色剂：称取10g对二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸溶解，缓慢加入65mL异丙醇)，摇匀后迅速将试管置于60℃水浴锅中，20min后取出冷水冷却，用分光光度计在560nm波长处测定吸光度值。
实施例1：含有proBA2的重组质粒(pET28a-Ptrp2-proBA2)的获得
取实验室保存的含有目的质粒的菌株活化，于37℃，220rpm培养12-16小时。取培养后的菌液提取质粒，所有操作均严格按照说明书进行。
实施例2：含有hyp的重组质粒(pUC19-Ptrp2-hyp)的获得
取实验室保存的含有目的质粒的菌株活化，于37℃，220rpm培养12-16小时。取培养后的菌液提取质粒，所有操作均严格按照说明书进行。
实施例3：含有两种基因的单一表达载体pET28a-PH及重组菌的获得
用EcoRI、BamHI两种酶分别双酶切处理pET28a-Ptrp2-proBA2、pUC19-Ptrp2-hyp，酶切产物胶回收得到线性的pET28a-Ptrp2-proBA2以及Ptrp2-hyp片段，用T4DNA连接酶将两者置于16℃连接过夜后，将10μL的连接液转入大肠杆菌JM109，挑取转化后的单菌落培养提取质粒进行酶切验证，验证正确的重组质粒即为pET28a-PH。
将pET28a-PH重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-PH。
实施例4：含有两种基因的双表达载体重组菌的获得
将等量的两种质粒pET28a-Ptrp2-proBA2、pUC19-Ptrp2-hyp共转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取转化后的单菌落培养、提取质粒进行酶切验证，经酶切验证正确的单菌即为含有两种基因的双表达载体重组菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-Ptrp2-proBA2、pUC19-Ptrp2-hyp。
实施例5：重组菌株的发酵实验
摇瓶培养重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-PH：在Kan抗性平板上挑取重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-PH单菌落，接种到LB液体培养基(含硫酸卡那霉素)中，37℃、220rpm过夜培养后，按6％接种量接入250mL摇瓶中的发酵培养基，在旋转式摇床中30℃、220rpm培养24h，然后取发酵液检测反式-4-羟脯氨酸浓度。反式-4-羟脯氨酸的测定方法详见实施例一般性说明。发酵结果显示，重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-PH的反式-4-羟脯氨酸产量为30mg/L。
摇瓶培养重组菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-Ptrp2-proBA2、pUC19-Ptrp2-hyp：在Kan、Amp双抗平板上挑取重组菌大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-Ptrp2-proBA2、pUC19-Ptrp2-hyp单菌落，接种到LB液体培养基(含硫酸卡那霉素、氨苄青霉素钠)中，37℃、220rpm过夜培养后，按6％接种量接入250mL摇瓶中的发酵培养基，在旋转式摇床中30℃、220rpm培养24h，然后取发酵液检测反式-4-羟脯氨酸浓度。反式-4-羟脯氨酸的测定方法详见实施例一般性说明。发酵结果显示，重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-Ptrp2-proBA2、pUC19-Ptrp2-hyp的反式-4-羟脯氨酸产量为109mg/L。
Claims (7)
1.一种提高含有重组DNA的反式-4-羟脯氨酸生物合成系统活性的方法，其中的含有重组DNA的反式-4-羟脯氨酸生物合成系统是通过将proBA2、hyp重组到载体上并转入微生物细胞共表达，得到具有反式-4-羟脯氨酸生物合成活性增强的重组微生物。
2.权利要求1所述的重组微生物中的两个基因共表达策略，可以是重组于同一个载体上的两个基因的共表达，也可以是分别重组于两个不同抗性载体的两个基因的共表达。
3.权利要求1所述的增强反式-4-羟脯氨酸生物合成系统活性的方法，其特征在于通过导入proBA2以及hyp并增加重组微生物中的两个基因的拷贝数来实现。
4.权利要求3所述的增加proBA2以及hyp在重组微生物中的拷贝数的方法，其特征是将两个基因连重组到一个或两个多拷贝质粒来实现。
5.权利要求2、4所述的载体、多拷贝质粒包括但不局限于pET-28a、pUC19、pKYP10等。
6.反式-4-羟脯氨酸的生产方法，其特征是将权利要求1、2、3、4所述的重组微生物在培养基上培养，将得到的培养物、菌体或者它们的处理物作为酶源，在葡萄糖存在下，于水性介质中使葡萄糖转化为L-脯氨酸，再从L-脯氨酸转化为反式-4-羟脯氨酸，最后从该水性介质中提取生成的反式-4-羟脯氨酸。
7.权利要求1、2、3、4所述的重组微生物包括但不局限于大肠杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌、酵母菌等。
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