CN105543303A - 一种通过敲除其他代谢途径进而提高反式-4-羟脯氨酸产量的生物合成方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种有效提高羟脯氨酸产量的生物合成方法。其中，生物合成法生产羟基-L-脯氨酸的系统是指，在生物细胞内生物体在α-酮戊二酸及亚铁离子存在的情况下利用脯氨酸羟化酶，将游离的L-脯氨酸转化为反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法。提高羟脯氨酸产量的方法为：切断生物细胞内与L-脯氨酸竞争前体底物谷氨酸的其他代谢途径。其中，其他代谢途径是指，精氨酸代谢途径。通过使用这种方法，反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量达到921mg/L。

Description

一种通过敲除其他代谢途径进而提高反式-4-羟脯氨酸产量的生物合成方法
技术领域
一种通过敲除其他代谢途径进而提高反式-4-羟脯氨酸产量的生物合成方法，属于微生物基因工程领域。
背景技术
羟基-L-脯氨酸(简称：羟脯氨酸，Hydroxyproline，Hyp)为亚氨基酸，是L-脯氨酸羟基化后的产物，根据其羟基化位置的不同，可分为3-羟脯氨酸(3-Hyp)或4-羟脯氨酸(4-Hyp)。羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)是胶原蛋白的主要组成成分，不属于20种常见的氨基酸。
近些年来，Hyp的研究和开发已经引起医药、生化、食品及美容业等方面的广泛关注。它可以作为化妆品添加剂，具有抗氧化、抗辐射的作用；它具有减肥作用，可望成为比较理想的减肥药物；具有多种生理功能与独特的生物活性，既可作为各种软组织疾病的药物，如结缔组织受损、风湿性关节炎等，又可加快伤口愈合，以及治疗各种皮肤疾病；作为氨基酸注射液的重要组分，它对急慢性肝病所导致的低蛋白血症有一定的疗效；它参与脂肪的乳化及红细胞血红素和球蛋白的形成，具有调节脂肪乳化等作用；它还是多种药物，如第三代抗生素、抗肿瘤、抗高血压及新型胃药等的合成原料。
目前，生产羟脯氨酸的方法有化学合成法、生物组织提取法以及生物合成法。化学合成方法合成步骤较多，成本高，不适合工业生产。而生物组织提取法利用动物蛋白来源如明胶、猪皮为原料，经酸、碱或蛋白水解酶水解后提取羟脯氨酸，该法纯化步骤长，成本高，浪费大量原料，且废弃物污染严重，很容易被市场淘汰。随着DNA重组技术的发展以及微生物资源的发现，生物合成酶法生产羟脯氨酸成为工业上很有前景的生产方法。
生物合成法能将游离的L-脯氨酸通过脯氨酸羟化酶的催化，转化为羟基-L-脯氨酸，但在生物细胞中，游离的脯氨酸也是一种可以被利用的碳源，其积累量比较有限，所以有必要切断生物细胞内与L-脯氨酸竞争前体底物谷氨酸的其他代谢途径，使得L-脯氨酸得到大量积累，进而更多的转化为羟基-L-脯氨酸，提高羟基-L-脯氨酸产量。
本发明所提供的切断分支代谢途径进而提高提高羟基-L-脯氨酸产量的生物合成方法，具有重要的工业应用价值。
发明内容
针对生物合成法生产羟基-L-脯氨酸时，需外源添加L-脯氨酸导致生产成本较高的缺点，本发明的目的是提供一种通过提高底物L-脯氨酸积累量进而提高羟基-L-脯氨酸产量的生物合成方法。
本发明是一种通过提高底物L-脯氨酸积累量进而提高羟基-L-脯氨酸产量的生物合成方法。其特征是：切断生物细胞内与L-脯氨酸竞争前体底物谷氨酸的其他代谢途径，使得L-脯氨酸得到大量积累，进而更多的转化为羟基-L-脯氨酸，提高羟基-L-脯氨酸产量。
本发明所述重组细胞的构建方法：
1.含有脯氨酸羟化酶基因的载体的构建
根据大肠杆菌密码子的偏好性，利用密码子的简并性在不改变氨基酸序列的基础上，消除低使用率的密码子，优化脯氨酸羟化酶基因，使得其更有利于在大肠杆菌中得到表达。同时，选用色氨酸串联启动子作为其启动子，对其进行优化，使得羟化酶基因得到更为高效的表达。
2.通过敲除基因argB切断生物细胞内与L-脯氨酸竞争前体底物谷氨酸的精氨酸代谢途径
谷氨酸起始的下游代谢主要包括脯氨酸、谷氨酰胺和精氨酸3个途径。在精氨酸合成途径中，三羧酸循环代谢支路生成的谷氨酸不仅是精氨酸合成的前体，而且还是脯氨酸合成的前体，脯氨酸与精氨酸的合成形成竞争关系。因此，切断精氨酸合成支路有利于细菌体内代谢流向脯氨酸合成方向。
argB编码的乙酰谷氨酸激酶NAGK是精氨酸生物合成一个关键酶，其受到精氨酸的反馈抑制和反馈阻遏。乙酰谷氨酸激酶(N-acetyl-L-glutamatekinase，NAGK)是氨基酸激酶家族酶系之一，利用ATP催化乙酰谷氨酸(N-acetyl-L-glutamate，NAG)的γ-COO群组磷酸化生成无水酰基磷酸盐，且这个过程具有可逆性。
敲除argB基因，可以有效的打断细胞内由谷氨酸生成精氨酸的途径，从而积累更多的L-脯氨酸，有利于羟脯氨酸的产生。
3.重组大肠杆菌的发酵实验
35℃、220rpm培养24h，包括重组菌株BL21(DE3)△putA/△argB(pUC19-ptrp2-Hyp-VHb)，取发酵液测定反式-4-羟脯氨酸的含量。
附图说明
图1.精氨酸和脯氨酸代谢途径。
图2.羟脯氨酸在大肠杆菌细胞中的生物转化途径。
图3.表达质粒pUC19-ptrp2-Hyp-VHb图谱。
图4.重组菌株BL21(DE3)△putA/△argB(pUC19-ptrp2-Hyp-VHb)的获得。
具体实施方式
LB培养基:1％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母抽提物，1％(W/V)NaCl，pH7.0-7.2。
Amp(Kan)抗性平板：1％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母抽提物，1％(W/V)NaCl，1.5％(W/V)琼脂糖，氨苄青霉素(卡那霉素)50μg/mL。
5×KCM(大肠杆菌转化缓冲液):0.5MKCl，0.15MCaCl2，0.25MMgCl2。
反式-4-羟脯氨酸的定量测定：将发酵液离心后，取上清，稀释到2.5mL后加于10mL试管中，之后加入1mL氯胺T(氯胺T溶液：将1.41g氯胺T溶于10mL水中，依次加入10mL正丙醇和80mL缓冲溶液，其中缓冲溶液配方为：将50g柠檬酸，26.3gNaOH和146.1g结晶乙酸钠溶于水至1L，然后与200mL水以及300mL正丙醇混合)，摇匀后在室温中放置20min，然后加入1mL显色剂(显色剂：称取10g对二甲氨基苯甲醛，用35mL高氯酸溶解，缓慢加入65mL异丙醇)，摇匀后迅速将试管移至60℃水浴锅中，保温20min，再用冷水冷却，最后用紫外分光光度计在560nm波长处测定吸光值。
实施例1：argB基因敲除
由NCBI获得argB的基因序列(GenBank:AM946981.2)：argB基因(SEQIDNO：1)
采用短同源臂，设计引物对：引物5′-3′：P1(SEQIDNO：2)、P2(SEQIDNO：3)
以pKD4为模板，获得含有argB上下游同源臂和抗性基因(Kan)的打靶片段。通过化学转化法获得含有质粒pKD46的大肠杆菌BL21(DE3)△putA，之后将其制备为电转感受态，利用电转仪将打靶片段导入到电转感受态中，在质粒pKD46表达的三个蛋白的作用下，利用Red重组系统完成基因重组。电转后，30℃复苏3h，涂布含有卡那霉素的平板。之后转入质粒pCP20，用于消除抗性基因，将菌株分别点种于无抗性、Amp抗性平板、Kan抗性平板，选择只在无抗性平板上生长的单菌落。利用引物对Y1：(SEQIDNO：4)和Y2：(SEQIDNO：5)进行菌落PCR验证基因是否敲除，从而获得敲除基因argB缺失型的菌株——BL21(DE3)△putA/△argB。
实施例2：重组质粒(pUC19-ptrp2-Hyp-VHb)的获得
取实验室保存的含有目的质粒的菌株活化，于37℃，220rpm培养12-16小时。取培养后的菌液提取质粒，所有操作均严格按照说明书进行。
实施例3：重组菌株的构建
取出大肠杆菌BL21(DE3)△putA/△argB感受态，置于冰上解冻后，加入37μL的无菌水，10μLKCM，3μL质粒。混匀后，置于冰上30min，42℃热激90s，再放置冰上5min，加入600μL新鲜的LB培养基，37℃振荡培养1h，取100μL涂布于氨苄抗性平板。37℃培养8-16h后，待长出单菌落，挑取单菌落验证。
实施例4：重组菌株的发酵实验
摇瓶培养：挑取重组大肠杆菌单菌落，接种到LB液体培养基(含氨苄青霉素50μg/mL)中，37℃、220rpm培养8h后，按6％(V/V)接种量接入含有30mL发酵培养基[0.8％(W/V)葡萄糖，1％(W/V)甘油，0.8％(W/V)玉米浆，1.3％(W/V)硫酸铵，0.15％(W/V)磷酸氢二钾，0.2％(W/V)氯化钠，4mM硫酸亚铁，0.3g/L硫酸镁，0.015g/L氯化钙，pH8.0]的250mL摇瓶中，在旋转式摇床中35℃、220rpm培养24h，取发酵液检测反式-4-羟脯氨酸浓度。反式-4-羟脯氨酸的测定方法详见实施方式一般性说明。发酵结果显示，反式-4-羟脯氨酸产量达到921mg/L。

Claims (4)

1.一种有效提高羟脯氨酸产量的生物合成方法，其特征在于，在生物细胞利用L-脯氨酸生产羟基-L-脯氨酸的过程中，通过切断生物细胞内与L-脯氨酸竞争前体底物谷氨酸的其他代谢途径，来提高底物脯氨酸的量进而达到提高羟基-L-脯氨酸的产量。
2.如权利要求1所述，利用生物细胞生产羟基-L-脯氨酸的过程是指，生物细胞利用外源添加或者自身积累的脯氨酸，在脯氨酸羟化酶、α-酮戊二酸和亚铁离子存在的情况下，将游离的L-脯氨酸转化为羟基-L-脯氨酸。
3.如权利要求1所述，切断生物细胞内与L-脯氨酸竞争前体底物谷氨酸的其他代谢途径的方法：包括生物细胞内与其他代谢途径的相关酶不能被表达或者不能行使功能的方法，如基因敲除、RNA干扰等。
4.如权利要求1和2所述，生物细胞包括任何能够表达脯氨酸羟化酶，自主产生α-酮戊二酸，将脯氨酸转化为羟基-L-脯氨酸的有机体，包括大肠杆菌、嗜乙酸棒杆菌、酵母、动植物细胞等。
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