CN105483069B - 一株生产反式-4-羟基-l-脯氨酸的重组菌株及其构建与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的重组菌株及其构建与应用,属于基因工程技术领域。一种用于生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的重组菌株，经鉴定为大肠杆菌HJ（Escherichia coli HJ），保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年9月17日，保藏编号为CCTCC NO:M 2015550。本发明选择受反馈调节控制的野生型谷氨酸激酶加强表达，同时将三个要表达的基因连同相关的启动子等表达元件整合到大肠杆菌染色体上，使其可以随着染色体的复制而不断复制，保持了极高的遗传稳定性，克服了质粒丢失的问题，从而延长了有效发酵周期，增加了羟脯氨酸的产量。

Description

一株生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株及其构建与应用

技术领域

本发明涉及一株生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株及其构建与应用，具体涉及一株用于发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株及其构建方法与应用。

背景技术

反式-4-羟基-L-脯氨酸，简称L-羟基脯氨酸或羟脯氨酸，主要存在于动物的胶原蛋白中，含量可达10%左右，其作用是加强结缔组织的弹性和韧性。在食品添加剂领域，由于羟脯氨酸具有呈苦味中的独特甜味，能改善果汁饮料风味，而且还具有皮肤修复功能，常作为饮料添加剂。在化妆品添加剂领域，由于羟脯氨酸具有抗氧化、抗辐射的作用，可消除氧化剂以及调整细胞的氧化还原状态的潜在效果，以期保养皮肤和延缓衰老，是化妆品的重要添加剂。在医药领域，由于羟脯氨酸存在两个手性中心，易于衍生化，药理活性多样，用于合成新一代培南类抗生素，还应用于多种新创新制药物的合成，既可作为各种软组织疾病的药物，如结缔组织受损、风湿性关节炎等；又可加快伤口愈合以及治疗各种皮肤疾病。可见，羟脯氨酸广泛应用于食品添加剂、化妆品和药物中间体。

目前，羟脯氨酸的生产主要有三种路线：动物骨胶提取法、生物催化法和发酵法。其中，动物骨胶提取法是以动物骨胶为原料，通过强酸水解、亚硝酸氧化和离子交换等过程获得产品，是国内生产企业采用的主要方法。但该方法由于需要用到强酸强碱水解，并且骨胶中成分复杂，分离提取难度大，后续需要采用离子交换树脂进行分离，产生大量的废水。因此，在环保压力日益增大的今天，该方法渐渐面临被淘汰的命运。

生物催化法是以L-脯氨酸和α-酮戊二酸为原料，利用高表达L-脯氨酸羟化酶的大肠杆菌作为酶源，经酶催化得到反式-4-羟基-L-脯氨酸。如现有技术CN94115662.1中公开了一种反式-4-羟基-L-脯氨酸的制造方法，该发明采用胞囊菌的羟基化酶，在维生素C，酮戊二酸，硫酸亚铁的条件下，催化L-脯氨酸生成反式-4-羟基-L-脯氨酸。CN96190335.X中公开了一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，该发明利用胞囊菌羟基化酶基因构建表达质粒，导入大肠杆菌，构建工程菌。在发酵表达酶的同时加入葡萄糖和L-脯氨酸，发酵72h，累积产物24g/L。CN201210203625.9 中公开了一种利用重组大肠杆菌发酵生产L-4-羟脯氨酸的方法，该发明通过构建羟基化酶质粒，导入大肠杆菌得到产L-4-羟脯氨酸的重组菌，然后在摇瓶发酵过程中加入L-脯氨酸，24h后产生0.3g/L羟基脯氨酸。CN201310283918.7中公开了一种反式-4- 羟脯氨酸的生产方法，该发明向羟基化酶大肠杆菌工程菌中导入透明颤菌血红蛋白基因，在摇瓶发酵过程中加入L-脯氨酸，48h后产生4.93g/L羟基脯氨酸。CN201410029052.1和CN201310235337.6中利用截断优化的羟基化基因构建了过程菌，发酵表达酶，再利用菌体转化，转化时添加酮戊二酸、MES缓冲液、L-脯氨酸、硫酸亚铁、抗坏血酸等，使转化率达97%以上，经72h反应，产物达26g/L。由此可见上述现有技术中利用生物催化法需要额外添加底物L-脯氨酸，有的还要添加α-酮戊二酸，这两种原料的成本较高且转化率低，使得最终体系中残留L-脯氨酸而存在难于纯化的问题，因此生产成本居高不下。

发酵法相对于生物催化法和骨胶提取法而言，整体工艺相对简单且易操作，同时采用廉价的葡萄糖为原料，成本低。目前，现有发酵法生产羟脯氨酸菌株在构建时，通常将需要加强表达的三个基因克隆在质粒表达载体上，然后引入大肠杆菌中表达；同时在摇瓶发酵或5～10L的实验室发酵罐发酵时，通过加入合适的抗生素，一方面防止感染其他杂菌，另一方面可以给大肠杆菌一个选择压力，使得大肠杆菌在不断的传代复制过程中，必须含有抗性质粒的细胞才能生长，从而避免了质粒的丢失。但在大规模的工业发酵时，一般不可能在培养基中添加抗生素，不仅因为控制成本的考虑，还因为添加了大量抗生素的发酵液不能被排放到环境中，以免对环境生态造成太大的干扰。因此，大规模发酵时，由于发酵规模大，周期长，菌种传代次数多，质粒在多次传代复制过程中会不断的发生丢失，而被质粒承载的表达基因也随之丢失。这就意味着在发酵的后期，发酵罐中不断增殖的细菌中包含了很大一部分无效的细菌，而且越往后期，无效细菌占得比例就越大。表现出来就是越往发酵后期，羟脯氨酸的产量增加速度逐渐变慢，直至不再增加。例如现有技术CN97117929.8中公开了一种反式－4－羟基－L－脯氨酸的制造方法，该发明强化宿主菌大肠杆菌L-脯氨酸生物合成系统，并敲除了脯氨酸分解酶系，利用胞囊菌羟基化酶基因构建表达质粒，导入改造的大肠杆菌，构建工程菌。在发酵时流加葡萄糖，生产羟基脯氨酸，最终发酵液中羟脯氨酸浓度可达25g/L左右。该发明工艺生产简单，成本优势明显。但该发明工艺在实际生产中也存在以下问题，一是表达基因通过质粒表达载体引入，在大规模长周期工业发酵中，质粒容易丢失，导致生产菌种遗传稳定性差，发酵后期产量下降的问题。二是通过强化表达了耐受L-脯氨酸反馈抑制的L-谷氨酸激酶突变体基因proB74和L-谷氨酰磷酸还原酶基因proA，虽然增加了细胞内L-脯氨酸的代谢通量，最终增加了羟脯氨酸的产量。但此处的构建也导致了细胞内L-脯氨酸的浓度始终较高，直至发酵结束时，发酵液中L-脯氨酸浓度较高，约为羟脯氨酸浓度的三分之一；再加之L-脯氨酸和羟脯氨酸二者物理性质比较相近，难以通过简单的结晶方法分离提纯，只能通过离子交换树脂加以分离纯化；而离子交换树脂的使用不仅增加了生产周期，而且加大了酸碱用量，更严重的时产生了大量的酸碱废水，带来了严重的环境问题，大大增加了成本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一株用于发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的具备遗传稳定性高，产量高，副产物少的重组菌株及其构建方法与应用。

本发明解决技术问题采用的技术方案是:

一种用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株，经鉴定为大肠杆菌（Escherichia coli）HJ，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年9月17日，保藏编号为CCTCC M 2015550。

作为优选，所述重组菌株是由L-脯氨酸羟化酶基因，野生型L-谷氨酸激酶基因、L-谷氨酰磷酸还原酶基因和抗性基因分别克隆到载体上，前端加上强启动子，然后设计包含了同源臂的长引物将表达框扩增出来，利用RED重组技术一次性将其整合到大肠杆菌基因组的L-脯氨酸脱氢酶基因位点得到的。

进一步，所述L-谷氨酸激酶基因和L-谷氨酰磷酸还原酶基因来源于大肠杆菌，分别由proB和proA基因编码，为大肠杆菌中从L-谷氨酸到L-脯氨酸的关键代谢酶，加强表达有助于增加代谢通量，提高反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量。可通过PCR从大肠杆菌基因组DNA中扩增获得，或者通过基因合成获得。

进一步，所述L-脯氨酸羟化酶来源于胞囊菌，由proH基因编码，导入大肠杆菌后使得大肠杆菌具备了从葡萄糖直到反式-4-羟基-L-脯氨酸的代谢通路，该基因可通过基因合成获得。

进一步，L-脯氨酸脱氢酶来源于大肠杆菌，由putA基因编码，催化L-脯氨酸降解为L-谷氨酸。将四个表达框整合到该位点会使得L-脯氨酸脱氢酶失活，避免了L-脯氨酸降解为L-谷氨酸，形成无效循环通路，分流L-脯氨酸到羟脯氨酸的代谢流，有助于增加终产物反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量。

进一步，所述抗性基因为卡那霉素抗性基因。

进一步，强启动子来源于枯草芽孢杆菌的木聚糖酶基因启动子。可实现基因的组成型高效表达，根据序列基因合成获得。

本发明进一步解决其技术问题采用的技术方案是，一种用于发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株的构建方法，通过将L-脯氨酸羟化酶基因，野生型L-谷氨酸激酶基因、L-谷氨酰磷酸还原酶基因和抗性基因分别克隆到载体上，前端加上强启动子，然后设计包含了同源臂的长引物将表达框扩增出来，利用RED重组技术一次性将其整合到大肠杆菌基因组的L-脯氨酸脱氢酶基因位点。

进一步，所述用于发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌株的构建方法，包括以下步骤：

（1）L-脯氨酸羟化酶基因及其启动子的克隆：根据NCBI数据库中GenBank:D78338.1设计L-脯氨酸羟化酶基因proH序列，如 SEQ ID NO∶1所示，和枯草芽孢杆菌的木聚糖酶基因启动子Pxyl序列，如SEQ ID NO∶2所示，将二者拼接到一起，为便于后续克隆，两端分别加上EcoRI和KpnI位点，基因合成整个片段Pxyl+proH，SEQ ID NO∶3所示；然后利用基因克隆技术将Pxyl+proH片段克隆到pUC18载体的EcoRI和KpnI位点处，得到pUC18-pxyl-proH；

（2）L-谷氨酸激酶基因proB和L-谷氨酰磷酸还原酶基因proA基因的克隆：设计引物对，F-proB，如SEQ ID NO∶4所示和R-proA ，如SEQ ID NO∶5所示，分别增加KpnI和BamH位点，从大肠杆菌基因组中扩增proB+proA两个基因及其上下游各一小段的DNA片段，在大肠杆菌中，proB和proA两个基因连锁排列在一起，因此，可以一次克隆出来；然后利用基因克隆技术将proB+proA片段克隆到pUC18-pxyl-proH的KpnI和BamHI位点处，得到重组质粒pUC18-pxyl-proH-proB-proA；

（3）卡那霉素抗性基因的克隆：设计引物对，F-kanR，如SEQ ID NO∶6所示和R-kanR，如SEQ ID NO∶7所示，为便于后续克隆，分别增加BamH和HindIII位点，从模板质粒pKD4上扩增卡那霉素抗性片段kanR；然后利用基因克隆技术将kanR片段克隆到pUC18-pxyl-proH-proB-proA的BamHI和HindIII位点，得到重组质粒pUC18-pxyl-proH-proB-proA-kanR；

（4）四个表达框的整合：根据大肠杆菌W3110的putA序列设计两条长引物，F-putA，见SEQ ID NO.8所示和R-putA，见SEQ ID NO.9所示，末端分别与待敲除的putA序列同源，然后以重组质粒pUC18-pxyl-proH-proB-proA-kanR为模板，经PCR扩增得到含有proH、proB、proA和kanR四个表达框的DNA片段，利用RED重组技术插入到大肠杆菌基因组的putA位点，达到了整合表达和敲除putA基因的目的。

本发明进一步解决的技术问题采用的技术方案是，一株用于发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株的应用，以葡萄糖为主碳源，通过好氧发酵合成高浓度反式-4-羟基-L-脯氨酸。

进一步，所述好氧发酵条件为培养温度33～37度，控制pH为6.8～7.0，溶氧20%以上，发酵时间60～70小时。

大肠杆菌中存在从葡萄糖开始到脯氨酸的代谢通路，见图1。首先葡萄糖被转运到细胞内，经过多步酶促反应后，生成L-谷氨酸，这部分代谢的通量非常大，可以提供充足的L-谷氨酸；然后L-谷氨酸经过proB基因编码的L-谷氨酸激酶，proA基因编码的L-谷氨酰磷酸还原酶和proC基因编码的吡咯琳-5-羟酸还原酶三个酶的催化，生成L-脯氨酸。其中，L-谷氨酸激酶的活性受L-脯氨酸浓度的反馈抑制，在L-脯氨酸浓度过高时，L-谷氨酸激酶的活性下降，从而L-谷氨酸到L-脯氨酸的代谢通量下降，L-脯氨酸浓度不再增加。这是细菌自身调节胞内物质浓度的一种常用方式。因此，本发明采用了高表达野生型L-谷氨酸激酶基因proB和L-谷氨酰磷酸还原酶基因proA，本发明之重组菌株的构建是通过在大肠杆菌自身存在葡萄糖到L-脯氨酸代谢途径的基础上，通过采用高表达野生型L-谷氨酸激酶基因proB和L-谷氨酰磷酸还原酶基因proA实现加强相关基因的表达，可使细胞自身能够调节L-脯氨酸的浓度，在浓度过高时，会抑制L-谷氨酸激酶的活性，减少代谢通量，避免L-脯氨酸的过高积累，从L-谷氨酸到羟脯氨酸的代谢流量由L-脯氨酸羟化酶加以驱动。再通过插入失活L-脯氨酸脱氢酶的基因putA获得阻断消耗途径，由此建立了从葡萄糖到反式-4-羟基-L-脯氨酸的代谢通路。本发明将其表达框一次性整合到大肠杆菌的putA位点，实现上述基因的稳定高效表达，同时实现了整合表达和插入失活的目的。

综上，本发明选择受反馈调节控制的野生型谷氨酸激酶加强表达，同时将三个要表达的基因连同相关的启动子等表达元件整合到大肠杆菌染色体上，使其可以随着染色体的复制而不断复制，保持了极高的遗传稳定性，克服了质粒丢失的问题，从而延长了有效发酵周期，增加了羟脯氨酸的产量。实验发现，本发明不仅避免L-脯氨酸的积累而且对最终羟脯氨酸的产量也没有影响。整个代谢通量可被精确调控，避免了中间产物的积累，使得发酵产物主要是目标产物羟脯氨酸，副产物L-脯氨酸浓度仅约为羟脯氨酸浓度的十分之一以下，给后续的分离纯化带来了很大的方便，并简化了分离步骤，有效的降低了生产成本。

本发明通过代谢工程技术对大肠杆菌进行改造得到重组大肠杆菌，可以葡萄糖为碳源，经过发酵生产羟脯氨酸，工艺简单，成本低廉，同时三废排放少，环境友好，具有工业化生产的应用价值。

附图说明

图1为原大肠杆菌中羟脯氨酸主要相关代谢途径。

图2为质粒pUC18-pxyl-proH-proB-proA-kanR的结构图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步加以说明。

常规的基因克隆实验操作按照《分子克隆实验指南第三版》（[美]J.莎姆布鲁克黄培堂译）操作方法进行。

RED重组实验原理和操作参照文献Kirill A. Datsenko and Barry L. Wanner,One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCRproducts, Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6;97(12):6640-5.

实施例1：L-脯氨酸羟化酶基因及其启动子的克隆

1、根据L-脯氨酸羟化酶基因proH序列GenBank: D78338.1（SEQ ID NO.1所示）和枯草芽孢杆菌木聚糖酶启动子Pxyl序列（SEQ ID NO.2所示），合成Pxyl+proH片段，两端加上EcoRI和KpnI位点（SEQ ID NO.3所示）；

2、利用EcoRI和KpnI双酶切Pxyl+proH，其中，酶切体系：DNA 43μL，buffer 5μL，EcoRI和KpnI各1μL，37℃保温3小时。电泳检测并回收备用。

3、培养含有pUC18质粒的大肠杆菌，并抽提质粒，提取方法按照试剂盒说明书操作。用EcoRI和KpnI双酶切质粒，酶切体系同上，电泳检测并回收备用。

4、用T4连接酶连接Pxyl+proH和载体pUC18 DNA片段，连接体系如下：Pxyl+proH7.5μL，pUC18载体 1.5μL，buffer 1μL，T4连接酶 1μL，保温16℃过夜，连接产物采用热激法转化至大肠杆菌宿主菌DH5α（购自TAKARA公司）中。涂布到含有1%蛋白胨，0.5%酵母膏，1 %氯化钠及1.5 %琼脂粉氨苄青霉素的LB固体培养基上。

5、LB平板在37℃培养至生长出转化子，挑取单菌落，测序验证序列符合预期的单菌落为阳性克隆，在本发明中命名为“pUC18-pxyl-proH”。

实施例2：L-谷氨酸激酶基因proB和L-谷氨酰磷酸还原酶基因proA基因的克隆

1、以大肠杆菌DH5α菌株的总DNA为模板，以引物F-proB：TATGGTACCAACTGCCGCTAGGCTTGCTG（SEQ ID NO.4所示）和R-proA ：GTAGGATCCCGTCAATGGCCTTGTGAATC（SEQ ID NO.5所示）扩增得到proB+proA基因片段。其中，PCR反应体系包括：模板1μL大肠杆菌基因组DNA，1μL dNTP(10 mmol/L)，2μmol/L MgCl₂，0.5 μmol/L primers，5μL 10×PCR buffer，3 U KODDNA 聚合酶(购自TOYOBO公司)。PCR反应条件包括：94℃预变性 5min；94℃变性30s，55℃退火40s，68℃延伸2min，25个循环；68，10min。

2、采用类似实施例1的操作，利用KpnI和BamHI双酶切proB+proA，与同样双酶切的pUC18-pxyl-proH质粒连接，转化大肠杆菌DH5α，得到重组质粒，在本发明中命名为“pUC18-pxyl-proH-proB-proA”。

实施例3：卡那霉素抗性基因的克隆

1、以模板质粒pKD4为模板，以引物F-kanR： CATGGATCCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG（SEQ ID NO.6所示）和R-kanR：GACAAGCTTATGGGAATTAGCCATGGTCC（SEQ ID NO.7所示）扩增得到卡那霉素抗性基因片段kanR， PCR条件同实施例1。

2、采用类似实施例1的操作，利用BamHI和HindIII双酶切kanR，与同样双酶切的pUC18-pxyl-proH-proB-proA质粒连接，转化大肠杆菌DH5α，得到重组质粒，在本发明中命名为“pUC18-pxyl-proH-proB-proA-kanR”；

实施例4：四个表达框的整合

1、根据大肠杆菌W3110（购自耶鲁大学大肠杆菌菌种保藏中心，CGSC）的putA序列设计引物，上游引物F-putA：ATGGGAACCACCACCATGGGGGTTAAGCTGGACGACGCGCAGGAAACAGCTATGACC（SEQ ID NO.8所示）和下游引物R-putA:TTAACCTATAGTCATTAAGCTGGCGTTACCGCCAGCGGCGTAAAACGACGGCCAGT（SEQ ID NO.9所示）。以实施例3中构建好的质粒pUC18-pxyl-proH-proB-proA-kanR为模板，经PCR扩增得到含有proH、proB、proA和kanR四个表达框的DNA片段。

2、将RED重组酶表达质粒载体pKD46利用电击转化法转入大肠杆菌W3110中，得到菌株W3110/pKD46；

3、LB培养基中加入1%（m/V，质量体积百分比）的L-阿拉伯糖，30℃震荡培养菌株W3110/pKD46至OD600达到0.6，然后制备感受态细胞。将上述制备好的DNA片段电转化入该感受态细胞内，涂布卡那霉素抗性（25µg/mL）LB平板，得到转化子。

4、挑取转化子，用菌落PCR鉴定。菌落PCR引物为F-kanR：CATGGATCCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG（SEQ ID NO.6所示）和R-putA2 ：TGTAACATCCTCCGGCTACCTG（SEQ ID NO.10所示），其中引物F-kanR位于表达片段内部，引物R-putA2位于大肠杆菌染色体putA基因的外部，如果有1.5kb左右DNA片段被扩增出，可证明表达框正确插入了putA基因处，所得即为预期的菌株。

实施例5：羟脯氨酸的发酵生产

1、种子和发酵培养基

种子培养基为LB培养基（成分为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L）。

发酵培养基成分：蛋白胨10 g/L，葡萄糖20 g/L，磷酸氢二钾 1g/L，硫酸铵 10g/L，氯化钠2g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸亚铁0.5g/L。按比例配好后，高压蒸汽灭菌，备用。

补料培养基：葡萄糖 650g/L。

2、发酵过程

过夜培养种子培养基，按5%的接种量后转接至发酵培养基，37℃好氧培养，控制pH为6.8，溶氧20%以上，当葡萄糖耗完后，按照5g/L•h的速率流加葡萄糖，培养至发酵结束。

在发酵后期取样检测羟脯氨酸含量，至含量不再增加为止。

经检测，60小时后，发酵液中羟脯氨酸浓度可达28.3g/L，L-脯氨酸浓度为2.3g/L。

实施例6：羟脯氨酸的发酵生产

与实施例5的不同之处在于，发酵过程为：过夜培养种子培养基，按2%的接种量后转接至发酵培养基，33℃好氧培养，控制pH为7.0，溶氧20%以上，当葡萄糖耗完后，按照5g/L•h的速率流加葡萄糖，培养至发酵结束。

经检测，70小时后，发酵液中羟脯氨酸浓度可达28.8g/L，L-脯氨酸浓度为2.4g/L。

实施例5-6所构建的大肠杆菌菌株经过发酵后，可以得到高浓度的羟脯氨酸产品，同时副产物少，相比现有技术水平，优势明显，具备了工业化的潜力。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江绿创生物科技有限公司

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<211> 57

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

atgggaacca ccaccatggg ggttaagctg gacgacgcgc aggaaacagc tatgacc 57

<210> 9

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

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<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

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Claims (3)

1.一种用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株，经鉴定为大肠杆菌（Escherichia coli）HJ，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2015年9月17日，保藏编号为CCTCCM 2015550。

2.根据权利要求1所述的一种用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的重组菌株在发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用，其特征在于，以葡萄糖为主碳源，通过好氧发酵合成高浓度反式-4-羟基-L-脯氨酸。

3.根据权利要求2所述的一种用于生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的菌株在发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用，其特征在于，所述好氧发酵条件为培养温度33～37度，控制pH为6.8～7.0，溶氧20%以上，发酵时间60～70小时。