KR102370964B1 - 다중약물 수송체의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 미생물, 및 그를 이용한 트립토판 대사체의 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
다중약물 수송체 A(Multidrug efflux system subunit A: MdtA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물에 관한 것이다.
다중약물 수송체의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 재조합 미생물, 및 그를 이용한 트립토판 대사체를 생산하는 방법은 트립토판 대사체의 대량 생산을 가능하게 할 수 있다.
다중약물 수송체의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 재조합 미생물, 및 그를 이용한 트립토판 대사체를 생산하는 방법은 트립토판 대사체의 대량 생산을 가능하게 할 수 있다.
Description
본 출원은 다중약물 수송체 A(Multidrug efflux system subunit A: MdtA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하는 재조합 미생물에 관한 것이다.
두 개의 L-트립토판은 이민 다이머(imine dimer)를 형성할 수 있고, 이로부터 다양한 유용물질들이 합성될 수 있다. 예를 들면, L-트립토판으로부터 생성될 수 있는 트립토판 대사체들 중에서 비올라세인(violacein) 및 디옥시비올라세인(deoxyviolacein)은 항암, 항궤양, 항균, 항진균, 항원생동물, 항바이러스 등 다양한 생리활성 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 포도상구균(Staphylococcus aureus) 및 기타 다양한 그람양성균에 대한 강력한 항생 작용으로 다제내성균에 대한 새로운 항생제로서의 역할, 면, 나일론, 레이온, 폴리에스테르 등 다양한 직물에 염색하는 염료로서 이용될 수 있어 활용도가 높다.
비올라세인 및 디옥시비올라세인 외에도, L-트립토판으로부터 생성될 수 있는 다양한 트립토판 대사체 또는 중간물질에 대한 관심이 높아지고 있으며, 이들을 수득하기 위해, 유전적으로 변형된 재조합 미생물을 제조하는 방법이 연구되고 있다. 하지만, 공지되어 있는 방법으로 제조된 미생물이 제조하는 목적 산물의 양이나 수율이 낮아, 트립토판 대사체를 상업적으로 대량 생산할 수 없다는 문제점이 있다.
따라서, L-트립토판으로부터 생성되는 다양한 대사체들을 대량 생산할 수 있는 미생물에 관한 연구가 수행될 필요가 있으며, 본 출원의 발명자들은 미생물 내 특정 단백질의 활성을 조절하여, 상기 대사체의 생산량을 크게 증가시킬 수 있었다.
본 출원은 다중약물 수송체 A(Multidrug efflux system subunit A: MdtA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하고, 비변형 균주에 비하여 트립토판 대사체의 생산능이 증가된 재조합 미생물을 제공한다.
본 출원은 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 배지 또는 상기 미생물로부터 목적산물을 회수하는 단계를 포함하고, 상기 목적산물은 트립토판 대사체인, 목적산물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 출원에서 용어, 단백질 활성의 "강화"는, 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성을 의미한다. 이는 "변형전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 단백질의 활성에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 "활성 증가"는 외래의 단백질을 도입하거나, 내재적인 단백질의 활성 강화를 통해 달성할 수 있으나, 구체적으로는 내재적인 단백질의 활성 강화를 통해 달성하는 것일 수 있다. 상기 단백질의 활성의 강화 여부는 해당 단백질의 활성 정도, 발현량 또는 해당 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 단백질의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 단백질의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않을 수 있다. 상기 방법은 이로 제한되는 것은 아니나, 유전자 공학 또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있다.
상기 유전자 공학을 이용하여 단백질 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면,
1) 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가,
2) 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 발현 조절 서열로 교체하는 방법,
3) 상기 단백질의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법,
4) 상기 단백질 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법,
5) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는
6) 상기 방법들의 조합 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질 공학을 이용하여 단백질 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면, 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 단백질을 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가는, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 해당 단백질을 코딩하는 유전자가 작동 가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터를 숙주세포 내에 도입함으로써 수행될 수 있다. 또는, 상기 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 유전자를 삽입시킬 수 있는 벡터를 숙주세포 내에 도입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 목적 단백질을 발현시키기에 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 형태로 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 발현 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, λMBL3, λMBL4, λIXII, λASHII, λAPII, λt10, λt11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다.
본 출원에서 용어, "형질전환"은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다.
또한, 상기에서 용어, "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미할 수 있다.
상기 2) 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 발현 조절 서열로 교체하는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 상기 방법은 구체적으로 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터를 연결시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ7 프로모터 (대한민국 등록특허 제10-0620092호), CJ1 프로모터 (대한민국 등록특허 제10-0620092호), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, araBAD 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터 및 tet 프로모터가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 단백질의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 단백질의 내재적 개시코돈을 상기 내재적 개시코돈에 비해 단백질 발현율이 더 높은 다른 개시코돈으로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 상기 단백질 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 상기 유전자를 염색체내로 삽입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 도입하고자 하는 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
상기 5) 상기 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 단백질을 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
마지막으로, 6) 상기 방법들의 조합은 상기 1) 내지 5) 중 어느 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.
이와 같은 단백질 활성의 강화는, 상응하는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 변형전 미생물 균주에서 발현된 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원에서 용어, "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미한다. 본 출원에 있어서, 상기 형질 변화는 다중약물 수송체의 활성 강화일 수 있다. 상기 "변형전 균주" 또는 "변형전 미생물"은 "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물", "비변형 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에 있어서 핵산 또는 폴리펩티드의 "서열 동일성 (sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 염기 또는 아미노산 잔기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 특정 비교 영역에서 2개의 서열을 최적으로 얼라인하여 비교함으로써 측정되는 값으로서, 비교 영역 내에서 서열의 일부는 대조 서열 (reference sequence)과 비교하여 부가 또는 삭제되어 있을 수 있다. 서열 동일성 백분율은 예를 들면, 비교 영역 전체에서 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하는 단계, 두 서열 모두에서 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드가 나타나는 위치의 갯수를 결정하여 일치된 (matched) 위치의 갯수를 수득하는 단계, 상기 일치된 위치의 갯수를 비교 범위 내의 위치의 총 갯수 (즉, 범위 크기)로 나누는 단계, 및 상기 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 수득하는 단계에 의해 계산될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 프로그램의 일례로 BLASTN(NCBI), BLASTP(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
여러 종의 동일하거나 유사한 기능이나 활성을 가지는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 확인하는데 있어서 여러 수준의 서열 동일성을 사용할 수 있다. 예를 들어, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 등을 포함하는 서열 동일성이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유전적 변형 (genetic modification)"이란 세포의 유전물질의 구성 또는 구조를 인위적으로 변경시키는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "생산능(productivity)의 증가"는 목적산물의 생산량, 생산효율, 또는 생산성 등이 증가된 것을 의미할 수 있다.
일 양상은 다중약물 수송체 A(Multidrug efflux system subunit A: MdtA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하고, 비변형 균주에 비하여 트립토판 대사체의 생산능이 증가된 재조합 미생물을 제공한다.
본 명세서에서 다중약물 수송체(Mdt)는 다양한 약물과 독성화합물을 세포 외부로 배출하는 시스템을 지칭할 수 있다. MdtA는 MdtB와 MdtC 그리고 외막채널(outer membrane channel)인 TolC와 함께 다중약물 수송체를 구성하는 단백질을 지칭할 수 있다. 상기 MdtA는 박테리아 유래의 것일 수 있다. 상기 MdtA는 상기 재조합 미생물에 대하여 외인성(exogenous) 또는 내인성(endogenous)인 것일 수 있다. 상기 mdtA는 에세리키아(Escherichia) 속 유래, 바실러스(Bacillus) 속 유래, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 유래, 마이코박테리움(Mycobacterium) 속 유래, 자이모모나스(Zymomonas) 속 유래, 아시네토박터(Acinetobacter) 속 유래, 또는 비브리오(Vibrio) 속 유래인 것일 수 있다. 상기 MdtA는 대장균(E.coli), 예를 들면, 대장균 W3110 균주 유래인 것일 수 있으나, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 제한되지 않는다.
본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명할 수 있다. 예를 들어, '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'는, 이와 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'에 속할 수 있음은 자명할 수 있다. 따라서, 본 출원에서의 MdtA 의 활성을 갖는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 또는 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 MdtA 활성을 갖는 단백질에 해당됨은 당업자에게 자명할 수 있다.
상기 MdtA는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 MdtA는 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 MdtA를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열과 90% 이상, 95% 이상 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "트립토판 대사체(tryptophan metabolite)"는 트립토판, 예를 들면, L-트립토판으로부터 비올라세인이 생합성되는 경로에서 생산되는 물질, 중간체 및/또는 상기 물질이 변형되어 생성될 수 있는 물질을 지칭할 수 있다. 상기 트립토판 대사체는 당업계에 공지되어 있는 물질, 예를 들면, 인돌-3-아세트산(Indole-3-acetic acid), 인돌-3-피루브산(Indole-3-pyruvic acid: IPA), 인돌-3-피루브산 이민(Indole-3-pyruvic acid imine: IPA 이민), 인돌-3-카르발데히드(Indole-3-carbaldehyde), 인돌-3-카르복시산(Indol-3-carboxylic acid), 인돌-3-락트산(Indole-3-lactic acid), 5-히드록시트립토판(5-hydroxytryptophan), 6-히드록시트립토판(6- hydroxytryptophan), N-카르보벤즈옥시(Cbz)-데히드로트립토판(N-carbobenzoxy(Cbz)-dehydrotryptophan), 옥시비올라세인(oxyviolacein), 디옥시비올라세인(deoxyviolacein), 슈도비올라세인(pseudoviolacein), 슈도디옥시비올라세인(pseudodeoxyviolacein), 프로비올라세인(proviolacein), 프로디옥시비올라세인(prodeoxyviolacein), 프로토비올라세인산(protoviolaceinic acid), 프로토디옥시비올라세인산(protodeoxyviolaceinic acid), 크로모피롤산(chromopyrrolic acid: CPA), 아르시리아루빈 A(arcyriarubin A), 크로모아제피논 A(chromoazepinone A), 크로모아제피논 B(chromoazepinone B), 크로모아제피논 C(chromoazepinone C), 인디고(indigo), 크로모비리단스(chromoviridans), 또는 디옥시크로모비리단스(deoxychromoviridans), 옥시크로모비리단스(oxychromoviridans)일 수 있다. 또한, 미래에 트립토판 대사체로 밝혀질 물질 또한 포함할 수 있다. 인돌(indole)기, 또는 두 개의 인돌이 연결된 비스-인돌(bis-indole)기를 갖는, 상기 트립토판 대사체들 중 일부는, 유사한 전기화학적 특성 또는 유사한 분자 크기를 가질 수 있다.
상기 미생물에서, 비올라세인 및/또는 디옥시비올라세인은 트립토판 대사 경로에서 합성되는 물질이므로 트립토판으로부터 비올라세인 및/또는 디옥시비올라세인의 생산능이 증가된 미생물은 트립토판으로부터 비올라세인 또는 디옥시비올라세인이 합성되는 경로에서 생산되는 중간체, 즉 트립토판 대사체의 생산능이 증가된 미생물일 수 있다.
상기 미생물에 있어서, MdtA의 활성을 증가시키는 유전적 변형은 MdtA를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 구체적인 활성 강화 방법은 전술된 사항을 참고할 수 있다.
상기 미생물은 크로모박테리움(Chromobacterium) 속, 잔티노박테리움(Janthinobacterium)속, 에세리키아(Escherichia) 속, 또는 두가넬라(Duganella)속에 속하는 것일 수 있다. 상기 미생물은 내재적(intrinsic) 트립토판 대사 경로(tryptophan metabolism pathway), 또는 내재적 비올라세인 생합성 경로를 가지고 있거나 가지고 있지 않은 것일 수 있다. 상기 미생물은 내재적 트립토판 대사 경로, 또는 내재적 비올라세인 생합성 경로를 가지고 있지 않은 것일 경우, 당업계에 공지된 분자생물학적 방법에 의해 트립토판 대사 경로 또는 비올라세인 생합성 경로를 갖도록 형질전환된 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 대장균(E.coli), 예를 들면, 대장균 W3110 균주일 수 있으나, 상기 유전적 변형에 의해 트립토판 대사체를 생산할 수 있는 미생물이라면 제한되지 않는다.
상기 미생물은 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자를 가지고 있는 것일 수 있다. 상기 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자는 내인성 또는 외인성일 수 있고, 구체적으로, vioABCDE 유전자, 또는 vioABCDE 유전자 중 vioD 유전자가 변이 또는 결실된 vioABCD*E 또는 vioABCE 유전자일 수 있다. 상기 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자는, 서열번호 3 내지 7의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 재조합 미생물은 유전자 클러스터 vioABCDE, vioABCD*E 또는 vioABCE의 활성이 강화된 유전적 변형을 포함하는 것에 의해 외인성 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 유전자 클러스터 vioABCDE, vioABCD*E 또는 vioABCE가 도입된 것, 예를 들면 벡터와 같은 비히클을 통하여 도입된 것일 수 있다. 상기 vioABCDE, vioABCD*E 또는 vioABCE는 크로모박테리움(Chromobacterium) 속, 예를 들면 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum) 유래일 수 있으나, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 제한이 없다. 일 구체예에서, 상기 크로모박테리움 비올라세움 유래 유전자 vioA, vioB, vioC, vioD 및 vioE에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 각각 서열번호 3 내지 7의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다. 상기 유전자 클러스터 vioABCDE, vioABCD*E 또는 vioABCE는 미생물에서 비올라세인 생합성에 관여하는 기능을 할 수 있다.
다른 양상은 다중약물 수송체 A(Multidrug efflux system subunit A: MdtA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하고, 비변형 균주에 비하여 트립토판 대사체의 생산능이 증가된 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및 배지 또는 상기 미생물로부터 목적산물을 회수하는 단계를 포함하고, 상기 목적산물은 트립토판 대사체인, 목적산물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법에서, 재조합 미생물, 트립토판 대사체에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 미생물의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지 및 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양의 방법은 회분식, 연속식, 및 유가식 배양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양을 포함할 수 있다.
상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소 성분, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
상기 탄소원은 탄수화물, 지방, 지방산, 알코올, 유기산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소원일 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스, 및 이들의 조합일 수 있다. 상기 지방은 대두유, 해바라기유, 파자마유, 코코넛유, 및 이들의 조합일 수 있다. 상기 지방산은 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 알코올은 글리세롤 또는 에탄올일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산을 포함할 수 있다.
상기 질소원은 유기 질소원, 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 유기 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 대두밀, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 무기 질소원은 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄, 및 이들의 조 합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 배지는 인, 금속염, 아미노산, 비타민, 전구체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함할 수 있다. 상기 인의 공급원은 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 또는 이들에 상응하는 소듐-함유염을 포함 할 수 있다. 상기 금속염은 황산마그네슘 또는 황산철일 수 있다.
상기 배지 또는 이를 이루는 개별 성분은 회분식, 연속식, 또는 유가식 배양으로 첨가될 수 있다.
상기 배양 방법에 있어서, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 상기 pH의 조정은 상기 배양물에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 또는 황산을 첨가하여 이루어질 수 있다. 또한, 상기 배양 방법은 기포 생성 억제를 포함할 수 있다. 상기 기포 생성 억제는 소포제의 사용을 통하여 이루어질 수 있다. 상기 소포제는 지방산 폴리글리콜 에스테르를 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양 방법은 배양물 내로 기체의 주입을 포함할 수 있다. 상기 기체는 배양물의 호기 상태를 유지하기 위한 어떤 기체도 포함할 수 있다. 상기 기체는 산소 또는 산소 함유 기 체일 수 있다. 상기 산소 함유 기체는 공기를 포함한다. 상기 배양에 있어서, 배양물의 온도는 20 내지 45℃, 예를 들면, 22 내지 42℃, 또는 25 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 원하는 트립토판 대사체의 생성량을 획득할 때까지 지속될 수 있다.
상기 방법에서, 배양액으로부터 트립토판 대사체를 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.
생산된 트립토판 대사체는 예를 들면, 배양액을 황산 또는 염산 처리한 후에 음이온 교환 크로마토그래피, 농축, 정석, 등전점 침전 등의 공정을 병용하여 배양물로부터 회수될 수 있다.
다른 양상은 다중약물 수송체 A(Multidrug efflux system subunit A: MdtA)의 활성을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 도입하는 단계를 포함하는 트립토판 대사체 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법을 제공한다.
일 양상에 따른 재조합 미생물에 의하면, 트립토판 대사체를 고효율로 생산하는데 사용할 수 있다.
다른 양상에 따른 목적산물을 제조하는 방법에 의하면, 목적산물인 트립토판 대사체를 효율적으로 생산할 수 있다.
다른 양상에 따른 트립토판 대사체 생산능이 증가된 미생물을 제조하는 방법에 의하면, 트립토판 대사체 생산능이 증가된 미생물을 효율적으로 제조할 수 있다.
다중약물 수송체의 활성을 증가시키는 유전적 변형을 포함하는 재조합 미생물, 및 그를 이용한 트립토판 대사체를 생산하는 방법은 트립토판 대사체의 대량 생산을 가능하게 할 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 방법으로 제작된 mdtA 유전자 과발현 벡터인 pCC1BAC-Ptrc-MdtA의 모식도이다.
도 2는 일 양상에 따른 방법으로 제작된 mdtA 유전자 과발현 벡터인 pCL-Ptrc-MdtA의 모식도이다.
도 2는 일 양상에 따른 방법으로 제작된 mdtA 유전자 과발현 벡터인 pCL-Ptrc-MdtA의 모식도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터의 제작
실시예 1-1. 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 갖는 균주의 제작을 위한 비올라세인 생합성 유전자 클러스터
vioABCDE
과발현 벡터의 제작
비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터를 제작하기 위하여 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum) ATCC 12472 유래의 게놈 DNA로부터 비올라세인 생합성 유전자 클러스터인 vioABCDE를 증폭하였다.
구체적으로, 5' 말단 영역에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 8)와 3' 말단 영역에 BamHⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 9)를 합성하고, 이 프라이머 쌍을 프라이머로 하고 크로모박테리움 비올라세움 ATCC 12472 유래의 게놈 DNA를 주형으로 한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 vioABCDE(서열번호 10)를 증폭하였다. PCR 조건은 94℃에서 5 분간 변성 후, 94℃ 30 초 변성, 60℃ 30 초 어닐링, 72℃ 10 분 중합을 30 회 반복한 후, 72℃에서 7 분간 중합반응을 수행하였다. 또한 강한 프로모터로서, 5' 말단에 KpnⅠ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 11)를 합성하였다.
상기와 같이 PCR로 증폭된 vioABCDE 유전자 클러스터 단편을 제한효소 NdeⅠ와 BamHⅠ으로 절단하고, 상기 합성된 trc 프로모터 단편을 제한효소 KpnⅠ과 NdeⅠ로 절단하여 각각의 DNA 절편을 획득하였다. 이를 제한효소 KpnⅠ과 BamHⅠ 말단을 가지는 과발현 벡터 pECCG117(Biotechnology letters vol. 13, No.10, p.721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 카나마이신이 25 ㎎/L로 포함된 LB(Luria Bertani, 리터 당 트립톤 10 g, 효모추출물 5 g, NaCl 10 g, Agar 12 g, pH 7.0) 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16 시간 동안 배양하여 콜로니가 형성되는 것을 확인하였다.
PCR을 통해 목적한 유전자 클러스터가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하기 전, 이미 형질전환된 대장균 DH5α의 콜로니 색상이 대부분 보라색을 띠는 것을 확인하였다. 각각의 형질전환된 대장균 DH5α로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 보라색 콜로니로부터 분리된 플라스미드를 pECCG117-Ptrc-vioABCDE로 명명하였다.
실시예 1-2. 디옥시비올라세인 생산능을 갖는 균주의 제작을 위한 비올라세인 생합성 유전자 클러스터
vioABCE
과발현 벡터의 제작
디옥시비올라세인 생산능을 갖는 균주의 제작을 위한 vioABCE 과발현 벡터를 제작하기 위하여, 크로모박테리움 비올라세움 ATCC 12472 유래의 게놈 DNA로부터 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 중 vioD를 제외한 vioABC 및 vioE를 증폭하였다.
구체적으로, 유전자 vioABC를 증폭하기 위하여, 5' 말단 영역에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 8)와 3' 말단 영역에 NheⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 12)를 합성하고, 이 프라이머 쌍을 프라이머로 한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 상기 유전자에 대한 강한 프로모터로서, 5' 말단에 KpnⅠ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 13)를 합성하였다.
또한, 유전자 vioE를 증폭하기 위하여, 5' 말단 영역에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 14)와 3' 말단 영역에 BamHⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 15)를 합성하고, 이 프라이머 쌍을 프라이머로 한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 상기 유전자에 대한 강한 프로모터로서, 5' 말단에 NheⅠ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 16)를 합성하였다.
상기와 같이 PCR로 증폭된 vioABC 유전자를 제한효소 NdeⅠ과 NheⅠ으로 절단하고, vioE 유전자를 제한효소 NdeⅠ와 BamHⅠ으로 절단하였다. 또한, 상기 합성된 trc 프로모터 단편(서열번호 13)을 제한효소 KpnⅠ과 NdeⅠ으로 절단하고, trc 프로모터 단편(서열번호 16)을 제한효소 NheⅠ과 NdeⅠ으로 절단하여 각각의 DNA 절편을 획득하였다. 이를 제한효소 KpnⅠ과 BamHⅠ 말단을 가지는 과발현 벡터 pECCG117(Biotechnology letters vol 13, No.10, p.721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)에 trc-vioABC-trc-vioE 순서로 연결하여 대장균 DH5α에 형질전환한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양하여 플라스미드를 획득하였다. 형질전환된 대장균 DH5α의 콜로니 색상은 대부분 남색을 띠는 것을 확인하였으며, 남색 콜로니로부터 분리된 플라스미드를 pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE로 명명하였다.
실시예 2. 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터를 도입한 균주의 제작
상기 실시예 1에서 제조한 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터 pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE를 각각 공지된 방법에 따라 대장균 W3110 균주에 형질전환하고, 카나마이신이 25 ㎎/L로 포함된 LB 배지에서의 생장여부를 통해 형질전환을 확인하였다. 최종적으로 제작된 균주를 각각 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE로 명명하였다.
실험예 1. 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터를 도입한 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능 평가
상기 실시예 2에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 카나마이신이 25 ㎎/L의 농도로 포함된 역가 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 1 백금이씩 접종하고, 37℃에서 30 시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 역가 배지의 조성은 포도당 40g/L, 탄산칼슘 30g/L, 황산 암모늄 10g/L, 일인산칼륨 1g/L, 황산마그네슘 1.5g/L, 및 효모엑기스 4g/L이다. 비올라세인 및 디옥시비올라세인을 정량하기 위하여 각 세포가 포함된 배양물을 에탄올에 30배 희석하여 1 시간 동안 진탕 추출하고 13,000 rpm에서 5 분간 원심분리한 후 상층액을 HPLC로 분석하였다. 이 결과를 표 1에 나타내었다.
균주명 | OD (660 ㎚ 흡광) |
비올라세인 (배양액 리터당 ㎎) |
디옥시비올라세인 (배양액 리터당 ㎎) |
W3110 | 15.8 | 0 | 0 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE | 29.7 | 521.2 | 78.1 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE | 32.1 | 0 | 617.4 |
상기 표 1에 나타낸 것과 같이, 야생형 대장균 W3110 균주는 비올라세인 및 디옥시비올라세인을 전혀 생산하지 못하였으나, 대장균 W3110 균주에 pECCG117-Ptrc-vioABCDE를 형질전환한 경우 비올라세인과 디옥시비올라세인이 약 8:2의 비율로 생산되는 것을 확인하였으며, pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE를 형질전환한 경우 디옥시비올라세인만 생산되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3.
mdtA
유전자 과발현 벡터 (1)의 제작
다중약물 수송체 Mdt를 구성하는 폴리펩티드 중 대표적인 폴리펩티드인 MdtA의 활성을 강화하고자 하는 목적으로, 대장균 W3110 게놈 DNA를 이용하여 MdtA를 코딩하는 유전자 mdtA를 증폭하고, mdtA 유전자 과발현 벡터 pCC1BAC-Ptrc-MdtA를 제작하였다.
구체적으로, mdtA를 증폭하기 위하여 5' 말단 영역에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 17)와 3' 말단 영역에 BamHⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 18)를 합성하고, 이 프라이머 쌍을 프라이머로 하고 Escherichia coli K-12 W3110 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR을 통해 mdtA(서열번호 19)를 증폭하였다. PCR은 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 조건으로 수행하였다. 또한 강한 프로모터로서, 5' 말단에 EcoRⅠ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 20)를 합성하였다.
상기와 같이 PCR로 증폭된 mdtA 유전자 단편을 제한효소 NdeⅠ과 BamHⅠ으로 절단하고, 상기 합성된 trc 프로모터 단편을 제한효소 EcoRⅠ과 NdeⅠ으로 절단하여 각각의 DNA 절편을 획득하였다. 이를 제한효소 EcoRⅠ과 BamHⅠ 말단을 가지는 벡터 pCC1BAC(GenBank No. EU140750.1)에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 클로람페니콜이 25 ㎎/L로 포함된 LB 고체배지에 도말한 것을 제외하고는 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양하여 콜로니 형성을 확인하였다.
PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하여 각각의 형질전환된 대장균 DH5α로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pCC1BAC-Ptrc-MdtA로 명명하였다.
실시예 4.
mdtA
유전자 과발현 벡터 (1)이 도입된 균주의 제작
상기 실시예 3에서 제조한 mdtA 과발현 벡터 pCC1BAC-Ptrc-MdtA를 실시예 2에서 제작된 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산 균주 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE에 공지된 방법으로 각각 형질전환 하였고, 제작된 균주를 각각 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCC1BAC-Ptrc-MdtA 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCC1BAC-Ptrc-MdtA로 명명하였다.
항생제에 대한 영향성을 최소화하여 비교하고자, 공벡터 pCC1BAC 또한 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE 균주에 각각 형질전환하여 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCC1BAC 및 pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCC1BAC로 명명하고 대조군으로 사용하였다. 벡터가 형질전환될 경우 카나마이신과 클로람페니콜 내성을 모두 가지게 되므로 카나마이신과 클로람페니콜이 각각 25 ㎎/L로 포함된 LB 배지에서의 생장여부를 통해 형질 전환을 확인하였다.
실험예 2.
mdtA
유전자 과발현 벡터 (1)이 도입된 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능 평가
상기 실시예 4에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 카나마이신과 클로람페니콜이 각각 25 ㎎/L의 농도로 포함된 역가 배지를 사용하고, 실시예 4에서 제조한 균주들을 접종한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하여 그 결과를 표 2에 나타내었다.
균주명 | OD (660 ㎚ 흡광) |
비올라세인 (배양액 리터당 ㎎) |
디옥시비올라세인 (배양액 리터당 ㎎) |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCC1BAC | 32.4 | 558.5 | 105.7 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCC1BAC | 35.6 | 0.0 | 640.2 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCC1BAC-Ptrc-MdtA | 33.8 | 619.4 | 120.5 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCC1BAC-Ptrc-MdtA | 34.0 | 0.0 | 755.4 |
상기 표 2에 나타낸 것과 같이, mdtA 유전자 과발현 벡터 (1)이 도입된 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 각각의 대조군과 비교하였을 때, 비올라세인 생산능은 대조군 대비 약 11% 증가하였고, 디옥시비올라세인 생산능은 대조군 대비 약 14 내지 18% 증가하였다.
실시예 5.
mdtA
유전자 과발현 벡터 (2)의 제작
다중약물 수송체 Mdt를 구성하는 폴리펩티드 중 대표적인 폴리펩티드인 MdtA의 활성을 강화하고자 하는 목적으로, 상기 실시예 3에서 제작한 mdtA 유전자 과발현 벡터에 비하여 보다 많은 카피 수로 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터를 이용하여 mdtA 유전자 과발현 벡터 pCL-Ptrc-MdtA를 제작하였다.
구체적으로, mdtA를 증폭하기 위하여 5' 말단 영역에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 21)와 3' 말단 영역에 BamHⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 22)를 합성하고, 이 프라이머 쌍을 프라이머로 하고 Escherichia coli K-12 W3110 게놈 DNA를 주형으로 한 PCR을 통해 mdtA(서열번호 23)를 증폭하였다. PCR은 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 조건으로 수행하였다. 또한 강한 프로모터로서, 5' 말단에 Hind Ⅲ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 24)를 합성하였다.
상기와 같이 PCR로 증폭된 mdtA 단편을 제한효소 NdeⅠ과 BamHⅠ으로 절단하고, 상기 합성된 trc 프로모터 단편을 제한효소 Hind Ⅲ와 NdeⅠ으로 절단하여 각각의 DNA 절편을 획득하였다. 이를 제한효소 Hind Ⅲ와 BamHⅠ 말단을 가지는 벡터 pCL1920(GenBank No. AB236930)에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 스펙티노마이신이 25 ㎎/L로 포함된 LB 고체배지에 도말한 것을 제외하고는 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양하여 콜로니 형성을 확인하였다.
PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하여 각각의 형질전환된 대장균 DH5α로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pCL-Ptrc-MdtA로 명명하였다.
실시예 6.
mdtA
유전자 과발현 벡터 (2)가 도입된 균주의 제작
상기 실시예 5에서 제조한 mdtA 과발현 벡터 pCL-Ptrc-MdtA를 실시예 2에서 제작된 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산 균주 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE에 공지된 방법으로 각각 형질전환 하였고, 제작된 균주를 각각 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-Ptrc-MdtA 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-Ptrc-MdtA로 명명하였다.
항생제에 대한 영향성을 최소화하여 비교하고자, 공벡터 pCL1920 또한 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE 균주에 각각 형질전환하여 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL1920 및 pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL1920으로 명명하고 대조군으로 사용하였다. 벡터가 형질전환될 경우 카나마이신과 스펙티노마이신 내성을 모두 가지게 되므로 카나마이신과 스펙티노마이신이 각각 25 ㎎/L로 포함된 LB 배지에서의 생장여부를 통해 형질 전환을 확인하였다.
실험예 3:
mdtA
유전자 과발현 벡터 (2)가 도입된 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능 평가
상기 실시예 6에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 카나마이신과 스펙티노마이신이 각각 25 ㎎/L의 농도로 포함된 역가 배지를 사용하고, 실시예 6에서 제조한 균주들을 접종한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하여 그 결과를 표 3에 나타내었다.
균주명 | OD (660 ㎚ 흡광) |
비올라세인 (배양액 리터당 ㎎) |
디옥시비올라세인 (배양액 리터당 ㎎) |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL1920 | 30.8 | 614.4 | 116.3 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL1920 | 33.8 | 0.0 | 650.0 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/ pCL-Ptrc-MdtA | 40.6 | 767.9 | 153.5 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-Ptrc-MdtA | 40.8 | 0.0 | 864.5 |
상기 표 3에 나타낸 것과 같이, mdtA 유전자 과발현 벡터 (2)가 도입된 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 각각의 대조군과 비교하였을 때, 비올라세인 생산능은 대조군 대비 약 25% 증가하였고, 디옥시비올라세인 생산능은 대조군 대비 약 32 내지 33% 증가하였다. 상기 생산능 증가 효과가 실시예 4에서 제조한 균주들에 비하여 높은 것으로 보아, 균주에서 발현되는 mdtA 유전자의 카피 수 증가에 따라 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능이 더욱 증가된 것임을 알 수 있었다.
실시예 7.
mdtA
유전자의 프로모터를 강한 프로모터로 치환한 균주의 제작
실시예 7-1. 프로모터 치환을 위한 DNA 단편 제작
mdtA 유전자의 프로모터를 보다 강한 프로모터로 치환하여 mdtA 발현을 강화하기 위해, mdtA 자가프로모터 좌에 trc 프로모터를 유전자 재조합효소(recombinase)를 이용하여 치환하기 위한 DNA 단편을 준비하였다.
구체적으로, 염색체 내부로의 trc 프로모터 삽입을 확인하기 위한 선별 마커로 클로람페니콜에 저항성을 부여하는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(chloramphenicol acetyltransferase) 유전자를 이용하였으며, 이를 위해 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제 유전자를 포함하는 pUCprmfmloxC 벡터(대한민국 공개특허 제2009-0075549호)를 이용하였다. 5' 말단에 KpnⅠ 제한효소 부위를 삽입하고, 3' 말단에 EcoRV 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 25)를 합성하고, 이를 제한효소 KpnⅠ 및 EcoRⅤ로 처리하여 DNA 절편을 획득하였다. 이를 제한효소 KpnⅠ과 SmaⅠ 말단을 가지는 pUCprmfmloxC 벡터에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하였다. 형질전환된 대장균을 클로람페니콜이 25 ㎎/L로 포함된 LB 고체배지에 도말한 것을 제외하고는 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양하여 콜로니 형성을 확인하고, PCR로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, 플라스미드를 획득하여 pmlox-Cm-Ptrc로 명명하였다.
mdtA 유전자의 자가프로모터 좌에 삽입하기 위한 trc 프로모터 단편을 증폭하기 위하여 서열번호 26 및 27의 프라이머를 합성하였고, 이 프라이머 쌍을 이용하여 상기 제작한 pmlox-Cm-Ptrc 플라스미드를 주형으로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 5 분간 변성 후, 94℃ 30 초 변성, 55℃ 30 초 어닐링, 72℃ 2 분 중합을 30 회 반복한 후, 72℃에서 5 분간 중합반응을 수행하였다. 상기 PCR로 증폭된 DNA 단편을 Cm-Ptrc-mdtA로 명명하였으며 그 염기서열을 서열번호 28에 나타내었다.
실시예 7-2.
mdtA
유전자의 프로모터를 강한 프로모터로 치환한 균주의 제작
상기 제조한 Cm-Ptrc-mdtA 및 유전자재조합효소를 이용하여 mdtA 유전자의 자가프로모터가 trc 프로모터로 치환된 균주를 제작하였다.
구체적으로, 람다 레드 재조합효소(lamda Red recombinase)를 이용한 1단계 유전자 불활성화 기법(one-step inactivation)을 응용하였다(Datsenko et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97:6640-45). 람다 레드 재조합효소를 발현하는 벡터인 pKD46 플라스미드를 실시예 2에서 제작된 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산 균주 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE에 각각 형질 전환하고, 암피실린이 25 ㎎/L로 포함된 LB 배지에서의 생장여부를 통해 형질전환된 균주를 선별하였다. 선별한 균주에서 람다 레드 재조합효소의 발현을 유도하기 위하여 5 mM의 아라비노즈(arabinose)를 포함한 20 ㎖의 LB 배지에서 각 균주들을 배양하였다. 균체의 양이 5 x 108 cells/㎖로 자랐을 때 원심분리하여 균체를 회수하고 이를 차가운 10% 글리세롤(glycerol) 용액으로 3회 세척하였다.
상기 각 균주에 전기천공법(electroporation)을 이용하여 DNA 단편 Cm-Ptrc-mdtA를 도입하였다. 상기 DNA 단편은 5' 및 3' 말단에 각각 mdtA 유전자의 자가프로모터 좌 주변의 염기서열과 같은 서열을 80 bp 포함하는 단편조각이므로, 람다 레드 재조합효소에 의해 mdtA 자가프로모터 좌에서 유전자 재조합이 일어나 클로람페니콜 저항성 유전자와 trc 프로모터가 mdtA 자가프로모터 좌에 치환될 수 있다. 유전자 재조합이 일어난 균주는 클로람페니콜 내성을 가지게 되므로 클로람페니콜이 25 ㎎/L로 포함된 LB 배지에서의 생장여부를 통해 선별하였다. 선별한 균주에서 서열번호 29 및 30의 프라이머를 이용한 PCR을 통해서 mdtA 유전자의 자가프로모터 좌에 Cm-Ptrc-mdtA 단편이 삽입된 것을 확인하였다. PCR 조건은 94℃에서 5 분간 변성 후, 94℃ 30 초 변성, 55℃ 30 초 어닐링, 72℃ 2 분 중합을 30 회 반복한 후, 72℃에서 5 분간 중합반응을 수행하였다.
다음으로, pKD46 벡터는 온도에 민감한 복제기점(replication origin)을 가지고 있기 때문에, 상기 각 균주를 40℃ 이상에서 배양하여 균체 내에서 pKD46 벡터를 제거하였고, 이는 암피실린이 25 ㎎/L로 포함된 LB 배지에서 선별한 균주가 자라지 않는 것을 통해서 확인하였다. 이후, Cre 재조합효소(Cre-recombinase)를 이용하여 클로람페니콜에 대한 저항성을 나타내는 유전자를 제거하기 위하여 pJW168 플라스미드(Beatriz Palmeros et al., Gene, 247, 255-264, 2000)를 상기 각 균주에 도입하였다. 플라스미드 도입을 확인하고, Cre 재조합효소를 발현시키기 위하여 25 ㎎/L의 암피실린 및 이소프로필 1-티오-β-D-갈락토피라노시드(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)가 포함된 LB 고체배지에 각 균주를 도말하여 선별하였다. 선별된 균주에서 Cre 재조합효소에 의해 mloxP 위치에서 유전자 재조합이 일어나 클로람페니콜에 대한 저항성 유전자가 제거되었음을 서열번호 31 및 32의 프라이머를 이용한 PCR을 통해서 확인하였다.
상기 과정을 통하여 최종적으로 확인된 균주는 mdtA 유전자의 자가프로모터가 trc 프로모터로 치환된 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산 균주로, 각각 W3110/Ptrc-mdtA/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 W3110/Ptrc-mdtA/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE로 명명하였다.
실험예 4.
mdtA
유전자의 프로모터를 강한 프로모터로 치환한 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능 평가
상기 실시예 7에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 실시예 7에서 제조한 균주들을 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하여 그 결과를 표 4에 나타내었다. 대조군으로는, 상기 실시예 2에서 제작한 비올라세인 생합성 유전자 클러스터가 과발현된 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE 균주를 사용하였다.
균주명 | OD (660 ㎚ 흡광) |
비올라세인 (배양액 리터당 ㎎) |
디옥시비올라세인 (배양액 리터당 ㎎) |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE | 32.4 | 553.1 | 81.0 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE | 35.6 | 0.0 | 657.0 |
W3110/Ptrc-mdtA/pECCG117-Ptrc-vioABCDE | 32.5 | 647.2 | 95.6 |
W3110/Ptrc-mdtA/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE | 33.7 | 0.0 | 781.8 |
상기 표 4에 나타낸 것과 같이, mdtA 유전자의 프로모터가 강한 프로모터로 치환된 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 각각의 대조군과 비교하였을 때, 비올라세인 생산능은 대조군 대비 약 17% 증가하였고, 디옥시비올라세인 생산능은 대조군 대비 약 18 내지 19% 증가하였다.
따라서, 염색체 상의 mdtA가 과발현된 형질전환체 혹은 mdtA 자가프로모터가 trc 프로모터로 치환되어 mdtABCD 오페론의 발현이 강화된 형질전환체를 이용하여 비올라세인 또는 디옥시비올라세인을 생산할 경우, 생산능이 유의적으로 증가하는 것을 알 수 있다.
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> Microorganism including genetic modification that increases
activity of multidrug efflux transport system, and method for
preparing tryptophan metabolites using the same
<130> PN125470KR
<160> 32
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 415
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 1
Met Lys Gly Ser Tyr Lys Ser Arg Trp Val Ile Val Ile Val Val Val
1 5 10 15
Ile Ala Ala Ile Ala Ala Phe Trp Phe Trp Gln Gly Arg Asn Asp Ser
20 25 30
Arg Ser Ala Ala Pro Gly Ala Thr Lys Gln Ala Gln Gln Ser Pro Ala
35 40 45
Gly Gly Arg Arg Gly Met Arg Ser Gly Pro Leu Ala Pro Val Gln Ala
50 55 60
Ala Thr Ala Val Glu Gln Ala Val Pro Arg Tyr Leu Thr Gly Leu Gly
65 70 75 80
Thr Ile Thr Ala Ala Asn Thr Val Thr Val Arg Ser Arg Val Asp Gly
85 90 95
Gln Leu Ile Ala Leu His Phe Gln Glu Gly Gln Gln Val Lys Ala Gly
100 105 110
Asp Leu Leu Ala Glu Ile Asp Pro Ser Gln Phe Lys Val Ala Leu Ala
115 120 125
Gln Ala Gln Gly Gln Leu Ala Lys Asp Lys Ala Thr Leu Ala Asn Ala
130 135 140
Arg Arg Asp Leu Ala Arg Tyr Gln Gln Leu Ala Lys Thr Asn Leu Val
145 150 155 160
Ser Arg Gln Glu Leu Asp Ala Gln Gln Ala Leu Val Ser Glu Thr Glu
165 170 175
Gly Thr Ile Lys Ala Asp Glu Ala Ser Val Ala Ser Ala Gln Leu Gln
180 185 190
Leu Asp Trp Ser Arg Ile Thr Ala Pro Val Asp Gly Arg Val Gly Leu
195 200 205
Lys Gln Val Asp Val Gly Asn Gln Ile Ser Ser Gly Asp Thr Thr Gly
210 215 220
Ile Val Val Ile Thr Gln Thr His Pro Ile Asp Leu Val Phe Thr Leu
225 230 235 240
Pro Glu Ser Asp Ile Ala Thr Val Val Gln Ala Gln Lys Ala Gly Lys
245 250 255
Pro Leu Val Val Glu Ala Trp Asp Arg Thr Asn Ser Lys Lys Leu Ser
260 265 270
Glu Gly Thr Leu Leu Ser Leu Asp Asn Gln Ile Asp Ala Thr Thr Gly
275 280 285
Thr Ile Lys Val Lys Ala Arg Phe Asn Asn Gln Asp Asp Ala Leu Phe
290 295 300
Pro Asn Gln Phe Val Asn Ala Arg Met Leu Val Asp Thr Glu Gln Asn
305 310 315 320
Ala Val Val Ile Pro Thr Ala Ala Leu Gln Met Gly Asn Glu Gly His
325 330 335
Phe Val Trp Val Leu Asn Ser Glu Asn Lys Val Ser Lys His Leu Val
340 345 350
Thr Pro Gly Ile Gln Asp Ser Gln Lys Val Val Ile Arg Ala Gly Ile
355 360 365
Ser Ala Gly Asp Arg Val Val Thr Asp Gly Ile Asp Arg Leu Thr Glu
370 375 380
Gly Ala Lys Val Glu Val Val Glu Ala Gln Ser Ala Thr Thr Pro Glu
385 390 395 400
Glu Lys Ala Thr Ser Arg Glu Tyr Ala Lys Lys Gly Ala Arg Ser
405 410 415
<210> 2
<211> 1248
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
atgaaaggta gttataaatc ccgttgggta atcgtaatcg tggtggttat cgccgccatc 60
gccgcattct ggttctggca aggccgcaat gactcccgga gtgcagcccc aggggcgacg 120
aaacaagcgc agcaatcgcc agcgggtggt cgacgtggta tgcgttccgg cccattagcc 180
ccggttcagg cggcgaccgc cgtagaacag gcagttccgc gttacctcac cgggcttggc 240
accattaccg ccgctaatac cgttacggtg cgcagccgcg tggacggcca actgatagcg 300
ttacatttcc aggaaggcca gcaggtcaaa gcaggcgatt tactggcaga aattgacccc 360
agccagttca aagttgcatt agcacaagcc cagggccaac tggcaaaaga taaagccacg 420
cttgccaacg cccgccgtga cctggcgcgt tatcaacaac tggcaaaaac caatctcgtt 480
tcccgccagg agctggatgc ccaacaggcg ctggtcagtg aaaccgaagg caccattaag 540
gctgatgaag caagcgttgc cagcgcgcag ctgcaactcg actggagccg gattaccgca 600
ccagtcgatg gtcgcgttgg tctcaagcag gttgatgttg gtaaccaaat ctccagtggt 660
gataccaccg ggatcgtggt gatcacccag acgcatccta tcgatttagt ctttaccctg 720
ccggaaagcg atatcgctac cgtagtgcag gcgcagaaag ccggaaaacc gctggtggta 780
gaagcctggg atcgcaccaa ctcgaagaaa ttaagtgaag gcacgctgtt aagtctagat 840
aaccaaatcg atgccactac cggtacgatt aaagtgaaag cacgctttaa taatcaggat 900
gatgcgctgt ttcccaatca gtttgttaac gcgcgcatgt tagtcgacac cgaacaaaac 960
gccgtagtga tcccaacagc cgccctgcaa atgggcaatg aaggccattt tgtctgggtg 1020
ctgaatagcg aaaacaaggt cagcaaacat ctggtgacgc cgggcattca ggacagtcag 1080
aaagtggtga tccgtgcagg tatttctgcg ggcgatcgcg tggtgacaga cggcattgat 1140
cgcctgaccg aaggggcgaa agtggaagtg gtggaagccc agagcgccac tactccggaa 1200
gagaaagcca ccagccgcga atacgcgaaa aaaggagcac gctcctga 1248
<210> 3
<211> 418
<212> PRT
<213> Chromobacterium violaceum
<400> 3
Met Lys His Ser Ser Asp Ile Cys Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly
1 5 10 15
Leu Thr Cys Ala Ser His Leu Leu Asp Ser Pro Ala Cys Arg Gly Leu
20 25 30
Ser Leu Arg Ile Phe Asp Met Gln Gln Glu Ala Gly Gly Arg Ile Arg
35 40 45
Ser Lys Met Leu Asp Gly Lys Ala Ser Ile Glu Leu Gly Ala Gly Arg
50 55 60
Tyr Ser Pro Gln Leu His Pro His Phe Gln Ser Ala Met Gln His Tyr
65 70 75 80
Ser Gln Lys Ser Glu Val Tyr Pro Phe Thr Gln Leu Lys Phe Lys Ser
85 90 95
His Val Gln Gln Lys Leu Lys Arg Ala Met Asn Glu Leu Ser Pro Arg
100 105 110
Leu Lys Glu His Gly Lys Glu Ser Phe Leu Gln Phe Val Ser Arg Tyr
115 120 125
Gln Gly His Asp Ser Ala Val Gly Met Ile Arg Ser Met Gly Tyr Asp
130 135 140
Ala Leu Phe Leu Pro Asp Ile Ser Ala Glu Met Ala Tyr Asp Ile Val
145 150 155 160
Gly Lys His Pro Glu Ile Gln Ser Val Thr Asp Asn Asp Ala Asn Gln
165 170 175
Trp Phe Ala Ala Glu Thr Gly Phe Ala Gly Leu Ile Gln Gly Ile Lys
180 185 190
Ala Lys Val Lys Ala Ala Gly Ala Arg Phe Ser Leu Gly Tyr Arg Leu
195 200 205
Leu Ser Val Arg Thr Asp Gly Asp Gly Tyr Leu Leu Gln Leu Ala Gly
210 215 220
Asp Asp Gly Trp Lys Leu Glu His Arg Thr Arg His Leu Ile Leu Ala
225 230 235 240
Ile Pro Pro Ser Ala Met Ala Gly Leu Asn Val Asp Phe Pro Glu Ala
245 250 255
Trp Ser Gly Ala Arg Tyr Gly Ser Leu Pro Leu Phe Lys Gly Phe Leu
260 265 270
Thr Tyr Gly Glu Pro Trp Trp Leu Asp Tyr Lys Leu Asp Asp Gln Val
275 280 285
Leu Ile Val Asp Asn Pro Leu Arg Lys Ile Tyr Phe Lys Gly Asp Lys
290 295 300
Tyr Leu Phe Phe Tyr Thr Asp Ser Glu Met Ala Asn Tyr Trp Arg Gly
305 310 315 320
Cys Val Ala Glu Gly Glu Asp Gly Tyr Leu Glu Gln Ile Arg Thr His
325 330 335
Leu Ala Ser Ala Leu Gly Ile Val Arg Glu Arg Ile Pro Gln Pro Leu
340 345 350
Ala His Val His Lys Tyr Trp Ala His Gly Val Glu Phe Cys Arg Asp
355 360 365
Ser Asp Ile Asp His Pro Ser Ala Leu Ser His Arg Asp Ser Gly Ile
370 375 380
Ile Ala Cys Ser Asp Ala Tyr Thr Glu His Cys Gly Trp Met Glu Gly
385 390 395 400
Gly Leu Leu Ser Ala Arg Glu Ala Ser Arg Leu Leu Leu Gln Arg Ile
405 410 415
Ala Ala
<210> 4
<211> 998
<212> PRT
<213> Chromobacterium violaceum
<400> 4
Met Ser Ile Leu Asp Phe Pro Arg Ile His Phe Arg Gly Trp Ala Arg
1 5 10 15
Val Asn Ala Pro Thr Ala Asn Arg Asp Pro His Gly His Ile Asp Met
20 25 30
Ala Ser Asn Thr Val Ala Met Ala Gly Glu Pro Phe Asp Leu Ala Arg
35 40 45
His Pro Thr Glu Phe His Arg His Leu Arg Ser Leu Gly Pro Arg Phe
50 55 60
Gly Leu Asp Gly Arg Ala Asp Pro Glu Gly Pro Phe Ser Leu Ala Glu
65 70 75 80
Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Asn Asn His Phe Ser Trp Glu Ser Ala Thr
85 90 95
Val Ser His Val Gln Trp Asp Gly Gly Glu Ala Asp Arg Gly Asp Gly
100 105 110
Leu Val Gly Ala Arg Leu Ala Leu Trp Gly His Tyr Asn Asp Tyr Leu
115 120 125
Arg Thr Thr Phe Asn Arg Ala Arg Trp Val Asp Ser Asp Pro Thr Arg
130 135 140
Arg Asp Ala Ala Gln Ile Tyr Ala Gly Gln Phe Thr Ile Ser Pro Ala
145 150 155 160
Gly Ala Gly Pro Gly Thr Pro Trp Leu Phe Thr Ala Asp Ile Asp Asp
165 170 175
Ser His Gly Ala Arg Trp Thr Arg Gly Gly His Ile Ala Glu Arg Gly
180 185 190
Gly His Phe Leu Asp Glu Glu Phe Gly Leu Ala Arg Leu Phe Gln Phe
195 200 205
Ser Val Pro Lys Asp His Pro His Phe Leu Phe His Pro Gly Pro Phe
210 215 220
Asp Ser Glu Ala Trp Arg Arg Leu Gln Leu Ala Leu Glu Asp Asp Asp
225 230 235 240
Val Leu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Ala Leu Phe Asn Met Ser Thr Pro
245 250 255
Pro Gln Pro Asn Ser Pro Val Phe His Asp Met Val Gly Val Val Gly
260 265 270
Leu Trp Arg Arg Gly Glu Leu Ala Ser Tyr Pro Ala Gly Arg Leu Leu
275 280 285
Arg Pro Arg Gln Pro Gly Leu Gly Asp Leu Thr Leu Arg Val Ser Gly
290 295 300
Gly Arg Val Ala Leu Asn Leu Ala Cys Ala Ile Pro Phe Ser Thr Arg
305 310 315 320
Ala Ala Gln Pro Ser Ala Pro Asp Arg Leu Thr Pro Asp Leu Gly Ala
325 330 335
Lys Leu Pro Leu Gly Asp Leu Leu Leu Arg Asp Glu Asp Gly Ala Leu
340 345 350
Leu Ala Arg Val Pro Gln Ala Leu Tyr Gln Asp Tyr Trp Thr Asn His
355 360 365
Gly Ile Val Asp Leu Pro Leu Leu Arg Glu Pro Arg Gly Ser Leu Thr
370 375 380
Leu Ser Ser Glu Leu Ala Glu Trp Arg Glu Gln Asp Trp Val Thr Gln
385 390 395 400
Ser Asp Ala Ser Asn Leu Tyr Leu Glu Ala Pro Asp Arg Arg His Gly
405 410 415
Arg Phe Phe Pro Glu Ser Ile Ala Leu Arg Ser Tyr Phe Arg Gly Glu
420 425 430
Ala Arg Ala Arg Pro Asp Ile Pro His Arg Ile Glu Gly Met Gly Leu
435 440 445
Val Gly Val Glu Ser Arg Gln Asp Gly Asp Ala Ala Glu Trp Arg Leu
450 455 460
Thr Gly Leu Arg Pro Gly Pro Ala Arg Ile Val Leu Asp Asp Gly Ala
465 470 475 480
Glu Ala Ile Pro Leu Arg Val Leu Pro Asp Asp Trp Ala Leu Asp Asp
485 490 495
Ala Thr Val Glu Glu Val Asp Tyr Ala Phe Leu Tyr Arg His Val Met
500 505 510
Ala Tyr Tyr Glu Leu Val Tyr Pro Phe Met Ser Asp Lys Val Phe Ser
515 520 525
Leu Ala Asp Arg Cys Lys Cys Glu Thr Tyr Ala Arg Leu Met Trp Gln
530 535 540
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545 550 555 560
Arg Glu Leu Ser Ala Pro Lys Ala Arg Leu Phe Leu Lys Tyr Leu Ala
565 570 575
His Val Glu Gly Gln Ala Arg Leu Gln Ala Pro Pro Pro Ala Gly Pro
580 585 590
Ala Arg Ile Glu Ser Lys Ala Gln Leu Ala Ala Glu Leu Arg Lys Ala
595 600 605
Val Asp Leu Glu Leu Ser Val Met Leu Gln Tyr Leu Tyr Ala Ala Tyr
610 615 620
Ser Ile Pro Asn Tyr Ala Gln Gly Gln Gln Arg Val Arg Asp Gly Ala
625 630 635 640
Trp Thr Ala Glu Gln Leu Gln Leu Ala Cys Gly Ser Gly Asp Arg Arg
645 650 655
Arg Asp Gly Gly Ile Arg Ala Ala Leu Leu Glu Ile Ala His Glu Glu
660 665 670
Met Ile His Tyr Leu Val Val Asn Asn Leu Leu Met Ala Leu Gly Glu
675 680 685
Pro Phe Tyr Ala Gly Val Pro Leu Met Gly Glu Ala Ala Arg Gln Ala
690 695 700
Phe Gly Leu Asp Thr Glu Phe Ala Leu Glu Pro Phe Ser Glu Ser Thr
705 710 715 720
Leu Ala Arg Phe Val Arg Leu Glu Trp Pro His Phe Ile Pro Ala Pro
725 730 735
Gly Lys Ser Ile Ala Asp Cys Tyr Ala Ala Ile Arg Gln Ala Phe Leu
740 745 750
Asp Leu Pro Asp Leu Phe Gly Gly Glu Ala Gly Lys Arg Gly Gly Glu
755 760 765
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770 775 780
Gln Leu Glu Val Phe Asp Arg Asp Ser Ala Leu Phe Gly Ile Ala Phe
785 790 795 800
Val Thr Asp Gln Gly Glu Gly Gly Ala Leu Asp Ser Pro His Tyr Glu
805 810 815
His Ser His Phe Gln Arg Leu Arg Glu Met Ser Ala Arg Ile Met Ala
820 825 830
Gln Ser Ala Pro Phe Glu Pro Ala Leu Pro Ala Leu Arg Asn Pro Val
835 840 845
Leu Asp Glu Ser Pro Gly Cys Gln Arg Val Ala Asp Gly Arg Ala Arg
850 855 860
Ala Leu Met Ala Leu Tyr Gln Gly Val Tyr Glu Leu Met Phe Ala Met
865 870 875 880
Met Ala Gln His Phe Ala Val Lys Pro Leu Gly Ser Leu Arg Arg Ser
885 890 895
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Leu Ser Cys Ala Leu Met Asn Leu Pro Ser Gly Ile Ala Gly Arg Thr
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995
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<211> 429
<212> PRT
<213> Chromobacterium violaceum
<400> 5
Met Lys Arg Ala Ile Ile Val Gly Gly Gly Leu Ala Gly Gly Leu Thr
1 5 10 15
Ala Ile Tyr Leu Ala Lys Arg Gly Tyr Glu Val His Val Val Glu Lys
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Arg Gly Asp Pro Leu Arg Asp Leu Ser Ser Tyr Val Asp Val Val Ser
35 40 45
Ser Arg Ala Ile Gly Val Ser Met Thr Val Arg Gly Ile Lys Ser Val
50 55 60
Leu Ala Ala Gly Ile Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ala Cys Gly Glu Pro
65 70 75 80
Ile Val Ala Met Ala Phe Ser Val Gly Gly Gln Tyr Arg Met Arg Glu
85 90 95
Leu Lys Pro Leu Glu Asp Phe Arg Pro Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ala
100 105 110
Phe Gln Lys Leu Leu Asn Lys Tyr Ala Asn Leu Ala Gly Val Arg Tyr
115 120 125
Tyr Phe Glu His Lys Cys Leu Asp Val Asp Leu Asp Gly Lys Ser Val
130 135 140
Leu Ile Gln Gly Lys Asp Gly Gln Pro Gln Arg Leu Gln Gly Asp Met
145 150 155 160
Ile Ile Gly Ala Asp Gly Ala His Ser Ala Val Arg Gln Ala Met Gln
165 170 175
Ser Gly Leu Arg Arg Phe Glu Phe Gln Gln Thr Phe Phe Arg His Gly
180 185 190
Tyr Lys Thr Leu Val Leu Pro Asp Ala Gln Ala Leu Gly Tyr Arg Lys
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Asp Thr Leu Tyr Phe Phe Gly Met Asp Ser Gly Gly Leu Phe Ala Gly
210 215 220
Arg Ala Ala Thr Ile Pro Asp Gly Ser Val Ser Ile Ala Val Cys Leu
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Pro Tyr Ser Gly Ser Pro Ser Leu Thr Thr Thr Asp Glu Pro Thr Met
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Arg Ala Phe Phe Asp Arg Tyr Phe Gly Gly Leu Pro Arg Asp Ala Arg
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Asn Val Arg Ser Ser Thr Phe His Tyr Lys Gly Asn Val Leu Leu Leu
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Gly Asp Ala Ala His Ala Thr Ala Pro Phe Leu Gly Gln Gly Met Asn
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Met Ala Leu Glu Asp Ala Arg Thr Phe Val Glu Leu Leu Asp Arg His
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Gln Gly Asp Gln Asp Lys Ala Phe Pro Glu Phe Thr Glu Leu Arg Lys
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Val Gln Ala Asp Ala Met Gln Asp Met Ala Arg Ala Asn Tyr Asp Val
355 360 365
Leu Ser Cys Ser Asn Pro Ile Phe Phe Met Arg Ala Arg Tyr Thr Arg
370 375 380
Tyr Met His Ser Lys Phe Pro Gly Leu Tyr Pro Pro Asp Met Ala Glu
385 390 395 400
Lys Leu Tyr Phe Thr Ser Glu Pro Tyr Asp Arg Leu Gln Gln Ile Gln
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Arg Lys Gln Asn Val Trp Tyr Lys Ile Gly Arg Val Asn
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<211> 373
<212> PRT
<213> Chromobacterium violaceum
<400> 6
Met Lys Ile Leu Val Ile Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu Val Phe Ala
1 5 10 15
Ser Gln Leu Lys Gln Ala Arg Pro Leu Trp Ala Ile Asp Ile Val Glu
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Ile Ala Ile Arg Phe Glu Ser Pro Leu Leu Glu His Gly Glu Leu Pro
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Leu Ala Asp Tyr Asp Leu Val Val Leu Ala Asn Gly Val Asn His Lys
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Leu Val Phe Arg Thr His Gly Lys Asp Ile Phe Ile Ala His Ala Tyr
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Lys Tyr Ser Asp Thr Met Ser Thr Phe Ile Val Glu Cys Ser Glu Glu
195 200 205
Thr Tyr Ala Arg Ala Arg Leu Gly Glu Met Ser Glu Glu Ala Ser Ala
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Glu Tyr Val Ala Lys Val Phe Gln Ala Glu Leu Gly Gly His Gly Leu
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Asp Arg Cys His Asp Gly Lys Leu Val Leu Leu Gly Asp Ala Leu Gln
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Ser Gly His Phe Ser Ile Gly His Gly Thr Thr Met Ala Val Val Val
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Ala Gln Leu Leu Val Lys Ala Leu Cys Thr Glu Asp Gly Val Pro Ala
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Ala Leu Lys Arg Phe Glu Glu Arg Ala Leu Pro Leu Val Gln Leu Phe
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370
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<212> PRT
<213> Chromobacterium violaceum
<400> 7
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1 5 10 15
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130 135 140
Pro Ser Thr Leu Tyr Leu Asp Ala Ala Ser Gly Thr Pro Leu Arg Met
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Val Thr Gly Asp Glu Ala Ser Arg Ala Ser Leu Arg Asp Phe Pro Asn
165 170 175
Val Ser Glu Ala Glu Ile Pro Asp Ala Val Phe Ala Ala Lys Arg
180 185 190
<210> 8
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 1
<400> 8
taacaatttc acacaggaaa catatgaagc attcttcc 38
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<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 2
<400> 9
gctctagaac tagtggatcc ctagcgcttg gcggcgaaga 40
<210> 10
<211> 7368
<212> DNA
<213> Chromobacterium violaceum
<400> 10
taacaatttc acacaggaaa catatgaagc attcttccga tatctgcatt gtcggcgccg 60
gcatcagcgg cctgacctgc gccagccatc tgctcgactc gcccgcttgc cgcggcctgt 120
cgctgcgcat cttcgacatg cagcaggagg cgggcggccg catccgctcg aagatgctgg 180
atggcaaggc gtcgatagag ctgggcgcgg ggcgatactc cccgcagctg cacccgcatt 240
tccagagcgc gatgcagcat tacagccaga agagcgaggt gtatccgttc acccagctga 300
aattcaagag ccatgtccag cagaagctga agcgggcgat gaacgagttg tcgcccaggc 360
tgaaagagca tggcaaggaa tcctttctcc agttcgtcag ccgctaccag ggccatgaca 420
gcgcggtggg catgatccgc tccatgggct acgacgcgct gttcctgccc gacatctcgg 480
ccgagatggc ctacgacatc gtcggcaagc acccggaaat ccagagcgtg accgataacg 540
acgccaacca gtggttcgcg gcggaaacgg gctttgcggg cctgatccag ggcatcaagg 600
ccaaggtcaa ggctgccggc gcgcgcttca gcctgggtta ccggctgctg tcggtgagga 660
cggacggcga cggctacctg ctgcaactgg ccggcgacga cggctggaag ctggaacacc 720
ggacccgcca tctgatcctg gccattcctc cgtcggcgat ggccgggctc aatgtcgact 780
tccccgaggc gtggagcggc gcgcgctacg gctcgctgcc gctgttcaag ggtttcctca 840
cctacggcga gccatggtgg ctggactaca agctggacga ccaggtgctg atcgtcgaca 900
acccgctgcg caagatctac ttcaagggcg acaagtacct gttcttctac accgacagcg 960
agatggccaa ttactggcgc ggctgcgtgg ccgaaggaga ggacggctac ctggagcaga 1020
tccgcaccca tctggccagc gcgctgggca tcgttcgcga gcgcattccc cagcccctcg 1080
cccatgtgca caagtattgg gcgcatggcg tggagttctg ccgcgacagc gatatcgacc 1140
atccgtccgc gctcagccac cgcgacagcg gcatcatcgc ctgttcggac gcctacaccg 1200
agcactgcgg ctggatggag ggcggcctgc tcagcgcccg cgaagccagc cgtctgctgc 1260
tgcagcgcat cgccgcgtga acggtccggc cgccgcatcg cgtcgccgcc cggttccggg 1320
cggcgcttgt cagccatgac cgttcgggaa acacatgagc attctggatt ttccacgcat 1380
ccatttccgc ggctgggcgc gggtcaacgc gcccaccgcc aaccgcgatc cgcacggcca 1440
catcgacatg gccagcaata cggtggccat ggcaggcgaa ccgttcgacc tcgcgcgcca 1500
tccgaccgag ttccaccgcc acctgcggtc gctggggccg cgtttcggcc tggacggccg 1560
ggctgacccg gaagggccgt tcagcctggc cgagggctac aacgcggccg gcaacaacca 1620
tttctcctgg gagagcgcca ccgtcagcca cgtgcagtgg gatggcggcg aagcggaccg 1680
cggcgacggc ctggtcggcg ccaggctggc gctgtggggg cattacaacg attacctgcg 1740
caccaccttc aaccgcgcgc gctgggtgga cagcgacccc acccgccgcg acgcggcgca 1800
gatctacgcc gggcagttca cgatcagccc ggccggcgcc ggaccgggca cgccctggct 1860
gttcaccgcc gacatcgacg acagccacgg cgcgcgctgg acgcgcggcg gccacatcgc 1920
cgagcgcggc ggccatttcc tggacgagga gttcggcctg gcgcggctgt tccagttctc 1980
ggtgcccaaa gaccatccgc acttcctgtt ccacccgggg ccattcgatt ccgaagcctg 2040
gcgcaggctg cagctggcgc tggaggacga cgacgtgctc ggcctgacgg tgcagtacgc 2100
gctgttcaat atgtcgacgc cgccgcaacc caactcgccg gtgttccacg acatggtcgg 2160
cgtggtcggc ctgtggcggc gcggcgaact ggccagctac ccggccggcc ggctgctgcg 2220
tccgcgccag cccgggctgg gcgatctgac gctgcgcgta agcggcggcc gcgtggcgct 2280
gaatctggcc tgcgccattc cgttctccac ccgggcggcg cagccgtccg cgccggacag 2340
gctgacgccc gatctcgggg ccaagctgcc gttgggcgac ctgctgctgc gcgacgagga 2400
cggcgcgttg ctggcgcggg tgccgcaggc gctttaccag gattactgga cgaaccacgg 2460
catcgtcgac ctgccgctgc tgcgcgagcc caggggctcg ctgacgctgt ccagcgagct 2520
ggccgaatgg cgcgagcagg actgggtcac gcagtccgac gcctccaatc tttatttgga 2580
agcgccggac cgccgccacg gccgtttctt tccggaaagc atcgcgctgc gcagctattt 2640
ccgcggcgag gcccgcgcgc gcccggacat tccccaccgg atcgagggga tgggtctggt 2700
cggcgtggag tcgcgccagg acggcgatgc cgccgaatgg cggctgaccg gcctgcggcc 2760
cggcccggcg cgcatcgtgc tcgacgacgg cgcggaggcg atcccgctgc gggtgctgcc 2820
ggacgactgg gcgttggacg acgcgacggt ggaggaggtc gattacgcct tcctgtaccg 2880
gcacgtgatg gcctattacg agctggtcta cccgttcatg tccgacaagg tgttcagcct 2940
ggccgaccgc tgcaagtgcg agacctacgc caggctgatg tggcagatgt gcgatccgca 3000
gaaccggaac aagagctact acatgcccag cacccgcgag ctgtcggcgc ccaaggccag 3060
gctgttcctc aaatacctgg cccatgtcga gggccaggcc aggctgcagg cgccgccgcc 3120
ggccgggccg gcgcgcatcg agagcaaggc ccagctggcg gccgagctgc gcaaggcggt 3180
ggatctggag ttgtcggtga tgctgcagta cctgtacgcc gcctattcca ttcccaatta 3240
cgcccagggc cagcagcggg tgcgcgacgg cgcgtggacg gcggagcagc tgcagctggc 3300
ctgcggcagc ggcgaccggc gccgcgacgg cggcatccgc gccgcgctgc tggagatcgc 3360
ccacgaggag atgatccatt acctggtggt caacaacctg ctgatggcgc tgggcgagcc 3420
gttctacgcc ggcgtgccgc tgatgggcga ggcggcgcgg caggcgttcg gcctggacac 3480
cgaattcgcg ctggagccgt tctccgagtc gacgctggcg cgcttcgtcc ggctggaatg 3540
gccgcacttc atccctgcgc cgggcaaatc catcgccgac tgctacgccg ccatccgcca 3600
ggcctttctc gatctgcccg acctgttcgg cggcgaggcc ggcaagcgcg gcggcgagca 3660
ccacttgttc ctcaacgagc tgaccaaccg cgcccatccc ggctaccagc tggaggtgtt 3720
cgatcgcgac agcgcgctgt tcggcatcgc cttcgtcacc gaccagggcg agggcggggc 3780
gctggactcg ccgcattacg agcattcgca tttccagcgg ctgcgggaga tgtcggccag 3840
gatcatggcg cagtccgcgc cgttcgagcc ggcgttgccg gcgctgcgca acccggtgct 3900
ggacgagtcg ccgggctgcc agcgcgtggc ggacggacgg gcgcgcgcgc tgatggcgct 3960
gtaccagggc gtgtacgagc tgatgttcgc gatgatggcg cagcacttcg cggtcaagcc 4020
gctgggcagc ctcaggcgct cgcggctgat gaacgcggcg atcgacctga tgaccggcct 4080
gctcaggccg ctgtcctgcg cgctgatgaa cctgccgtcg ggcatcgccg gacgcaccgc 4140
cgggccgccg ctgccggggc cggtggatac ccgcagctac gacgactacg cgctgggctg 4200
ccggatgctg gcgcggcgct gcgagcgcct gctggagcag gcgtcgatgc tggagccggg 4260
ctggctgccc gacgcgcaaa tggaactgct ggatttctac cgccggcaga tgctggattt 4320
ggcttgtgga aagctttcta gagaggcctg aaatgaaaag agcaatcata gtcggaggcg 4380
ggctcgccgg cgggctgacc gccatctacc tggcgaagcg cggctacgag gtccacgtgg 4440
tggaaaagcg cggcgacccg ctgcgggacc tgtcttccta cgtggatgtg gtcagctcgc 4500
gggcgatagg cgtcagcatg accgtgcgcg gcatcaagtc ggtgctggcg gccggcattc 4560
cgcgcgcgga gctggacgcc tgcggcgaac ccatcgtggc gatggcgttt tccgtcggcg 4620
gccagtaccg gatgcgggag ctcaagccgc tggaggattt ccgcccgctg tcgctgaacc 4680
gcgcggcgtt tcagaagctg ctgaacaagt acgccaacct ggccggcgtc cgctactact 4740
tcgagcacaa gtgcctggac gtggatctgg acggcaagtc ggtgctgatc cagggcaagg 4800
acggccagcc gcagcgcttg cagggcgata tgatcatcgg cgccgacggc gcgcactcgg 4860
cggtgcggca ggcgatgcag agcgggttgc gccgcttcga attccagcag actttcttcc 4920
gccacggcta caagacgctg gtgctgccgg acgcgcaggc gctgggctac cgcaaggaca 4980
cgctgtattt cttcggcatg gactccggcg gcctgttcgc cggccgcgcc gccaccatcc 5040
cggacggcag cgtcagcatc gcggtctgcc tgccgtacag cggcagcccc agcctgacca 5100
ccaccgacga gccgacgatg cgcgcctttt tcgaccgtta cttcggcggc ctgccgcggg 5160
acgcgcgcga cgagatgctg cgccagttcc tggccaagcc cagcaacgac ctgatcaacg 5220
tccgttccag caccttccac tacaagggca atgtgctgct gctgggcgac gccgcccacg 5280
ccaccgcgcc tttcctcggc cagggcatga acatggcgct ggaggacgcg cgcaccttcg 5340
tcgagctgct ggaccgccac cagggcgacc aggacaaggc ctttcccgag ttcaccgagc 5400
tgcgcaaggt gcaggccgac gcgatgcagg acatggcgcg cgccaactac gacgtgctca 5460
gctgctccaa tcccatcttc ttcatgcggg cccgctacac ccgctacatg catagcaagt 5520
ttcccggcct ttacccgccg gacatggcgg agaagctgta cttcacgtcc gagccgtacg 5580
acagactgca gcagatccag agaaaacaga acgtttggta caagataggg agggtcaact 5640
gatgaagatt ctggtcatcg gcgcggggcc ggccggcctg gtgttcgcca gccaactgaa 5700
acaggcgcgt ccgctgtggg cgatagacat cgtcgaaaag aacgacgagc aggaagtgct 5760
gggctggggc gtggtgctgc ccggccggcc cggccagcat ccggccaatc cgctgtccta 5820
cctggacgcg ccggagaggc tgaatccgca gttcctggaa gacttcaagc tggtccacca 5880
caacgagccc agcctgatga gcaccggcgt gctgctgtgc ggcgtggagc gccgcggcct 5940
ggtgcacgcc ttgcgcgaca agtgccgctc gcagggcatc gccatccgct tcgaatcgcc 6000
gctgctggag catggcgagc tgccgctggc cgactacgac ctggtggtgc tggccaacgg 6060
cgtcaatcac aagaccgccc acttcaccga ggcgctggtg ccgcaggtgg actacggccg 6120
caacaagtac atctggtacg gcaccagcca gctgttcgac cagatgaacc tggtgttccg 6180
cacccacggc aaggacattt tcatcgccca cgcctacaag tactcggaca cgatgagcac 6240
cttcatcgtc gagtgcagcg aggagaccta tgcccgcgcc cgcctgggcg agatgtcgga 6300
agaggcgtcg gccgaatacg tcgccaaggt gttccaggcc gagctgggcg gccacggcct 6360
ggtgagccag cccggcctcg gctggcgcaa cttcatgacc ctgagccacg accgctgcca 6420
cgacggcaag ctggtgctgc tgggcgacgc gctgcagtcc ggccacttct ccatcggcca 6480
cggcaccacg atggcggtgg tggtggcgca gctgctggtg aaggcgctgt gcaccgagga 6540
cggcgtgccg gccgcgctga agcgcttcga ggagcgcgcg ctgccgctgg tccagctgtt 6600
ccgcggccat gccgacaaca gccgggtctg gttcgagacg gtggaggagc gcatgcacct 6660
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ggaagcgctg gcgcagaacc tgcgctacgc gctgcaacgc tgaggaggcc gcatggaaaa 6780
ccgggaaccg ccgctgctgc cggcgcgctg gagcagcgcc tatgtgtcgt actggagtcc 6840
gatgctgccg gatgaccagc tgacgtccgg ctactgctgg ttcgactacg agcgcgacat 6900
ctgtcggata gacggcctgt tcaatccctg gtcggagcgc gacaccggct accggctgtg 6960
gatgtccgag gtcggcaacg ccgccagcgg ccgcacctgg aagcagaagg tggcctatgg 7020
ccgcgagcgg accgccctgg gcgagcagct gtgcgagcgg ccgctggacg acgagaccgg 7080
cccgttcgcc gagctgttcc tgccgcgcga cgtgctgcgc cggctgggcg cccgccatat 7140
cggccgccgc gtggtgctgg gcagggaagc cgacggctgg cgctaccagc gtccgggcaa 7200
ggggccgtcc acgttgtacc tggacgccgc cagcggtacg ccgctgagga tggtgaccgg 7260
ggacgaggcg tcgcgcgcgt cgctgcgcga tttccccaac gtcagcgagg ccgagattcc 7320
cgacgccgtc ttcgccgcca agcgctaggg atccactagt tctagagc 7368
<210> 11
<211> 505
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> trc promoter 1
<400> 11
acaaaagctg ggtacccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca 60
gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc 120
ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 180
aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg taagttagcg cgaattgatc tggtttgaca 240
gcttatcatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 300
tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 360
gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 420
gctgttgaca attaatcatc cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 480
tcacacagga aacatatgaa gcatt 505
<210> 12
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 3
<400> 12
gcagcaagcg gctagctcag ttgaccctcc ctatct 36
<210> 13
<211> 510
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> trc promoter 2
<400> 13
acaaaagctg ggtacccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca 60
gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc 120
ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 180
aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg taagttagcg cgaattgatc tggtttgaca 240
gcttatcatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 300
tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 360
gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 420
gctgttgaca attaatcatc cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 480
tcacacagga aacatatgaa gcattcttcc 510
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 4
<400> 14
ttcacacagg aaacatatgg aaaaccggga accgcc 36
<210> 15
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 5
<400> 15
ctagaactag tggatcccta gcgcttggcg gcgaaga 37
<210> 16
<211> 525
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> trc promoter 3
<400> 16
agatagggag ggtcaactga gctagccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga 60
agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata 120
cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 180
cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg taagttagcg cgaattgatc 240
tggtttgaca gcttatcatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca 300
tcggaagctg tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag 360
gcgcactccc gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat 420
tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg 480
gataacaatt tcacacagga aacatatgga aaaccgggaa ccgcc 525
<210> 17
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 6
<400> 17
acacaggaaa catatgaaag gtagttataa atc 33
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 7
<400> 18
gtcgactcta gaggatcctc aggagcgtgc tccttttt 38
<210> 19
<211> 1279
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 19
acacaggaaa catatgaaag gtagttataa atcccgttgg gtaatcgtaa tcgtggtggt 60
tatcgccgcc atcgccgcat tctggttctg gcaaggccgc aatgactccc ggagtgcagc 120
cccaggggcg acgaaacaag cgcagcaatc gccagcgggt ggtcgacgtg gtatgcgttc 180
cggcccatta gccccggttc aggcggcgac cgccgtagaa caggcagttc cgcgttacct 240
caccgggctt ggcaccatta ccgccgctaa taccgttacg gtgcgcagcc gcgtggacgg 300
ccaactgata gcgttacatt tccaggaagg ccagcaggtc aaagcaggcg atttactggc 360
agaaattgac cccagccagt tcaaagttgc attagcacaa gcccagggcc aactggcaaa 420
agataaagcc acgcttgcca acgcccgccg tgacctggcg cgttatcaac aactggcaaa 480
aaccaatctc gtttcccgcc aggagctgga tgcccaacag gcgctggtca gtgaaaccga 540
aggcaccatt aaggctgatg aagcaagcgt tgccagcgcg cagctgcaac tcgactggag 600
ccggattacc gcaccagtcg atggtcgcgt tggtctcaag caggttgatg ttggtaacca 660
aatctccagt ggtgatacca ccgggatcgt ggtgatcacc cagacgcatc ctatcgattt 720
agtctttacc ctgccggaaa gcgatatcgc taccgtagtg caggcgcaga aagccggaaa 780
accgctggtg gtagaagcct gggatcgcac caactcgaag aaattaagtg aaggcacgct 840
gttaagtcta gataaccaaa tcgatgccac taccggtacg attaaagtga aagcacgctt 900
taataatcag gatgatgcgc tgtttcccaa tcagtttgtt aacgcgcgca tgttagtcga 960
caccgaacaa aacgccgtag tgatcccaac agccgccctg caaatgggca atgaaggcca 1020
ttttgtctgg gtgctgaata gcgaaaacaa ggtcagcaaa catctggtga cgccgggcat 1080
tcaggacagt cagaaagtgg tgatccgtgc aggtatttct gcgggcgatc gcgtggtgac 1140
agacggcatt gatcgcctga ccgaaggggc gaaagtggaa gtggtggaag cccagagcgc 1200
cactactccg gaagagaaag ccaccagccg cgaatacgcg aaaaaaggag cacgctcctg 1260
aggatcctct agagtcgac 1279
<210> 20
<211> 505
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> trc promoter 4
<400> 20
actatagggc gaattccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca 60
gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc 120
ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 180
aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg taagttagcg cgaattgatc tggtttgaca 240
gcttatcatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 300
tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 360
gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 420
gctgttgaca attaatcatc cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 480
tcacacagga aacatatgaa aggta 505
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 8
<400> 21
tttcacacag gaaacatatg aaaggtagtt ataaatc 37
<210> 22
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 9
<400> 22
agctcggtac ccggggatcc tcaggagcgt gctccttttt 40
<210> 23
<211> 1285
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 23
tttcacacag gaaacatatg aaaggtagtt ataaatcccg ttgggtaatc gtaatcgtgg 60
tggttatcgc cgccatcgcc gcattctggt tctggcaagg ccgcaatgac tcccggagtg 120
cagccccagg ggcgacgaaa caagcgcagc aatcgccagc gggtggtcga cgtggtatgc 180
gttccggccc attagccccg gttcaggcgg cgaccgccgt agaacaggca gttccgcgtt 240
acctcaccgg gcttggcacc attaccgccg ctaataccgt tacggtgcgc agccgcgtgg 300
acggccaact gatagcgtta catttccagg aaggccagca ggtcaaagca ggcgatttac 360
tggcagaaat tgaccccagc cagttcaaag ttgcattagc acaagcccag ggccaactgg 420
caaaagataa agccacgctt gccaacgccc gccgtgacct ggcgcgttat caacaactgg 480
caaaaaccaa tctcgtttcc cgccaggagc tggatgccca acaggcgctg gtcagtgaaa 540
ccgaaggcac cattaaggct gatgaagcaa gcgttgccag cgcgcagctg caactcgact 600
ggagccggat taccgcacca gtcgatggtc gcgttggtct caagcaggtt gatgttggta 660
accaaatctc cagtggtgat accaccggga tcgtggtgat cacccagacg catcctatcg 720
atttagtctt taccctgccg gaaagcgata tcgctaccgt agtgcaggcg cagaaagccg 780
gaaaaccgct ggtggtagaa gcctgggatc gcaccaactc gaagaaatta agtgaaggca 840
cgctgttaag tctagataac caaatcgatg ccactaccgg tacgattaaa gtgaaagcac 900
gctttaataa tcaggatgat gcgctgtttc ccaatcagtt tgttaacgcg cgcatgttag 960
tcgacaccga acaaaacgcc gtagtgatcc caacagccgc cctgcaaatg ggcaatgaag 1020
gccattttgt ctgggtgctg aatagcgaaa acaaggtcag caaacatctg gtgacgccgg 1080
gcattcagga cagtcagaaa gtggtgatcc gtgcaggtat ttctgcgggc gatcgcgtgg 1140
tgacagacgg cattgatcgc ctgaccgaag gggcgaaagt ggaagtggtg gaagcccaga 1200
gcgccactac tccggaagag aaagccacca gccgcgaata cgcgaaaaaa ggagcacgct 1260
cctgaggatc cccgggtacc gagct 1285
<210> 24
<211> 507
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> trc promoter 5
<400> 24
catgattacg ccaagcttcg cttgctgcaa ctctctcagg gccaggcggt gaagggcaat 60
cagctgttgc ccgtctcact ggtgaaaaga aaaaccaccc tggcgcccaa tacgcaaacc 120
gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg 180
gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtaagttag cgcgaattga tctggtttga 240
cagcttatca tcgactgcac ggtgcaccaa tgcttctggc gtcaggcagc catcggaagc 300
tgtggtatgg ctgtgcaggt cgtaaatcac tgcataattc gtgtcgctca aggcgcactc 360
ccgttctgga taatgttttt tgcgccgaca tcataacggt tctggcaaat attctgaaat 420
gagctgttga caattaatca tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa 480
tttcacacag gaaacatatg aaaggta 507
<210> 25
<211> 504
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> trc promoter 6
<400> 25
atatatatgg tacccgcttg ctgcaactct ctcagggcca ggcggtgaag ggcaatcagc 60
tgttgcccgt ctcactggtg aaaagaaaaa ccaccctggc gcccaatacg caaaccgcct 120
ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa 180
gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgta agttagcgcg aattgatctg gtttgacagc 240
ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc ggaagctgtg 300
gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc gcactcccgt 360
tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc tgaaatgagc 420
tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 480
acacaggaaa gatatcatat atat 504
<210> 26
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 10
<400> 26
atgacccttt ccttatttat ggccccttcc tcgggagggg ctttcccgtt tcagcgtccc 60
gctgaaatcg tcggcttacc aggtgacact atagaacgcg 100
<210> 27
<211> 97
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 11
<400> 27
tgccagaacc agaatgcggc gatggcggcg ataaccacca cgattacgat tacccaacgg 60
gatttataac tacctttcat ggtctgtttc ctgtgtg 97
<210> 28
<211> 1943
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cm-Ptrc-mdtA
<400> 28
atgacccttt ccttatttat ggccccttcc tcgggagggg ctttcccgtt tcagcgtccc 60
gctgaaatcg tcggcttacc aggtgacact atagaacgcg gccgccagct gaagctttac 120
cgttcgtata gcatacatta tacgaagtta tctgccctga accgacgacc gggtcgaatt 180
tgctttcgaa tttctgccat tcatccgctt attatcactt attcaggcgt agcaccaggc 240
gtttaagggc accaataact gccttaaaaa aattacgccc cgccctgcca ctcatcgcag 300
tactgttgta attcattaag cattctgccg acatggaagc catcacagac ggcatgatga 360
acctgaatcg ccagcggcat cagcaccttg tcgccttgcg tataatattt gcccatggtg 420
aaaacggggg cgaagaagtt gtccatattg gccacgttta aatcaaaact ggtgaaactc 480
acccagggat tggctgagac gaaaaacata ttctcaataa accctttagg gaaataggcc 540
aggttttcac cgtaacacgc cacatcttgc gaatatatgt gtagaaactg ccggaaatcg 600
tcgtggtatt cactccagag cgatgaaaac gtttcagttt gctcatggaa aacggtgtaa 660
caagggtgaa cactatccca tatcaccagc tcaccgtctt tcattgccat acggaattcc 720
ggatgagcat tcatcaggcg ggcaagaatg tgaataaagg ccggataaaa cttgtgctta 780
tttttcttta cggtctttaa aaaggccgta atatccagct gaacggtctg gttataggta 840
cattgagcaa ctgactgaaa tgcctcaaaa tgttctttac gatgccattg ggatatatca 900
acggtggtat atccagtgat ttttttctcc attttagctt ccttagctcc tgaaaatctc 960
gataactcaa aaaatacgcc cggtagtgat cttatttcat tatggtgaaa gttggaacct 1020
cttacgtgcc gatcaacgtc tcattttcgc caaaagttgg cccagggctt cccggtatca 1080
acagggacac caggatttat ttattctgcg aagtgatctt ccgtcacagg tatttattcg 1140
gcgcaaagtg cgtcgggtga tgcataactt cgtatagcat acattatacg aacggtaccc 1200
atcagatcca ctagtcattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct 1260
cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 1320
cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattc gagctcggta 1380
ccgcttgctg caactctctc agggccaggc ggtgaagggc aatcagctgt tgcccgtctc 1440
actggtgaaa agaaaaacca ccctggcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt 1500
ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc 1560
gcaacgcaat taatgtaagt tagcgcgaat tgatctggtt tgacagctta tcatcgactg 1620
cacggtgcac caatgcttct ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggctgtgca 1680
ggtcgtaaat cactgcataa ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt 1740
ttttgcgccg acatcataac ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa 1800
tcatccggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 1860
accatgaaag gtagttataa atcccgttgg gtaatcgtaa tcgtggtggt tatcgccgcc 1920
atcgccgcat tctggttctg gca 1943
<210> 29
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 12
<400> 29
gcggggaagc ttatga 16
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 13
<400> 30
tgctgcgctt gtttcgt 17
<210> 31
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 14
<400> 31
gcggggaagc ttatga 16
<210> 32
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 15
<400> 32
tgctgcgctt gtttcgt 17
Claims (11)
- 다중약물 수송체 A(Multidrug efflux system subunit A: MdtA) 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형(genetic modification)을 포함하고, 비변형 균주에 비하여 트립토판 대사체의 생산능이 증가된, 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 트립토판 대사체는 인돌-3-아세트산(Indole-3-acetic acid), 인돌-3-피루브산(Indole-3-pyruvic acid: IPA), 인돌-3-피루브산 이민(Indole-3-pyruvic acid imine: IPA 이민), 인돌-3-카르발데히드(Indole-3-carbaldehyde), 인돌-3-카르복시산(Indol-3-carboxylic acid), 인돌-3-락트산(Indole-3-lactic acid), 5-히드록시트립토판(5-hydroxytryptophan), 6-히드록시트립토판(6-hydroxytryptophan), N-카르보벤즈옥시(Cbz)-데히드로트립토판(N-carbobenzoxy(Cbz)-dehydrotryptophan), 옥시비올라세인(oxyviolacein), 디옥시비올라세인(deoxyviolacein), 슈도비올라세인(pseudoviolacein), 슈도디옥시비올라세인(pseudodeoxyviolacein), 프로비올라세인(proviolacein), 프로디옥시비올라세인(prodeoxyviolacein), 프로토비올라세인산(protoviolaceinic acid), 프로토디옥시비올라세인산(protodeoxyviolaceinic acid), 크로모피롤산(chromopyrrolic acid: CPA), 아르시리아루빈 A(arcyriarubin A), 크로모아제피논 A(chromoazepinone A), 크로모아제피논 B(chromoazepinone B), 크로모아제피논 C(chromoazepinone C), 인디고(indigo), 크로모비리단스(chromoviridans), 디옥시크로모비리단스(deoxychromoviridans), 및 옥시크로모비리단스(oxychromoviridans)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물은 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자를 포함하는, 미생물.
- 제3항에 있어서, 상기 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자는 크로모박테리움(Chromobacterium) 속 유래인, 미생물.
- 제3항에 있어서, 상기 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자는 vioABCDE, 또는 vioABCE 유전자인, 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 다중약물 수송체 A는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 미생물.
- 제5항에 있어서, 상기 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자는, 서열번호 3 내지 7의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 것인, 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 다중약물 수송체 A 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키는 유전적 변형은,
1) 상기 다중약물 수송체 A를 코딩하는 유전자의 세포 내 카피수 증가,
2) 상기 다중약물 수송체 A를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 강한 활성을 갖는 발현 조절 서열로 교체하는 방법,
3) 상기 다중약물 수송체 A의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법,
4) 상기 다중약물 수송체 A의 발현이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형시키는 방법,
5) 상기 다중약물 수송체 A의 발현을 증가시키는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는
6) 상기 방법들의 조합을 포함하는, 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물은 에세리키아(Escherichia) 속에 속하는 것인 미생물.
- 제1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것인 미생물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 미생물을 배양하는 단계; 및
배지 또는 상기 미생물로부터 목적산물을 회수하는 단계를 포함하고,
상기 목적산물은 트립토판 대사체인, 목적산물을 제조하는 방법.
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