KR102404998B1 - 다중약물 유출펌프 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 변이체를 포함하는 미생물, 및 이를 이용하여 비올라세인 또는 디옥시비올라세인을 제조하는 방법 - Google Patents
다중약물 유출펌프 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 변이체를 포함하는 미생물, 및 이를 이용하여 비올라세인 또는 디옥시비올라세인을 제조하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
다중약물 유출펌프(multidrug efflux pump, mepA) 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 변이체를 포함하는 미생물, 및 이를 이용하여 비올라세인(violacein) 또는 디옥시비올라세인(deoxyviolacein)을 제조하는 방법에 관한 것으로, 비올라세인 또는 디옥시비올라세인의 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 출원은 다중약물 유출펌프(multidrug efflux pump, mepA) 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 변이체를 포함하는 미생물, 및 이를 이용하여 비올라세인(violacein) 또는 디옥시비올라세인(deoxyviolacein)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
비올라세인은 두 개의 L-트립토판(L-tryptophan) 분자의 융합(fusion)에 의해 발생되는 비스-인돌(bis-indole) 분자 화합물인 보라색 염료로, L-트립토판으로부터 5개의 폴리펩티드가 효소 작용을 하여 생합성된다. 이들 폴리펩티드를 코딩하고 있는 유전자들은 클러스터를 이루고 있어 vioABCDE로 표기하며, 이 유전자 클러스터는 VioA(L-tryptophan oxidase)를 코딩하는 유전자 vioA, VioB(N-[2-(carboxylatoamino)-1,2-bis(1H-indol-3-yl)ethyl]carbamate synthase)를 코딩하는 유전자 vioB, VioC(violacein synthase)를 코딩하는 유전자 vioC, VioD(protoviolaceinate synthase)를 코딩하는 유전자 vioD, 그리고 VioE를 코딩하는 유전자 vioE의 5개 유전자로 이루어져 있다(August PR et al., 2000, J Mol Microbiol Biotechnol. 2(4):513-519).
비올라세인과 유사한 구조를 갖는 디옥시비올라세인도 L-트립토판 분자의 융합에 의해 발생되는 비스-인돌 분자 화합물이며 고체 상태에서 비올라세인보다 남색을 띤다. 디옥시비올라세인은 상기 5개의 폴리펩티드 중 VioD를 제외한 4개의 폴리펩티드 VioA, VioB, VioC 및 VioE에 의해 생합성되며, 비올라세인 생합성 중에는 항상 특정 비율의 디옥시비올라세인이 함께 생합성되나, vioD가 변이 또는 결실되어 VioD 폴리펩티드의 활성이 제거되면 디옥시비올라세인만 생산될 수 있다.
비올라세인 및 디옥시비올라세인은 항암, 항궤양, 항균, 항진균, 항원생동물, 항바이러스 등 다양한 생리활성이 있어 그 양산 필요성 또한 증가하고 있다. 비올라세인 또는 디옥시비올라세인은 극성 유기 용매에 잘 용해되고 물에는 용해되지 않으며, 생산 균주의 세포 외부로 유출되지 못하는 특성이 있어 상기 화합물들을 생산하는 균주의 균체를 회수하여 극성 유기용매에 재현탁한 후 진탕하여 추출하는 방법이 주로 사용된다. 그러나, 비올라세인 또는 디옥시비올라세인의 세포 외부 유출에 관한 연구는 미미한 실정인 바, 이들 화합물의 세포 외부로의 유출 효율을 증가시켜 상기 화합물들을 상업적으로 양산하기 위한 새로운 방법을 개발할 필요가 있다.
본 출원은 mepA 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 mepA 변이체를 포함하는 재조합 미생물, 및 이를 이용하여 목적산물을 제조하는 방법을 제공한다.
일 양상은 서열번호 1의 N-말단으로부터 32번째 세린, 36번째 글리신, 39번째 아스파라긴, 59번째 루신, 62번째 페닐알라닌, 183번째 아스파르트산 및 288번째 루신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 치환(substitution)을 포함하고, 서열번호 1과 적어도 90% 및 100% 미만의 상동성을 갖는 다중약물 유출펌프(multidrug efflux pump, mepA) 변이체를 제공한다.
본 명세서에서 다중약물 유출펌프(mepA)는 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속 유래인 것일 수 있고, 예를 들면, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래일 수 있으나, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "다중약물 유출펌프(mepA) 변이체"란 상기 mepA 단백질의 아미노산 서열상 하나 또는 그 이상의 아미노산이 변이, 예를 들어, 치환된 단백질을 의미할 수 있다. 구체적으로, 상기 mepA 변이체는 mepA 단백질이 본 출원의 변이에 의해서 그 활성이 야생형(wild-type) 또는 변형 전과 비교하여 효율적으로 증가된 단백질일 수 있다. 본 출원에서 변이는 일반적으로 효소를 개량하기 위한 방법으로 당업계의 알려진 공지된 방법들이 제한없이 사용될 수 있으며, 이에는 합리적 설계(rational design)와 유도 진화(directed evolution) 등의 전략이 있다. 예를 들어, 합리적 설계 전략에는 특정 위치의 아미노산을 위치-지정 돌연변이도입(site-directed mutagenesis 또는 site-specific mutagenesis)하는 방법 등이 있고, 유도 진화 전략에는 무작위적 변이(random mutagenesis)를 일으키는 방법 등이 있다. 또한, 자연적인 돌연변이에 의해 외부의 조작 없이 돌연변이된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 mepA 변이체는 분리된 것이거나, 재조합 단백질일 수 있으며, 비자연적으로 발생된 것일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명할 수 있다. 예를 들어, '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'는, 이와 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'에 속할 수 있음은 자명할 수 있다. 따라서, 본 출원에서의 mepA 의 활성을 갖는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 또는 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 mepA 활성을 갖는 단백질에 해당됨은 당업자에게 자명할 수 있다.
상기 변형 전의 mepA는 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 mepA를 코딩하는 유전자는 서열번호 2 또는 3의 염기서열과 적어도 90%, 예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.
본 출원의 mepA 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 99% 이상, 및 100% 미만의 상동성을 갖는 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 mepA 변이체를 코딩하는 유전자는 서열번호 2 또는 3의 염기서열과 적어도 90% 및 100% 미만, 예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 99% 이상, 및 100% 미만의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다. 상기에서 용어 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "폴리뉴클레오티드"는 gDNA 및 cDNA와 같은 DNA 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하며, 폴리뉴클레오티드의 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 세포로부터 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 인위적으로 합성된 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 아미노산 치환은 상기 서열번호 1의 N-말단으로부터 32번째 세린의 메티오닌으로의 치환(S32M), 36번째 글리신의 아스파라긴으로의 치환(G36N), 39번째 아스파라긴의 아스파르트산으로의 치환(N39D), 59번째 루신의 페닐알라닌으로의 치환(L59F), 59번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L59M), 59번째 루신의 아스파라긴으로의 치환(L59N), 62번째 페닐알라닌의 메티오닌으로의 치환(F62M), 183번째 아스파르트산의 알라닌으로의 치환(D183A), 183번째 아스파르트산의 글루타메이트로의 치환(D183E), 183번째 아스파르트산의 루신으로의 치환(D183L) 및 288번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L288M)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 mepA 변이체는 서열번호 4 내지 14의 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열과 적어도 90%, 예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 아미노산 치환과 동시에 아미노산 서열 중 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우에도 본 출원의 mepA 변이체와 동일하거나 상응하는 활성을 나타낸다면 본 출원의 범주에 포함될 수 있다.
다른 양상은 상기 mepA 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 mepA 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속 유래인 것일 수 있고, 예를 들면, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래일 수 있다.
상기 mepA 변이체는 상기한 바와 같다. 예를 들어, 상기 mepA 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 32번째 세린의 메티오닌으로의 치환(S32M), 36번째 글리신의 아스파라긴으로의 치환(G36N), 39번째 아스파라긴의 아스파르트산으로의 치환(N39D), 59번째 루신의 페닐알라닌으로의 치환(L59F), 59번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L59M), 59번째 루신의 아스파라긴으로의 치환(L59N), 62번째 페닐알라닌의 메티오닌으로의 치환(F62M), 183번째 아스파르트산의 알라닌으로의 치환(D183A), 183번째 아스파르트산의 글루타메이트로의 치환(D183E), 183번째 아스파르트산의 루신으로의 치환(D183L) 및 288번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L288M)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 아미노산 치환을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 mepA 변이체는 서열번호 4 내지 14의 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열과 적어도 90%, 예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포인 재조합 미생물에 대하여 코돈 최적화된 것일 수 있다. 코돈 최적화란 동일한 아미노산을 코딩하지만 내재적 코돈 중 하나 이상이 해당 숙주에서 발현에 유리한 코돈으로 치환된 유전자를 생성하는 것을 나타낸다.
상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 서열번호 15 내지 25의 염기서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열과 적어도 90% 및 100% 미만, 예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
다른 양상은 mepA 변이체를 포함하는 재조합 미생물로서, 상기 mepA 변이체는, 서열번호 1의 N-말단으로부터 32번째 세린, 36번째 글리신, 39번째 아스파라긴, 59번째 루신, 62번째 페닐알라닌, 183번째 아스파르트산 및 288번째 루신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 치환(substitution)을 포함하고, 서열번호 1과 적어도 90% 및 100% 미만의 상동성을 갖는 것인, 미생물을 제공한다. 상기 재조합 미생물은 모균주에 비하여 비올라세인 생산능 및 디옥시비올라세인 생산능 중 하나 이상이 증가된 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 mepA 변이체를 포함함으로써 모균주에 비하여 비올라세인 생산능 및 디옥시비올라세인 생산능 중 하나 이상이 증가된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "모세포(parent cell)" 또는 "모균주(parent strain)"는 본래 세포(original cell), 예를 들면, 조작된 미생물에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "모세포"는 상기 특정 유전적 변형을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상황에 대하여는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 상기 모세포는 주어진 단백질, 예를 들면, mepA의 변이체와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 포함하는 유전적으로 조작된 미생물을 생산하는데 출발 물질(starting material)로 사용된 세포일 수 있다. 예를 들면, 상기 모균주 또는 비변형 균주는 야생형의 mepA를 포함하는 미생물일 수 있으며, 상기 미생물은 비올라세인 또는 디옥시비올라세인을 생산하는 미생물 일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "유전적 변형(genetic modification)"이란 세포의 유전물질의 구성 또는 구조를 인위적으로 변경시키는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "생산능(productivity)의 증가"는 목적산물의 생산량, 생산효율, 또는 생산성 등이 증가된 것을 의미할 수 있다. 상기 생산능의 증가는 상기 특정 유전적 변형을 갖지 않는 미생물이 갖는 생산능에 비하여, 증가된 것을 의미할 수 있다.
상기 mepA 변이체를 포함하는 재조합 미생물은 상기 mepA 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 미생물일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 도입은 형질전환, 형질도입(transfection), 전기천공(electroporation)과 같은 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 운반체를 통하여 도입되거나, 그 자체로서 도입될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "운반체"란 연결되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 특정한 유전자의 도입을 매개하는 뉴클레오티드 서열이라는 관점에서, 본 명세서에서 운반체는, 벡터, 핵산 구조체, 및 카세트와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 해석된다. 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터, 예를 들면, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스, 또는 그 조합이 포함될 수 있다. 구체적으로, 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 의해 작동 가능하게 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
상기 mepA 변이체를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 아미노산 치환은 상기 서열번호 1의 N-말단으로부터 32번째 세린의 메티오닌으로의 치환(S32M), 36번째 글리신의 아스파라긴으로의 치환(G36N), 39번째 아스파라긴의 아스파르트산으로의 치환(N39D), 59번째 루신의 페닐알라닌으로의 치환(L59F), 59번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L59M), 59번째 루신의 아스파라긴으로의 치환(L59N), 62번째 페닐알라닌의 메티오닌으로의 치환(F62M), 183번째 아스파르트산의 알라닌으로의 치환(D183A), 183번째 아스파르트산의 글루타메이트로의 치환(D183E), 183번째 아스파르트산의 루신으로의 치환(D183L) 및 288번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L288M)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 미생물은 에세리키아(Escherichia) 속, 예를 들면 대장균(Escherichia coli)일 수 있다. 일 구체예에서 상기 대장균은 W3110 균주일 수 있으나, 상기 유전적 변형에 의해 비올라세인 또는 디옥시비올라세인을 생산할 수 있는 미생물이라면 제한되지 않는다.
상기 미생물은 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자를 가지고 있는 것일 수 있다. 상기 미생물은 내인성 또는 외인성의 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자를 포함하고 있는 것일 수 있다. 상기 미생물이 내인성 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자를 가지고 있지 않는 것일 경우, 당업계에 공지된 분자생물학적 방법에 의해 상기 유전자를 갖도록 형질전환된 미생물일 수 있다.
상기 외인성 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자는 vioABCDE 유전자, 또는 vioABCDE 유전자 중 vioD 유전자가 변이 또는 결실된 vioABCD*E 또는 vioABCE 유전자일 수 있다. 일 구체예에서, 재조합 미생물은 유전자 클러스터 vioABCDE, vioABCD*E 또는 vioABCE의 활성이 강화된 유전적 변형을 포함하는 것에 의해 외인성 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 유전자 클러스터 vioABCDE, vioABCD*E 또는 vioABCE가 도입된 것, 예를 들면 벡터와 같은 비히클을 통하여 도입된 것일 수 있다. 상기 vioABCDE, vioABCD*E 또는 vioABCE는 크로모박테리움(Chromobacterium) 속, 예를 들면 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum) 유래일 수 있으나, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 제한이 없다. 일 구체예에서, 상기 크로모박테리움 비올라세움 유래 유전자 vioA, vioB, vioC, vioD 및 vioE에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 각각 서열번호 26 내지 30의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다. 상기 유전자 클러스터 vioABCDE, vioABCD*E 또는 vioABCE는 미생물에서 비올라세인 생합성에 관여하는 기능을 할 수 있다.
다른 양상은 상기 mepA 변이체를 포함하는 재조합 미생물을 미생물을 배양하는 단계; 및 배지 또는 상기 미생물로부터 목적산물을 회수하는 단계를 포함하고, 상기 목적산물은, 비올라세인, 디옥시비올라세인, 또는 이들의 조합인, 목적산물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법에서, mepA 변이체를 포함하는 재조합 미생물에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 미생물의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지 및 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양의 방법은 회분식, 연속식, 및 유가식 배양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양을 포함할 수 있다.
상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소 성분, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
상기 탄소원은 탄수화물, 지방, 지방산, 알코올, 유기산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소원일 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스, 및 이들의 조합일 수 있다. 상기 지방은 대두유, 해바라기유, 파자마유, 코코넛유, 및 이들의 조합일 수 있다. 상기 지방산은 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 알코올은 글리세롤 또는 에탄올일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산을 포함할 수 있다.
상기 질소원은 유기 질소원, 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 유기 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 대두밀, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 무기 질소원은 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄, 및 이들의 조 합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 배지는 인, 금속염, 아미노산, 비타민, 전구체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포 함할 수 있다. 상기 인의 공급원은 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 또는 이들에 상응하는 소듐-함유염을 포함 할 수 있다. 상기 금속염은 황산마그네슘 또는 황산철일 수 있다.
상기 배지 또는 이를 이루는 개별 성분은 회분식, 연속식, 또는 유가식 배양으로 첨가될 수 있다.
상기 배양 방법에 있어서, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 상기 pH의 조정은 상기 배양물에 수산화암모늄, 수산 화칼륨, 암모니아, 인산, 또는 황산을 첨가하여 이루어질 수 있다. 또한, 상기 배양 방법은 기포 생성 억제를 포함할 수 있다. 상기 기포 생성 억제는 소포제의 사용을 통하여 이루어질 수 있다. 상기 소포제는 지방산 폴리글리콜 에스테르를 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양 방법은 배양물 내로 기체의 주입을 포함할 수 있다. 상기 기체는 배양물의 호기 상태를 유지하기 위한 어떤 기체도 포함할 수 있다. 상기 기체는 산소 또는 산소 함유 기체일 수 있다. 상기 산소 함유 기체는 공기를 포함한다. 상기 배양에 있어서, 배양물의 온도는 20 내지 45℃, 예를 들면, 22 내지 42℃, 또는 25 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 원하는 비올라세인 및 디옥시비올라세인 중 하나 이상의 생성량을 획득할 때까지 지속될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 배지 또는 상기 미생물로부터 목적산물을 회수하는 단계는 예를 들면, 배지에 황산 또는 염산 처리한 후에 음이온 교환 크로마토그래피, 농축, 정석, 등전점 침전 등의 공정을 병용하여 수행되는 것일 수 있다.
다중약물 유출펌프(multidrug efflux pump, mepA) 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 변이체를 포함하는 미생물, 및 이를 이용하여 비올라세인(violacein) 또는 디옥시비올라세인(deoxyviolacein)을 제조하는 방법은 비올라세인 또는 디옥시비올라세인의 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 mepA 막단백질의 3차원 구조를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터의 제작
실시예 1-1. 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 갖는 균주의 제작을 위한 비올라세인 생합성 유전자 클러스터
vioABCDE
과발현 벡터의 제작
비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터를 제작하기 위하여 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum) ATCC 12472 유래의 게놈 DNA로부터 비올라세인 생합성 유전자 클러스터인 vioABCDE를 증폭하였다.
구체적으로, 5' 말단 영역에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 31)와 3' 말단 영역에 BamHⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 32)를 합성하고, 이 프라이머 쌍을 프라이머로 하고 크로모박테리움 비올라세움 ATCC 12472 유래의 게놈 DNA를 주형으로 한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 vioABCDE(서열번호 33)를 증폭하였다. PCR 조건은 94℃에서 5 분간 변성 후, 94℃ 30 초 변성, 60℃ 30 초 어닐링, 72℃ 10 분 중합을 30 회 반복한 후, 72℃에서 7 분간 중합반응을 수행하였다. 또한 강한 프로모터로서, 5' 말단에 KpnⅠ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 34)를 합성하였다.
상기와 같이 PCR로 증폭된 vioABCDE 유전자 클러스터 단편을 제한효소 NdeⅠ과 BamHⅠ으로 절단하고, 상기 합성된 trc 프로모터 단편을 제한효소 KpnⅠ과 NdeⅠ으로 절단하여 각각의 DNA 절편을 획득하였다. 이를 제한효소 KpnⅠ과 BamHⅠ 말단을 가지는 과발현 벡터 pECCG117(Biotechnology letters vol. 13, No.10, p.721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 카나마이신이 25 ㎎/L로 포함된 LB(Luria Bertani, 리터 당 트립톤 10 g, 효모추출물 5 g, NaCl 10 g, Agar 12 g, pH 7.0) 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16 시간 동안 배양하여 콜로니가 형성되는 것을 확인하였다.
PCR을 통해 목적한 유전자 클러스터가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하기 전, 이미 형질전환된 대장균 DH5α의 콜로니 색상이 대부분 보라색을 띠는 것을 확인하였다. 각각의 형질전환된 대장균 DH5α로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 보라색 콜로니로부터 분리된 플라스미드를 pECCG117-Ptrc-vioABCDE로 명명하였다.
실시예 1-2. 디옥시비올라세인 생산능을 갖는 균주의 제작을 위한 비올라세인 생합성 유전자 클러스터
vioABCE
과발현 벡터의 제작
디옥시비올라세인 생산능을 갖는 균주의 제작을 위한 vioABCE 과발현 벡터를 제작하기 위하여, 크로모박테리움 비올라세움 ATCC 12472 유래의 게놈 DNA로부터 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 중 vioD를 제외한 vioABC 및 vioE를 증폭하였다.
구체적으로, 유전자 vioABC를 증폭하기 위하여, 5' 말단 영역에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 31)와 3' 말단 영역에 NheⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 35)를 합성하고, 이 프라이머 쌍을 프라이머로 한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 상기 유전자에 대한 강한 프로모터로서, 5' 말단에 KpnⅠ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 36)를 합성하였다.
또한, 유전자 vioE를 증폭하기 위하여, 5' 말단 영역에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 37)와 3' 말단 영역에 BamHⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 38)를 합성하고, 이 프라이머 쌍을 프라이머로 한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 상기 유전자에 대한 강한 프로모터로서, 5' 말단에 NheⅠ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 39)를 합성하였다.
상기와 같이 PCR로 증폭된 vioABC 유전자를 제한효소 NdeⅠ과 NheⅠ으로 절단하고, vioE 유전자를 제한효소 NdeⅠ와 BamHⅠ으로 절단하였다. 또한, 상기 합성된 trc 프로모터 단편(서열번호 36)을 제한효소 KpnⅠ과 NdeⅠ으로 절단하고, trc 프로모터 단편(서열번호 39)을 제한효소 NheⅠ과 NdeⅠ으로 절단하여 각각의 DNA 절편을 획득하였다. 이를 제한효소 KpnⅠ과 BamHⅠ 말단을 가지는 과발현 벡터 pECCG117(Biotechnology letters vol. 13, No.10, p.721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)에 trc-vioABC-trc-vioE 순서로 연결하여 대장균 DH5α에 형질전환한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양하여 플라스미드를 획득하였다. 형질전환된 대장균 DH5α의 콜로니 색상은 대부분 남색을 띠는 것을 확인하였으며, 남색 콜로니로부터 분리된 플라스미드를 pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE로 명명하였다.
실시예 2. 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터를 도입한 균주의 제작
상기 실시예 1에서 제조한 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터 pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE를 각각 공지된 방법에 따라 대장균 W3110 균주에 형질전환하고, 카나마이신이 25 ㎎/L로 포함된 LB 배지에서의 생장여부를 통해 형질전환을 확인하였다. 최종적으로 제작된 균주를 각각 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE로 명명하였다.
실험예 1. 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터를 도입한 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능 평가
상기 실시예 2에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 카나마이신이 25 ㎎/L의 농도로 포함된 역가 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 1 백금이씩 접종하고, 37℃에서 30 시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 역가 배지의 조성은 포도당 40g/L, 탄산칼슘 30g/L, 황산 암모늄 10g/L, 일인산칼륨 1g/L, 황산마그네슘 1.5g/L, 및 효모엑기스 4g/L이다. 비올라세인 및 디옥시비올라세인을 정량하기 위하여 각 세포가 포함된 배양물을 에탄올에 30배 희석하여 1 시간 동안 진탕 추출하고 13,000 rpm에서 5 분간 원심분리한 후 상층액을 HPLC로 분석하였다. 이 결과를 표 1에 나타내었다.
균주명 | OD (660 ㎚ 흡광) |
비올라세인 (배양액 리터당 ㎎) |
디옥시비올라세인 (배양액 리터당 ㎎) |
W3110 | 15.8 | 0 | 0 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE | 29.7 | 521.2 | 78.1 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE | 32.1 | 0 | 617.4 |
상기 표 1에 나타낸 것과 같이, 야생형 대장균 W3110 균주는 비올라세인 및 디옥시비올라세인을 전혀 생산하지 못하였으나, 대장균 W3110 균주에 pECCG117-Ptrc-vioABCDE를 형질전환한 경우 비올라세인과 디옥시비올라세인이 약 8:2의 비율로 생산되는 것을 확인하였으며, pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE를 형질전환한 경우 디옥시비올라세인만 생산되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3.
mepA
유전자 과발현 벡터의 제작
실시예 3-1.
mepA
유전자의 합성
mepA 유전자 과발현 벡터를 제작하기 위하여, bis-indole계 물질을 수송하는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 mepA 유전자를 사용하였다.
구체적으로, 코스모진텍사(대한민국)에 의뢰하여 스타필로코쿠스 아우레우스의 mepA 유전자를 합성하였다. 스타필로코쿠스 아우레우스와 대장균 간의 특정 아미노산을 지정하는 코돈에 대한 선호도 차이를 고려하여 스타필로코쿠스 아우레우스의 야생형 mepA 유전자(이하, 'mepA_WT', 서열번호 2) 및 대장균에 코돈 최적화된 mepA 유전자(이하, 'mepA_opti', 서열번호 3)의 각 5' 말단에 XbaI 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 SacI 제한효소 부위를 삽입하여 합성하였다.
실시예 3-2. 플라스미드 pCL-DtrpL의 제작
5' 말단에 KpnⅠ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 XbaI 제한효소 부위를 삽입한 DtrpL 프로모터(서열번호 40)를 합성한 후, 제한효소 KpnI 및 XbaI으로 절단하여 DNA 절편을 획득하였다. 이를 제한효소 KpnI과 XbaI 말단을 가지는 과발현 벡터 pCL1920(GenBank No. AB236930)에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 스펙티노마이신이 25 ㎎/L로 포함된 LB 고체배지에 도말하여 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후 콜로니가 형성되는 것을 확인하였다.
PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하여 각각의 형질전환된 대장균 DH5α로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pCL-DtrpL로 명명하였다.
실시예 3-3.
mepA
유전자 과발현 벡터의 제작
합성한 mepA 유전자를 플라스미드 pCL-DtrpL에 연결하기 위하여, 서열번호 41 및 42의 프라이머 쌍을 각각 합성한 후, 이를 이용하여, pCL-DtrpL를 주형으로 PCR을 수행하여 pCL-DtrpL 벡터를 증폭하였다. PCR 반응은 94℃에서 5 분간 변성 후, 94℃에서 30 초 변성, 55℃에서 30 초 어닐링, 72℃에서 15 분 중합을 15 회 반복한 후, 72℃에서 5 분간 중합반응을 하는 조건으로 수행하였다. 상기 PCR로 증폭된 pCL-DtrpL DNA단편을 제한효소 XbaI으로 절단하고, 합성한 mepA_WT와 mepA_opti를 XbaI 및, SacI과 동일한 염기서열을 인식하는 평활말단 제한효소인 Eco53kI으로 절단하였다. 상기 각 mepA 유전자의 DNA절편을 각각 pCL-DtrpL DNA절편에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 스펙티노마이신이 25 ㎎/L로 포함된 LB 고체배지에 도말하여 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후 콜로니가 형성되는 것을 확인하였다.
PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하여 각각의 형질전환된 대장균 DH5α로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, mepA_WT를 삽입한 플라스미드를 pCL-DtrpL-mepA_WT(서열번호 43)로, mepA_opti를 삽입한 플라스미드를 pCL-DtrpL-mepA_opti(서열번호 44)로 명명하였다.
실시예 4.
mepA
유전자 과발현 벡터를 도입한 균주의 제작
비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능에 대한 mepA 유전자 과발현의 효과를 확인하기 위해 실시예 3에서 제조한 mepA 과발현 벡터 pCL-DtrpL-mepA_WT 또는 pCL-DtrpL-mepA_opti를 실시예 2에서 제작한 균주들인 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE에 공지된 방법으로 각각 형질전환하였다. 제작한 균주를 각각 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_WT, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_WT, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti로 명명하였다.
항생제에 대한 영향성을 최소화하여 비교하고자, 공벡터 pCL1920 또한 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE에 각각 형질전환하여 대조군으로 사용하였다. 대조군 균주를 각각 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL1920 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL1920으로 명명하였다. 상기 벡터가 형질전환될 경우 카나마이신과 스펙티노마이신 내성을 모두 가지게 되므로 카나마이신과 스펙티노마이신이 각각 25 ㎎/L로 포함된 LB 배지에서의 생장여부를 통해 형질전환을 확인하였다.
실험예 2.
mepA
유전자 과발현 벡터를 도입한 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능 평가
상기 실시예 4에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 카나마이신과 스펙티노마이신이 각각 25 ㎎/L의 농도로 포함된 역가 배지를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시예 4에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 분석하여 표 2에 나타내었다.
균주명 | OD (660 ㎚ 흡광) |
비올라세인 (배양액 리터당 ㎎) |
디옥시비올라세인 (배양액 리터당 ㎎) |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE /pCL1920 | 32.4 | 526.8 | 132.6 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL1920 | 35.6 | 0.0 | 672.2 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE /pCL-DtrpL-mepA_WT | 30.8 | 473.1 | 136.2 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_WT | 31.0 | 0.0 | 626.3 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE /pCL-DtrpL-mepA_opti | 37.5 | 503.0 | 129.8 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti | 35.8 | 0.0 | 648.2 |
상기 표 2에 나타낸 것과 같이, mepA 유전자 과발현 벡터를 도입한 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 각각의 대조군과 비교하였을 때, 비올라세인 생산능은 대조군 대비 유사한 수준이거나 감소하였고, 디옥시비올라세인 생산능은 대조군과 유사한 수준임을 확인하였다. 따라서, 야생형 mepA 유전자는 비올라세인류 분자를 선택특이적으로 배출하지 못 함을 알 수 있다.
실시예 5. mepA 단백질의 비올라세인류에 대한 선택특이성을 높이기 위한 변이형 도출
mepA 단백질의 구조 예측 및 분석을 통하여 mepA 단백질의 비올라세인류에 대한 선택특이성을 높이기 위한 변이형을 도출하였다.
구체적으로, mepA 단백질과 높은 상동성을 보이며, 같은 MATE(Multidrug and toxic compound extrusion) 유형의 트랜스포터 막단백질 중 베라파밀(verapamil)을 높은 선택특이성으로 배출하는 NorM 단백질의 구조를 주형으로 하여 PSI-BLAST(Position-Specific Iterative Basic Local Alignment Search Tool) 방법을 이용하여 mepA 단백질의 3차원 구조를 예측하였다. 예측된 mepA 막단백질 구조에서 비올라세인류 분자와의 친화성을 높이는 데 기여할 수 있을 것으로 추측되는 부위를 PSI-BLAST 프로그램을 이용하여 도출하였다.
그 결과, mepA 단백질의 총 7종 변이로 S32M, G36N, N39D, L59F, F62M, D183A 및 L288M을 도출하였다.
실시예 6.
mepA
유전자 변이체 발현 벡터의 제작
실시예 6-1.
mepA
유전자 변이체의 합성
실시예 3-1에서 합성한 서열번호 3의 mepA_opti 유전자에 상기 도출한 7종 변이를 각각 반영한 mepA 유전자 변이체를 코스모진텍사(대한민국)에 의뢰하여 합성하였다. 구체적으로, 각각 서열번호 15 내지 21의 염기서열로 구성되는 7종 유전자 변이체의 5' 말단에 XbaI 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 SacI 제한효소 부위를 삽입하여 발현 벡터 제작을 위한 유전자 변이체를 합성하였고, 이들을 mepA_opti_S32M, mepA_opti_G36N, mepA_opti_N39D, mepA_opti_L59F, mepA_opti_F62M, mepA_opti_D183A 및 mepA_opti_L288M으로 명명하였다.
실시예 6-2.
mepA
유전자 변이체 발현 벡터의 제작
합성한 mepA 유전자 변이체를 이용하여 상기 실시예 3-2 및 3-3에 기재된 것과 동일한 방법으로 발현 벡터를 제작하였고, 제작한 플라스미드들을 각각 pCL-DtrpL-mepA_opti_S32M, pCL-DtrpL-mepA_opti_G36N, pCL-DtrpL-mepA_opti_N39D, pCL-DtrpL-mepA_opti_L59F, pCL-DtrpL-mepA_opti_F62M, pCL-DtrpL-mepA_opti_D183A, pCL-DtrpL-mepA_opti_L288M로 명명하였다.
실시예 7.
mepA
유전자 변이체 발현 벡터를 도입한 균주의 제작
비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능에 대한 mepA 유전자 변이체 발현의 효과를 확인하기 위해 실시예 6에서 제조한 mepA 유전자 변이체 발현 벡터들을 이용한 것을 제외하고는 상기 실시예 4에 기재된 것과 동일한 방법으로 mepA 유전자 변이체 발현 벡터를 도입한 균주를 제작하고, 형질전환을 확인하였다. 제작한 균주들을 각각 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_S32M, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_G36N, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_N39D, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59F, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_F62M, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183A, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L288M, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_S32M, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_G36N, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE /pCL-DtrpL-mepA_opti_N39D, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59F, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_F62M, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183A 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L288M으로 명명하였다.
실험예 3.
mepA
유전자 변이체 발현 벡터를 도입한 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능 평가
상기 실시예 6에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 실험예 2에 기재된 것과 동일한 방법으로 평가하여 표 3에 나타내었다.
균주명 | OD (660 ㎚ 흡광) |
비올라세인 (배양액 리터당 ㎎) |
디옥시비올라세인 (배양액 리터당 ㎎) |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE /pCL1920 |
32.4 | 526.8 | 132.6 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_S32M | 33.9 | 560.2 | 140.6 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_G36N | 34.5 | 556.4 | 142.6 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_N39D | 33.9 | 557.9 | 148.2 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59F | 34.8 | 586.0 | 158.0 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_F62M | 35.6 | 569.1 | 144.0 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183A | 34.7 | 597.9 | 161.8 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L288M | 32.9 | 566.9 | 142.3 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL1920 | 35.6 | 0.0 | 672.2 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_S32M | 34.5 | 0.0 | 702.6 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_G36N | 36.2 | 0.0 | 742.9 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_N39D | 35.6 | 0.0 | 756.6 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59F | 33.4 | 0.0 | 776.8 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_F62M | 35.7 | 0.0 | 763.6 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183A | 35.8 | 0.0 | 784.2 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L288M | 36.2 | 0.0 | 749.8 |
상기 표 3에 나타낸 것과 같이, mepA 유전자 변이체 발현 벡터를 도입한 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 각각의 대조군과 비교하였을 때, 비올라세인 생산능은 대조군 대비 약 6 내지 14% 증가하였고, 디옥시비올라세인 생산능은 대조군 대비 약 5 내지 22% 증가하였다. mepA 유전자 변이 중 D183A 및 L59F 변이가 비올라세인 및 디옥시비올라세인 수율 증가에 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 8.
추가
mepA
유전자 변이체 발현 벡터 및 이를 도입한 균주의 제작
상기 실험예 3에서 우수한 비올라세인 및 디옥시비올라세인 수율 증가 효과를 확인한 D183A 및 L59F에 대하여, 동일한 위치의 다른 추가적인 변이가 비올라세인류 수율 증가에 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여, mepA_opti 아미노산 서열의 D183E, D183L, L59M 및 L59N 변이체를 발현하는 벡터 및 이를 도입한 균주를 하기와 같이 제작하였다.
구체적으로, mepA 단백질의 D183E, D183L, L59M 및 L59N 변이에 대하여 서열번호 22 내지 25로 각각 표시되는 mepA 유전자 변이체를 합성한 것을 제외하고는 상기 실시예 6-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 mepA 유전자 변이체를 합성하였고, 각각 mepA_opti_D183E, mepA_opti_D183L, mepA_opti_L59M 및 mepA_opti_L59N로 명명하였다.
합성한 mepA 유전자 변이체를 이용하여 실시예 6-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 mepA 유전자 변이체 벡터를 제작하였고, 각각 pCL-DtrpL-mepA_opti_D183E, pCL-DtrpL-mepA_opti_D183L, pCL-DtrpL-mepA_opti_L59M 및 pCL-DtrpL-mepA_opti_L59N으로 명명하였다.
제작한 mepA 유전자 변이체 발현 벡터들을 이용한 것을 제외하고는 상기 실시예 7에 기재된 것과 동일한 방법으로 mepA 유전자 변이체 발현 벡터를 도입한 균주를 제작하고, 형질전환을 확인하였다. 제작한 균주들을 각각 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183E, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183L, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59M, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59N, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183E, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183L, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59M 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59N으로 명명하였다.
실험예 4.
추가
mepA
유전자 변이체 발현 벡터를 도입한 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능 평가
상기 실시예 8에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 실험예 2에 기재된 것과 동일한 방법으로 평가하여 각각 D183A 변이체 및 L59F 변이체의 비올라세인류 생산능과 비교하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
균주명 | OD (660 ㎚ 흡광) |
비올라세인 (배양액 리터당 ㎎) |
디옥시비올라세인 (배양액 리터당 ㎎) |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL1920 | 32.4 | 518.8 | 124.6 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183A | 34.7 | 581.9 | 153.8 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183E | 33.2 | 564.0 | 142.7 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183L | 34.0 | 555.7 | 149.7 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59F | 34.8 | 578.0 | 153.2 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59M | 34.0 | 551.8 | 139.9 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59N | 33.5 | 569.3 | 141.4 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL1920 | 35.6 | 0.0 | 664.2 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183A | 35.8 | 0.0 | 773.0 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183E | 33.6 | 0.0 | 731.7 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183L | 34.8 | 0.0 | 752.2 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59F | 33.4 | 0.0 | 768.8 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59M | 32.9 | 0.0 | 748.2 |
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59N | 35.8 | 0.0 | 731.8 |
상기 표 4에 나타낸 것과 같이, 비올라세인류의 수율은 D183E 또는 D183L 변이 시, D183A 변이 대비 향상되지 않았으나, 대조군 균주보다는 향상되었고, L59M 또는 L59N 변이 시, L59F 변이 대비 향상되지 않았으나, 대조군 균주보다는 향상되었다. 따라서, mepA 유전자가 변이된 형질전환체를 이용하여 비올라세인 또는 디옥시비올라세인을 생산할 경우, mepA 단백질의 비올라세인류 수송에 따라 비올라세인류 생산능이 증가하는 것을 알 수 있다.
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> Multidrug efflux pump variant, polynucleotide coding the variant,
microorganism including the variant, and method for producing
violacein or deoxyviolacein using the same
<130> PN126262KR
<160> 44
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 451
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 1
Met Lys Asp Glu Gln Leu Tyr Tyr Phe Glu Lys Ser Pro Val Phe Lys
1 5 10 15
Ala Met Met His Phe Ser Leu Pro Met Met Ile Gly Thr Leu Leu Ser
20 25 30
Val Ile Tyr Gly Ile Leu Asn Ile Tyr Phe Ile Gly Phe Leu Glu Asp
35 40 45
Ser His Met Ile Ser Ala Ile Ser Leu Thr Leu Pro Val Phe Ala Ile
50 55 60
Leu Met Gly Leu Gly Asn Leu Phe Gly Val Gly Ala Gly Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Leu Leu Gly Ala Lys Asp Tyr Ser Lys Ser Lys Phe Val Ser
85 90 95
Ser Phe Ser Ile Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Gly Leu Ile Val Ile Leu
100 105 110
Val Thr Leu Pro Phe Ser Asp Gln Ile Ala Ala Ile Leu Gly Ala Arg
115 120 125
Gly Glu Thr Leu Ala Leu Thr Ser Asn Tyr Leu Lys Val Met Phe Leu
130 135 140
Ser Ala Pro Phe Val Ile Leu Phe Phe Ile Leu Glu Gln Phe Ala Arg
145 150 155 160
Ala Ile Gly Ala Pro Met Val Ser Met Ile Gly Met Leu Ala Ser Val
165 170 175
Gly Leu Asn Ile Ile Leu Asp Pro Ile Leu Ile Phe Gly Phe Asp Leu
180 185 190
Asn Val Val Gly Ala Ala Leu Gly Thr Ala Ile Ser Asn Val Ala Ala
195 200 205
Ala Leu Phe Phe Ile Ile Tyr Phe Met Lys Asn Ser Asp Val Val Ser
210 215 220
Val Asn Ile Lys Leu Ala Lys Pro Asn Lys Glu Met Leu Ser Glu Ile
225 230 235 240
Phe Lys Ile Gly Ile Pro Ala Phe Leu Met Ser Ile Leu Met Gly Phe
245 250 255
Thr Gly Leu Val Leu Asn Leu Phe Leu Ala His Tyr Gly Asn Phe Ala
260 265 270
Ile Ala Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Arg Leu Val Gln Phe Pro Glu Leu
275 280 285
Ile Ile Met Gly Leu Cys Glu Gly Val Val Pro Leu Ile Ala Tyr Asn
290 295 300
Phe Met Ala Asn Lys Gly Arg Met Lys Asp Val Ile Lys Ala Val Ile
305 310 315 320
Met Ser Ile Gly Val Ile Phe Val Val Cys Met Ser Ala Val Phe Thr
325 330 335
Ile Gly His His Met Val Gly Leu Phe Thr Thr Asp Gln Ala Ile Val
340 345 350
Glu Met Ala Thr Phe Ile Leu Lys Val Thr Met Ala Ser Leu Leu Leu
355 360 365
Asn Gly Ile Gly Phe Leu Phe Thr Gly Met Leu Gln Ala Thr Gly Gln
370 375 380
Gly Arg Gly Ala Thr Ile Met Ala Ile Leu Gln Gly Ala Ile Ile Ile
385 390 395 400
Pro Val Leu Phe Ile Met Asn Ala Leu Phe Gly Leu Thr Gly Val Ile
405 410 415
Trp Ser Leu Leu Ile Ala Glu Ser Leu Cys Ala Leu Ala Ala Met Leu
420 425 430
Ile Val Tyr Leu Leu Arg Asp Arg Leu Thr Val Asp Thr Ser Glu Leu
435 440 445
Ile Glu Gly
450
<210> 2
<211> 1356
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 2
atgaaagacg aacaattata ttattttgag aaatcgccag tatttaaagc gatgatgcat 60
ttctcattgc caatgatgat agggacttta ttaagcgtta tttatggcat attaaatatt 120
tactttatag gatttttaga agatagccac atgatttctg ctatctctct aacactgcca 180
gtatttgcta tcttaatggg gttaggtaat ttatttggcg ttggtgcagg aacttatatt 240
tcacgtttat taggtgcgaa agactatagt aagagtaaat ttgtaagtag tttctctatt 300
tatggtggta ttgcactagg acttatcgtg attttagtta ctttaccatt cagtgatcaa 360
atcgcagcaa ttttaggggc gagaggtgaa acgttagctt taacaagtaa ttatttgaaa 420
gtaatgtttt taagtgcacc ttttgtaatt ttgttcttca tattagaaca atttgcacgt 480
gcaattgggg caccaatggt ttctatgatt ggtatgttag ctagtgtagg cttaaatatt 540
attttagatc caattttaat ttttggtttt gatttaaacg ttgttggtgc agctttgggt 600
actgcaatca gtaatgttgc tgctgctctg ttctttatca tttattttat gaaaaatagt 660
gacgttgtgt cagttaatat taaacttgcg aaacctaata aagaaatgct ttctgaaatc 720
tttaaaatcg gtattcctgc atttttaatg agtatcttaa tgggattcac aggattagtt 780
ttaaatttat ttttagcaca ttatggaaac ttcgcgattg caagttatgg tatctcattt 840
agacttgtgc aatttccaga acttattatc atgggattat gtgaaggtgt tgtaccacta 900
attgcatata actttatggc aaataaaggc cgtatgaaag acgttatcaa agcagttatc 960
atgtctatcg gcgttatctt tgttgtatgt atgagtgctg tatttacaat tggacatcat 1020
atggtcggac tatttactac tgatcaagcc attgttgaga tggcgacatt tattttgaaa 1080
gtaacaatgg catcattatt attaaatggt ataggtttct tgtttactgg tatgcttcaa 1140
gcgactgggc aaggtcgtgg tgctacaatt atggccattt tacaaggtgc aattatcatt 1200
ccagtattat ttattatgaa tgctttgttt ggactaacag gtgtcatttg gtcattatta 1260
attgctgagt cactttgtgc tttagcagca atgttaatcg tctatttatt acgtgatcgt 1320
ttgacagttg atacatctga attaatagaa ggttaa 1356
<210> 3
<211> 1356
<212> DNA
<213> Staphylococcus aureus
<400> 3
atgaaggacg agcaattgta ctactttgaa aaatccccag tgttcaaagc catgatgcat 60
ttttctctgc cgatgatgat cggcacgtta ttgtcggtga tatacggtat acttaatatc 120
tactttatag gtttcttaga agatagtcac atgattagtg ctatctcact tacattaccg 180
gtttttgcga ttcttatggg cttggggaac ctgttcggtg tcggagcagg cacctatata 240
tctcggttgc tgggtgctaa agactattct aaatcaaaat tcgttagttc attcagtatc 300
tatggaggca ttgcgttagg tctgattgtg atacttgtga ctttgccatt tagtgaccaa 360
atagcggcga tcctgggggc gcgtggcgag acgcttgcgc ttacgagtaa ttacttaaag 420
gtcatgtttc tttcagctcc gttcgttatc ctgttcttca tacttgaaca gttcgctaga 480
gctataggag ccccaatggt atccatgatt ggcatgctgg caagcgtcgg cttgaatatt 540
atattggatc ccatattgat cttcgggttt gatttaaatg tcgtcggggc ggcactgggg 600
acggccatat ccaatgtggc ggctgctctg ttttttataa tctattttat gaagaattcc 660
gacgttgtat ctgtaaatat caagttagca aaaccgaaca aagaaatgtt gtctgagatc 720
tttaagattg ggatcccggc gttcttaatg tcgatcctta tgggtttcac agggttggtt 780
ttgaatttat tcttggctca ttatggtaac tttgcgattg catcatatgg tatttccttc 840
cgcctggttc aatttccaga acttattatc atgggtttat gcgagggtgt tgtgcccctt 900
atagcctata actttatggc gaacaagggg agaatgaagg atgtcataaa agcggtgatc 960
atgtccattg gagttatttt tgtggtgtgt atgagtgcag ttttcaccat aggccaccac 1020
atggtagggt tattcacaac cgatcaggct attgtcgaaa tggccacctt catccttaaa 1080
gtgaccatgg cgtcgttatt attgaacgga ataggatttt tatttacagg gatgctgcaa 1140
gcaacgggcc aaggtcgcgg cgcgacgatc atggcaatat tacaaggagc gattatcatt 1200
ccggtgcttt ttataatgaa tgcgctgttc ggcctgacag gggttatctg gagtttatta 1260
atagcggaga gcctttgcgc tttggctgcg atgcttattg tatatttgtt acgtgaccgg 1320
ttgactgtgg atacctcgga gttgatcgaa gggtaa 1356
<210> 4
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mepA variant S32M
<400> 4
Met Lys Asp Glu Gln Leu Tyr Tyr Phe Glu Lys Ser Pro Val Phe Lys
1 5 10 15
Ala Met Met His Phe Ser Leu Pro Met Met Ile Gly Thr Leu Leu Met
20 25 30
Val Ile Tyr Gly Ile Leu Asn Ile Tyr Phe Ile Gly Phe Leu Glu Asp
35 40 45
Ser His Met Ile Ser Ala Ile Ser Leu Thr Leu Pro Val Phe Ala Ile
50 55 60
Leu Met Gly Leu Gly Asn Leu Phe Gly Val Gly Ala Gly Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Leu Leu Gly Ala Lys Asp Tyr Ser Lys Ser Lys Phe Val Ser
85 90 95
Ser Phe Ser Ile Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Gly Leu Ile Val Ile Leu
100 105 110
Val Thr Leu Pro Phe Ser Asp Gln Ile Ala Ala Ile Leu Gly Ala Arg
115 120 125
Gly Glu Thr Leu Ala Leu Thr Ser Asn Tyr Leu Lys Val Met Phe Leu
130 135 140
Ser Ala Pro Phe Val Ile Leu Phe Phe Ile Leu Glu Gln Phe Ala Arg
145 150 155 160
Ala Ile Gly Ala Pro Met Val Ser Met Ile Gly Met Leu Ala Ser Val
165 170 175
Gly Leu Asn Ile Ile Leu Asp Pro Ile Leu Ile Phe Gly Phe Asp Leu
180 185 190
Asn Val Val Gly Ala Ala Leu Gly Thr Ala Ile Ser Asn Val Ala Ala
195 200 205
Ala Leu Phe Phe Ile Ile Tyr Phe Met Lys Asn Ser Asp Val Val Ser
210 215 220
Val Asn Ile Lys Leu Ala Lys Pro Asn Lys Glu Met Leu Ser Glu Ile
225 230 235 240
Phe Lys Ile Gly Ile Pro Ala Phe Leu Met Ser Ile Leu Met Gly Phe
245 250 255
Thr Gly Leu Val Leu Asn Leu Phe Leu Ala His Tyr Gly Asn Phe Ala
260 265 270
Ile Ala Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Arg Leu Val Gln Phe Pro Glu Leu
275 280 285
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290 295 300
Phe Met Ala Asn Lys Gly Arg Met Lys Asp Val Ile Lys Ala Val Ile
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Met Ser Ile Gly Val Ile Phe Val Val Cys Met Ser Ala Val Phe Thr
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Ile Gly His His Met Val Gly Leu Phe Thr Thr Asp Gln Ala Ile Val
340 345 350
Glu Met Ala Thr Phe Ile Leu Lys Val Thr Met Ala Ser Leu Leu Leu
355 360 365
Asn Gly Ile Gly Phe Leu Phe Thr Gly Met Leu Gln Ala Thr Gly Gln
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Gly Arg Gly Ala Thr Ile Met Ala Ile Leu Gln Gly Ala Ile Ile Ile
385 390 395 400
Pro Val Leu Phe Ile Met Asn Ala Leu Phe Gly Leu Thr Gly Val Ile
405 410 415
Trp Ser Leu Leu Ile Ala Glu Ser Leu Cys Ala Leu Ala Ala Met Leu
420 425 430
Ile Val Tyr Leu Leu Arg Asp Arg Leu Thr Val Asp Thr Ser Glu Leu
435 440 445
Ile Glu Gly
450
<210> 5
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mepA variant G36N
<400> 5
Met Lys Asp Glu Gln Leu Tyr Tyr Phe Glu Lys Ser Pro Val Phe Lys
1 5 10 15
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20 25 30
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50 55 60
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Val Thr Leu Pro Phe Ser Asp Gln Ile Ala Ala Ile Leu Gly Ala Arg
115 120 125
Gly Glu Thr Leu Ala Leu Thr Ser Asn Tyr Leu Lys Val Met Phe Leu
130 135 140
Ser Ala Pro Phe Val Ile Leu Phe Phe Ile Leu Glu Gln Phe Ala Arg
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Met Ser Ile Gly Val Ile Phe Val Val Cys Met Ser Ala Val Phe Thr
325 330 335
Ile Gly His His Met Val Gly Leu Phe Thr Thr Asp Gln Ala Ile Val
340 345 350
Glu Met Ala Thr Phe Ile Leu Lys Val Thr Met Ala Ser Leu Leu Leu
355 360 365
Asn Gly Ile Gly Phe Leu Phe Thr Gly Met Leu Gln Ala Thr Gly Gln
370 375 380
Gly Arg Gly Ala Thr Ile Met Ala Ile Leu Gln Gly Ala Ile Ile Ile
385 390 395 400
Pro Val Leu Phe Ile Met Asn Ala Leu Phe Gly Leu Thr Gly Val Ile
405 410 415
Trp Ser Leu Leu Ile Ala Glu Ser Leu Cys Ala Leu Ala Ala Met Leu
420 425 430
Ile Val Tyr Leu Leu Arg Asp Arg Leu Thr Val Asp Thr Ser Glu Leu
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Ile Glu Gly
450
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Val Ile Tyr Gly Ile Leu Asn Ile Tyr Phe Ile Gly Phe Leu Glu Asp
35 40 45
Ser His Met Ile Ser Ala Ile Ser Leu Thr Asn Pro Val Phe Ala Ile
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Leu Met Gly Leu Gly Asn Leu Phe Gly Val Gly Ala Gly Thr Tyr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Leu Leu Gly Ala Lys Asp Tyr Ser Lys Ser Lys Phe Val Ser
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Ser Phe Ser Ile Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Gly Leu Ile Val Ile Leu
100 105 110
Val Thr Leu Pro Phe Ser Asp Gln Ile Ala Ala Ile Leu Gly Ala Arg
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130 135 140
Ser Ala Pro Phe Val Ile Leu Phe Phe Ile Leu Glu Gln Phe Ala Arg
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Ala Ile Gly Ala Pro Met Val Ser Met Ile Gly Met Leu Ala Ser Val
165 170 175
Gly Leu Asn Ile Ile Leu Asp Pro Ile Leu Ile Phe Gly Phe Asp Leu
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195 200 205
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Val Asn Ile Lys Leu Ala Lys Pro Asn Lys Glu Met Leu Ser Glu Ile
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Phe Lys Ile Gly Ile Pro Ala Phe Leu Met Ser Ile Leu Met Gly Phe
245 250 255
Thr Gly Leu Val Leu Asn Leu Phe Leu Ala His Tyr Gly Asn Phe Ala
260 265 270
Ile Ala Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Arg Leu Val Gln Phe Pro Glu Leu
275 280 285
Ile Ile Met Gly Leu Cys Glu Gly Val Val Pro Leu Ile Ala Tyr Asn
290 295 300
Phe Met Ala Asn Lys Gly Arg Met Lys Asp Val Ile Lys Ala Val Ile
305 310 315 320
Met Ser Ile Gly Val Ile Phe Val Val Cys Met Ser Ala Val Phe Thr
325 330 335
Ile Gly His His Met Val Gly Leu Phe Thr Thr Asp Gln Ala Ile Val
340 345 350
Glu Met Ala Thr Phe Ile Leu Lys Val Thr Met Ala Ser Leu Leu Leu
355 360 365
Asn Gly Ile Gly Phe Leu Phe Thr Gly Met Leu Gln Ala Thr Gly Gln
370 375 380
Gly Arg Gly Ala Thr Ile Met Ala Ile Leu Gln Gly Ala Ile Ile Ile
385 390 395 400
Pro Val Leu Phe Ile Met Asn Ala Leu Phe Gly Leu Thr Gly Val Ile
405 410 415
Trp Ser Leu Leu Ile Ala Glu Ser Leu Cys Ala Leu Ala Ala Met Leu
420 425 430
Ile Val Tyr Leu Leu Arg Asp Arg Leu Thr Val Asp Thr Ser Glu Leu
435 440 445
Ile Glu Gly
450
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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gacgttgtat ctgtaaatat caagttagca aaaccgaaca aagaaatgtt gtctgagatc 720
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atattggaac ccatattgat cttcgggttt gatttaaatg tcgtcggggc ggcactgggg 600
acggccatat ccaatgtggc ggctgctctg ttttttataa tctattttat gaagaattcc 660
gacgttgtat ctgtaaatat caagttagca aaaccgaaca aagaaatgtt gtctgagatc 720
tttaagattg ggatcccggc gttcttaatg tcgatcctta tgggtttcac agggttggtt 780
ttgaatttat tcttggctca ttatggtaac tttgcgattg catcatatgg tatttccttc 840
cgcctggttc aatttccaga acttattatc atgggtttat gcgagggtgt tgtgcccctt 900
atagcctata actttatggc gaacaagggg agaatgaagg atgtcataaa agcggtgatc 960
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gtgaccatgg cgtcgttatt attgaacgga ataggatttt tatttacagg gatgctgcaa 1140
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ccggtgcttt ttataatgaa tgcgctgttc ggcctgacag gggttatctg gagtttatta 1260
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<211> 1356
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mepA variant D183L
<400> 23
atgaaggacg agcaattgta ctactttgaa aaatccccag tgttcaaagc catgatgcat 60
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tactttatag gtttcttaga agatagtcac atgattagtg ctatctcact tacattaccg 180
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<210> 24
<211> 1356
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 24
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<210> 25
<211> 1356
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mepA variant L59N
<400> 25
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tctcggttgc tgggtgctaa agactattct aaatcaaaat tcgttagttc attcagtatc 300
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<210> 26
<211> 418
<212> PRT
<213> Chromobacterium violaceum
<400> 26
Met Lys His Ser Ser Asp Ile Cys Ile Val Gly Ala Gly Ile Ser Gly
1 5 10 15
Leu Thr Cys Ala Ser His Leu Leu Asp Ser Pro Ala Cys Arg Gly Leu
20 25 30
Ser Leu Arg Ile Phe Asp Met Gln Gln Glu Ala Gly Gly Arg Ile Arg
35 40 45
Ser Lys Met Leu Asp Gly Lys Ala Ser Ile Glu Leu Gly Ala Gly Arg
50 55 60
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Ser Gln Lys Ser Glu Val Tyr Pro Phe Thr Gln Leu Lys Phe Lys Ser
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Leu Lys Glu His Gly Lys Glu Ser Phe Leu Gln Phe Val Ser Arg Tyr
115 120 125
Gln Gly His Asp Ser Ala Val Gly Met Ile Arg Ser Met Gly Tyr Asp
130 135 140
Ala Leu Phe Leu Pro Asp Ile Ser Ala Glu Met Ala Tyr Asp Ile Val
145 150 155 160
Gly Lys His Pro Glu Ile Gln Ser Val Thr Asp Asn Asp Ala Asn Gln
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Ala Lys Val Lys Ala Ala Gly Ala Arg Phe Ser Leu Gly Tyr Arg Leu
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210 215 220
Asp Asp Gly Trp Lys Leu Glu His Arg Thr Arg His Leu Ile Leu Ala
225 230 235 240
Ile Pro Pro Ser Ala Met Ala Gly Leu Asn Val Asp Phe Pro Glu Ala
245 250 255
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Thr Tyr Gly Glu Pro Trp Trp Leu Asp Tyr Lys Leu Asp Asp Gln Val
275 280 285
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Tyr Leu Phe Phe Tyr Thr Asp Ser Glu Met Ala Asn Tyr Trp Arg Gly
305 310 315 320
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325 330 335
Leu Ala Ser Ala Leu Gly Ile Val Arg Glu Arg Ile Pro Gln Pro Leu
340 345 350
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370 375 380
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Gly Leu Leu Ser Ala Arg Glu Ala Ser Arg Leu Leu Leu Gln Arg Ile
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Ala Ala
<210> 27
<211> 998
<212> PRT
<213> Chromobacterium violaceum
<400> 27
Met Ser Ile Leu Asp Phe Pro Arg Ile His Phe Arg Gly Trp Ala Arg
1 5 10 15
Val Asn Ala Pro Thr Ala Asn Arg Asp Pro His Gly His Ile Asp Met
20 25 30
Ala Ser Asn Thr Val Ala Met Ala Gly Glu Pro Phe Asp Leu Ala Arg
35 40 45
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Gly Leu Asp Gly Arg Ala Asp Pro Glu Gly Pro Phe Ser Leu Ala Glu
65 70 75 80
Gly Tyr Asn Ala Ala Gly Asn Asn His Phe Ser Trp Glu Ser Ala Thr
85 90 95
Val Ser His Val Gln Trp Asp Gly Gly Glu Ala Asp Arg Gly Asp Gly
100 105 110
Leu Val Gly Ala Arg Leu Ala Leu Trp Gly His Tyr Asn Asp Tyr Leu
115 120 125
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130 135 140
Arg Asp Ala Ala Gln Ile Tyr Ala Gly Gln Phe Thr Ile Ser Pro Ala
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Gly Ala Gly Pro Gly Thr Pro Trp Leu Phe Thr Ala Asp Ile Asp Asp
165 170 175
Ser His Gly Ala Arg Trp Thr Arg Gly Gly His Ile Ala Glu Arg Gly
180 185 190
Gly His Phe Leu Asp Glu Glu Phe Gly Leu Ala Arg Leu Phe Gln Phe
195 200 205
Ser Val Pro Lys Asp His Pro His Phe Leu Phe His Pro Gly Pro Phe
210 215 220
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225 230 235 240
Val Leu Gly Leu Thr Val Gln Tyr Ala Leu Phe Asn Met Ser Thr Pro
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Gly Arg Val Ala Leu Asn Leu Ala Cys Ala Ile Pro Phe Ser Thr Arg
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325 330 335
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Ala Arg Ile Glu Ser Lys Ala Gln Leu Ala Ala Glu Leu Arg Lys Ala
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Val Asp Leu Glu Leu Ser Val Met Leu Gln Tyr Leu Tyr Ala Ala Tyr
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675 680 685
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Leu Ala Arg Phe Val Arg Leu Glu Trp Pro His Phe Ile Pro Ala Pro
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785 790 795 800
Val Thr Asp Gln Gly Glu Gly Gly Ala Leu Asp Ser Pro His Tyr Glu
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Gln Ser Ala Pro Phe Glu Pro Ala Leu Pro Ala Leu Arg Asn Pro Val
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Glu Leu Leu Asp Phe Tyr Arg Arg Gln Met Leu Asp Leu Ala Cys Gly
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Lys Leu Ser Arg Glu Ala
995
<210> 28
<211> 429
<212> PRT
<213> Chromobacterium violaceum
<400> 28
Met Lys Arg Ala Ile Ile Val Gly Gly Gly Leu Ala Gly Gly Leu Thr
1 5 10 15
Ala Ile Tyr Leu Ala Lys Arg Gly Tyr Glu Val His Val Val Glu Lys
20 25 30
Arg Gly Asp Pro Leu Arg Asp Leu Ser Ser Tyr Val Asp Val Val Ser
35 40 45
Ser Arg Ala Ile Gly Val Ser Met Thr Val Arg Gly Ile Lys Ser Val
50 55 60
Leu Ala Ala Gly Ile Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ala Cys Gly Glu Pro
65 70 75 80
Ile Val Ala Met Ala Phe Ser Val Gly Gly Gln Tyr Arg Met Arg Glu
85 90 95
Leu Lys Pro Leu Glu Asp Phe Arg Pro Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ala
100 105 110
Phe Gln Lys Leu Leu Asn Lys Tyr Ala Asn Leu Ala Gly Val Arg Tyr
115 120 125
Tyr Phe Glu His Lys Cys Leu Asp Val Asp Leu Asp Gly Lys Ser Val
130 135 140
Leu Ile Gln Gly Lys Asp Gly Gln Pro Gln Arg Leu Gln Gly Asp Met
145 150 155 160
Ile Ile Gly Ala Asp Gly Ala His Ser Ala Val Arg Gln Ala Met Gln
165 170 175
Ser Gly Leu Arg Arg Phe Glu Phe Gln Gln Thr Phe Phe Arg His Gly
180 185 190
Tyr Lys Thr Leu Val Leu Pro Asp Ala Gln Ala Leu Gly Tyr Arg Lys
195 200 205
Asp Thr Leu Tyr Phe Phe Gly Met Asp Ser Gly Gly Leu Phe Ala Gly
210 215 220
Arg Ala Ala Thr Ile Pro Asp Gly Ser Val Ser Ile Ala Val Cys Leu
225 230 235 240
Pro Tyr Ser Gly Ser Pro Ser Leu Thr Thr Thr Asp Glu Pro Thr Met
245 250 255
Arg Ala Phe Phe Asp Arg Tyr Phe Gly Gly Leu Pro Arg Asp Ala Arg
260 265 270
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275 280 285
Asn Val Arg Ser Ser Thr Phe His Tyr Lys Gly Asn Val Leu Leu Leu
290 295 300
Gly Asp Ala Ala His Ala Thr Ala Pro Phe Leu Gly Gln Gly Met Asn
305 310 315 320
Met Ala Leu Glu Asp Ala Arg Thr Phe Val Glu Leu Leu Asp Arg His
325 330 335
Gln Gly Asp Gln Asp Lys Ala Phe Pro Glu Phe Thr Glu Leu Arg Lys
340 345 350
Val Gln Ala Asp Ala Met Gln Asp Met Ala Arg Ala Asn Tyr Asp Val
355 360 365
Leu Ser Cys Ser Asn Pro Ile Phe Phe Met Arg Ala Arg Tyr Thr Arg
370 375 380
Tyr Met His Ser Lys Phe Pro Gly Leu Tyr Pro Pro Asp Met Ala Glu
385 390 395 400
Lys Leu Tyr Phe Thr Ser Glu Pro Tyr Asp Arg Leu Gln Gln Ile Gln
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<210> 29
<211> 373
<212> PRT
<213> Chromobacterium violaceum
<400> 29
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1 5 10 15
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20 25 30
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Arg Arg Gly Leu Val His Ala Leu Arg Asp Lys Cys Arg Ser Gln Gly
100 105 110
Ile Ala Ile Arg Phe Glu Ser Pro Leu Leu Glu His Gly Glu Leu Pro
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Leu Ala Asp Tyr Asp Leu Val Val Leu Ala Asn Gly Val Asn His Lys
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Thr Ala His Phe Thr Glu Ala Leu Val Pro Gln Val Asp Tyr Gly Arg
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Leu Val Phe Arg Thr His Gly Lys Asp Ile Phe Ile Ala His Ala Tyr
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Lys Tyr Ser Asp Thr Met Ser Thr Phe Ile Val Glu Cys Ser Glu Glu
195 200 205
Thr Tyr Ala Arg Ala Arg Leu Gly Glu Met Ser Glu Glu Ala Ser Ala
210 215 220
Glu Tyr Val Ala Lys Val Phe Gln Ala Glu Leu Gly Gly His Gly Leu
225 230 235 240
Val Ser Gln Pro Gly Leu Gly Trp Arg Asn Phe Met Thr Leu Ser His
245 250 255
Asp Arg Cys His Asp Gly Lys Leu Val Leu Leu Gly Asp Ala Leu Gln
260 265 270
Ser Gly His Phe Ser Ile Gly His Gly Thr Thr Met Ala Val Val Val
275 280 285
Ala Gln Leu Leu Val Lys Ala Leu Cys Thr Glu Asp Gly Val Pro Ala
290 295 300
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<212> PRT
<213> Chromobacterium violaceum
<400> 30
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Asp Val Leu Arg Arg Leu Gly Ala Arg His Ile Gly Arg Arg Val Val
115 120 125
Leu Gly Arg Glu Ala Asp Gly Trp Arg Tyr Gln Arg Pro Gly Lys Gly
130 135 140
Pro Ser Thr Leu Tyr Leu Asp Ala Ala Ser Gly Thr Pro Leu Arg Met
145 150 155 160
Val Thr Gly Asp Glu Ala Ser Arg Ala Ser Leu Arg Asp Phe Pro Asn
165 170 175
Val Ser Glu Ala Glu Ile Pro Asp Ala Val Phe Ala Ala Lys Arg
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<210> 31
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 1
<400> 31
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<210> 32
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 2
<400> 32
gctctagaac tagtggatcc ctagcgcttg gcggcgaaga 40
<210> 33
<211> 7368
<212> DNA
<213> Chromobacterium violaceum
<400> 33
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ggacccgcca tctgatcctg gccattcctc cgtcggcgat ggccgggctc aatgtcgact 780
tccccgaggc gtggagcggc gcgcgctacg gctcgctgcc gctgttcaag ggtttcctca 840
cctacggcga gccatggtgg ctggactaca agctggacga ccaggtgctg atcgtcgaca 900
acccgctgcg caagatctac ttcaagggcg acaagtacct gttcttctac accgacagcg 960
agatggccaa ttactggcgc ggctgcgtgg ccgaaggaga ggacggctac ctggagcaga 1020
tccgcaccca tctggccagc gcgctgggca tcgttcgcga gcgcattccc cagcccctcg 1080
cccatgtgca caagtattgg gcgcatggcg tggagttctg ccgcgacagc gatatcgacc 1140
atccgtccgc gctcagccac cgcgacagcg gcatcatcgc ctgttcggac gcctacaccg 1200
agcactgcgg ctggatggag ggcggcctgc tcagcgcccg cgaagccagc cgtctgctgc 1260
tgcagcgcat cgccgcgtga acggtccggc cgccgcatcg cgtcgccgcc cggttccggg 1320
cggcgcttgt cagccatgac cgttcgggaa acacatgagc attctggatt ttccacgcat 1380
ccatttccgc ggctgggcgc gggtcaacgc gcccaccgcc aaccgcgatc cgcacggcca 1440
catcgacatg gccagcaata cggtggccat ggcaggcgaa ccgttcgacc tcgcgcgcca 1500
tccgaccgag ttccaccgcc acctgcggtc gctggggccg cgtttcggcc tggacggccg 1560
ggctgacccg gaagggccgt tcagcctggc cgagggctac aacgcggccg gcaacaacca 1620
tttctcctgg gagagcgcca ccgtcagcca cgtgcagtgg gatggcggcg aagcggaccg 1680
cggcgacggc ctggtcggcg ccaggctggc gctgtggggg cattacaacg attacctgcg 1740
caccaccttc aaccgcgcgc gctgggtgga cagcgacccc acccgccgcg acgcggcgca 1800
gatctacgcc gggcagttca cgatcagccc ggccggcgcc ggaccgggca cgccctggct 1860
gttcaccgcc gacatcgacg acagccacgg cgcgcgctgg acgcgcggcg gccacatcgc 1920
cgagcgcggc ggccatttcc tggacgagga gttcggcctg gcgcggctgt tccagttctc 1980
ggtgcccaaa gaccatccgc acttcctgtt ccacccgggg ccattcgatt ccgaagcctg 2040
gcgcaggctg cagctggcgc tggaggacga cgacgtgctc ggcctgacgg tgcagtacgc 2100
gctgttcaat atgtcgacgc cgccgcaacc caactcgccg gtgttccacg acatggtcgg 2160
cgtggtcggc ctgtggcggc gcggcgaact ggccagctac ccggccggcc ggctgctgcg 2220
tccgcgccag cccgggctgg gcgatctgac gctgcgcgta agcggcggcc gcgtggcgct 2280
gaatctggcc tgcgccattc cgttctccac ccgggcggcg cagccgtccg cgccggacag 2340
gctgacgccc gatctcgggg ccaagctgcc gttgggcgac ctgctgctgc gcgacgagga 2400
cggcgcgttg ctggcgcggg tgccgcaggc gctttaccag gattactgga cgaaccacgg 2460
catcgtcgac ctgccgctgc tgcgcgagcc caggggctcg ctgacgctgt ccagcgagct 2520
ggccgaatgg cgcgagcagg actgggtcac gcagtccgac gcctccaatc tttatttgga 2580
agcgccggac cgccgccacg gccgtttctt tccggaaagc atcgcgctgc gcagctattt 2640
ccgcggcgag gcccgcgcgc gcccggacat tccccaccgg atcgagggga tgggtctggt 2700
cggcgtggag tcgcgccagg acggcgatgc cgccgaatgg cggctgaccg gcctgcggcc 2760
cggcccggcg cgcatcgtgc tcgacgacgg cgcggaggcg atcccgctgc gggtgctgcc 2820
ggacgactgg gcgttggacg acgcgacggt ggaggaggtc gattacgcct tcctgtaccg 2880
gcacgtgatg gcctattacg agctggtcta cccgttcatg tccgacaagg tgttcagcct 2940
ggccgaccgc tgcaagtgcg agacctacgc caggctgatg tggcagatgt gcgatccgca 3000
gaaccggaac aagagctact acatgcccag cacccgcgag ctgtcggcgc ccaaggccag 3060
gctgttcctc aaatacctgg cccatgtcga gggccaggcc aggctgcagg cgccgccgcc 3120
ggccgggccg gcgcgcatcg agagcaaggc ccagctggcg gccgagctgc gcaaggcggt 3180
ggatctggag ttgtcggtga tgctgcagta cctgtacgcc gcctattcca ttcccaatta 3240
cgcccagggc cagcagcggg tgcgcgacgg cgcgtggacg gcggagcagc tgcagctggc 3300
ctgcggcagc ggcgaccggc gccgcgacgg cggcatccgc gccgcgctgc tggagatcgc 3360
ccacgaggag atgatccatt acctggtggt caacaacctg ctgatggcgc tgggcgagcc 3420
gttctacgcc ggcgtgccgc tgatgggcga ggcggcgcgg caggcgttcg gcctggacac 3480
cgaattcgcg ctggagccgt tctccgagtc gacgctggcg cgcttcgtcc ggctggaatg 3540
gccgcacttc atccctgcgc cgggcaaatc catcgccgac tgctacgccg ccatccgcca 3600
ggcctttctc gatctgcccg acctgttcgg cggcgaggcc ggcaagcgcg gcggcgagca 3660
ccacttgttc ctcaacgagc tgaccaaccg cgcccatccc ggctaccagc tggaggtgtt 3720
cgatcgcgac agcgcgctgt tcggcatcgc cttcgtcacc gaccagggcg agggcggggc 3780
gctggactcg ccgcattacg agcattcgca tttccagcgg ctgcgggaga tgtcggccag 3840
gatcatggcg cagtccgcgc cgttcgagcc ggcgttgccg gcgctgcgca acccggtgct 3900
ggacgagtcg ccgggctgcc agcgcgtggc ggacggacgg gcgcgcgcgc tgatggcgct 3960
gtaccagggc gtgtacgagc tgatgttcgc gatgatggcg cagcacttcg cggtcaagcc 4020
gctgggcagc ctcaggcgct cgcggctgat gaacgcggcg atcgacctga tgaccggcct 4080
gctcaggccg ctgtcctgcg cgctgatgaa cctgccgtcg ggcatcgccg gacgcaccgc 4140
cgggccgccg ctgccggggc cggtggatac ccgcagctac gacgactacg cgctgggctg 4200
ccggatgctg gcgcggcgct gcgagcgcct gctggagcag gcgtcgatgc tggagccggg 4260
ctggctgccc gacgcgcaaa tggaactgct ggatttctac cgccggcaga tgctggattt 4320
ggcttgtgga aagctttcta gagaggcctg aaatgaaaag agcaatcata gtcggaggcg 4380
ggctcgccgg cgggctgacc gccatctacc tggcgaagcg cggctacgag gtccacgtgg 4440
tggaaaagcg cggcgacccg ctgcgggacc tgtcttccta cgtggatgtg gtcagctcgc 4500
gggcgatagg cgtcagcatg accgtgcgcg gcatcaagtc ggtgctggcg gccggcattc 4560
cgcgcgcgga gctggacgcc tgcggcgaac ccatcgtggc gatggcgttt tccgtcggcg 4620
gccagtaccg gatgcgggag ctcaagccgc tggaggattt ccgcccgctg tcgctgaacc 4680
gcgcggcgtt tcagaagctg ctgaacaagt acgccaacct ggccggcgtc cgctactact 4740
tcgagcacaa gtgcctggac gtggatctgg acggcaagtc ggtgctgatc cagggcaagg 4800
acggccagcc gcagcgcttg cagggcgata tgatcatcgg cgccgacggc gcgcactcgg 4860
cggtgcggca ggcgatgcag agcgggttgc gccgcttcga attccagcag actttcttcc 4920
gccacggcta caagacgctg gtgctgccgg acgcgcaggc gctgggctac cgcaaggaca 4980
cgctgtattt cttcggcatg gactccggcg gcctgttcgc cggccgcgcc gccaccatcc 5040
cggacggcag cgtcagcatc gcggtctgcc tgccgtacag cggcagcccc agcctgacca 5100
ccaccgacga gccgacgatg cgcgcctttt tcgaccgtta cttcggcggc ctgccgcggg 5160
acgcgcgcga cgagatgctg cgccagttcc tggccaagcc cagcaacgac ctgatcaacg 5220
tccgttccag caccttccac tacaagggca atgtgctgct gctgggcgac gccgcccacg 5280
ccaccgcgcc tttcctcggc cagggcatga acatggcgct ggaggacgcg cgcaccttcg 5340
tcgagctgct ggaccgccac cagggcgacc aggacaaggc ctttcccgag ttcaccgagc 5400
tgcgcaaggt gcaggccgac gcgatgcagg acatggcgcg cgccaactac gacgtgctca 5460
gctgctccaa tcccatcttc ttcatgcggg cccgctacac ccgctacatg catagcaagt 5520
ttcccggcct ttacccgccg gacatggcgg agaagctgta cttcacgtcc gagccgtacg 5580
acagactgca gcagatccag agaaaacaga acgtttggta caagataggg agggtcaact 5640
gatgaagatt ctggtcatcg gcgcggggcc ggccggcctg gtgttcgcca gccaactgaa 5700
acaggcgcgt ccgctgtggg cgatagacat cgtcgaaaag aacgacgagc aggaagtgct 5760
gggctggggc gtggtgctgc ccggccggcc cggccagcat ccggccaatc cgctgtccta 5820
cctggacgcg ccggagaggc tgaatccgca gttcctggaa gacttcaagc tggtccacca 5880
caacgagccc agcctgatga gcaccggcgt gctgctgtgc ggcgtggagc gccgcggcct 5940
ggtgcacgcc ttgcgcgaca agtgccgctc gcagggcatc gccatccgct tcgaatcgcc 6000
gctgctggag catggcgagc tgccgctggc cgactacgac ctggtggtgc tggccaacgg 6060
cgtcaatcac aagaccgccc acttcaccga ggcgctggtg ccgcaggtgg actacggccg 6120
caacaagtac atctggtacg gcaccagcca gctgttcgac cagatgaacc tggtgttccg 6180
cacccacggc aaggacattt tcatcgccca cgcctacaag tactcggaca cgatgagcac 6240
cttcatcgtc gagtgcagcg aggagaccta tgcccgcgcc cgcctgggcg agatgtcgga 6300
agaggcgtcg gccgaatacg tcgccaaggt gttccaggcc gagctgggcg gccacggcct 6360
ggtgagccag cccggcctcg gctggcgcaa cttcatgacc ctgagccacg accgctgcca 6420
cgacggcaag ctggtgctgc tgggcgacgc gctgcagtcc ggccacttct ccatcggcca 6480
cggcaccacg atggcggtgg tggtggcgca gctgctggtg aaggcgctgt gcaccgagga 6540
cggcgtgccg gccgcgctga agcgcttcga ggagcgcgcg ctgccgctgg tccagctgtt 6600
ccgcggccat gccgacaaca gccgggtctg gttcgagacg gtggaggagc gcatgcacct 6660
gtccagcgcc gagttcgtgc agagcttcga cgcgcgccgc aagtcgctgc cgccgatgcc 6720
ggaagcgctg gcgcagaacc tgcgctacgc gctgcaacgc tgaggaggcc gcatggaaaa 6780
ccgggaaccg ccgctgctgc cggcgcgctg gagcagcgcc tatgtgtcgt actggagtcc 6840
gatgctgccg gatgaccagc tgacgtccgg ctactgctgg ttcgactacg agcgcgacat 6900
ctgtcggata gacggcctgt tcaatccctg gtcggagcgc gacaccggct accggctgtg 6960
gatgtccgag gtcggcaacg ccgccagcgg ccgcacctgg aagcagaagg tggcctatgg 7020
ccgcgagcgg accgccctgg gcgagcagct gtgcgagcgg ccgctggacg acgagaccgg 7080
cccgttcgcc gagctgttcc tgccgcgcga cgtgctgcgc cggctgggcg cccgccatat 7140
cggccgccgc gtggtgctgg gcagggaagc cgacggctgg cgctaccagc gtccgggcaa 7200
ggggccgtcc acgttgtacc tggacgccgc cagcggtacg ccgctgagga tggtgaccgg 7260
ggacgaggcg tcgcgcgcgt cgctgcgcga tttccccaac gtcagcgagg ccgagattcc 7320
cgacgccgtc ttcgccgcca agcgctaggg atccactagt tctagagc 7368
<210> 34
<211> 505
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> trc promoter 1
<400> 34
acaaaagctg ggtacccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca 60
gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc 120
ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 180
aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg taagttagcg cgaattgatc tggtttgaca 240
gcttatcatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 300
tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 360
gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 420
gctgttgaca attaatcatc cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 480
tcacacagga aacatatgaa gcatt 505
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 3
<400> 35
gcagcaagcg gctagctcag ttgaccctcc ctatct 36
<210> 36
<211> 510
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> trc promoter 2
<400> 36
acaaaagctg ggtacccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga agggcaatca 60
gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata cgcaaaccgc 120
ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga 180
aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg taagttagcg cgaattgatc tggtttgaca 240
gcttatcatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 300
tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 360
gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 420
gctgttgaca attaatcatc cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg gataacaatt 480
tcacacagga aacatatgaa gcattcttcc 510
<210> 37
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 4
<400> 37
ttcacacagg aaacatatgg aaaaccggga accgcc 36
<210> 38
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 5
<400> 38
ctagaactag tggatcccta gcgcttggcg gcgaaga 37
<210> 39
<211> 525
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> trc promoter 3
<400> 39
agatagggag ggtcaactga gctagccgct tgctgcaact ctctcagggc caggcggtga 60
agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccaccctg gcgcccaata 120
cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt 180
cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg taagttagcg cgaattgatc 240
tggtttgaca gcttatcatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca 300
tcggaagctg tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag 360
gcgcactccc gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat 420
tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc cggctcgtat aatgtgtgga attgtgagcg 480
gataacaatt tcacacagga aacatatgga aaaccgggaa ccgcc 525
<210> 40
<211> 251
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DtrpL promoter
<400> 40
ttaggtaccg gcgcactccc gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc 60
tggcaaatat tctgaaatga gctgttgaca attaatcatc gaactagtta actagtacgc 120
aagttcacgt aaaaagggta tcgacaacgg gcagtgtatt caccatgcgt aaagcaatca 180
gatacccagc ccgcctaatg agcgggcttt tttttgaaca aaattagaga ataacagata 240
tctctagatt a 251
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 6
<400> 41
ctcggcgtaa tcatggtc 18
<210> 42
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer 7
<400> 42
ttttctagag atatctgtta ttctctaa 28
<210> 43
<211> 6111
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pCL-DtrpL-mepA_WT
<400> 43
taagcctgtt gatgataccg ctgccttact gggtgcatta gccagtctga atgacctgtc 60
acgggataat ccgaagtggt cagactggaa aatcagaggg caggaactgc tgaacagcaa 120
aaagtcagat agcaccacat agcagacccg ccataaaacg ccctgagaag cccgtgacgg 180
gcttttcttg tattatgggt agtttccttg catgaatcca taaaaggcgc ctgtagtgcc 240
atttaccccc attcactgcc agagccgtga gcgcagcgaa ctgaatgtca cgaaaaagac 300
agcgactcag gtgcctgatg gtcggagaca aaaggaatat tcagcgattt gcccgagctt 360
gcgagggtgc tacttaagcc tttagggttt taaggtctgt tttgtagagg agcaaacagc 420
gtttgcgaca tccttttgta atactgcgga actgactaaa gtagtgagtt atacacaggg 480
ctgggatcta ttctttttat ctttttttat tctttcttta ttctataaat tataaccact 540
tgaatataaa caaaaaaaac acacaaaggt ctagcggaat ttacagaggg tctagcagaa 600
tttacaagtt ttccagcaaa ggtctagcag aatttacaga tacccacaac tcaaaggaaa 660
aggactagta attatcattg actagcccat ctcaattggt atagtgatta aaatcaccta 720
gaccaattga gatgtatgtc tgaattagtt gttttcaaag caaatgaact agcgattagt 780
cgctatgact taacggagca tgaaaccaag ctaattttat gctgtgtggc actactcaac 840
cccacgattg aaaaccctac aaggaaagaa cggacggtat cgttcactta taaccaatac 900
gctcagatga tgaacatcag tagggaaaat gcttatggtg tattagctaa agcaaccaga 960
gagctgatga cgagaactgt ggaaatcagg aatcctttgg ttaaaggctt tgagattttc 1020
cagtggacaa actatgccaa gttctcaagc gaaaaattag aattagtttt tagtgaagag 1080
atattgcctt atcttttcca gttaaaaaaa ttcataaaat ataatctgga acatgttaag 1140
tcttttgaaa acaaatactc tatgaggatt tatgagtggt tattaaaaga actaacacaa 1200
aagaaaactc acaaggcaaa tatagagatt agccttgatg aatttaagtt catgttaatg 1260
cttgaaaata actaccatga gtttaaaagg cttaaccaat gggttttgaa accaataagt 1320
aaagatttaa acacttacag caatatgaaa ttggtggttg ataagcgagg ccgcccgact 1380
gatacgttga ttttccaagt tgaactagat agacaaatgg atctcgtaac cgaacttgag 1440
aacaaccaga taaaaatgaa tggtgacaaa ataccaacaa ccattacatc agattcctac 1500
ctacataacg gactaagaaa aacactacac gatgctttaa ctgcaaaaat tcagctcacc 1560
agttttgagg caaaattttt gagtgacatg caaagtaagt atgatctcaa tggttcgttc 1620
tcatggctca cgcaaaaaca acgaaccaca ctagagaaca tactggctaa atacggaagg 1680
atctgaggtt cttatggctc ttgtatctat cagtgaagca tcaagactaa caaacaaaag 1740
tagaacaact gttcaccgtt acatatcaaa gggaaaactg tccatatgca cagatgaaaa 1800
cggtgtaaaa aagatagata catcagagct tttacgagtt tttggtgcat tcaaagctgt 1860
tcaccatgaa cagatcgaca atgtaacaga tgaacagcat gtaacaccta atagaacagg 1920
tgaaaccagt aaaacaaagc aactagaaca tgaaattgaa cacctgagac aacttgttac 1980
agctcaacag tcacacatag acagcctgaa acaggcgatg ctgcttatcg aatcaaagct 2040
gccgacaaca cgggagccag tgacgcctcc cgtggggaaa aaatcatggc aattctggaa 2100
gaaatagcgc tttcagccgg caaaccggct gaagccggat ctgcgattct gataacaaac 2160
tagcaacacc agaacagccc gtttgcgggc agcaaaaccc gtgggaatta attcccctgc 2220
tcgcgcaggc tgggtgccaa gctctcgggt aacatcaagg cccgatcctt ggagcccttg 2280
ccctcccgca cgatgatcgt gccgtgatcg aaatccagat ccttgacccg cagttgcaaa 2340
ccctcactga tccgcatgcc cgttccatac agaagctggg cgaacaaacg atgctcgcct 2400
tccagaaaac cgaggatgcg aaccacttca tccggggtca gcaccaccgg caagcgccgc 2460
gacggccgag gtcttccgat ctcctgaagc cagggcagat ccgtgcacag caccttgccg 2520
tagaagaaca gcaaggccgc caatgcctga cgatgcgtgg agaccgaaac cttgcgctcg 2580
ttcgccagcc aggacagaaa tgcctcgact tcgctgctgc ccaaggttgc cgggtgacgc 2640
acaccgtgga aacggatgaa ggcacgaacc cagtggacat aagcctgttc ggttcgtaag 2700
ctgtaatgca agtagcgtat gcgctcacgc aactggtcca gaaccttgac cgaacgcagc 2760
ggtggtaacg gcgcagtggc ggttttcatg gcttgttatg actgtttttt tggggtacag 2820
tctatgcctc gggcatccaa gcagcaagcg cgttacgccg tgggtcgatg tttgatgtta 2880
tggagcagca acgatgttac gcagcagggc agtcgcccta aaacaaagtt aaacatcatg 2940
agggaagcgg tgatcgccga agtatcgact caactatcag aggtagttgg cgtcatcgag 3000
cgccatctcg aaccgacgtt gctggccgta catttgtacg gctccgcagt ggatggcggc 3060
ctgaagccac acagtgatat tgatttgctg gttacggtga ccgtaaggct tgatgaaaca 3120
acgcggcgag ctttgatcaa cgaccttttg gaaacttcgg cttcccctgg agagagcgag 3180
attctccgcg ctgtagaagt caccattgtt gtgcacgacg acatcattcc gtggcgttat 3240
ccagctaagc gcgaactgca atttggagaa tggcagcgca atgacattct tgcaggtatc 3300
ttcgagccag ccacgatcga cattgatctg gctatcttgc tgacaaaagc aagagaacat 3360
agcgttgcct tggtaggtcc agcggcggag gaactctttg atccggttcc tgaacaggat 3420
ctatttgagg cgctaaatga aaccttaacg ctatggaact cgccgcccga ctgggctggc 3480
gatgagcgaa atgtagtgct tacgttgtcc cgcatttggt acagcgcagt aaccggcaaa 3540
atcgcgccga aggatgtcgc tgccgactgg gcaatggagc gcctgccggc ccagtatcag 3600
cccgtcatac ttgaagctag acaggcttat cttggacaag aagaagatcg cttggcctcg 3660
cgcgcagatc agttggaaga atttgtccac tacgtgaaag gcgagatcac caaggtagtc 3720
ggcaaataat gtctaacaat tcgttcaagc cgacgccgct tcgcggcgcg gcttaactca 3780
agcgttagat gcactaagca cataattgct cacagccaaa ctatcaggtc aagtctgctt 3840
ttattatttt taagcgtgca taataagccc tacacaaatt gggagatata tcatgaaagg 3900
ctggcttttt cttgttatcg caatagttgg cgaagtaatc gcaacatccg cattaaaatc 3960
tagcgagggc tttactaagc tcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact 4020
atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca 4080
gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt 4140
gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg 4200
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<211> 6111
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<220>
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<400> 44
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Claims (10)
- 다중약물 유출펌프(multidrug efflux pump, mepA)의 변이체로서,
상기 변이체는 서열번호 1에서 아미노산 치환(substitution)을 포함하는 아미노산 서열을 포함하고,
상기 아미노산 치환(substitution)은 상기 서열번호 1의 N-말단으로부터 32번째 세린의 메티오닌으로의 치환(S32M), 36번째 글리신의 아스파라긴으로의 치환(G36N), 39번째 아스파라긴의 아스파르트산으로의 치환(N39D), 59번째 루신의 페닐알라닌으로의 치환(L59F), 59번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L59M), 59번째 루신의 아스파라긴으로의 치환(L59N), 62번째 페닐알라닌의 메티오닌으로의 치환(F62M), 183번째 아스파르트산의 알라닌으로의 치환(D183A), 183번째 아스파르트산의 글루타메이트로의 치환(D183E), 183번째 아스파르트산의 루신으로의 치환(D183L) 또는 288번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L288M)을 포함하는, 다중약물 유출펌프(multidrug efflux pump, mepA) 변이체. - 삭제
- 제1항의 mepA 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제1항의 mepA 변이체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 미생물.
- 삭제
- 제4항에 있어서, 상기 미생물은 에세리키아(Escherichia) 속인 것인 미생물.
- 제4항에 있어서, 상기 미생물은 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자를 가지고 있는 것인 미생물.
- 제7항에 있어서, 상기 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자는 크로모박테리움(Chromobacterium) 속 유래인, 미생물.
- 제7항에 있어서, 상기 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자는 vioABCDE 또는 vioABCE를 포함하는 것인 미생물.
- 제4항의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
배지 또는 상기 미생물로부터 목적산물을 회수하는 단계를 포함하고,
상기 목적산물은, 비올라세인, 디옥시비올라세인, 또는 이들의 조합인, 목적산물을 제조하는 방법.
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PCT/KR2020/011317 WO2021125494A1 (ko) | 2019-12-20 | 2020-08-25 | 다중약물 유출펌프 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 변이체를 포함하는 미생물, 및 이를 이용하여 비올라세인 또는 디옥시비올라세인을 제조하는 방법 |
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