JP5632370B2 - デオキシビオラセインを産生する組み換え細菌及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、デオキシビオラセインを産生する組み換え細菌及びその使用に関する。
研究の結果、ビオラセインは、以下の生物活性を有することが示された：（１）黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｌｏｙｌｏｃｏｃｃｏｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）などに対する広域スペクトル抗微生物活性（非特許文献１参照）、（２）酸化防止活性（非特許文献２参照）、（３）抗腫瘍活性（非特許文献３参照）、（４）抗ウイルス活性、（５）抗原生動物活性、及び（６）様々な織物工程における天然バイオ色素活性（非特許文献４参照）。要約すると、ビオラセインは、高い医学的価値を有すると共に、広く産業的に応用される可能性を有する。
ビオラセインを産生する菌株の中でも、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）が最も集中的に研究されてきた。Ｃ．ビオラセウムの完全ゲノム配列は、２００３年に解読が完了し、ビオラセインの生合成経路分析及び応用の基礎を与えた。ビオラセイン生合成遺伝子クラスタは、４つの関連遺伝子から成ると以前報告されていたが、近年、ビオラセイン生合成経路のほぼ全体が明らかになり、５番目の遺伝子（ｖｉｏＥ）が見出された。ビオラセイン生合成には、ｖｉｏＡ、ｖｉｏＢ、ｖｉｏＣ、ｃｉｏＤ、及びｖｉｏＥを含む５遺伝子から成り、７．３ｋｂに及ぶ１遺伝子クラスタが関与している。
デオキシビオラセインは、ビオラセインよりも酸素原子が１つ少ない構造類似体であり、一般に、ビオラセイン生合成の副産生物として生じる。青紫色色素中のデオキシビオラセインの比率は非常に低く、ビオラセイン産生の僅か１０分の１の量であるため、デオキシビオラセインの性質及び機能を分析するために十分な量のデオキシビオラセインを得ることは困難である。今日まで、デオキシビオラセインの単離方法及び技術に関する研究は、国際的にはほとんど行われていない。更に、産生量が少なく、且つ単離及び精製が困難であるため、デオキシビオラセインの性質及び生物活性についてほとんど研究されていない。現在、原生動物に対する阻害活性（非特許文献５参照）を除いて、デオキシビオラセインが特殊な機能を有することは知られていない。本発明者らは、以前、デオキシビオラセインがビオラセインよりも優れた染色作用及び抗細菌活性を有していることを示した。したがって、デオキシビオラセインがビオラセインのような用途を有する可能性があり、デオキシビオラセインに対する基礎研究及び応用研究を強化することは、科学的にも応用的にも重要な価値があると推測できる。現在、デオキシビオラセインを効率的に産生するための有効な方法を発明することが早急に求められている。
Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｖｉｏｌａｃｅｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐａｔｈｗａｙ ａｎｄ ｉｔｓ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ Ｉｎｄｏｌｏｃａｒｂａｚｏｌｅ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ２００６．７，１２３１−１２４０
Ｋｏｎｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｖｉｏｌａｃｅｉｎ：ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｉｔｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ２００６．１４，８３０７−８３１３
ｄｅ Ｃａｒｖａｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｖｉｏｌａｃｅｉｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ２００６．
Ａｋｉｒａ ＳＨＩＲＡＴＡ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｂｌｕｉｓｈ−Ｐｕｒｐｌｅ Ｐｉｇｍｅｎｔ ａｎｄ Ｕｓｅ ｆｏｒ Ｄｙｅｉｎｇ．Ｊａｐａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ．２０００．３４
Ｍａｔｚ，Ｃ ｅｔ ａｌ．．Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｆｉｌｍ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｅｖａｄｅ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｅｄａｔｉｏｎ ｂｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｆｅｎｓｅ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ，（２００８）３（７）：ｅ２７４４
本発明の目的は、デオキシビオラセインを効率的に産生する組み換え細菌及びその使用を提供することにある。
デオキシビオラセインを産生する組み換え細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ又はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）にデオキシビオラセイン合成関連遺伝子クラスタを導入することにより得られる。前記組み換え細菌は、基質としてＬ−トリプトファンを用いる発酵によりデオキシビオラセインを産生することができた。
この場合、デオキシビオラセイン合成関連遺伝子クラスタは、ＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、ＶｉｏＤ、及びＶｉｏＥを含むビオラセイン合成関連遺伝子クラスタのＶｉｏＤ遺伝子をノックアウトすることにより得られる。
既に報告されている遺伝子クラスタとしては、以下の１）、２）又は３）に示す遺伝子が挙げられる：
１）塩基配列は、配列表の配列番号１に示される。厳しい（ｓｔｒｉｃｔ）条件下で、そのＤＮＡ分子は、配列表の配列番号１に示される塩基配列とハイブリダイズすることができた。前記配列番号１は、ビオラセインの生合成経路における４種の酵素ＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、及びＶｉｏＥをコードする。
２）ＤＮＡ分子は、１）の遺伝子と９９％を超える配列同一性を示し、ビオラセインの生合成経路における４種の酵素ＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、及びＶｉｏＥをコードする。
３）３）におけるＤＮＡ分子は、１）の遺伝子と少なくとも７５％の配列同一性を有することが好ましい。
１）塩基配列は、配列表の配列番号１に示される。厳しい（ｓｔｒｉｃｔ）条件下で、そのＤＮＡ分子は、配列表の配列番号１に示される塩基配列とハイブリダイズすることができた。前記配列番号１は、ビオラセインの生合成経路における４種の酵素ＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、及びＶｉｏＥをコードする。
２）ＤＮＡ分子は、１）の遺伝子と９９％を超える配列同一性を示し、ビオラセインの生合成経路における４種の酵素ＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、及びＶｉｏＥをコードする。
３）３）におけるＤＮＡ分子は、１）の遺伝子と少なくとも７５％の配列同一性を有することが好ましい。
抽出条件は、６×ＳＳＣ及び０．５％ ＳＤＳを含む溶液中で、６８℃にてハイブリダイズさせ、次いで、２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ及び１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳでそれぞれ１回ずつメンブレンを洗浄する。
デオキシビオラセイン生合成遺伝子クラスタも、本発明の保護範囲内にある。
前記遺伝子クラスタを大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬに導入することにより得られる組み換え細菌を、大腸菌ＢＬ−ＤＶと命名した。
大腸菌ＢＬ−ＤＶは、２００８年６月２５日に中国微生物菌株保存管理委員会普通微生物中心（Ｃｈｉｎａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＭＣＣ）、住所：北京市朝陽区北辰西路、中国科学院微生物研究所、郵便番号１００１０１）に寄託されており、アクセッション番号は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５５７である。
前記遺伝子クラスタをシュードモナス・プチダｍｔ−２ ＮＣＩＭＢ １０４３２に導入することにより得られる組み換え細菌を、Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤと命名した。
前記遺伝子クラスタを含む発現カセット、又は遺伝子クラスタ若しくは発現カセットを含む組み換え発現ベクターも本発明の保護範囲内にある。
本発明の第２の目的は、デオキシビオラセインを産生する方法を提供することにある。
デオキシビオラセインを産生する方法は、基質としてＬ−トリプトファンを用いる組み換え大腸菌又は組み換えＰ．プチダの発酵により提供される。
大腸菌ＢＬ−ＤＶを例にとると、デオキシビオラセインを産生するために大腸菌ＢＬ−ＤＶを用いるとき、Ｌ−トリプトファンの濃度は、発酵培地１Ｌ当たり０．３ｇ〜０．５ｇ、特に発酵培地１Ｌ当たり０．４ｇである。発酵温度は、１０℃〜３７℃、特に２０℃である。細胞濃度がＯＤ６００＝０．６〜１．０に達したとき、組み換え細菌に誘導物質が添加されるが、これも本発明の方法に含まれる。選択的に、細胞濃度がＯＤ６００＝０．８に達したときに誘導物質が添加され、前記誘導物質は無作為に選択される。ＩＰＴＧが、大腸菌ＢＬ−ＤＶ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５５７の誘導物質として用いられ、ＩＰＴＧの濃度は、０．７ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．３ｍｍｏｌ／Ｌ、特に１．０ｍｍｏｌ／Ｌである。
組み換えＰ．プチダ−ＶｉｏΔＤを例にとると、Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤを用いてデオキシビオラセインを産生するとき、Ｌ−トリプトファンの濃度は、発酵培地１Ｌ当たり０．３ｇ〜０．５ｇ、特に発酵培地１Ｌ当たり０．４ｇである。発酵培地は、Ｐ．プチダを増殖させるためのいずれの培養培地であってもよく、具体的には、１．０ｇ／Ｌ〜２．０ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、３．０ｇ／Ｌ〜４．０ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ〜１．０ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、７．０ｇ／Ｌ〜８．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、１０ｍＬ／Ｌ〜１５ｍＬ／Ｌの１００ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３ｍＬ／Ｌ〜４ｍＬ／Ｌのグリセロール、及び０．５ｇ／Ｌ〜１．５ｇ／Ｌの酵母抽出物であり、溶媒は水である。細胞濃度がＯＤ６００＝１．０に達したとき、組み換え細菌に誘導物質が添加されるが、これも本発明の方法に含まれる。誘導物質は無作為に選択される。Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤの誘導物質としては、６超の炭素数を有するｎ−アルカン、特にｎ−オクタンが用いられ、ｎ−オクタンの濃度は、具体的には、培地１００ｍＬ当たり０．０５ｍＬである。発酵温度は、２０℃に設定される。
以下に実施される実験方法は、特に明記しない限り、ルーチンな方法である。
（実施例１：デオキシビオラセインを産生する組み換え株）
１）デオキシビオラセイン生合成関連遺伝子クラスタ
デュガネラ（Ｄｕｇａｎｅｌｌａ）属Ｂ２ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２０５６を、液体培地（１５ｇ／Ｌのデンプン、０．０３ｇ／Ｌの硫酸第一鉄、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、０．７ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、０．５ｇ／Ｌのトリプトファン、ｐＨ７．０に調整）に接種し、２００ｒｐｍ、２５℃の条件下で３６時間培養した。ゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｈｅｎｇｇｏｎｇ）のプロトコルに従ってデュガネラ属Ｂ２ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２０５６からゲノムＤＮＡを抽出した。
１）デオキシビオラセイン生合成関連遺伝子クラスタ
デュガネラ（Ｄｕｇａｎｅｌｌａ）属Ｂ２ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２０５６を、液体培地（１５ｇ／Ｌのデンプン、０．０３ｇ／Ｌの硫酸第一鉄、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、０．７ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、０．５ｇ／Ｌのトリプトファン、ｐＨ７．０に調整）に接種し、２００ｒｐｍ、２５℃の条件下で３６時間培養した。ゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｓｈｅｎｇｇｏｎｇ）のプロトコルに従ってデュガネラ属Ｂ２ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２０５６からゲノムＤＮＡを抽出した。
ソフトウェアＯｌｉｇｏ７．１０を用いて、ビオラセイン遺伝子クラスタの配列に基づいて３対のプライマーを設計した。プライマー配列を表１に示す。Ｐ１及びＰ２を用いて、ｖｉｏＡとｖｉｏＢの遺伝子の一部とを増幅させ、増幅産物を断片Ａと命名した。Ｐ３及びＰ４を用いて、ｖｉｏＢの遺伝子の一部及びｖｉｏＣを増幅させ、増幅産物を断片Ｂと命名した。Ｐ５及びＰ６を用いてｖｉｏＥを増幅させ、増幅産物を断片Ｃと命名した。２つのプライマーＰ４とＰ５との間には４８ｂｐの繰り返し配列が存在する（図１）。
プライマーＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、及びＰ６と、高忠実度Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼとを用い、テンプレートであるデュガネラ属のゲノムＤＮＡを増幅させた。ＰＣＲ反応系は、５０μＬ（０．５μｇのＤＮＡテンプレート、２５ｐｍｏｌの上流プライマー、２５ｐｍｏｌの下流プライマー、及び２．５ＵのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ）である。
断片Ａ及び断片Ｂを、表２に示すＰＣＲプログラムＩを用いて増幅させ、断片Ｃを、表２に示すＰＣＲプログラムＩＩを用いて増幅させた。
ＰＣＲ産物である断片Ｂ及びＣを１：１の体積比で混合し、その混合物を１０倍希釈した後、次のＰＣＲ増幅のテンプレートとして用いた。
５０μＬのＰＣＲ反応系は、１．５μＬの断片Ｂと断片Ｃとの混合物、及び２．５ＵのＴａＫａＲａ Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。ＰＣＲプログラムは、ＰＣＲプログラムＩＩＩである。第２の工程後、プログラムを停止させ、２５ｐｍｏｌのＰ３及びＰ６プライマーをそれぞれ反応系に添加し、次いでプログラムの第３の工程及び第４の工程を実行して、断片Ｂ及びＣを組み合わせることにより断片Ｄを産生させた（図１）。ＰＣＲ精製キットを用いて断片Ｄを精製し、次いでｐＭＤ１８−Ｔベクターにクローニングして、配列解析用のｐＭＤ１８−Ｔ−Ｄベクターを得た。配列解析の結果は、断片Ｄの塩基配列が、配列表の配列番号１の３，０５８ｂｐ〜６，１９８ｂｐの５’末端塩基配列であることを示した。
ＰＣＲ増幅により得られたビオラセイン遺伝子クラスタの断片Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの結果を図２に示す。
３，０５７ｂｐの断片ＡをＡｓｅＩ及びＮｏｔＩで切断し、３，１４０ｂｐの断片ＤをｐＭＤ１８−Ｔ−ＤベクターのＸｈｏｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、ＸｈｏｌＩ及びＮｄｅＩで切断した発現ベクターｐＥＴ３０ａをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いることによりライゲーションさせて、組み換え発現ベクターｐＥＴ３０ａＶｉｏΔＤを構築した。組み換え発現ベクターｐＥＴ３０ａＶｉｏΔＤを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有しているＬＢ寒天平板中で形質転換産物を培養した。形質転換体を選択し、培養して、アルカリ法によりプラスミドＤＮＡを抽出した。断片が挿入されていた陽性クローンをスクリーニングして、配列解析した。配列解析により、配列表の配列番号１に示す断片ＶｉｏΔＤの塩基配列が明らかになった。配列番号１の１ｂｐ〜１，３０８ｂｐの５’末端塩基配列は、ビオラセイン生合成経路のＶｉｏＡタンパク質をコードするＶｉｏＡ遺伝子である。配列番号１の１，３０５ｂｐ〜４，３２２ｂｐの５’末端塩基配列は、ビオラセイン生合成経路のＶｉｏＢタンパク質をコードするＶｉｏＢ遺伝子である。配列番号１の４，３２３ｂｐ〜５，６１２ｂｐの５’末端塩基配列は、ビオラセイン生合成経路のＶｉｏＣタンパク質をコードするＶｉｏＣ遺伝子である。配列番号１の５，６２２ｂｐ〜６，１９７ｂｐの５’末端塩基配列は、ビオラセイン生合成経路のＶｉｏＥタンパク質をコードするＶｉｏＥ遺伝子である。ＶｉｏΔＤ断片にはビオラセイン生合成遺伝子クラスタのＶｉｏＤ遺伝子は存在しない。ＶｉｏΔＤは、デオキシビオラセイン生合成関連遺伝子クラスタである。
３，０５７ｂｐの断片ＡをＡｓｅＩ及びＮｏｔＩで切断し、３，１４０ｂｐの断片ＤをｐＭＤ１８−Ｔ−ＤベクターのＸｈｏｌＩ及びＮｏｔＩで切断し、ＳａｌＩ及びＮｄｅＩで切断した発現ベクターｐＣＯＭ１０（Ｓｍｉｔｓ Ｔ．Ｈ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ ａｌｋａｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｅ．ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ．Ｐｌａｓｍｉｄ ２００１．４６，１６−２４．）（清華大学）をＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いることによりライゲーションさせて、組み換え発現ベクターｐＣＯＭ１０ＶｉｏΔＤを構築した。
２）発現ホストの選択
ａ）組み換えベクターｐＥＴ３０ａＶｉｏΔＤを大腸菌ＢＬ２１及び大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬに形質転換して、組み換え大腸菌ＢＬ２１−ＶｉｏΔＤ及び大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ−ＶｉｏΔＤを得た。ｐＥＴ３０ａを大腸菌ＢＬ２１及び大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬに形質転換することにより得られた組み換え株大腸菌ＢＬ２１−ｐＥＴ３０ａ及び大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ−ｐＥＴ３０ａを対照として用いた。
ａ）組み換えベクターｐＥＴ３０ａＶｉｏΔＤを大腸菌ＢＬ２１及び大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬに形質転換して、組み換え大腸菌ＢＬ２１−ＶｉｏΔＤ及び大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ−ＶｉｏΔＤを得た。ｐＥＴ３０ａを大腸菌ＢＬ２１及び大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬに形質転換することにより得られた組み換え株大腸菌ＢＬ２１−ｐＥＴ３０ａ及び大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ−ｐＥＴ３０ａを対照として用いた。
組み換え株を３７℃でＬＢ培地中にて培養し、ＯＤ６００が０．７に達したとき、２０℃で３０時間、０．１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。発酵ブロスの５０ｍＬのアリコートを回収し、７，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、細胞ペレットを５ｍＬのエタノールですすぎ、Ｗｈｉｒｌｐｏｏｌミキサで混合し、次いで２００Ｗの超音波洗浄器内で３０分間振盪し、次いで９，０００×ｇで１０分間遠心分離して、エタノール溶液を回収した。
大腸菌ＢＬ２１−ｐＥＴ３０ａ、大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ−ｐＥＴ３０ａ、及び大腸菌ＢＬ２１−ＶｉｏΔＤから青色色素は得られなかったが、大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ−ＶｉｏΔＤでは青色色素が合成された。これは、組み換え発現ベクターｐＥＴ３０ａＶｉｏΔＤに由来するデオキシビオラセイン産生のための４種の酵素が正しく発現しなかった、又は１種／数種の酵素が大腸菌ＢＬ２１中で非常に少量しか発現しなかったが、大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬでは正しく発現したことを示す。したがって、デオキシビオラセイン生合成遺伝子クラスタに稀にしか発現しないコードが存在すると推測することができる。デオキシビオラセインを産生する大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ−ＶｉｏΔＤを、大腸菌ＢＬ−ＤＶと命名した。
組み換え株ＢＬ−ＤＶから得られた青紫色産物のエタノール溶液の常圧−減圧蒸留産物をメタノールに溶解させ、次いでＡｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×４ｍｍ、５μｍ）を備える高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、Ａｇｉｌｅｎｔ−１１００）により分析した。脱離溶媒は、流速１ｍＬ／分、温度３０℃の７０％メタノールであった。モニタリング波長は、５７０ｎｍであった。
ＨＰＬＣ分析の結果を図３に示す。組み換え株大腸菌ＢＬ−ＤＶ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５５７から得られた色素の保持時間（４．９分間）は、デュガネラ Ｂ２のビオラセイン生合成の副産生物であるデオキシビオラセインと一致しており、ＨＰＬＣのピークは１つだけであった。これら結果は、組み換えベクターｐＥＴ３０ａＶｉｏΔＤがデオキシビオラセイン生合成のための酵素を正しく発現し、大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬにおける触媒によりデオキシビオラセインを合成できることを示す。
図３のＩは、デュガネラ属Ｂ２ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２０５６から得られた色素のＨＰＬＣ結果であり、第１のピークがビオラセイン、第２のピークがデオキシビオラセインである。図３のＩＩは、組み換え株大腸菌ＢＬ−ＤＶから得られた粗色素のＨＰＬＣ結果である。
大腸菌ＢＬ−ＤＶは、２００８年６月２５日に中国微生物菌株保存管理委員会普通微生物中心（ＣＧＭＣＣ、住所：北京市朝陽区北辰西路、中国科学院微生物研究所、郵便番号１００１０１）に寄託されており、アクセッション番号は、ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５５７である。
ｂ）組み換えベクターｐＣＯＭ１０ＶｉｏΔＤを、シュードモナス・プチダｍｔ−２ ＮＣＩＭＢ １０４３２に形質転換して、組み換え体Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤを得た。ｐＣＯＭ１０をシュードモナス・プチダｍｔ−２ ＮＣＩＭＢ １０４３２に形質転換することにより得られた組み換え株Ｐ．プチダ−ｐＣＯＭ１０を対照として用いた。
組み換え株Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤ及びＰ．プチダ−ｐＣＯＭ１０を、３７℃でＬＢ培地中にて培養し、ＯＤ６００が０．７に達したとき、２０℃で３０時間、０．０５％（ｖ／ｖ）のｎ−オクタンを用いて誘導した。発酵ブロスの５０ｍＬのアリコートを回収し、７，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、細胞ペレットを同量の脱イオン水ですすぎ、Ｗｈｉｒｌｐｏｏｌミキサで混合し、次いで７，０００×ｇで１０分間遠心分離して、沈殿を回収した。次いで、細胞ペレットを５０ｍＬのエタノールですすぎ、Ｗｈｉｒｌｐｏｏｌミキサで十分混合し、次いで７，０００×ｇで１０分間遠心分離して、エタノール抽出物を別の清潔な容器に移した。細胞が完全に脱色されるまで上記抽出手順を繰り返した。粗デオキシビオラセインを含む上清を全て回収した。
対照株Ｐ．プチダ−ｐＣＯＭ１０から青色産物は得られなかったが、Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤから青色産物が得られた。
組み換え株Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤから得られた青紫色産物のエタノール溶液の常圧−減圧蒸留産物を１００％メタノールに溶解させ、次いでＡｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×４ｍｍ、５μｍ）を備えるＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ−１１００）により分析した。脱離溶媒は、流速１ｍＬ／分、温度３０℃の７０％メタノールであった。モニタリング波長は、５７０ｎｍであった。
ＨＰＬＣ分析の結果を図４に示す。組み換え株Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤから得られた青色色素の保持時間（４．９分間）は、デュガネラ Ｂ２のビオラセイン生合成の副産生物であるデオキシビオラセインと一致しており、ＨＰＬＣのピークは１つだけであった。これら結果は、青色産物がデオキシビオラセインであり、Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤが、ビオラセイン生合成のための４種の酵素、ＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、及びＶｉｏＥを正しく発現し、次いでデオキシビオラセインを合成できることを示す。
図４のＩは、デュガネラ属Ｂ２ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２０５６から得られた色素のＨＰＬＣ結果であり、第１のピークがビオラセイン、第２のピークがデオキシビオラセインである。図４のＩＩは、Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤから得られた粗色素のＨＰＬＣ結果である。
（実施例２：デオキシビオラセインを産生する組み換え株）
１）デオキシビオラセインを産生する組み換え株大腸菌ＢＬ−ＤＶ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５５７
組み換え株大腸菌ＢＬ−ＤＶ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５５７によるデオキシビオラセイン産生に対する、Ｌ−トリプトファン、誘導物質（ＩＰＴＧ）を添加する細胞濃度（ＯＤ６００）、誘導物質の濃度、及び誘導時間の影響を、４因子及び３水準の直交実験計画により試験した。結果を表３に示す。
１）デオキシビオラセインを産生する組み換え株大腸菌ＢＬ−ＤＶ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５５７
組み換え株大腸菌ＢＬ−ＤＶ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５５７によるデオキシビオラセイン産生に対する、Ｌ−トリプトファン、誘導物質（ＩＰＴＧ）を添加する細胞濃度（ＯＤ６００）、誘導物質の濃度、及び誘導時間の影響を、４因子及び３水準の直交実験計画により試験した。結果を表３に示す。
色素抽出法は、実施例１に示す。色素の濃度は、エタノール溶液中における色素サンプルの最大吸収により測定した。デュガネラ属Ｂ２により産生されるデオキシビオラセインを測定する波長は、５６２ｎｍであり、ブランク対照としてエタノールを用いた。吸光度と色素濃度との検量線に基づいて、相当する色素濃度を得た。全ての測定を３回繰り返し、結果を平均した。色素について得られた吸光係数は、９．０９５５［ｌ／ｇ／ｃｍ］である。
表３の結果は、デオキシビオラセイン産生に対する影響が、細胞濃度＞Ｌ−トリプトファン＞誘導時間＞誘導物質濃度の順に大きいことを示した。最適な組み合わせは、０．４ｇ／ＬのＬ−トリプトファンをＬＢ培地に添加し、１．０ｍｍｏｌ／Ｌの誘導物質（ＩＰＴＧ）及びＯＤ６００＝０．８の細胞濃度でＩＰＴＧ誘導を行うことであると判定された。
前記最適条件で、３回の検証を行ったところ、それぞれ０．１８３ｇ／Ｌ、０．１６５ｇ／Ｌ、及び０．１５３ｇ／Ｌのデオキシビオラセインが産生され、平均は０．１６７ｇ／Ｌであった。
２）デオキシビオラセインを産生する組み換え株Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤ
Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤを、０．４ｇ／ＬのＬ−トリプトファンを含有しているＥ２液体培地（１．３ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、３．０ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．９ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、７．５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、１０ｍＬ／Ｌの１００ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３ｍＬ／Ｌのグリセロール、及び１．０ｇ／Ｌの酵母抽出物、ｐＨ７．０に調整）に接種し、２００ｒｐｍ、３０℃の条件下で一晩培養した。次いで、培養培地（一晩）を、０．４ｇ／ＬのＬ−トリプトファン及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有している新たなＥ２液体培地に、接種材料１０％となるように接種し、３０℃で３時間〜４時間培養し、ＯＤ６００が１．０に達したときに誘導物質ｎ−オクタンを発酵ブロスに添加した。次いで培養温度を２０℃に変更して３０時間培養し、次いで遠心分離して細胞を回収した。回収された細胞をエタノールと十分に混合し、青紫色色素のエタノール抽出物を遠心分離により細胞から分離した。
Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤを、０．４ｇ／ＬのＬ−トリプトファンを含有しているＥ２液体培地（１．３ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、３．０ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．９ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、７．５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、１０ｍＬ／Ｌの１００ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３ｍＬ／Ｌのグリセロール、及び１．０ｇ／Ｌの酵母抽出物、ｐＨ７．０に調整）に接種し、２００ｒｐｍ、３０℃の条件下で一晩培養した。次いで、培養培地（一晩）を、０．４ｇ／ＬのＬ−トリプトファン及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有している新たなＥ２液体培地に、接種材料１０％となるように接種し、３０℃で３時間〜４時間培養し、ＯＤ６００が１．０に達したときに誘導物質ｎ−オクタンを発酵ブロスに添加した。次いで培養温度を２０℃に変更して３０時間培養し、次いで遠心分離して細胞を回収した。回収された細胞をエタノールと十分に混合し、青紫色色素のエタノール抽出物を遠心分離により細胞から分離した。
デュガネラ属Ｂ２ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２０５６を、液体培地（１５ｇ／Ｌのデンプン、０．０３ｇ／Ｌの硫酸第一鉄、１ｇ／Ｌの硝酸カリウム、０．７ｇ／Ｌのリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、０．５ｇ／Ｌのトリプトファン、ｐＨ７．０に調整）に接種し、２００ｒｐｍ、２５℃の条件下で３６時間培養し、次いで遠心分離して細胞を回収した。回収された細胞をエタノールと十分に混合し、青紫色色素のエタノール抽出物を遠心分離により細胞から分離した。
２種の青紫色産物をＨＰＬＣにより分析した。この方法は、実施例１に示す。
Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤの青紫色産物のＨＰＬＣ結果は、前記青紫色産物がデオキシビオラセインであることを示した。デュガネラ属Ｂ２ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２０５６の青紫色産物のＨＰＬＣ結果は、前記青紫色産物がビオラセインとデオキシビオラセインとの混合物であることを示した。
Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤ及びデュガネラ属Ｂ２ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２０５６により産生されるデオキシビオラセインの定量分析を実施した。
最大吸収における青紫色色素のエタノール溶液の吸光度を測定することにより、定量分析を実施した。デュガネラ属Ｂ２により産生されるデオキシビオラセインを測定するための波長は、５６２ｎｍであり、ブランク対照としてエタノールを用いた。吸光度と色素濃度との検量線に基づいて、相当する色素濃度を得た。全ての測定を３回繰り返し、結果を平均した。吸光係数は、１４．８５２［ｌ／ｇ／ｃｍ］である。
定量分析の結果は、Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤのデオキシビオラセイン産生が最も多く、最終産物は１．５ｇ／Ｌ（平均）であることを示した。これは、デュガネラ属Ｂ２ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２０５６により産生されるデオキシビオラセイン（０．１６ｇ／Ｌ）よりも遥かに多い。
デオキシビオラセインは、多くの野生株におけるビオラセイン生合成の副産生物であり、生産性が低く且つ分離が困難であるため、科学的研究、大規模生産、及び応用が全体的に限定されている。大腸菌ＢＬ−ＤＶ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５５７及びＰ．プチダ−ＶｉｏΔＤは、高収量でデオキシビオラセインを産生することができた。Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中における液体発酵を用いた、大腸菌ＢＬ−ＤＶ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５５７によるデオキシビオラセイン産生は、発酵ブロス１Ｌ当たり０．１７ｇに達し、Ｐ．プチダ−ＶｉｏΔＤによるデオキシビオラセイン産生は、発酵ブロス１Ｌ当たり１．５ｇに達した。更に、産生されるデオキシビオラセインは、抽出が簡便であり、且つ分離及び精製が容易である。組み換え株は、大腸菌又はＰ．プチダであり、これらはデオキシビオラセイン産生のために容易に制御及び工業化することができる。
Claims (23)
- ＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、ＶｉｏＤ、及びＶｉｏＥを含む天然ビオラセイン合成関連遺伝子クラスタのＶｉｏＤ遺伝子をノックアウトすることにより得られ、配列表の配列番号１に示される塩基配列を有するＤＮＡ分子であることを特徴とするデオキシビオラセイン合成関連遺伝子クラスタ。
- 請求項１に記載のデオキシビオラセイン合成関連遺伝子クラスタを大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬに導入することにより得られることを特徴とするデオキシビオラセインを産生する組み換え大腸菌。
- 組み換え大腸菌が、大腸菌ＢＬ−ＤＶ ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．２５５７である請求項２に記載の組み換え大腸菌。
- 請求項１に記載のデオキシビオラセイン合成関連遺伝子クラスタをＰ．プチダｍｔ−２に導入することにより得られることを特徴とするデオキシビオラセインを産生する組み換えシュードモナス・プチダ。
- シュードモナス・プチダが、シュードモナス・プチダｍｔ−２ ＮＣＩＭＢ １０４３２（ＶｉｏＡＢＣＥ）である請求項４に記載の組み換えシュードモナス・プチダ。
- 請求項１に記載のデオキシビオラセイン合成関連遺伝子クラスタを含むことを特徴とする発現カセット。
- 請求項１に記載のデオキシビオラセイン合成関連遺伝子クラスタ、又は請求項６に記載の発現カセットを含むことを特徴とする組み換え発現ベクター。
- 請求項２又は３に記載の組み換え大腸菌が、基質としてＬ−トリプトファンを用いる発酵によりデオキシビオラセインを産生することを特徴とするデオキシビオラセインの産生方法。
- Ｌ−トリプトファンの濃度が、０．３ｇ／Ｌ〜０．５ｇ／Ｌである請求項８に記載の方法。
- Ｌ−トリプトファンの濃度が、０．４ｇ／Ｌである請求項８又は９に記載の方法。
- 発酵温度が、１０℃〜３７℃である請求項１０に記載の方法。
- 発酵温度が、２０℃である請求項１１に記載の方法。
- 組み換え株の細胞濃度がＯＤ６００＝０．６〜１．０に達したとき、前記組み換え株に誘導物質を添加する請求項１２に記載の方法。
- 細胞濃度が、ＯＤ６００＝０．８である請求項１３に記載の方法。
- 誘導物質が、ＩＰＴＧであり、且つ前記ＩＰＴＧ濃度が、０．７ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．３ｍｍｏｌ／Ｌである請求項１３又は１４に記載の方法。
- ＩＰＴＧ濃度が、１．０ｍｍｏｌ／Ｌである請求項１５に記載の方法。
- 請求項４又は５に記載の組み換えシュードモナス・プチダを発酵させて、基質としてＬ−トリプトファンを用いることによりデオキシビオラセインを産生させることを特徴とするデオキシビオラセインの産生方法。
- Ｌ−トリプトファンの濃度が、０．３ｇ／Ｌ〜０．５ｇ／Ｌである請求項１７に記載の方法。
- Ｌ−トリプトファンの濃度が、０．４ｇ／Ｌである請求項１７に記載の方法。
- 発酵培地が、１．０ｇ／Ｌ〜２．０ｇ／ＬのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、３．０ｇ／Ｌ〜４．０ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ〜１．０ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、７．０ｇ／Ｌ〜８．０ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４・３Ｈ２Ｏ、１０ｍＬ／Ｌ〜１５ｍＬ／Ｌの１００ｍＭ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３ｍＬ／Ｌ〜４ｍＬ／Ｌのグリセロール、及び０．５ｇ／Ｌ〜１．５ｇ／Ｌの酵母抽出物であり、溶媒が水である請求項１９に記載の方法。
- 細胞濃度がＯＤ６００＝１．０に達したとき、前記組み換え株に誘導物質を添加する請求項２０に記載の方法。
- 誘導物質が、ｎ−オクタンであり、且つ前記ｎ−オクタン濃度が、培地１００ｍＬ当たり０．０５ｍＬである請求項２１に記載の方法。
- 発酵温度が、２０℃である請求項２２に記載の方法。
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