CN112063680B - 泊沙康唑中间体(2s,3r)-2-苄氧基-3-戊醇的生物催化制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了泊沙康唑中间体(2S,3R)‑2‑苄氧基‑3‑戊醇的生物催化制备方法，属于生物催化技术领域，具体涉及医药中间体制备技术领域，以解决现有方法存在反应条件苛刻，存在安全隐患，收率低，成本高，还会造成污染的问题，包括如下步骤：构建突变型酮基还原酶载体；发酵培养得到突变型酮基还原酶的菌泥；用磷酸钠盐缓冲液均质上述菌泥，离心收集离心液即为粗酶液；在(2S)‑2‑苄氧基‑3‑戊酮、辅酶和酮基还原酶的反应体系中，进行不对称还原反应，得到(2S,3R)‑2‑苄氧基‑3‑戊醇。本发明绿色，安全，经济，产品光学选择性强，ee值大于99％；纯度大于98％，且杂质较少收率高，适合工业化生产。

Description

泊沙康唑中间体(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的生物催化制备 方法
技术领域
泊沙康唑中间体(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的生物催化制备方法，本发明属于生物催化技术领域，具体涉及医药中间体制备技术领域。
背景技术
近20年来，由于广谱抗菌药、皮质激素、抗癌药物和免疫抑制剂的广泛使用，以及艾滋病的流行，深部真菌感染已成为导致癌症、造血干细胞移植及一些免疫力低下的患者死亡的主要原因。但目前治疗深部真菌感染特别是曲霉病的治疗，现在的抗真菌药得不到满意的疗效，临床迫切需要开发一些新的高效、广谱、低毒的抗真菌药。
泊沙康唑(Posaconazole，商品名为Noxafil)是Schering-Plough公司研发的第三代抗真菌药物。2005年12月在德国首次上市，2006年3月在英国上市，2006年9月18日获得美国FDA批准。泊沙康唑抗菌谱广，对于念珠菌属、荚膜组织胞浆菌、赛多孢子菌、双极菌接合菌、镰刀菌、酵母菌，包括耐氟康唑的非白色念珠菌株、新型隐球菌和曲霉菌都有强大的抑制活性；尤其是对比较罕见、但威胁生命的真菌疾病(接合菌病、镰刀菌病和球孢子菌病等)也有效。因此，主要用于多种对两性霉素不能耐受或难治性成人侵袭性真菌感染的治疗和预防。
泊沙康唑是一个具有4个手性中心的小分子化合物，现有技术条件下的合成方法都是采用的汇聚式合成方法。(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇是制备泊沙康唑的中间体。
现有文献报道的(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的制备方法均为化学合成法，一是通过将羰基还原的方式得到一对非对映异构体，经过后期转化，然后在手性助剂的作用下进行拆分。如专利WO9633178公开的一种泊沙康唑制备方法。其合成路线如下(式1)：
Figure BDA0002644713580000011
该方法在还原化合物4的过程中，使用硼氢化锂/溴化锌反应，原位生成硼氢化锌进行还原，以提高还原反应的光学选择性。硼氢化锂活性较高，易制爆而受管制，不适合工业化实施。而且，该方法还原反应选择性较差，所得化合物5中两种非对映异构体比例只有88:12，有部分不需要的异构体产生，导致收率低，生产成本大大增加。
二是中国专利CN103936564A公开的一种泊沙康唑中间体(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的制备方法,(2S)-2-苄氧基-3-戊酮4在手性催化剂作用下直接用硼烷进行手性还原得到(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇11。其合成路线如下(式2)：
Figure BDA0002644713580000021
该方法虽然得到ee值大于99％的高选择性产品，但是其配体成本较高；反应对水、氧气敏感，因此工艺操作条件苛刻，需氮气保护，无水无氧；反应后还需淬灭，体系出现强烈放热，存在明显的安全隐患。
三是通过手性助剂诱导的方式，实现格氏试剂对醛的高选择性不对称加成来获得立体专一性的化合物11。如中国专利CN102795972A公开的一种泊沙康唑中间体(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的制备方法，醛在手性助剂诱导下与乙基格氏试剂进行加成，得到ee值大于99％的产物，光学选择性强。但是该方法需要大量的手性诱导剂不容易得到，价格相当昂贵，其来源成了最大的缺陷，而且在反应后期无法回收，造成很大污染。
发明内容
本发明的目的在于：提供泊沙康唑中间体(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的生物催化制备方法，以解决现有方法存在反应条件苛刻，存在安全隐患，收率低，成本高，还会造成污染的问题。
本发明采用的技术方案如下：
泊沙康唑中间体(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的生物催化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建突变型酮基还原酶载体；
(2)发酵培养得到突变型酮基还原酶的菌泥；
(3)用磷酸钠盐缓冲液均质上述菌泥，离心收集离心液即为粗酶液；
(4)在(2S)-2-苄氧基-3-戊酮、辅酶和酮基还原酶的反应体系中，进行不对称还原反应，得到(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇。
反应式如下：
Figure BDA0002644713580000031
本申请的技术方案中，将构建好的重组质粒进行定点突变，优选出含B144突变片段的E.coli BL21-pET21c-KRED突变体，再进行发酵培养得到菌泥，用磷酸钠盐缓冲液均质上述菌泥，离心收集离心液即为粗酶液，利用来源于酮基还原酶的新型催化反应体系，通过生物催化还原高效获得(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇，底物(2S)-2-苄氧基-3-戊酮的转化率高达99％以上，产物(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的手性纯度高达99％以上，得到了高化学纯度和高光学纯度的(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇，然后进一步进行后续反应，生产泊沙康唑关键中间体，本发明方法和反应体系有高立体选择性、高催化活性、以及对有机溶剂的高耐受性、对底物的耐受性，从而可以在较高的底物浓度下，进行大规模生产；极大地提高生产效率，降低生产成本；绿色环保，与化学法相比，本发明显著减少或消除了各类污染性化学品的使用，从而显著降低了环境污染风险。
优选的，构建突变型酮基还原酶载体的方法包括如下步骤：
(a)以Lachnellula hyalina的酮基还原酶KRED序列为已知序列，菌株编号为azaE_1，NCBI上登录号为：XM_031150188，酮基还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，酮基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(b)通过PCR扩增得到KRED核苷酸片段，将KRED核苷酸片段与质粒载体pET21c连接，并转化到大肠杆菌E.coli，菌株感受态为BL21，得到基因工程菌E.coli-pET21c-KRED；
(c)对基因工程菌E.coli-pET21c-KRED上的KRED中F85T苯丙氨酸突变为甘氨酸acc、T124G苏氨酸突变为甘氨酸gaa、Y144K酪氨酸突变为赖氨酸aag、S168W丝氨酸与变为色氨酸tgg、M192S9蛋氨酸突变为丝氨酸agt、K227Y赖氨酸突变为酪氨酸tac、E253V谷氨酸突变为缬氨酸gta及I278A异亮氨酸突变为丙氨酸gcg，8个氨基酸位点进行定点突变，得到含突变体的E.coli-pET21c-KRED，即构建的突变型酮基还原酶载体。
优选的，含突变体的E.coli-pET21c-KRED的单菌落接种至300ml的一级种子培养基中，在34-38℃，160-200rpm的条件下培养10-14小时，OD600达到0.6，缓慢降温至26-30℃时加入诱导剂IPTG，再表达18-10h，离心后获得菌泥。
优选的，将含突变体的E.coli-pET21c-KRED一级种子300ml接种至30L的发酵培养基中，34-38℃，pH6.5-7.5培养15-19h，OD600达到25-30时，缓慢降温至28℃时加入诱导剂IPTG，再表达12-14h，离心，获得含突变体的E.coli-pET21c-KRED菌泥。
更为优选的，将含突变体的E.coli-pET21c-KRED一级种子300ml接种至30L的发酵培养基中，36℃，pH6.9培养17h，OD600达到25-30时，缓慢降温至28℃时加入诱导剂IPTG，再表达12-14h，离心，获得含突变体的E.coli-pET21c-KRED菌泥。
优选的，步骤(3)中加菌泥2.5-3.5倍pH5.5-6.5的磷酸缓冲盐溶液高压匀浆破碎，离心收集离心液即为粗酶液。
更为优选的，步骤(3)中加菌泥3倍pH6的磷酸缓冲盐溶液高压匀浆破碎，离心收集离心液即为粗酶液。
优选的，步骤(4)中反应体系中还包括磷酸缓冲盐溶液、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖，辅酶为氧化性辅酶NAD+，(2S)-2-苄氧基-3-戊酮的浓度为0.25-5.0mol/L，磷酸缓冲盐溶液浓度为0.01-0.2mol/L，磷酸缓冲盐溶液的pH为6.0-8.5，辅酶的浓度为0.05-0.5mol/L，葡萄糖的浓度为0.5-0.95mol/L，酮基还原酶的浓度为38-44U/L，葡萄糖脱氢酶的浓度为4-6U/L。
更为优选的，步骤(4)中反应体系中还包括磷酸缓冲盐溶液、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖，辅酶为氧化性辅酶，(2S)-2-苄氧基-3-戊酮的浓度为0.5-1.5mol/L，磷酸缓冲盐溶液浓度为0.1mol/L，磷酸缓冲盐溶液的pH为7.0，辅酶的浓度为0.3mol/L，葡萄糖的浓度为0.65mol/L，酮基还原酶的浓度为41U/L，葡萄糖脱氢酶的浓度为5U/L。
优选的，反应体系用10％的碳酸钠控制pH至4.0-9.0，反应温度为10-50℃，搅拌时间16-24h。
优选的，反应体系用10％的碳酸钠控制pH至5.0-5.5，反应温度为29-32℃，搅拌时间20h。
一级种子培养基即菌种培养基，包括蛋白胨：10g/L、酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，氨苄霉素100mg/L，余量为自来水。
发酵培养基，包括蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，七水硫酸镁3.63g/L，磷酸二氢钾13.8g/L，氢氧化钾2.35g/L，葡萄糖15g/L，甘油8g/L，消泡剂0.5g/L，氨苄霉素：0.01g/L，余量为自来水。
上述培养基灭菌后再使用。
本申请中，离心菌体，用有机溶剂萃取，浓缩有机层，有机溶剂选自二氯甲烷，乙酸乙酯，醋酸异丙酯，甲基叔丁基醚，甲苯等，优选甲基叔丁基醚；
质粒载体pET21c及大肠杆菌E.coli BL21来自市售；
定点突变试剂盒为TIANGEN快速定点突变试剂盒，来自市售；
IPTG为异丙基硫代半乳糖苷；
酮基还原酶既可还原酮基又可还原羰基；
PBS磷酸缓冲盐溶液；
Lachnellula hyalina为现有菌种，可购买得到。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明中，利用来源于酮基还原酶的新型催化反应体系，通过生物催化还原高效进行生产；
2、本发明适合工业化生产具有高化学纯度和高光学纯度的式11化合物，然后进一步进行后续反应，生产泊沙康唑关键中间体；
3、本发明方法和反应体系有高立体选择性、高催化活性、以及对有机溶剂的高耐受性、对底物的耐受性，从而可以在较高的底物浓度下，进行大规模生产；
4、本发明极大地提高生产效率，降低生产成本；
5、绿色环保，与化学法相比，本发明显著减少或消除了各类污染性化学品的使用，从而显著降低了环境污染风险；
6、按照本发明方法，转化后得到的(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇de值大于99％，纯度大于98％。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
突变体的设计与构建
(1)以Lachnellula hyalina(azaE_1)中获得的酮基还原酶(KRED)序列为已知序列，NCBI上登录号为：XM_031150188。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2。
核苷酸序列如SEQ ID NO.1序列：
Figure BDA0002644713580000051
Figure BDA0002644713580000061
氨基酸序列如SEQ ID NO.2：
Figure BDA0002644713580000062
(2)通过PCR扩增得到KRED核苷酸片段，将KRED核苷酸片段与质粒载体pET21c连接，并入大肠杆菌E.coli，菌株感受态为BL21，得到基因工程菌E.coli-pET21c-KRED；
(c)对基因工程菌E.coli-pET21c-KRED上的KRED中F85T苯丙氨酸突变为甘氨酸acc、T124G苏氨酸突变为甘氨酸gaa、Y144K酪氨酸突变为赖氨酸aag、S168W丝氨酸与变为色氨酸tgg、M192S9蛋氨酸突变为丝氨酸agt、K227Y赖氨酸突变为酪氨酸tac、E253V谷氨酸突变为缬氨酸gta及I278A异亮氨酸突变为丙氨酸gcg，8个氨基酸位点进行定点突变，得到含突变体的E.coli-pET21c-KRED，即构建的突变型酮基还原酶载体。
实施例2
将E.coli-pET21c-KRED的单菌落(含突变体)接种至300ml的一级种子培养基中，在36℃，180rpm的条件下培养12小时，OD600达到0.6，缓慢降温至28℃时加入诱导剂IPTG，再表达18-10h，离心获得菌泥。
实施例3
酶活检测及优势菌株的筛选：
方法：向试管中加入1450ul PBs、200ul异丙醇、50ulNAD+、100ul底物，放入30℃，200rpm的摇床中预热10min后，加入200ul酶液(菌泥：PBS＝1：3)反应10min。加入甲醇中止反应；12000rpm离心2min，取上清稀释2倍，测HPLC。
计算：根据产物峰面积计算产物的浓度为X，乘以稀释倍数，除以反应时间10min即为总酶活。
表1不同突变体的酶活
菌株 酶活(U/g)
原始菌种 12
B85突变片段 25
B124突变片段 13
B144突变片段 41
B168突变片段 10
M192突变片段 9
K227突变片段 35
E253突变片段 19
I278突变片段 22
从表1可以看出，含B144突变片段的大肠杆菌发酵后酶活较高，作为优势菌种，进行发酵罐发酵培养。
实施例4
发酵培养及粗酶液的制备
(1)将培养好的E.coli-pET21c-KRED(B144突变)一级种子200ml接种到30L发酵培养基中，36℃，PH至6.9培养17h，OD600达到25-30时，缓慢降温至28℃时加入诱导剂IPTG，再表达12-14h，离心，获得E.coli-pET21c-KRED(B144突变)菌泥；
(2)将上述菌泥加3倍质量的PH至6.0的PBS高压匀浆破碎，离心收集离心液即为粗酶液。
实施例5
最适pH筛选
筛选体系：100ml体系，0.1mol/L的磷酸钠盐缓冲液，0.3mmol/L的NAD+，0.65mol/L的葡萄糖，1.0mol/L的底物、酮基还原酶的添加量为41U/g，葡萄糖脱氢酶的添加量为5U/g.温度控制在30-32℃，然后再用10％碳酸钠分别控制PH在(4.5-5.0,5.0-5.5,5.5-6.0,6.0-6.5，6.5-7.0)，搅拌20h，研究结果表明，本反应的最佳PH为5.0到5.5。
表1不同PH对本反应的影响
PH 转化率
4.5-5.0 90.5％
5.0-5.5 98.8％
5.5-6.0 96.7％
6.0-6.5 86.3％
6.5-7.0 67.9％
实施例6
最适温度筛选
筛选体系：100ml体系，0.1mol/L的磷酸钠盐缓冲液，0.3mmol/L的NAD+,0.65mol/L的葡萄糖，1.0mol/L的底物、酮基还原酶的添加量为50U/g，葡萄糖脱氢酶的添加量为6U/g。然后用10％碳酸钠控制PH在5.0-5.5，温度分别控制在25-28℃,29-32℃,33-36℃,36-40℃，搅拌20h，研究结果表明，本反应的最佳温度为30-32℃。
表2不同温度对反应的影响
温度 转化率
25-28℃ 90.7％
29-32℃ 99.7％
33-36℃ 87.4％
36-40℃ 75.9％
实施例7
金属离子对反应的影响
反应体系：100ml体系，0.1mol/L的磷酸钠盐缓冲液，0.3mmol/L的NAD+,0.65mol/L的葡萄糖，1.0mol/L的底物、酮基还原酶的添加量为41U/g，葡萄糖脱氢酶的添加量为5U/g。然后，分别添加终浓度为1mmol/L的不同金属离子(CoCl2、CaCl2、CuSO4、FeSO4、ZnCl2)再用10％碳酸钠控制pH在5.0-5.5，温度控制在29-32℃，搅拌20h，研究结果表明，Zn2+对本反应有促进作用。
表3金属离子对反应的影响
金属离子 转化率
CoCl<sub>2</sub> 90.1％
CaCl2 85.4％
CuSO4 90.4％
FeSO4 87.8％
ZnCL2 98.9％
实施例8
葡萄糖浓度对辅酶NAD再生以及对反应的影响
反应体系：100ml体系，0.1mol/L的磷酸钠盐缓冲液，0.3mmol/L的NAD+,1.0mol/L的底物、酮基还原酶的添加量为41U/L，葡萄糖脱氢酶的添加量为5U/g。然后，分别添加不同浓度的葡萄糖(0.5mol/L、0.65mol/L、0.8mol/L、0.95mol/L)，再用10％碳酸钠控制PH在5.0-5.5，温度控制在29-32℃，搅拌20h，研究结果表明，葡萄糖浓度为0.65mol/L时可以实现辅酶再生，反应完全。
表4葡萄糖浓度对反应的影响
葡萄糖浓度 转化率
0.5mol/L 86.6％
0.65mol/L 98.9％
0.8mol/L 98.1％
0.95mol/L 99.4％
本发明所用到的葡萄糖脱氢酶为苏州汉酶生物技术有限公司提供。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.泊沙康唑中间体(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的生物催化制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建突变型酮基还原酶载体；构建突变型酮基还原酶载体的方法包括如下步骤：
(a)以Lachnellula hyalina的酮基还原酶KRED序列为已知序列，菌株编号为azaE_1，NCBI上登录号为：XM_031150188，酮基还原酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，酮基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(b)通过PCR扩增得到KRED核苷酸片段，将KRED核苷酸片段与质粒载体pET21c连接，并转入大肠杆菌E.coli，菌株感受态为BL21，得到基因工程菌E.coli-pET21c-KRED；
(c)对基因工程菌E.coli-pET21c-KRED上的KRED中Y144K酪氨酸突变为赖氨酸aag、K227Y赖氨酸突变为酪氨酸tac、E253V谷氨酸突变为缬氨酸gta及I278A异亮氨酸突变为丙氨酸gcg，氨基酸位点分别进行定点突变，分别得到含突变体的E.coli-pET21c-KRED，即构建的突变型酮基还原酶载体；
(2)发酵培养得到突变型酮基还原酶的菌泥；
(3)用磷酸钠盐缓冲液均质上述菌泥，离心收集离心液即为粗酶液；
(4)在(2S)-2-苄氧基-3-戊酮、辅酶和酮基还原酶的反应体系中，进行不对称还原反应，得到(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇。
2.根据权利要求1所述的泊沙康唑中间体(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的生物催化制备方法，其特征在于，含突变体的E.coli-pET21c-KRED的单菌落接种至300ml的一级种子培养基中，在34-38℃，160-200rpm的条件下培养10-14小时，OD600达到0.6，缓慢降温至26-30℃时加入诱导剂IPTG，再表达18-10h，离心后获得菌泥。
3.根据权利要求2所述的泊沙康唑中间体(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的生物催化制备方法，其特征在于，将含突变体的E.coli-pET21c-KRED一级种子300ml接种至30L的发酵培养基中，34-38℃，pH6.5-7.5培养15-19h，OD600达到25-30时，缓慢降温至28℃时加入诱导剂IPTG，再表达12-14h，离心，获得含突变体的E.coli-pET21c-KRED菌泥。
4.根据权利要求1所述的泊沙康唑中间体(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的生物催化制备方法，其特征在于，步骤(3)中加菌泥2.5-3.5倍pH5.5-6.5的磷酸缓冲盐溶液高压匀浆破碎，离心收集离心液即为粗酶液。
5.根据权利要求4所述的泊沙康唑中间体(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的生物催化制备方法，其特征在于，步骤(3)中加入菌泥3倍量pH＝6的磷酸缓冲盐溶液，混匀后高压匀浆破碎，离心收集离心液即为粗酶液。
6.根据权利要求1所述的泊沙康唑中间体(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的生物催化制备方法，其特征在于，步骤(4)中反应体系中还包括磷酸缓冲盐溶液、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖，辅酶为氧化性辅酶NAD+，(2S)-2-苄氧基-3-戊酮的浓度为0.25-5.0mol/L，磷酸缓冲盐溶液浓度为0.01-0.2mol/L，磷酸缓冲盐溶液的pH为6.0-8.5，辅酶的浓度为0.05-0.5mol/L，葡萄糖的浓度为0.5-0.95mol/L，酮基还原酶的浓度为38-44U/L，葡萄糖脱氢酶的浓度为4-6U/L。
7.根据权利要求6所述的泊沙康唑中间体(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的生物催化制备方法，其特征在于，步骤(4)中反应体系中还包括磷酸缓冲盐溶液、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖，辅酶为氧化性辅酶，(2S)-2-苄氧基-3-戊酮的浓度为0.5-1.5mol/L，磷酸缓冲盐溶液浓度为0.1mol/L，磷酸缓冲盐溶液的pH为7.0，辅酶的浓度为0.3mol/L，葡萄糖的浓度为0.65mol/L，酮基还原酶的浓度为41U/L，葡萄糖脱氢酶的浓度为5U/L。
8.根据权利要求6或7所述的泊沙康唑中间体(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的生物催化制备方法，其特征在于，反应体系用10％的碳酸钠控制pH至4.0-6.5，反应温度为10-50℃，搅拌时间16-24h。
9.根据权利要求8所述的泊沙康唑中间体(2S,3R)-2-苄氧基-3-戊醇的生物催化制备方法，其特征在于，反应体系用10％的碳酸钠控制pH至5.0-5.5，反应温度为29-32℃，搅拌时间20h。
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