CN106282205A - 一种高比活l-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种高比活l-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体及其制备方法和应用，其核苷酸序列如SEQ ID No 64所示，其编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No 65所示。采用分子体外重组技术筛选高活性L-谷氨酸氧化酶基因，通过载体构建、酶活性筛选以及多位点突变技术等制备得到所述高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体，该多位点突变体在同一基因上含有9个不同突变位点，使该多位点突变体对L-谷氨酸的氧化专一性和比活性均大幅度提高，可应用于检测食物中L-谷氨酸的含量。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一种来源于淀粉酶产色链霉菌的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体及其制备方法和应用。
背景技术
L-谷氨酸氧化酶(L-Glutamate oxidase，LGOX)能专一地催化谷氨酸氧化成α-酮戊二酸和过氧化氢，因此，通过过氧化氢含量的变化可以方便地测定谷氨酸的含量。然而，主要因为L-谷氨酸氧化酶产品的来源问题还未从根本上得到解决，使得L-谷氨酸氧化酶的价格还很昂贵，导致其应用受到限制。
1983年，日本人Kamei等首次从浅紫链霉菌(Streptomyces violascens)麦麸培养基抽提物中发现一种能催化谷氨酸氧化产生α-酮戊二酸和过氧化氢的酶，该酶是典型的氧化酶而不是脱氢酶，NAD+，NADP+不能作为该酶的电子受体，因此将其命名为L-谷氨酸氧化酶(Chem Pharm Bull，1983，31，1307-1314)。该酶的分子量约为60KD，具有黄素蛋白(FAD)的特征性吸收光谱(吸收峰为490nm)，每摩尔酶中含有1个摩尔的FAD。底物特异性研究表明，在pH5.0-6.5范围内，它能有效地催化L-谷氨酸的氧化，并且对L-谷氨酰胺、L-酪氨酸和L-组氨酸有微弱的氧化作用；在pH6.8时，对L-谷氨酰胺和L-组氨酸的相对活性分别为L-谷氨酸的32.1％和13.1％，Km值分别3.3和5.0mM。在pH5.0时，对L-谷氨酸和L-谷氨酰胺的Km值分别为1.1mM和10mM。该酶的稳定性较好，在pH3.0-7.0范围内，37℃可稳定1小时。
同年，Kusakabe等从另外一株链霉菌X-119-6(Streptomyces sp.X-119-6)菌株中分离出特异性更好的L-谷氨酸氧化酶，以L-谷氨酸为底物的Km值仅为0.2mM。该酶分子量大约为140000，由三个亚基组成，每个酶分子上结合有2个FAD，最适pH为7.0-8.0。该酶耐热性较强，在pH5.5的条件下，65℃加热15分钟不失活；75℃加热15分钟，活性为87％；85℃加热15分钟，活性仍能保留47％。该酶除催化L-谷氨酸氧化外，仅对L-天冬氨酸有微弱的催化作用(在pH7.4时，相对活性为L-谷氨酸的0.6％)。
1989年，德国Bohmer等从内涂链霉菌(Streptomyces endus)中分离纯化到对L-谷氨酸完全特异的L-谷氨酸氧化酶。其分子量为90000，由两个亚基构成，亚基分子量为50000，每个亚基含有一个非共价结合的FAD。在pH7.0时对L-谷氨酸km值为 1.1mM。2001年，台湾Chen等从普拉特链霉菌NTU3304(Streptomyces platensis NTU3304)纯化获得L-谷氨酸氧化酶，该酶对L-谷氨酸专化性好，用作生物传感器时只对L-谷氨酸反应；2000年俄罗斯Sukhacheva等筛选到一株产L-谷氨酸氧化酶的链霉菌Streptomyces sp.Z-l1-6，经过亚硝酸诱变，酶的比活为50.8U/mg，该酶特异性好，只氧化L-谷氨酸，不受其它氨基酸的影响。2004年，泰国Wachiratianchai等从另一株链霉菌Streptomyces sp.18G中纯化获得了一个新的L-谷氨酸氧化酶，该酶由两个亚基组成分子量为120000，最适pH为pH7.0，对L-谷氨酸底物比较专一，对D-谷氨酸和D-天冬氨酸的相对活性只有0.79％和0.53％。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来源于淀粉酶产色链霉菌的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体及其制备方法和应用，利用DNA分子重排方法和高通量筛选法对L-谷氨酸氧化酶基因进行定向筛选，获得多个与酶活性相关位点，通过多位点突变技术，将所有突变位点整合到一条基因中，获得多位点突变体，该多位点突变体对L-谷氨酸的氧化专一性和比活性均大幅度提高。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体，其核苷酸序列如SEQ ID No 64所示。
在所述多位点突变体编码的氨基酸序列上共有9处突变位点，其中，突变1位点为D32A即第32位上的天冬氨酸被替换为丙氨酸；突变2位点为H54P即第54位上的组氨酸被替换为脯氨酸；突变3位点为Y144F即第144位的酪氨酸被替换为苯丙氨酸；突变4位点为G155D即第155位上的甘氨酸被替换为天冬氨酸；突变5位点为T166K即第166位上的苏氨酸被替换为赖氨酸；突变6位点为T319K即第319位上的苏氨酸被替换为赖氨酸；突变7位点为A362V即第362位上的丙氨酸被替换为缬氨酸；突变8位点为S567F即第569位的丝氨酸被替换为苯丙氨酸；突变9位点为K600R即第600位上的赖氨酸被替换为精氨酸。具体地，所述高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No 65所示。
本发明所述高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体的制备方法，其包括如下步骤：
(1)DNA分子重排
通过基因合成方法合成来源于淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因，以合成 的L-谷氨酸氧化酶基因为模板，扩增L-谷氨酸氧化酶基因，回收1974bp的基因片段，以DNase I进行不完全酶解，并回收小片段；
再对回收的酶解片段进行无引物PCR扩增，然后以无引物PCR产物为模板，SDLG1、SDLG49为引物扩增重排L-谷氨酸氧化酶基因片段，并回收1974bp基因片段。
(2)高比活L-谷氨酸氧化酶基因高通量筛选
将回收的重排L-谷氨酸氧化酶基因片段经BamHI和Sac I双酶切后，构建入原核表达载体pG251(CN1338515)启动子和t1t2终止子之间，电击法转化大肠杆菌菌株DH5α获得突变体表达文库，而后进行质粒提取。将提取的质粒转入大肠杆菌，涂板于含有氨苄青霉素抗生素的培养基上培养，获得抗性转化子。
以40个抗性转化菌落为一个单元，挑入40孔细菌培养板。利用溶菌酶破碎细胞，加入酶测定液，挑取显黄色的加样孔，对该加样孔中的40个单菌进行再一轮的筛选，并对筛选出的突变单菌进行比活以及对谷氨酸底物的专一性测定，从中挑选5个比活性高且谷氨酸底物专一的突变体。
对上述5个突变基因进行DNA序列分析，显示其氨基酸突变有9个位点即D32A，H54P，Y144F，G155D，T166K，T319K，A362V，S567F，K600R。
(3)多位点突变
以L-谷氨酸氧化酶基因为模版，按照多位点突变技术将上述9个位点同时突变即D32A，H54P，Y144F，G155D，T166K，T319K，A362V，S567F，K600R，获得本发明的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体。
进一步，步骤(3)中，以氨基酸突变了3个位点：D32A、Y144F、K600R的L-谷氨酸氧化酶基因为模版，将其氨基酸第54、155、166、319、362、567位进行突变，完成9个位点同时突变即D32A，H54P，Y144F，G155D，T166K，T319K，A362V，S567F，K600R，所述突变所用引物如下：
H54P突变引物：
54Z：GCCGCCTCGGCCCCACCCCCCA
54F：TGGGGGGTGGGGCCGAGGCGGC
G155D突变引物：
155Z：TGGGCCCCTCCACCGGCAGCGAC
155F:GTCGCTGCCGGTGGAGGGGCCCA
T166K突变引物：
166Z：CGTACCCCCGGTGACGTACAAC
166F：GTTGTACGTCACCGGGGGTACG
T319R突变引物：
319Z：CGCAGCGACATCAACCCCAAG
319F:CTTGGGGTTGATGTCGCTGCG
A362V突变引物：
362Z：ACGACCCCAGCCGCGACGTC
362F：GACGTCGCGGCTGGGGTCGT
S569F突变引物：
569Z：GACGCCGCGCGCTGGGACTTG
569F:CAAGTCCCAGCGCGCGGCGTC
本发明制备得到的L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体能够在大肠杆菌中大量表达，可应用于检测食物中L-谷氨酸的含量。
本发明对来自淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因进行定向筛选，获得9个与酶活性相关位点，通过多位点突变技术，将所有突变位点整合到一条基因中，获得高比活L-谷氨酸氧化酶多位点突变体，测试结果显示：改造后的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体对L-谷氨酸的氧化专一性和比活性均大幅度提高。
本发明所述的术语与其一般概念相同。
所述的“核苷酸”和“引物”序列均为5’端至3’端。
本发明的有益效果：
本发明制备的L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体对L-谷氨酸的氧化专一性和比活性均大幅度提高，具体是其比活性提高了至少3-4倍。
本发明制备的L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体可灵敏检测食物中L-谷氨酸的含量，对商品化的L-谷氨酸检测特异性可达到99％，灵敏度达到0.05mg/l。
附图说明
图1为本发明实施例5的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体SDLGOXM在大肠杆菌中表达的结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但所述实施例不限制本 发明的保护范围。
实施例1 来源于淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶(SDLDOX)基因DNA分子重排(DNA Shuffling)
1.1来源于淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶(SDLDOX)基因合成
通过基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)合成淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因(SDLDOX)，所用的引物如下：
SDLG1：GGATCCATGACTGAAACTCCACGTGATAATTCTGCAAC TCGTGCACGTTGGCAAACTTGT(SEQ ID NO.1所示)
SDLG2：CATCAGGACCAACAAGAAGCAGTTCACGTGCCAGCTT GAGACAAGTTTGCCAACGTGCAC(SEQ ID NO.2所示)
SDLG3：GCTTCTTGTTGGTCCTGATGACAAGGATCTGAAACTGT CCTATCTGCATACTCTGATTGA(SEQ ID NO.3所示)
SDLG4：CTTCTTACGTGGATGATGAGTTGGACCCAG ACGACCAG TATCAATCAGAGTATGCAGATA(SEQ ID NO.4所示)
SDLG5：CTCATCATCCACGTAAGAAGATCCTGGTCATTGGTGCT GGTATCACTGGTCTGGTTGCTG(SEQ ID NO.5所示)
SDLG6：ATGATAGTGACATCGTAACCAGCATCCTTGAGCAGACG ACCAGCAACCAGACCAGTGATA(SEQ ID NO.6所示)
SDLG7：GGTTACGATGTCACTATCATTGAGGCAAACGAATCTCG TGTTGGTGGTCGTATCAAGACT(SEQ ID NO.7所示)
SDLG8：CAGCATCATCGAATGGCTGATGATGCTTGG TTGCACGG AAAGTCTTGATACGACCACCAA(SEQ ID NO.8所示)
SDLG9：TCAGCCATTCGATGATGCTGCACAGTACGCTGAGGCTG GTGCAATGCGTCTGCCTGACTT(SEQ ID NO.9所示)
SDLG10：AAGACCCAGCTTGTCAACCAGTGCCAGAACCAGTGGA TGGAAGTCAGGCAGACGCATTGC(SEQ ID NO.10所示)
SDLG11：TGGTTGACAAGCTGGGTCTTGGTCGTCGTCAGTTCTAC AACGTTGATGTTGGTCCATCTA(SEQ ID NO.11所示)
SDLG12：TAGGTGACAGGTGGAACAGGAACCTCAGGACCAGAA CCAG TAGATGGACCAACATCAACG(SEQ ID NO.12所示)
SDLG13：CCTGTTCCACCTGTCACCTACACCTCCTTCACTGGTCA GACTTGGACCAATGGTGATGAC(SEQ ID NO.13所示)
SDLG14：AAGAGTTACCACGCTTGTCAGGTTCACGGAAGTCAGG AGAGTCATCACCATTGGTCCAAG(SEQ ID NO.14所示)
SDLG15：TGACAAGCGTGGTAACTCTTGGATTCGTGCTAACCGT GTTCAGGTTCGTCGTGCTGACTA(SEQ ID NO.15所示)
SDLG16：GAGATGGAAACCCTCGTTGATACGCTCAGGAGATGCA GTATAGTCAGCACGACGAACCTG(SEQ ID NO.16所示)
SDLG17：TCAACGAGGGTTTCCATCTCACTGGTGATG AGGTTCG TGCACCTGTTGTCAAGATGGTTG(SEQ ID NO.17所示)
SDLG18：ACATCAGAGTAGTAGTCACGAACAGACTCCAGTGCAT CATCAACCATCTTGACAACAGGT(SEQ ID NO.18所示)
SDLG19：CGTGACTACTACTCTGATGTTGTTGATGGCAAGCGTG TCAACAAGCCTTT CGATGAGTGG(SEQ ID NO.19所示)
SDLG20：AACCGTCGAAGTCACGGATGACACGTGCCCAACCCTC AACCCACTCATCGAAAGGCTTGT(SEQ ID NO.20所示)
SDLG21：CATCCGTGACTTCGACGGTTACTCCATGGGTGGTTTC CTGCGTGATCATGCTGGTCTCTC(SEQ ID NO.21所示)
SDLG22：GGTGTTCTCCAGAGTACCAACAGCCTCGATTGCCTCG TCAGAGAGACCAGCATGATCACG(SEQ ID NO.22所示)
SDLG23：TTGGTACTCTGGAGAACACCTCCTCTCGTCTGCATCT CTCCTTCTTCCACTCCTTCCTGT(SEQ ID NO.23所示)
SDLG24：ATCTCCCAGTAACGAACAGTTGGATTGATGTCAGAAC GAGACAGGAAGGAGTGGAAGAAG(SEQ ID NO.24所示)
SDLG25：ACTGTTCGTTACTGGGAGATCCCTGGTGGTTCTTGGC GTCTGCCACATGCACTCCATGAG(SEQ ID NO.25所示)
SDLG26：GGATCATACGATGACCAAGACGAACCTCATCACGCAG ACCCTCATGGAGTGCATGTGGCA(SEQ ID NO.26所示)
SDLG27：TCTTGGTCATCGTATGATCCGTCTCGAATACCATGAT CCATCTCGTGATGCTGATCCTGA(SEQ ID NO.27所示)
SDLG28：GACAGTGACACCCCAACCATCAGGACCAACAGCAGT ACCCTCAGGATCAGCATCACGAGA(SEQ ID NO.28所示)
SDLG29：ATGGTTGGGGTGTCACTGTCGAAACTGTTGCTGAGAA CGATCCACAGGCACCTCCTCGTC(SEQ ID NO.29所示)
SDLG30：GAGAATGGAATGGTGACGATTGCCAGGTCAGCAGTCC AACGACGAGGAGGTGCCTGTGGA(SEQ ID NO.30所示)
SDLG31：ATCGTCACCATTCCATTCTCTGCACTGCGT TTCGTCG AGATCGTTCCATCCATGTCCTAC(SEQ ID NO.31所示)
SDLG32：CAGAGTCGTAGTGAGTCTCGACGATAGCACGACGCTT CTTGTAGGACATGGATGGAACGA(SEQ ID NO.32所示)
SDLG33：CGAGACTCACTACGACTCTGCAACTAAGGTCCTGCTG GAGTTCTCTCATCGTTGGTGGGA(SEQ ID NO.33所示)
SDLG34：GATACGCTCCAGTTCCTCACGCCAGTCATCCTCAGTG AACTCCCACCAACGATGAGAGAA(SEQ ID NO.34所示)
SDLG35：GTGAGGAACTGGAGCGTATCGCACCTGGTGTCTACGA GTACTATCGTCTTGGTCCTGAGG(SEQ ID NO.35所示)
SDLG36：GCCTCAGCAAGAGTTGGCATACGTGCAGGTTCACCAG CAGCCTCAGGACCAAGACGATAG(SEQ ID NO.36所示)
SDLG37：ATGCCAACTCTTGCTGAGGCTGATGCTGGT CTGCTTG GTG CTGCTGTCAA GGACTCTGGT(SEQ ID NO.37所示)
SDLG38：GTGGCATGGTAGAACCAATCTGACGCATCT CCTCAGT GAC ACCAGAGTCC TTGACAGCAG(SEQ ID NO.38所示)
SDLG39：GATTGGTTCTACCATGCCACTGCGTGGTCC TGCACTG CGT CCTGCTACTC ACTCTTTCGG(SEQ ID NO.39所示)
SDLG40：GTACATGAAACGGTTTGGATTGTCAGTTGC AGAACCA CCA CCGAAAGAGT GAGTAGCAGG(SEQ ID NO.40所示)
SDLG41：ATCCAAACCG TTTCATGTACTACCCATCTC ATCGTGT CGA GGGTTCTACT GGTGGTGTCG(SEQ ID NO.41所示)
SDLG42：CAACGAGCAGCATCATCAGACCAGGAGTAG GATGCG AGGACGACACCACC AGTAGAACCC(SEQ ID NO.42所示)
SDLG43：GGACTCTATGCGTTCTGCTGAACGTTACGTCTACGCA CTGCGTAACCTTC AGGCACTGCA(SEQ ID NO.43所示)
SDLG44：AGCACCACGACCAGTGAAGAAGACCTCGAT ACGACG ACCATGCAGTGCCT GAAGGTTACG(SEQ ID NO.44所示)
SDLG45：TCTTCACTGGTCGTGGTGCT ACCAAGTCTT GGGCACG TGATCCTTACGCA TTCGGTGAGG(SEQ ID NO.45所示)
SDLG46：AGGTGGAAAGAGGTCATCTGGTGTGCAGTG TAGATTG CAGCCTCACCGAA TGCGTAAGGA(SEQ ID NO.46所示)
SDLG47：CAGATGACCTCTTTCCACCTGGATGCATCT CGTCCTG AAGGTCCTGTCCACTTCGCTGGT(SEQ ID NO.47所示)
SDLG48：GTGCACCCTCGATCCATGCGTGCTTCAGAGAGGTGTG TTC ACCAGCGAAG TGGACAGGAC(SEQ ID NO.48所示)
SDLG49：GAGCTCTTAGGCAGTATGAACCTCCAGTGCACCCTCG ATCCATGCG(SEQ ID NO.49所示)
利用PCR进行L-谷氨酸氧化酶(SDLDOX)基因扩增，在100μl反应体系中，SDLG2-SDLG48共47个引物的添加量为2ng，外侧引物SDLG1和SDLG49添加量为30ng。以KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)为Taq DNA聚合酶。扩增条件依次为：94℃预热1min；94℃，30s；50℃，30s；72℃，10min，使用的，共25个循环。
PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4℃连接过夜。高效转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得阳性克隆。
1.2PCR扩增L-谷氨酸氧化酶(SDLDOX)基因及回收
以合成的L-谷氨酸氧化酶(SDLDOX)基因为模板，SD1，SD2为引物扩增(SDLDOX)基因，SD1：5’GAGAGAGGATCCATGACTGAAACT CCACGTGATAATTC3’(SEQ ID NO.50所示)；SD2：5’GAGAGAGAGCTCTTAGGCAGTATGAACCTCCAGTG3’(SEQ ID NO.51所示)反应条件为：94℃10min预变性，94℃变性30s，72℃退火和延伸1.5min，共30个循环，1％Agrose电泳，透析袋法回收1974bp的基因片段。
DNase I降解DNA及回收小片段
回收L-谷氨酸氧化酶(SDLDOX)基因片段以DNase I缓冲液(50mmol/L Tris-Cl
pH7.4+1mmol/L MgCl2)100μl溶解；加入0.1U DNase I，25℃处理15分钟。70℃处理10分钟。10％丙烯酰胺电泳，透吸袋法回收10-50bp的小片段。用10μl 10×无引物PCR缓冲液(Primerless PCR Buffer)(50mmol/L KCl+10mmol/LTris-Cl pH9.0+1％Triton)溶解沉淀。
无引物PCR(Primerless PCR)
进行Primerless PCR扩增。反应体系：5μl小片段DNA+4μl 2.5mmol/L dNTPs+4.5μl25mmol/LMgCl2+Taq2U+ddH2O to 50μl；反应程序为：94℃30s，40℃30s，72℃30s，共45个循环)，2％Agrose电泳检测PCR扩增结果。
有引物PCR(Primer PCR)
进行PrimerPCR扩增反应。反应体系：5μl Primerless PCR产物+SDLG10.2ng+SDLG49 0.2ng+10×PCR Buffer 5μl+2.5mmol/L dNTPs 4μl+Taq2U+ddH2O to50μl。反应程序为：94℃30s，70℃30s，72℃2.0min，共35个循环，1％Agrose电泳检测，回收1974bp基因片段。
实施例2 高比活性L-谷氨酸氧化酶(SDLDOX)基因筛选
将实施例1中回收重排的L-谷氨酸氧化酶基因片段，经BamH I和SacI双酶切后，构建入原核表达载体pG251(CN1338515)启动子和t1t2终止子之间，该载体带有氨苄青霉素抗性基因。电击法转化大肠杆菌菌株DH5α获得突变体表达文库，库容达到108，而后用质粒大量提取试剂盒(美国Omega公司)进行质粒提取。
取1μl大量提取的质粒转入大肠杆菌DH5α涂布在含有100mg/L氨苄青霉素抗生素培养基，经过16小时的37℃培养，挑选抗性转化子进行L-谷氨酸氧化酶活性筛选。具体筛库方法如下：转化子挑入40孔细菌培养板，加入含细菌溶菌酶(1mg/ml)和蛋白酶Fator-Xa(1mg/ml)pH8.0磷酸缓冲液50μl，37℃放置10min，转入温度设置在70℃的烘箱内，处理30分钟后，加入酶测定液200μl，反应10分钟，观察培养板中的颜色反应，挑取显黄色的加样孔，测定550nm吸光度。
筛选分两步完成，先40个菌落为一个单元调取到一个细菌培养板孔中，然后将现色较强的菌再分别调取到一个40孔细菌培养板中，调取现色较强的菌落。抽提现色菌落中的质粒进行回转大肠杆菌，调取菌落培养12小时，离心收集菌体，Tris-HCl缓冲液悬浮菌体，1ml菌液中加入含细菌溶菌酶(1mg/ml)和蛋白酶Fator-Xa(1mg/ml)pH8.0磷酸缓冲液100μl，37℃放置10min，加入酶测定液400μl,反应10分钟，测定550nm吸光度。通过反复筛选，共获得5个比活性较强的突变体，分别命名为 SDLGOXM1-M5。
酶测定液：用水配制11mg/ml L-谷氨酸溶液0.5ml，并调至pH7.0，用0.1M pH7.0的磷酸钾盐缓冲液配制121.5μg/ml的4-氨基安替比林溶液1.0ml、0.26μl/ml的N，N-二甲基苯胺溶液l.4ml，60u/ml过氧化物酶溶液0.1ml。临用时混匀，共2mL。L-谷氨酸溶液底物在其他混合液37℃预处理2min后加入。
实施例3 高比活L-谷氨酸氧化酶基因突变体获取
利用逐步序列测定方法对实施例2中所筛选获得的5个高比活L-谷氨酸氧化酶基因全序列进行DNA测序，显示有21个核苷酸位点发生了变化T27C，T33A，A95C，A158C，A431T，G464A，C497A，T633A，T714C，C744A，C956A，C957G，C1085T，T1293C，T1410G，A1440C，T1479A，C1588A，C1701T，A1728T，A1799G推导的氨基酸变化有9个(D32A，H54P，Y144F，G155D，T166K，T319K，A362V，S567F，K600R)，具体结果如表1所示。
表1 L-谷氨酸氧化酶基因突变体的核苷酸及氨基酸变化
以突变了3个位点的L-谷氨酸氧化酶(SDLDOX)基因SDLGOXM2为模版，将其它6个筛选的突变位点进行全部突变，完成9位点突变。突变所用引物如下。
H54P突变引物：
54Z：GCCGCCTCGGCCCCACCCCCCA(SEQ ID NO.52所示)
54F：TGGGGGGTGG GGCCGAGGCG GC(SEQ ID NO.53所示)
G155D突变引物：
155Z：TGGGCCCCTCCACCGGCAGCGAC(SEQ ID NO.54所示)
155F：GTCGCTGCCG GTGGAGGGGC CCA(SEQ ID NO.55所示)
T166K突变引物：
166Z：CGTACCCCCGGTGACGTACAAC(SEQ ID NO.56所示)
166F：GTTGTACGTC ACCGGGGGTA CG(SEQ ID NO.57所示)
T319R突变引物：
319Z：CGCAGCGACATCAACCCCAAG(SEQ ID NO.58所示)
319F：CTTGGGGTTGATGTCGCTGCG(SEQ ID NO.59所示)
A362V突变引物：
362Z：ACGACCCCAGCCGCGACGTC(SEQ ID NO.60所示)
362F：GACGTCGCGG CTGGGGTCGT(SEQ ID NO.61所示)
S569F突变引物：
569Z：GACGCCGCGCGCTGGGACTTG(SEQ ID NO.62所示)
569F：CAAGTCCCAG CGCGCGGCGT C(SEQ ID NO.63所示)
取1μl L-谷氨酸氧化酶基因扩增片段为模板，以SD1和54F；54Z和155F；155Z和166F；166Z和319F；319Z和362F；362Z和569F；569Z和SD2进行PCR扩增，扩增条件为：94℃预热1min；94℃30s，60℃，30s，72℃，1min。共25个循环，PCR结束后，片断用10％丙烯酰胺胶回收，将上述7个回收片断取10-100ng为模板混合，以SD1和SD2为引物将上述片断拼接，扩增条件为：94℃预热1min；94℃30s，60℃30s，72℃，4min。共25个循环。
PCR结束后，酚、氯仿抽提，再加入2倍体积的无水乙醇进行沉淀。各加入SacI和BamHI酶切消化，DNA柱回收酶切片断。将酶切处理好片段进行定向克隆，转化大肠杆菌DH5α，筛选转化子。序列测定获得9个突变的L-谷氨酸氧化酶基因SDLGOXM，其核苷酸序列如SEQ ID No 64所示，编码的氨基酸序列上共有9处突变点，其中，突变1位点为D32A：第32位上的天冬氨酸被替换为丙氨酸；突变2位点为H54P：第54位上的组氨酸被替换为脯氨酸；突变3位点为Y144F：第144位的酪氨酸被替换为苯丙氨酸；突变4位点为G155D：第155位上的甘氨酸被替换为天冬氨酸；突变5位点为T166K：第166位上的苏氨酸被替换为赖氨酸；突变6位点为T319K：第319位上的苏氨酸被替换为赖氨酸；突变7位点为A362V：第362位上的丙氨酸被替换为缬氨酸；突变8位点为S567F：第569位的丝氨酸被替换为苯丙氨酸；突变9位点为K600R：第600位上的赖氨酸被替换为精氨酸。
实施例4 高比活L-谷氨酸氧化酶活性测定
利用BamH I和Sac I进行双酶切SDLGOXM基因后，通过T4DNA连接酶将该基因与载体pET-32a(NEB公司)16℃连接，得到重组质粒pET-SDLGOXM，将其转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen公司)，将菌液涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的固体LB培养基，37℃过夜培养。次日，挑取单菌落，接种于50ml液体LB培养基，37℃培养到菌液的浓度达到OD600为0.6时加入终浓度为1mM的IPTG，25℃诱导12h。9000rpm离心去上清，收集湿细胞。取湿细胞用生理盐水洗涤两次，再悬浮于pH6.5、100mM的磷酸-磷酸钠缓冲液中(1g湿细胞/10ml缓冲液)得悬浮液，用超声波处理悬浮液(功率为400W，超声4s，间歇6s，重复99轮)，9000rpm离心取上清，即得粗酶液。用镍离子交换柱Ni-NTA agrose(Qiagen公司)对其进行蛋白表达纯化，获得L-谷氨酸氧化酶前体蛋白，然后加入1mg/ml Factor Xa蛋白酶(New England Biolabs公司)在4℃下处理6h，即得有活性的L-谷氨酸氧化酶蛋白，如图1所示，L-谷氨酸氧化酶多位点突变体SDLDOXM在大肠杆菌中表达。其中，图1中，中间：表达的全蛋白经镍离子交换柱Ni-NTA纯化；右：表达蛋白经过1mg/ml Factor Xa蛋白酶酶切后产物。
测定液：用水配制11mg/ml L-谷氨酸溶液0.5ml,并调至pH7.0，用0.1mol/L pH7.0的磷酸钾盐缓冲液配制121.5μg/ml的4-氨基安替比林溶液1.0ml、0.26μl/ml的N，N-二甲基苯胺溶液l.4ml，60u/ml过氧化物酶溶液0.1ml。临用时混匀，共3mL。底物在其他混合液37℃预处理2min后加入。
测定方法：上述3mL测定液于37℃恒温水预热3分钟，加入合适浓度的粗酶液0.1mL，反应l0分钟，置沸水浴中煮沸30秒钟终止反应，冷却后测定550nm吸光度。
酶活力单位定义及酶活力计算：在上述反应条件下每分钟释放1μmol过氧化氢所需酶量为1单位。
结果表明，突变L-谷氨酸氧化酶SDLGOXM对L-谷氨酸的Km值为0.28mM，比野生型酶的Km值小0.17mM，表明该酶对L-谷氨酸的亲和性更高；该突变L-谷氨酸氧化酶SDLGOXM比活性为126.5U/mg，比野生型酶比活高4.24倍。
实施例5 高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体专一性、灵敏度检测
测试方法同实施例4，分别以L-谷氨酸L-glutamate，D-谷氨酸D-glutamate，L-谷氨酰胺L-glutamine，L-天冬氨酸L-aspartate，L-天冬酰胺L-Asparagine，L-甘氨酸L-glycine，L-精氨酸L-arginine，L-酪氨酸L-proline，L-组氨酸L-histidine，L-苏氨酸L-Tyrosine，L-半胱氨酸L-cysteine作为反应底物，测定突变L-谷氨酸氧化酶氨基酸 专一性，研究发现：该高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体SDLGOXM对L-谷氨酸表现比较专一，对L-谷氨酸的酶活性达到99％，对其他氨基酸相对酶活性只有1％。
将L-谷氨酸按比例稀释，利用高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体SDLGOXM检测L-谷氨酸的最小稀释倍数，研究发现，该酶对检测L-谷氨酸的最小浓度为0.05mg/l，由此说明本发明得到的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体SDLGOXM可灵敏检测食物中L-谷氨酸的含量。
Claims (5)
1.一种高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体，其核苷酸序列如SEQ ID No 64所示。
2.根据权利要求1所述的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体，其特征在于，所述多位点突变体编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No 65所示。
3.如权利要求1所述的L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)DNA分子重排
通过基因合成方法合成来源于淀粉酶产色链霉菌的L-谷氨酸氧化酶基因，以合成的L-谷氨酸氧化酶基因为模板，扩增L-谷氨酸氧化酶基因，回收1974bp的基因片段，以DNase I进行不完全酶解，并回收小片段；
再，对回收的酶解片段进行无引物PCR扩增，然后以无引物PCR产物为模板，SDLG1、SDLG49为引物扩增重排L-谷氨酸氧化酶基因片段，并回收1974bp基因片段；
2)高比活L-谷氨酸氧化酶基因高通量筛选
将回收的重排L-谷氨酸氧化酶基因片段经BamHI和Sac I双酶切后，构建入原核表达载体pG251启动子和t1t2终止子之间，电击法转化大肠杆菌菌株DH5α获得突变体表达文库，而后进行质粒提取；将提取的质粒转入大肠杆菌，涂板于含有氨苄青霉素抗生素的培养基上培养，获得抗性转化子；
以40个抗性转化菌落为一个单元，挑入40孔细菌培养板；利用溶菌酶破碎细胞，加入酶测定液，挑取显黄色的加样孔，对该加样孔中的40个单菌进行再一轮的筛选，并对筛选出的突变单菌进行比活以及对谷氨酸底物的专一性测定，从中挑选5个比活性高且对谷氨酸底物专一的突变体；
对上述5个突变基因进行DNA序列分析，显示其氨基酸突变有9个位点即D32A，H54P，Y144F，G155D，T166K，T319K，A362V，S567F，K600R；
3)多位点突变
以L-谷氨酸氧化酶基因为模版，将上述9个位点同时突变即D32A，H54P，Y144F，G155D，T166K，T319K，A362V，S567F，K600R，获得所述高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体。
4.根据权利要求3所述的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，以氨基酸突变3个位点：D32A、Y144F、K600R的L-谷氨酸氧化酶基因为模版，将其氨基酸第54、155、166、319、362、567位进行突变，完成9个位点同时突变即D32A，H54P，Y144F，G155D，T166K，T319K，A362V，S567F，K600R，获得所述高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体；所述突变所用引物如下：
H54P突变引物：
54Z：GCCGCCTCGGCCCCACCCCCCA
54F：TGGGGGGTGG GGCCGAGGCG GC
G155D突变引物：
155Z：TGGGCCCCTCCACCGGCAGCGAC
155F:GTCGCTGCCG GTGGAGGGGC CCA
T166K突变引物：
166Z：CGTACCCCCGGTGACGTACAAC
166F：GTTGTACGTC ACCGGGGGTACG
T319R突变引物：
319Z：CGCAGCGACATCAACCCCAAG
319F:CTTGGGGTTGATGTCGCTGCG
A362V突变引物：
362Z：ACGACCCCAGCCGCGACGTC
362F：GACGTCGCGG CTGGGGTCGT
S569F突变引物：
569Z：GACGCCGCGCGCTGGGACTTG
569F:CAAGTCCCAG CGCGCGGCGTC。
5.如权利要求1-4任一项所述的高比活L-谷氨酸氧化酶基因多位点突变体在检测食物中L-谷氨酸含量的应用。
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