WO2023140286A1 - 組換え発現グルタミン酸オキシダーゼ - Google Patents

組換え発現グルタミン酸オキシダーゼ Download PDF

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WO2023140286A1
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amino acid
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glod
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圭太朗 久世
敦 一柳
達哉 日詰
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キッコーマン株式会社
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    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to recombinantly expressed glutamate oxidase.
  • L-glutamic acid measurement was traditionally performed using L-glutamic acid decarboxylase and L-glutamic acid dehydrogenase.
  • the measurement of carbon dioxide is troublesome, and in the dehydrogenase measurement system, the change in absorbance of the coenzyme is measured, which is complicated.
  • Non-Patent Document 1 L-glutamate oxidase is encoded as a single polypeptide having ⁇ , ⁇ , and ⁇ chains, with the two polypeptides forming a homodimer. This homodimer is cleaved by a protease to form the mature form. The mature form is a heterohexameric structure composed of ⁇ 2 ⁇ 2 ⁇ 2 .
  • Non-Patent Document 2 A method of mass-producing this precursor using genetically modified Escherichia coli and treating with protease is industrially used. US Pat. No. 6,200,009 describes L-glutamate oxidase mutants. Patent document 1 does not describe the thermostability of the produced mutant L-glutamate oxidase.
  • the present disclosure aims to provide a method for easily producing L-glutamate oxidase. Also, in certain embodiments, the present disclosure aims to provide L-glutamate oxidase. Also, in certain embodiments, the present disclosure aims to provide an L-glutamate oxidase with high sequence identity to SEQ ID NO:58.
  • the present inventors found that the above problems can be at least partially solved by using, as an example, a genetically engineered actinomycete-derived glutamate oxidase, and completed the present invention including this as an embodiment.
  • the present inventors have found that the above problems can be at least partially solved by using a glutamate oxidase having a specific mutation, and completed the present invention including this as one embodiment.
  • a glutamate oxidase mutant having a deleted region, lacking all or part of the ⁇ - ⁇ interregion existing between the ⁇ chain region and the ⁇ chain region of wild-type glutamate oxidase, 1 to 10 amino acids on the carboxy-terminal side of the ⁇ -chain region of wild-type glutamate oxidase are deleted or are not deleted; 1 to 4 amino acids on the amino terminal side of the ⁇ -chain region of wild-type glutamate oxidase are deleted or not deleted; A glutamate oxidase mutant, wherein the deleted region is one continuous deleted region and has glutamate oxidase activity.
  • a composition, reagent, electrode, sensor or kit comprising the glutamate oxidase variant of any of embodiments 1-10.
  • a vector comprising the polynucleotide of embodiment 13.
  • a host cell comprising the vector of embodiment 14.
  • a method for producing a glutamate oxidase variant comprising: [17] A method of contacting the glutamate oxidase mutant of any one of Embodiments 1 to 11 or the composition, reagent, electrode, sensor or kit of Embodiment 12 with a sample containing glutamic acid to oxidize the glutamic acid contained in the sample. [18] The method of embodiment 17, wherein glutamate is detected.
  • a glutamate oxidase mutant containing an amino acid substitution wherein the glutamate oxidase mutant after the amino acid substitution has improved thermostability compared to the glutamate oxidase before the substitution; (i) When aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, the amino acids at positions corresponding to positions selected from the group consisting of positions 87, 103, 133, 186, 297, 376, 393, 428, 516, 566, 568, 585, and 615 of SEQ ID NO: 1 are substituted.
  • a glutamate oxidase mutant selected from the group consisting of: [20] the amino acid substitution at the position corresponding to position 87 of SEQ ID NO: 1 is tyrosine; the amino acid substitution at the position corresponding to position 103 of SEQ ID NO: 1 is selected from the group consisting of phenylalanine, leucine, valine, isoleucine and methionine; the amino acid substitution to the position corresponding to position 133 of SEQ ID NO: 1 is selected from the group consisting of leucine and tyrosine; the amino acid substitution at the position corresponding to position 186 of SEQ ID NO: 1 is selected from the group consisting of glutamic acid, aspartic acid, tyrosine, asparagine, glutamine, alanine, leucine, cysteine, methionine, phenylalanine, serine, histidine and threonine; the amino
  • an advantage of the present invention is a recombinantly expressed glutamate oxidase that does not require treatment with a protease.
  • glutamate oxidases with improved thermostability are provided.
  • L-glutamate oxidase is encoded by the GLOD gene as a single polypeptide having ⁇ , ⁇ , and ⁇ chains, and the two polypeptides form a homodimer. In nature, this homodimer is cleaved by a protease into the mature form. The mature form is a heterohexameric structure composed of ⁇ 2 ⁇ 2 ⁇ 2 .
  • GLOD refers to L-glutamate oxidase unless otherwise specified.
  • L-glutamate oxidase is an oxidoreductase classified under EC 1.4.3.11 and catalyzes the following chemical reactions. [Chemical 1] L-glutamic acid + O 2 + H 2 O ⁇ 2-oxoglutarate + NH 3 + H 2 O 2
  • GLOD uses flavin adenine dinucleotide (FAD) as a coenzyme.
  • FAD-coenzyme oxidoreductases are known to have a FAD-binding motif sequence, eg, a Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly motif (where Xaa is any amino acid).
  • FAD-binding motif sequence eg, a Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly motif (where Xaa is any amino acid).
  • SEQ ID NO: 1 as a reference sequence
  • the amino acid sequence "Gly-Ala-Gly-Ile-Ala-Gly" from positions 51 to 56 of SEQ ID NO: 1 corresponds to the FAD-binding motif sequence Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly.
  • Gly at positions corresponding to positions 51, 53, and 56, respectively, relative to SEQ ID NO: 1 may be left unsubstituted.
  • Gly at positions 51, 53, and 56 of L-glutamate oxidase SEQ ID NO:1 are not amino acid substituted.
  • GLOD is known to recognize the substrate glutamic acid through arginine residues.
  • Arg (R) at position 291 is an important position for recognition of glutamic acid.
  • the position corresponding to position 291 of SEQ ID NO: 1 may be left unsubstituted.
  • the amino acid at position corresponding to position 291 of SEQ ID NO: 1 is Arg(R), that amino acid is not substituted.
  • each position of the GLOD is defined herein using SEQ ID NO: 1 as the reference sequence.
  • SEQ ID NO: 1 is Streptomyces sp. Amino acid sequence of X-119-6-derived glutamate oxidase (StGLOD), except that the N-terminal secretory signal sequence (MTTDTARRHTGAER) in the native sequence has been removed.
  • StGLOD Amino acid sequence of X-119-6-derived glutamate oxidase
  • MTTDTARRHTGAER N-terminal secretory signal sequence in the native sequence has been removed.
  • SEQ ID NO: 1 the first amino acid in the ⁇ -chain region immediately after cleavage of the secretory signal sequence in the wild type is changed from wild type Ala to Met. The position of this Met is referred to herein as the position corresponding to position 1 of SEQ ID NO:1.
  • SEQ ID NO: 1 is used as a reference sequence, and the ⁇ -chain of GLOD is defined as a polypeptide consisting of 375 amino acid residues from positions 1 to 375 (ANEM...EGEP).
  • SEQ ID NO: 1 is used as a reference sequence, and the ⁇ chain of GLOD is defined as a polypeptide consisting of 91 amino acids from positions 376 to 466 (YAAT...AEAA).
  • SEQ ID NO: 1 is used as the reference sequence, and the ⁇ chain of GLOD is defined as a polypeptide consisting of 163 amino acids from positions 507 to 669.
  • the C-terminal sequence (RRGAAAATEPMREEALTS) from positions 670 to 687 is a region to be removed by protease.
  • amino acid sequence deletion type GLOD mutant (Amino acid sequence deletion type GLOD mutant) The present inventors suspected that the region of the GLOD amino acid sequence that is removed by a protease may interfere with the functional expression of GLOD, and therefore produced and expressed a GLOD mutant sequence in which the amino acid sequence between the ⁇ region and the ⁇ region was deleted.
  • the last 8 amino acids of the ⁇ region (GEDDAEAA) were also removed from the mutant.
  • the first amino acid residue G of the ⁇ -strand was also removed in the mutant.
  • the boundary between the ⁇ -chain region and the ⁇ -chain region of the prepared mutants was the sequence of ⁇ -chain region...QQW-GVRP... ⁇ -chain region, in which the C-terminal QQW of the ⁇ -chain and the N-terminal GVRP of the ⁇ -chain were linked.
  • mutants exhibiting GLOD activity were obtained.
  • This amino acid sequence deleted GLOD mutant does not require treatment with a protease for expression of activity. In certain embodiments, protease treatment is not used during recombinant expression of the amino acid sequence deleted GLOD mutants.
  • junction region-substituted mutants in which the border sequences ( ⁇ chain region... QQW-GVRP... ⁇ chain region) were replaced with various amino acid sequences.
  • a mutant M7GLOD ⁇ 49C having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59, a mutant StGLOD ⁇ 49Ai having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, or a mutant StGLOD ⁇ 49C having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 were prepared as mutants in which the border sequences ( ⁇ chain region ... QQW-GVRP ... ⁇ chain region) were modified, and recombinant expression was performed to confirm the activity of the mutants.
  • all mutants exhibited GLOD activity.
  • These amino acid sequence deleted GLOD mutants also do not require treatment with protease for expression of activity.
  • the mutant M7GLOD ⁇ 49C having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59 can be considered to have deleted 56 amino acids from positions 456 to 511 of M7GLOD having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 58, and inserted 7 amino acids (QDAAEPP) different from the sequence of M7GLOD at the positions.
  • M7GLOD ⁇ 49C lacks positions 456-504 of SEQ ID NO:58 and replaces positions 505-511 with QDAAEPP.
  • M7GLOD ⁇ 49C has deletion of positions 457-505 of SEQ ID NO:58, substitution of Q at position 456, and substitution of DAAEPP at positions 506-511.
  • M7GLOD ⁇ 49C has deleted positions 458-506 of SEQ ID NO:58, replaced positions 456-457 with QD, and substituted positions 507-511 with AAEPP.
  • M7GLOD ⁇ 49C has deletions of positions 459-507 of SEQ ID NO:58, substitutions of QDA at positions 456-458, and substitutions of AEPP at positions 508-511.
  • M7GLOD ⁇ 49C has deletions of positions 460-508 of SEQ ID NO:58, substitutions of QDAA at positions 456-459, and substitutions of EPP at positions 509-511.
  • M7GLOD ⁇ 49C has deletions of positions 461-509 of SEQ ID NO:58, substitutions of QDAAE at positions 456-460, and substitutions of PP at positions 510-511.
  • M7GLOD ⁇ 49C has deleted positions 462-510 of SEQ ID NO:58, replaced positions 456-461 with QDAAEP, and replaced position 511 with P.
  • M7GLOD ⁇ 49C has deleted positions 462-510 of SEQ ID NO:58 and replaced positions 456-462 with QDAAEPP.
  • the mutant StGLOD ⁇ 49Ai having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12 can be considered to have deleted 56 amino acids from positions 456 to 511 of StGLOD having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and inserted 7 amino acids (RKLDKTE) different from the sequence of StGLOD at the positions.
  • StGLOD ⁇ 49Ai has deleted positions 456-504 of SEQ ID NO: 1 and substituted RKLDKTE at positions 505-511.
  • StGLOD ⁇ 49Ai has deleted positions 457-505 of SEQ ID NO: 1, substituted R at position 456, and substituted KLDKTE at positions 506-511.
  • StGLOD ⁇ 49Ai has deletions of positions 458-506 of SEQ ID NO:1, substitutions of RK at positions 456-457, and substitutions of LDKTE at positions 507-511.
  • StGLOD ⁇ 49Ai has deletions of positions 459-507 of SEQ ID NO:1, substitutions of RKL at positions 456-458, and substitutions of DKTE at positions 508-511.
  • StGLOD ⁇ 49Ai has deletions of positions 460-508 of SEQ ID NO:1, substitutions of RKLD at positions 456-459, and substitutions of KTE at positions 509-511.
  • StGLOD ⁇ 49Ai has deletions of positions 461-509 of SEQ ID NO:1, substitutions of RKLDK at positions 456-460, and substitutions of TE at positions 510-511.
  • StGLOD ⁇ 49Ai has deletions of positions 462-510 of SEQ ID NO:1, substitutions of RKLDKT at positions 456-461, and substitution of E at positions 511.
  • StGLOD ⁇ 49Ai has deleted positions 462-510 of SEQ ID NO: 1 and substituted RKLDKTE at positions 456-462.
  • the mutant StGLOD ⁇ 49C having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 has 56 amino acids from positions 456 to 511 of StGLOD having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 deleted, and 7 amino acids (QDAAEPP) different from the sequence of StGLOD are inserted at the positions.
  • StGLOD ⁇ 49C lacks positions 456-504 of SEQ ID NO: 1 and replaces positions 505-511 with QDAAEPP.
  • StGLOD ⁇ 49C has deletion of positions 457-505 of SEQ ID NO: 1, substitution of Q at position 456, and substitution of DAAEPP at positions 506-511.
  • StGLOD ⁇ 49C has deletions of positions 458-506 of SEQ ID NO:1, substitutions of QD at positions 456-457, and substitutions of AAEPP at positions 507-511.
  • StGLOD ⁇ 49C has deletions of positions 459-507 of SEQ ID NO:1, substitutions of QDA at positions 456-458, and substitutions of AEPP at positions 508-511.
  • StGLOD ⁇ 49C has deletions of positions 460-508 of SEQ ID NO:1, substitutions of QDAA at positions 456-459, and substitutions of EPP at positions 509-511.
  • StGLOD ⁇ 49C has deletions of positions 461-509 of SEQ ID NO:1, substitutions of QDAAE at positions 456-460, and substitutions of PP at positions 510-511.
  • StGLOD ⁇ 49C has deleted positions 462-510 of SEQ ID NO: 1, replaced positions 456-461 with QDAAEP, and replaced position 511 with P.
  • StGLOD ⁇ 49C has deleted positions 462-510 of SEQ ID NO: 1 and replaced positions 456-462 with QDAAEPP.
  • the present inventors continued development and generated multiple mutants while varying the length of the region to be deleted.
  • the disclosure provides: A glutamate oxidase mutant having a deleted region, lacking all or part of the ⁇ - ⁇ interregion present between the ⁇ chain region and the ⁇ chain region of wild-type glutamate oxidase, 1 to 10 amino acids on the carboxy-terminal side of the ⁇ -chain region of wild-type glutamate oxidase are deleted or are not deleted; 1 to 4 amino acids on the amino terminal side of the ⁇ -chain region of wild-type glutamate oxidase are deleted or not deleted; A glutamate oxidase mutant is provided wherein the deleted region is one contiguous deleted region and has glutamate oxidase activity.
  • the deletion mutant is deleting positions corresponding to positions 457-510 of SEQ ID NO: 1 (d ⁇ 54); deleting positions corresponding to positions 458-510 of SEQ ID NO: 1 (d ⁇ 53); deleting positions corresponding to positions 459-510 of SEQ ID NO: 1 (d ⁇ 52); deleting positions corresponding to positions 460-510 of SEQ ID NO: 1 (d ⁇ 51); deleting positions corresponding to positions 461-510 of SEQ ID NO: 1 (d ⁇ 50); deleting positions corresponding to positions 462-510 of SEQ ID NO: 1 (d ⁇ 49); deleting positions corresponding to positions 463-510 of SEQ ID NO: 1 (d ⁇ 48); deleting positions corresponding to positions 464-510 of SEQ ID NO: 1 (d ⁇ 47); deleting positions corresponding to positions 465-510 of SEQ ID NO: 1 (d ⁇ 46); deleting positions corresponding to positions 466-510 of SEQ ID NO: 1 (d ⁇ )
  • the deletion mutant is deleting positions corresponding to positions 455-508 of SEQ ID NO: 1 (D ⁇ 54); deleting positions corresponding to positions 456-508 of SEQ ID NO: 1 (D ⁇ 53); deleting positions corresponding to positions 457-508 of SEQ ID NO: 1 (D ⁇ 52); deleting positions corresponding to positions 458-508 of SEQ ID NO: 1 (D ⁇ 51); deleting positions corresponding to positions 459-508 of SEQ ID NO: 1 (D ⁇ 50); deleting positions corresponding to positions 460-508 of SEQ ID NO: 1 (D ⁇ 49); deleting positions corresponding to positions 461-508 of SEQ ID NO: 1 (D ⁇ 48); deleting positions corresponding to positions 462-508 of SEQ ID NO: 1 (D ⁇ 47); deleting positions corresponding to positions 463-508 of SEQ ID NO: 1 (D ⁇ 46); deleting positions corresponding to positions 464-508 of SEQ ID NO: 1 (D ⁇ 45); deleting positions corresponding to positions 465-508 of SEQ ID NO: 1 (D ⁇ 54
  • the disclosure provides, with reference to SEQ ID NO: 58, RWGEDDAEAALTVPESVRNLPTGLLGAHPSVDEQLIDDEQVEYLRNSTLRGGVR is deleted.
  • This deletion mutant is sometimes referred to herein as M7GLOD-d ⁇ 54 for convenience.
  • the present disclosure provides mutants based on SEQ ID NO: 58 that lack the following deletion regions with different chain lengths.
  • the present disclosure provides mutants based on SEQ ID NO: 58 that lack the following deletion regions with different chain lengths.
  • the present disclosure provides mutants in which the following deletion regions with different chain lengths are deleted based on SEQ ID NO:1.
  • the present disclosure provides mutants in which the following deletion regions with different chain lengths are deleted based on SEQ ID NO:1.
  • the above mutants shall be included in the glutamate oxidase mutants lacking 31 to 54 consecutive amino acids referred to herein.
  • the C-terminus of the deleted region can be a position corresponding to positions 512, 511, 510, 509, 508, 507, 506, or 505 of SEQ ID NO:1. In certain embodiments, the C-terminus of the deleted region can be at positions corresponding to positions 510, 508, or 507 of SEQ ID NO:1. For convenience, the C-terminal position of the deleted region is sometimes referred to herein as the starting point. In certain embodiments, the deletion mutant may lack 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 or 54 contiguous amino acids from the origin.
  • the glutamate oxidase deletion mutant Since the origin is deleted, the glutamate oxidase deletion mutant has no origin. Also, the glutamate oxidase deletion mutant does not have 31-54 contiguous amino acids from the origin (ie, does not have 31-54 amino acids including the origin amino acid).
  • deletion mutants in which a long sequence is deleted and deletion mutants in which a short sequence is deleted for example, when activity is confirmed for a ⁇ 54 mutant and a ⁇ 31 mutant
  • a mutant in which an intermediate-length region is deleted for example, a ⁇ 53 to ⁇ 32 mutant
  • GLOD activity was confirmed when a mutant was created.
  • One skilled in the art can generate similar deletion mutants based on the disclosure herein and confirm the presence or absence of activity by routine testing. Deletion mutants with no activity are excluded from glutamate oxidase mutants with glutamate oxidase activity.
  • the present disclosure provides amino acid sequence deleted GLOD mutants that lack the region corresponding to positions 459-507 of SEQ ID NO: 1 and have glutamate oxidase activity. In certain embodiments, the variant may further lack the region corresponding to positions 670-687.
  • the present disclosure provides amino acid sequence deleted GLOD mutants that lack the region corresponding to positions 459 to 507 of SEQ ID NO: 1, have glutamate oxidase activity, and have improved thermal stability compared to glutamate oxidase that does not lack all or part of the region corresponding to positions 459 to 507 of SEQ ID NO: 1.
  • the variant may further lack the region corresponding to positions 670-687.
  • the present disclosure provides amino acid sequence deleted GLOD mutants that lack the region corresponding to positions 459-507 of SEQ ID NO: 1, have glutamate oxidase activity, and have improved thermostability compared to glutamate oxidase that does not lack the region corresponding to positions 459-466 of SEQ ID NO: 1.
  • the variant may further lack the region corresponding to positions 670-687.
  • deletion mutants can be made based on SEQ ID NO:58.
  • deletion variants may be made based on glutamate oxidase that have 90% or greater, such as 91% or greater, 92% or greater, 93% or greater, 94% or greater, 95% or greater, 96% or greater, 97% or greater, 98% or greater, or 99% or greater sequence identity with SEQ ID NO:58.
  • deletion mutants can be made based on SEQ ID NO:1.
  • deletion variants may be made based on glutamate oxidase that have 90% or greater, such as 91% or greater, 92% or greater, 93% or greater, 94% or greater, 95% or greater, 96% or greater, 97% or greater, 98% or greater, or 99% or greater sequence identity with SEQ ID NO:1.
  • a deletion mutant can be generated based on a known glutamate oxidase or a glutamate oxidase having 90% or more, such as 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more sequence identity with it.
  • Thermal stability improvement effect Furthermore, when these amino acid sequence-deleted GLOD mutants were subjected to heat treatment, surprisingly, all of the mutants had improved residual activity compared to the corresponding GLOD sequences before deletion of the amino acid sequence.
  • the residual activity indicates the value of the activity of the GLOD sample after heat treatment when the activity of the GLOD sample stored in a refrigerator (for example, 4° C.) is set to 1.
  • the residual activity can have a value of 0 or more and 1 or less, but can exceed 1 when GLOD is activated by heat treatment.
  • mutants lacking the amino acid sequence between the ⁇ chain and the ⁇ chain such as StGLOD ⁇ 49C, M7GLOD ⁇ 49C, and StGLOD ⁇ 49Ai, and the mutants listed in Table 1-4 are sometimes referred to as GLOD mutants lacking the amino acid sequence between the ⁇ chain and the ⁇ chain, or simply GLOD mutants lacking the amino acid sequence.
  • an amino acid sequence-deficient GLOD mutant is sometimes referred to as "GLOD ⁇ ”.
  • the number XX of deleted amino acid residues may be written after GLOD ⁇ (GLOD ⁇ XX).
  • a GLOD mutant lacking 49 amino acid residues is sometimes referred to as GLOD ⁇ 49.
  • a deletion mutant starting from the position corresponding to position 510 of SEQ ID NO: 1 is sometimes referred to as "GLOD-d ⁇ ".
  • a mutant based on SEQ ID NO:58 and starting at position corresponding to position 510 of SEQ ID NO:1 and lacking 54 amino acids may be designated M7GLOD-d ⁇ 54.
  • a deletion mutant starting from the position corresponding to position 508 of SEQ ID NO: 1 is sometimes referred to as "GLOD-D ⁇ ".
  • a mutant based on SEQ ID NO: 58 and starting at position corresponding to position 508 of SEQ ID NO: 1 and lacking 54 amino acids may be designated M7GLOD-D ⁇ 54.
  • GLOD mutants lacking an amino acid sequence includes not only StGLOD and M7GLOD, but also variants thereof, GLODs having 90% or more amino acid sequence identity with them, and GLODs derived from other sources lacking regions corresponding to the deleted regions of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NOS: 12 and 13.
  • the GLOD mutant of the present disclosure has a residual activity after heat treatment of GLOD before modification of 100%, for example, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, 100% or more, 150% or more, 200% or more, 250% or more, The improvement may be 300% or more, 350% or more, such as 400% or more.
  • "improving the residual activity by 10%” means that the residual activity of the modified GLOD mutant after heat treatment is 110% when the residual activity of the GLOD before modification after heat treatment is 100%.
  • the thermal stability of the GLOD mutants of the present disclosure can be assessed by residual activity after heat treatment at 45°C for 30 minutes or 35 minutes, or heat treatment at 65°C for 30 minutes.
  • GLOD ⁇ lacking a region corresponding to the predetermined region of SEQ ID NO: 1 has a residual activity of 105% or more, 110% or more, 120% or more, 130% or more, 140% or more, 150% or more, 200% or more, 300% or more, for example 40%, when the residual activity of GLOD without the predetermined region after heat treatment at 45°C for 30 minutes or 35 minutes is 100%. It can be 0% or more.
  • the predetermined region to be deleted can start at a position corresponding to positions 510, 508, or 507 of SEQ ID NO: 1 as the C-terminal side, and can have 31-54 contiguous amino acids (including the starting point).
  • GLOD ⁇ lacking the region corresponding to positions 459 to 507 of SEQ ID NO: 1 has a residual activity of 105% or more, 110% or more, 120% or more, 130% or more, 140% or more, 15% or more, when the residual activity of GLOD not lacking all or part of positions 459 to 507 of SEQ ID NO: 1 after heat treatment at 45 ° C. for 30 minutes or 35 minutes is 100%. It can be 0% or more, 200% or more, 300% or more, such as 400% or more.
  • GLOD ⁇ lacking the region corresponding to positions 459 to 507 of SEQ ID NO: 1 has a residual activity of 105% or more, 110% or more, 120% or more, 130% or more, 140% or more, or 150% when the residual activity of GLOD not lacking the amino acid sequence of positions 459 to 466 of SEQ ID NO: 1 after heat treatment at 45°C for 30 minutes or 35 minutes is taken as 100%. % or more, 200% or more, 300% or more, such as 400% or more.
  • the variant may further lack the region corresponding to positions 670-687.
  • GLOD ⁇ lacking all or part of the region corresponding to positions 457 to 510 of SEQ ID NO: 1 has a residual activity of 10% when the residual activity of GLOD without the deletion after heat treatment at 65 ° C. for 30 minutes is 100%. It may be 5% or more, 110% or more, 120% or more, 130% or more, 140% or more, 150% or more, 200% or more, 300% or more, such as 400% or more.
  • the variant may further lack the region corresponding to positions 670-687.
  • GLOD ⁇ mutants lacking a predetermined region consisting of 31 to 54 consecutive amino acids starting at the region corresponding to positions 459 to 507 of SEQ ID NO: 1 or positions corresponding to positions 510, 508, or 507 of SEQ ID NO: 1 have improved thermal stability compared to GLOD before modification. Based on these findings, a person skilled in the art understands that other GLODs having a sequence identity of 90% or more and GLODs derived from other sources, in which the corresponding region amino acid sequence is deleted, similarly have improved thermostability and can be used in various reactions. The same applies to the region corresponding to positions 670-687 of SEQ ID NO:1.
  • the present disclosure provides GLOD ⁇ having 90% or more amino acid sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 59, 12, or 13, deleting a predetermined region, and having glutamate oxidase activity.
  • the predetermined region can be a region consisting of 31 to 54 consecutive amino acids starting from the position corresponding to position 510, 508, or 507 of SEQ ID NO:1 on the C-terminal side.
  • This GLOD ⁇ may additionally lack the region corresponding to positions 670-687 of SEQ ID NO:1.
  • GLOD is widely distributed in the natural world and can be obtained by searching for enzymes of microbial, animal or plant origin. Microorganisms can be obtained, for example, from actinomycetes, filamentous fungi, yeasts, or bacteria. In the present specification, the origin of GLOD is not particularly limited, for example, Streptomyces genera such as Streptomyces sp. X-119-6 and Streptomyces sp.
  • GLOD derived from microorganisms belonging to the genus Actinobacteria, Actinophytocola, Sphaerisporangium, Microbispora, Streptosporangium, Phytohabitans, Haliangium, Archangium, Streptacidiphilus, Saccharothrix, or Trichoderma, and includes wild-type and variants thereof unless otherwise specified.
  • GLOD gene a gene encoding GLOD
  • a generally used gene cloning method is used.
  • chromosomal DNA or mRNA can be extracted from microbial cells or various cells having GLOD-producing ability by conventional methods.
  • cDNA can be synthesized using mRNA as a template. The chromosomal DNA or cDNA thus obtained can be used to construct a library of chromosomal DNA or cDNA.
  • a method of synthesizing an appropriate probe DNA and using it to select the GLOD gene from a library of chromosomal DNA or cDNA, or preparing an appropriate primer DNA based on the above amino acid sequence and using an appropriate polymerase chain reaction (PCR method) such as the 5'RACE method or the 3'RACE method to amplify the DNA containing the target gene fragment encoding GLOD, and amplifying these DNA fragments. can be ligated to obtain a DNA containing the full-length GLOD gene of interest.
  • Examples of the GLOD gene include, but are not limited to, the GLOD gene derived from Streptomyces sp. X-119-6 and the GLOD gene derived from Streptomyces sp. MOE7.
  • the GLOD gene may be ligated to a vector.
  • Vectors include any vectors such as plasmids, bacteriophages, and cosmids, such as pBluescriptII SK+ (manufactured by Stratagene).
  • a plasmid can be obtained according to a conventional method.
  • a plasmid containing the GLOD gene can be extracted and purified using GenElute Plasmid Miniprep Kit (manufactured by Sigma-Aldrich).
  • GenElute Plasmid Miniprep Kit manufactured by Sigma-Aldrich
  • the resulting GLOD gene can be manipulated to produce a GLOD mutant gene or to obtain a purified enzyme.
  • Mutation treatment of the GLOD gene can be performed by any known method depending on the intended mutation form. That is, a method of bringing the GLOD gene or a recombinant DNA into which the gene is integrated into contact with a drug acting as a mutagen; an ultraviolet irradiation method; a genetic engineering method;
  • mutagen agents used in the above mutation treatment include hydroxylamine, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, sulfurous acid, hydrazine, formic acid, or 5-bromouracil.
  • the desired mutation can be induced by contacting and acting at a concentration of the above drug of preferably 0.5 to 12 M at a reaction temperature of 20 to 80° C. for 10 minutes or more, preferably 10 to 180 minutes.
  • ultraviolet irradiation it can be performed according to the conventional method as described above.
  • a desired modified GLOD gene can also be synthesized directly by an organic synthesis method or an enzymatic synthesis method.
  • the nucleotide sequence of the GLOD gene can be confirmed, for example, by a multicapillary DNA analysis system, Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • the GLOD gene can be incorporated into vectors such as bacteriophages, cosmids, or plasmids used to transform prokaryotic or eukaryotic cells by conventional methods. Using this, the host corresponding to each vector can be transformed or transduced by conventional methods.
  • GLOD can be expressed using prokaryotic cells such as Escherichia microorganisms such as Escherichia coli, Brevibacillus microorganisms such as Brevibacillus choshinensis, Corynebacterium microorganisms such as Corynebacterium glutamicum, Streptomyces microorganisms such as Streptomyces violaceoruber.
  • E. coli hosts include, but are not limited to, various E.
  • a host cell (transformant) into which the GLOD gene has been introduced is obtained by transforming or transducing the host.
  • a method for transfecting a recombinant vector into such host cells for example, when the host cells are microorganisms belonging to Escherichia coli, a method of transfecting recombinant DNA in the presence of calcium ions can be employed, and an electroporation method can also be used.
  • commercially available competent cells eg, ECOS Competent Escherichia Collie BL21 (DE3); manufactured by Nippon Gene
  • the GLOD gene may be codon-optimized according to the expression host.
  • GLOD can be expressed using eukaryotic cells.
  • a eukaryotic host cell is yeast.
  • microorganisms classified as yeast include yeast belonging to the genus Zygosaccharomyces, Schizosaccharomyces, Saccharomyces, Pichia, Candida, and the like.
  • the inserted gene may contain a marker gene to allow selection of transformed cells. Marker genes include, for example, genes such as URA3 and TRP1 that complement host auxotrophy.
  • the inserted gene also desirably contains a promoter or other regulatory sequences (eg, enhancer sequences, terminator sequences, polyadenylation sequences, etc.) capable of expressing the gene of interest in the host cell.
  • promoters include GAL1 promoter, ADH1 promoter and the like.
  • known methods such as a method using lithium acetate (Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269 (1995)), electroporation (J Microbiol Methods 55 (2003) 481-484), and the like can be suitably used, but not limited thereto, and various arbitrary methods including spheroplast method and glass bead method can be used. Transformation may be performed using
  • eukaryotic host cells include fungal cells (including filamentous fungi) such as Aspergillus and Trichoderma.
  • the method for producing the fungal cell transformant is not particularly limited, and includes, for example, a method of inserting the GLOD-encoding gene into a host filamentous fungus according to a conventional method in such a manner that the gene is expressed. Specifically, a DNA construct is prepared in which a gene encoding GLOD is inserted between an expression-inducing promoter and a terminator, and then a host filamentous fungus is transformed with the DNA construct containing the gene encoding GLOD to obtain a transformant that overexpresses the gene encoding GLOD.
  • the method of inserting the GLOD-encoding gene into the host filamentous fungus in a manner in which it is expressed is not particularly limited, but includes, for example, a method of directly inserting it into the chromosome of the host organism by utilizing homologous recombination;
  • a DNA construct can be ligated between sequences homologous to the upstream region and downstream region of the recombination site on the chromosome and inserted into the genome of the host filamentous fungus.
  • a transformant can be obtained by self-cloning by overexpressing it in a host filamentous fungus under the control of its own high expression promoter.
  • the high-expression promoter is not particularly limited, but includes, for example, the TEF1 gene (tef1) promoter region, which is a translation elongation factor, the ⁇ -amylase gene (amy) promoter region, the alkaline protease gene (alp) promoter region, and the like.
  • the DNA construct can be incorporated into a plasmid vector used for transformation of filamentous fungi by a conventional method, and the corresponding host filamentous fungus can be transformed by a conventional method.
  • Such a suitable vector-host system is not particularly limited as long as it is a system capable of producing GLOD in the host filamentous fungus.
  • the DNA construct is preferably used by introducing it into the chromosome of the host filamentous fungus, but as another method, it can be used without being introduced into the chromosome by incorporating the DNA construct into an autonomously replicating vector (Ozeki et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1133 (1995)).
  • the DNA construct may contain a marker gene to enable selection of transformed cells.
  • Marker genes are not particularly limited, and include, for example, genes that complement host auxotrophy such as pyrG, niaD and adeA; drug resistance genes against drugs such as pyrithiamine and hygromycin B oligomycin.
  • the DNA construct also preferably contains promoters, terminators and other regulatory sequences (eg, enhancers, polyadenylation sequences, etc.) that allow overexpression of the GLOD-encoding gene in the host cell.
  • the promoter is not particularly limited, but includes suitable expression-inducing promoters and constitutive promoters, such as tef1 promoter, alp promoter, amy promoter and the like.
  • Terminators are also not particularly limited, but include, for example, alp terminator, amy terminator, tef1 terminator and the like.
  • the expression control sequence of the GLOD-encoding gene is not necessarily required if the inserted DNA fragment containing the GLOD-encoding gene contains a sequence having an expression control function.
  • the DNA construct may not have a marker gene.
  • DNA construct is, for example, a DNA construct in which the tef1 gene promoter, the gene encoding GLOD, the alp gene terminator and the pyrG marker gene are linked to the In-Fusion Cloning Site in the pUC19 multicloning site.
  • a method for transforming a filamentous fungus a method known to those skilled in the art can be appropriately selected. For example, after preparing a protoplast of a host filamentous fungus, the protoplast PEG method using polyethylene glycol and calcium chloride (see, for example, Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989, JP-A-2007-222055, etc.) can be used. An appropriate medium for regenerating the transformed filamentous fungus is used according to the host filamentous fungus and the transformation marker gene.
  • the transformed filamentous fungus can be regenerated, for example, in Czapek-Dox minimal medium (Difco) containing 0.5% agar and 1.2M sorbitol.
  • Czapek-Dox minimal medium Difco
  • homologous recombination may be used to replace the promoter of the gene encoding GLOD that the host filamentous fungus originally has on the chromosome with a high expression promoter such as tef1.
  • a transformation marker gene such as pyrG in addition to the high expression promoter.
  • a transformation cassette consisting of the upstream region of the gene encoding GLOD-transformation marker gene-high expression promoter-all or part of the gene encoding GLOD can be used.
  • the upstream region of the GLOD-encoding gene and all or part of the GLOD-encoding gene are utilized for homologous recombination.
  • All or part of the gene encoding GLOD can be used that includes the region from the initiation codon.
  • the length of the region suitable for homologous recombination is preferably 0.5 kb or longer.
  • the production of the transformed filamentous fungus of the present invention can be confirmed by culturing the transformed filamentous fungus of the present invention under conditions where GLOD enzymatic activity is observed, and then confirming the GLOD activity in the culture obtained after culturing.
  • confirmation that the transformed filamentous fungus of the present invention has been produced may be performed by extracting chromosomal DNA from the transformed filamentous fungus, performing PCR using this as a template, and confirming that a PCR product that can be amplified is generated when transformation occurs.
  • PCR is performed using a combination of a forward primer for the base sequence of the promoter used and a reverse primer for the base sequence of the transformation marker gene, and it is confirmed that a product of the expected length is generated.
  • the host can be known microorganisms, known strains, and equivalents or equivalents of known microorganisms or known strains described herein.
  • Equivalents refer to hosts that perform equivalent functions with respect to recombinant expression of proteins. Equivalents include hosts that were created and modified based on hosts that were publicly known at the time of filing of this application and that were developed after the filing of this application, and hosts that are similar in nature to hosts that were publicly known at the time of filing of this application and were discovered after filing of this application.
  • the scientific name and classification of microorganisms if there is a change in the scientific name, genus name, classification, etc. after the filing of the application, the descriptions in this specification shall take precedence, and the time of filing of the application shall be the standard.
  • GLOD can also be subjected to high-throughput screening to obtain functional GLOD variants.
  • a library of transformed or transduced strains with a mutated GLOD gene may be generated and subjected to microtiter plate-based high-throughput screening or droplet-based microfluidic-based ultra-high throughput screening. Examples include constructing combinatorial libraries of mutated genes encoding variants, followed by phage display (e.g. Chem. Rev. 105 (11): 4056-72, 2005), yeast display (e.g. Comb Chem High Throughput Screen. 2008;11(2): 127-34), bacterial display (e.g.
  • the library can be used to transform suitable cells, such as electrocompetent EBY-100 cells, to obtain approximately 107 mutants (10 million). Yeast cells transformed with the library can then be subjected to cell sorting. Polydimethoxylsiloxane (PDMS) microfluidic devices fabricated using standard soft lithographic methods may also be used. A flow focus device can be used to form monodisperse droplets. Formed droplets containing individual variants may be subjected to a suitable sorting device. When sorting cells, the presence or absence of GLOD activity can be used. For this purpose, for example, a reaction solution having a composition that develops color when the above GLOD acts may be used.
  • suitable cells such as electrocompetent EBY-100 cells
  • Yeast cells transformed with the library can then be subjected to cell sorting.
  • PDMS Polydimethoxylsiloxane
  • a flow focus device can be used to form monodisperse droplets. Formed droplets containing individual variants may be
  • absorbance at 600 nm may be measured using a 96-well plate, 192-well plate, 384-well plate, 9600-well plate, etc. and a plate reader. Mutagenesis and selection may be repeated multiple times. Mutations herein include amino acid substitutions, insertions, deletions and/or additions.
  • GLOD activity can be confirmed by introducing 1 to 10 mutations into GLOD. Then, starting with a GLOD mutant confirmed to have activity, 1-10 additional mutations can be introduced and activity confirmed.
  • a series of high-throughput screening (eg, the above procedure for obtaining and screening about 10 7 mutants) may be repeated for 2 or more rounds, 5 or more rounds, 10 or more rounds, 15 or more rounds, eg, 20 or more rounds.
  • 10 rounds of high-throughput screening in which 1 or more mutations, 5 or more mutations, for example 10 or more mutations are introduced in each round, 10 or more mutations, 50 or more mutations, for example 100 or more mutations are introduced from the starting GLOD, and active mutants can be rapidly obtained.
  • 20 rounds, 20 or more mutations 100 or more mutations, for example, 200 or more mutations are introduced from the starting GLOD, and active mutants can be rapidly obtained.
  • Such operations may be performed by repeating routine processes.
  • Mutations can be introduced at any one or more positions from the first amino acid to the last amino acid in the full-length amino acid sequence of GLOD.
  • the active center, the substrate recognition site, the coenzyme recognition motif, and regions important to the function of the enzyme, such as the vicinity of these motifs, are excluded.
  • GLOD is widely used in industry, and those skilled in the art are familiar with regions important for enzyme function, including its active center, substrate recognition site, and coenzyme recognition motif.
  • one or more mutations may be first introduced into positions 1-10 of the full-length GLOD sequence. Then, starting with a GLOD mutant confirmed to have activity, one or more mutations at positions 11-20 may be introduced to confirm activity. This can be repeated n times (n ⁇ 68).
  • one or more mutations may be introduced at positions 680-687 in the 68th round.
  • regions that are important for the function of the enzyme or regions that are not intended to be modified may be skipped as appropriate.
  • any mutation can be introduced at any position in the full-length sequence except for the region important for the function of the enzyme. For example, active GLOD mutants with more than 200 mutations can be rapidly obtained.
  • Mutations may be introduced randomly or by rational design.
  • mutations introduced by rational design or randomly introduced mutations can be conservative amino acid substitutions.
  • Conservative amino acid substitutions include amino acid substitutions in which the amino acid before and after the substitution have similar chemical properties (eg, Stryer et al., Biochemistry, 5th Edition, 2002, pp. 44-49).
  • conservative amino acid substitutions can be selected from the group consisting of (i) replacement of a basic amino acid with a different type of basic amino acid; (ii) replacement of an acidic amino acid with a different type of acidic amino acid; (iii) replacement of an aromatic amino acid with a different type of aromatic amino acid; (iv) replacement of a non-polar aliphatic amino acid with a different type of non-polar aliphatic amino acid;
  • Basic amino acids may be selected from, for example, arginine, histidine, and lysine.
  • Acidic amino acids can be, for example, aspartic acid or glutamic acid.
  • Aromatic amino acids may be selected from, for example, phenylalanine, tyrosine and tryptophan.
  • Non-polar aliphatic amino acids may be selected from, for example, glycine, alanine, valine, leucine, methionine and isoleucine.
  • Polar uncharged amino acids may for example be selected from serine, threonine, cysteine, proline, asparagine and glutamine.
  • mutations introduced by rational design or randomly introduced mutations involve substitutions with functionally similar amino acids.
  • Tables of functionally similar amino acids are widely known in the art.
  • the pre-substitution amino acid and the post-substitution amino acid may fall into any of the amino acid classes specified below: 1) glycine (G), alanine (A); 2) aspartic acid (D), glutamic acid (E); 3) Asparagine (N), Glutamine (Q); 4) Arginine (N), Lysine (K); 5) isoleucine (I), leucine (L), methionine (M), valine (V), proline (P); 6) Phenylalanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophan (W); 7) Serine (S), Threonine (T); and 8) Cysteine (C), Methionine (M).
  • conservative amino acid substitutions or substitutions with functionally similar amino acids are not present in regions important for the function of the enzyme, such as the active center of GLOD, the substrate recognition site, the coenzyme recognition motif and their vicinity, and therefore do not significantly affect the activity of the enzyme.
  • GLOD variants can also include those in which additional amino acids are inserted compared to the sequence before mutation.
  • the amino acid insertions are not in regions important for the function of the enzyme, such as the active center, substrate recognition site, coenzyme recognition motifs and their vicinity, and thus do not significantly affect the activity of the enzyme.
  • GLOD variants can also include those in which additional amino acids have been added compared to the pre-mutation sequence.
  • amino acid additions are made to the N-terminus or C-terminus of GLOD and do not significantly affect the activity of the enzyme. Examples of additions include, but are not limited to, short stretches of histidine residues (eg, 2-6 histidine residues) to aid purification of GLOD. Examples of addition include, but are not limited to, addition of a signal peptide for assisting expression of GLOD. Signal peptides include known signal sequences or functional equivalents thereof.
  • GLOD mutants may also contain deletions of amino acids compared to the sequence before mutation.
  • the amino acid deletion is not in a region critical to the function of the enzyme and therefore does not significantly affect the activity of the enzyme.
  • deletions can be short deletions of 1-2 amino acids.
  • the amino acid sequence of one GLOD is compared to the amino acid sequence of another GLOD, and if an amino acid is deleted in one sequence, the deletion can be introduced into the other GLOD. Since both GLODs are active, such deletions are unlikely to significantly affect the activity of the enzyme.
  • Mutations into GLOD can be performed so as not to disrupt secondary structures and structural motifs such as ⁇ -helix structures and ⁇ -sheet structures. Regions of secondary structure can be identified, for example, by secondary structure prediction algorithms. Predictive algorithms include, but are not limited to, NetSurfP - 2.0. The same is true for other structural motifs such as nest and niche.
  • thermostability-enhancing mutation provides GLOD variants with thermostability-enhancing mutations.
  • This mutant has improved thermostability compared to GLOD before the mutation.
  • "having improved thermal stability” means that the residual activity of the GLOD mutant after heat treatment is improved when GLOD is subjected to heat treatment at a predetermined temperature and time, compared to the residual activity of GLOD before the mutation introduction after heat treatment.
  • the GLOD variants of this disclosure are a position corresponding to position 87 of SEQ ID NO: 1, the position corresponding to position 103 of SEQ ID NO: 1, the position corresponding to position 133 of SEQ ID NO: 1, the position corresponding to position 186 of SEQ ID NO: 1, a position corresponding to position 297 of SEQ ID NO: 1, a position corresponding to position 376 of SEQ ID NO: 1, the position corresponding to position 393 of SEQ ID NO: 1, a position corresponding to position 428 of SEQ ID NO: 1, the position corresponding to position 516 of SEQ ID NO: 1, the position corresponding to position 566 of SEQ ID NO: 1, a position corresponding to position 568 of SEQ ID NO: 1, the position corresponding to position 585 of SEQ ID NO: 1, the position corresponding to position 615 of SEQ ID NO: 1, At one or more positions selected from the group consisting of, for example, positions 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, or 13, there is an amino acid substitution compared to
  • the substituted amino acid (amino acid after substitution) introduced at the position corresponding to position 87 of SEQ ID NO: 1 can be tyrosine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 103 of SEQ ID NO: 1 can be selected from the group consisting of phenylalanine, leucine, valine, isoleucine and methionine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 133 of SEQ ID NO: 1 can be selected from the group consisting of leucine and tyrosine.
  • the amino acid substitution introduced at the position corresponding to position 186 of SEQ ID NO: 1 can be selected from the group consisting of glutamic acid, aspartic acid, tyrosine, glutamine, asparagine, alanine, leucine, cysteine, methionine, phenylalanine, serine, histidine, and threonine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 297 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of leucine, valine, isoleucine and methionine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 376 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of phenylalanine, leucine, isoleucine and methionine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 393 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of leucine, valine, isoleucine and methionine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 428 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of tyrosine and methionine.
  • the substituted amino acid introduced at the position corresponding to position 516 of SEQ ID NO: 1 can be phenylalanine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 566 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of phenylalanine, leucine, valine and methionine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 568 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of isoleucine and methionine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 585 of SEQ ID NO: 1 can be selected from the group consisting of leucine and methionine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 615 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of leucine, valine, and phenylalanine. The corresponding positions will be described later.
  • thermostability-enhancing mutations can be introduced into wild-type GLOD or conventional GLOD.
  • conventional GLOD refers to conventional GLOD that requires treatment with a protease to express the active protein.
  • GLOD introduced with such a thermostability-enhancing mutation not only exhibits activity after protease treatment like wild-type GLOD and conventional GLOD, but also has improved thermostability compared to GLOD before mutation introduction.
  • such mutants are sometimes referred to herein as GLOD-T.
  • a plurality of such thermostability-enhancing mutations can also be introduced.
  • GLOD introduced with one thermostability-enhancing mutation is sometimes referred to as GLOD-T1.
  • GLOD-T2 GLOD-T3, GLOD-T4, GLOD-T5, GLOD-T6, GLOD-T7, GLOD-T8, GLOD-T9, GLOD-T10, GLOD-T1, respectively 1, GLOD-T12, or GLOD-T13.
  • GLOD mutant in which amino acid substitutions were introduced at positions corresponding to positions 87, 103, 133, 186, 297, 376, 393, 428, 516, 566, 568, 585, and 615 of SEQ ID NO: 1 has improved thermal stability compared to GLOD before modification. Based on these findings, a person skilled in the art understands that GLOD derived from other sources, in which a similar amino acid substitution is introduced at a position corresponding to position 87 of SEQ ID NO: 1, similarly has improved thermal stability and can be used in various reactions.
  • thermostability-enhancing mutations may be introduced into the amino acid sequence deletion mutants of GLOD (GLOD ⁇ ) of the present disclosure.
  • the amino acid sequence deleted GLOD variants of the disclosure do not require treatment with proteases for expression of active protein.
  • the amino acid sequence deletion-type GLOD mutants of the present disclosure surprisingly have improved thermostability as compared to the corresponding GLOD prior to the amino acid sequence deletion, as described above.
  • the thermostability-enhancing mutations described above may be further introduced.
  • such mutants are sometimes referred to herein as GLOD ⁇ -T.
  • GLOD ⁇ into which one thermostability-enhancing mutation has been introduced is sometimes referred to as GLOD ⁇ -T1.
  • GLOD ⁇ -T2 GLOD ⁇ -T3, GLOD ⁇ -T4, GLOD ⁇ -T5, GLOD ⁇ -T6, GLOD ⁇ -T7, GLOD ⁇ -T8, GLOD ⁇ -T9, and GLOD ⁇ -T, respectively 10, GLOD ⁇ -T11, GLOD ⁇ -T12, or GLOD ⁇ -T13.
  • GLOD variants of the disclosure such as thermostable variants such as GLOD-T and GLOD-T1 to GLOD-T13, and amino acid sequence deletion GLOD variants, such as GLOD ⁇ -T and GLOD ⁇ -T1 to GLOD ⁇ -T13, such as SEQ ID NOs: 12, 13, 58, 59 or 60, or any of these, 70% or more, 80% GLOD variants with amino acid sequence identity of greater than or equal to 90% may optionally have amino acid substitutions as described in WO2021/193598.
  • Ser can be substituted for Ala at position 106 relative to SEQ ID NO: 1 herein.
  • A106S This amino acid substitution is referred to herein as A106S.
  • the GLOD variants of the present disclosure are A106S, C210S, Q235E, D236E, D237E, P244H, T311S, W313F, Q333E, I334V, I334L, M336L, Q338E, R339K, T416S, A438P, It may have one or more, eg, 1-25, amino acid substitutions selected from the group consisting of K441E, Y455F, Q456R, Q457E, Q457K, L505I, P598A, C601S, and P609A. The same applies to positions corresponding to these positions.
  • the amino acid substitution described in WO 2021/193598 may be denoted as J to distinguish it from the thermostability-enhancing amino acid deletion ⁇ of the present disclosure and the thermostability-enhancing mutation T of the present disclosure. That is, let J be a set (set) of amino acid substitutions described in International Publication No. 2021/193598, and the order of each constituent element does not matter.
  • a mutant having one mutation contained in J is defined as J1
  • a mutant having n mutations is defined as Jn
  • J25 is defined in the same manner.
  • the present disclosure provides the following combination variants. Those skilled in the art can generate these finite combinations of mutants one by one and confirm their activity and thermostability.
  • the ⁇ deleted below can be a sequence 31-54 in length. Also, in the following, the starting point on the C-terminal side of ⁇ to be deleted can be the position corresponding to position 510, 508 or 507 of SEQ ID NO:1.
  • GLOD mutant GLOD ⁇ mutants can be generated by introducing amino acid sequence deletions of the present disclosure into the GLOD gene to produce GLOD, eg, highly thermostable GLOD, without protease treatment.
  • a GLOD-T variant can be generated by introducing the amino acid substitution T of this disclosure into the GLOD gene to produce a highly thermostable GLOD.
  • GLOD ⁇ -T variants can be generated by introducing amino acid sequence deletions and substitutions of the present disclosure into the GLOD gene to produce GLOD, eg, highly thermostable GLOD, without protease treatment.
  • back mutations from amino acids after substitution to amino acids in the native GLOD sequence are excluded.
  • the amino acid after substitution at a position corresponding to, for example, position 87 of SEQ ID NO: 1 can be identical to the amino acid at that position in the native GLOD sequence (natural amino acid).
  • corresponding position As used herein, when a specific position in a reference amino acid sequence corresponds to a specific position in another similar amino acid sequence, this is referred to as a corresponding position. An amino acid at a corresponding position is called a corresponding amino acid.
  • the “corresponding position” in the amino acid sequence refers to the position in the amino acid sequence of GLOD derived from other species that corresponds to a specific position in the amino acid sequence of GLOD derived from Streptomyces sp. X-119-6 shown in SEQ ID NO:1.
  • amino acid sequences can be compared using known algorithms such as the Lippmann-Person method, and the conserved amino acid residues present in the amino acid sequences of each GLOD can be given maximum identity.
  • aligning the GLOD amino acid sequences in this way it is possible to determine the sequence positions of homologous amino acid residues in each GLOD sequence, regardless of insertions or deletions in the amino acid sequences.
  • Corresponding positions are thought to be at the same position in the three-dimensional structure and can be presumed to have similar effects on the specific function of the GLOD of interest.
  • the position corresponding to position 87 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 refers to the position corresponding to position 87 of SEQ ID NO: 1 when the amino acid sequence of the subject GLOD is compared with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • positions 103, 133, 186, 297, 376, 393, 428, 516, 566, 568, 585 and 615 are also included in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the "corresponding region” in the amino acid sequence is also defined in the same manner as the "corresponding position” above.
  • the region corresponding to positions 459-507 of SEQ ID NO:1 is positions 459-507 of SEQ ID NO:58.
  • the region corresponding to positions 459 to 466 of SEQ ID NO:1 is positions 459 to 466 of SEQ ID NO:58.
  • the region corresponding to positions 457 to 510 of SEQ ID NO:1 is positions 457 to 510 of SEQ ID NO:58.
  • the region corresponding to positions 670 to 687 of SEQ ID NO:1 is positions 673 to 690 of SEQ ID NO:58.
  • amino acid sequence homology, identity or similarity The homology, identity or similarity of amino acid sequences can be calculated using programs such as maximum matching and search homology of GENETYX (manufactured by GENETYX), maximum matching and multiple alignment of DNASIS Pro (manufactured by Hitachi Solutions), and programs such as multiple alignment of CLUSTAL W.
  • GENETYX manufactured by GENETYX
  • DNASIS Pro manufactured by Hitachi Solutions
  • CLUSTAL W programs such as multiple alignment of CLUSTAL W.
  • amino acid sequence identity when two or more GLODs are aligned, the positions of identical amino acids in the two or more GLODs can be examined. Based on such information, identical regions in amino acid sequences can be determined.
  • the percent identity refers to the percentage obtained by taking the total number of amino acids in the region that could be aligned when aligning two or more amino acid sequences using an algorithm such as Blosum62 as the denominator and the number of positions occupied by the same amino acid as the numerator. Therefore, usually, when two or more amino acid sequences have a region where no identity is found, for example, when one amino acid sequence has an additional sequence where no identity is found at the C-terminus, the region with no identity cannot be aligned and is not used for calculating percent identity.
  • CLUSTALW can be used to align multiple amino acid sequences.
  • Blosum62 is used as an algorithm, and amino acids determined to be similar when aligning multiple amino acid sequences are sometimes called similar amino acids.
  • amino acid substitutions may be due to substitutions between such similar amino acids.
  • alignments allow multiple amino acid sequences to be examined for regions where the amino acid sequences are identical and for positions occupied by similar amino acids. Based on such information, homologous regions (conserved regions) in the amino acid sequence can be determined.
  • the GLOD variant of the present disclosure is 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 9 It has a full-length amino acid sequence identity of 8% or more, for example, 99% or more, and has improved thermal stability compared to GLOD before modification.
  • the GLOD variant of the present disclosure is an amino acid sequence in which one or several amino acids are altered or mutated, or deleted, substituted, added and/or inserted at positions other than those corresponding to positions 87, 103, 133, 186, 297, 376, 393, 428, 516, 566, 568, 585 and 615 of SEQ ID NO: 1. and has improved thermal stability compared to GLOD before modification.
  • one or several amino acids means 1 to 15, 1 to 10, 1 to 7, 1 to 5, 1 to 4, eg 1 to 3, eg 1 or 2 amino acids.
  • the GLOD ⁇ of the present disclosure is: (i) When aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of the predetermined region of SEQ ID NO: 1 is deleted, optionally the amino acid sequence of the region corresponding to positions 670 to 687 of SEQ ID NO: 1 is deleted, and has glutamate oxidase activity, wherein the predetermined region is a region consisting of 31 to 54 consecutive amino acids starting at the position corresponding to position 510, 508, or 507 of SEQ ID NO: 1 on the C-terminal side.
  • the full-length amino acid sequence of GLOD ⁇ has 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, for example 99% or more, with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 59; (iv) in (i) or (ii) above, the full-length amino acid sequence of GLOD ⁇ has 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, for example, 99% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 59; In L
  • 9 has a sequence identity of 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, for example 99% or more, and the amino acid at the position corresponding to position 291 of SEQ ID NO: 1 in the GLOD ⁇ is arginine, and corresponds to positions 51 to 56 of SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence at the position is Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly (here, Xaa represents any amino acid), and the thermostability is improved compared to GLOD before modification.
  • the GLOD-T of the present disclosure is (i) When aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, amino acids at positions corresponding to positions selected from the group consisting of positions 87, 103, 133, 186, 297, 376, 393, 428, 516, 566, 568, 585, and 615 of SEQ ID NO: 1 are substituted.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 87 of SEQ ID NO: 1 can be tyrosine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 103 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of phenylalanine, leucine, valine, isoleucine and methionine.
  • the replacement amino acid introduced at position corresponding to position 133 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of leucine and tyrosine.
  • the replacement amino acid introduced at position corresponding to position 186 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of glutamic acid, aspartic acid, tyrosine, glutamine, asparagine, alanine, leucine, cysteine, methionine, phenylalanine, serine, histidine, and threonine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 297 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of leucine, valine, isoleucine and methionine.
  • the replacement amino acid introduced at position corresponding to position 376 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of phenylalanine, leucine, isoleucine and methionine. In certain embodiments, for the GLOD-T variants of the present disclosure, the replacement amino acid introduced at position corresponding to position 393 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of leucine, valine, isoleucine and methionine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 428 of SEQ ID NO:1 may be selected from the group consisting of tyrosine and methionine.
  • the substituted amino acid introduced at the position corresponding to position 516 of SEQ ID NO: 1 can be phenylalanine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 566 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of phenylalanine, leucine, valine and methionine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 568 of SEQ ID NO:1 may be selected from the group consisting of isoleucine and methionine. In certain embodiments, for the GLOD-T variants of the disclosure, the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 585 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of leucine and methionine. In certain embodiments, for the GLOD-T variants of the disclosure, the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 615 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of leucine, valine, and phenylalanine.
  • the GLOD ⁇ -T of the present disclosure is (i) When aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence of the predetermined region of SEQ ID NO: 1 is deleted, and optionally the amino acid sequence of the region corresponding to positions 670 to 687 of SEQ ID NO: 1 is deleted, and has glutamate oxidase activity, wherein the predetermined region is a region consisting of 31 to 54 consecutive amino acids starting at the position corresponding to position 510, 508, or 507 of SEQ ID NO: 1 on the C-terminal side.
  • amino acids at positions corresponding to positions selected from the group consisting of positions 87, 103, 133, 186, 297, 376, 393, 428, 516, 566, 568, 585 and 615 of SEQ ID NO: 1 are substituted.
  • the full-length amino acid sequence of the GLOD ⁇ -T is 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, for example 99% % or greater sequence identity
  • the full-length amino acid sequence of GLOD ⁇ -T is 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, for example 9.
  • the full-length amino acid sequence of GLOD ⁇ -T is 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, for example 99% of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, or SEQ ID NO: 69.
  • the amino acid at position 291 of SEQ ID NO: 1 is arginine
  • the amino acid sequence at positions 51 to 56 of SEQ ID NO: 1 is Gly-Xaa-Gly-Xaa-Xaa-Gly (where Xaa represents any amino acid)
  • the thermostability is improved compared to GLOD before modification.
  • the present disclosure has 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, such as 90% or more, such as 95% or more amino acid sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60 or SEQ ID NO: 69, and lacks a predetermined region of SEQ ID NO: 1, wherein the predetermined region extends from 31 to 54 with the C-terminal starting point corresponding to position 510, 508, or 507 of SEQ ID NO: 1.
  • the substituted amino acid introduced at the position corresponding to position 87 of SEQ ID NO: 1 can be tyrosine.
  • the replacement amino acid introduced at position corresponding to position 103 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of phenylalanine, leucine, valine, isoleucine and methionine.
  • the replacement amino acid introduced at position corresponding to position 133 of SEQ ID NO:1 may be selected from the group consisting of leucine and tyrosine.
  • the replacement amino acid introduced at position corresponding to position 186 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of glutamic acid, aspartic acid, tyrosine, glutamine, asparagine, alanine, leucine, cysteine, methionine, phenylalanine, serine, histidine, and threonine.
  • the replacement amino acid introduced at position corresponding to position 297 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of leucine, valine, isoleucine and methionine.
  • the replacement amino acid introduced at position corresponding to position 376 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of phenylalanine, leucine, isoleucine and methionine. In certain embodiments, for the GLOD ⁇ -T variants of the present disclosure, the replacement amino acid introduced at position corresponding to position 393 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of leucine, valine, isoleucine and methionine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 428 of SEQ ID NO:1 may be selected from the group consisting of tyrosine and methionine.
  • the substituted amino acid introduced at the position corresponding to position 516 of SEQ ID NO: 1 can be phenylalanine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 566 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of phenylalanine, leucine, valine and methionine.
  • the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 568 of SEQ ID NO:1 may be selected from the group consisting of isoleucine and methionine. In certain embodiments, for the GLOD ⁇ -T variants of the present disclosure, the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 585 of SEQ ID NO:1 may be selected from the group consisting of leucine and methionine. In certain embodiments, for the GLOD ⁇ -T variants of the disclosure, the replacement amino acid introduced at the position corresponding to position 615 of SEQ ID NO: 1 may be selected from the group consisting of leucine, valine, and phenylalanine.
  • the present invention provides a method for producing GLOD, comprising the steps of culturing a strain capable of producing GLOD under conditions that allow expression of the GLOD, and isolating GLOD from the culture or culture medium.
  • This method can employ a host cell transformed with a vector that has incorporated a gene encoding a GLOD of the present disclosure.
  • the conditions under which GLOD can be expressed mean that the GLOD gene is transcribed and translated to produce a polypeptide encoded by the gene.
  • one or more nitrogen sources such as yeast extract, tryptone, peptone, meat extract, corn steep liquor, soybean or wheat bran exudate, sodium chloride, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate, manganese sulfate, or the like inorganic salts are added, and if necessary, sugar raw materials, vitamins, etc. are added as appropriate.
  • substrates on which the GLOD can act and similar compounds thereof such as glycated amino acids, glycated peptides, glycated protein hydrolysates, or glycated proteins such as glycated hemoglobin and glycated albumin, the production amount of the target enzyme can be improved.
  • Cultivation is preferably carried out at a culture temperature of 20 to 42° C., preferably around 25 to 37° C. for 4 to 24 hours, more preferably around 25 to 37° C. for 8 to 16 hours, by aeration stirring deep culture, shaking culture, stationary culture, or the like.
  • GLOD can be collected from the culture using normal enzyme collection means.
  • the present enzyme can be excreted from the cells by subjecting the cells to ultrasonic destruction treatment, grinding treatment, etc. by a conventional method, extracting the present enzyme using a bacteriolytic enzyme such as lysozyme, or shaking or allowing to stand in the presence of toluene or the like to lyse the bacteria.
  • a bacteriolytic enzyme such as lysozyme, or shaking or allowing to stand in the presence of toluene or the like to lyse the bacteria.
  • this solution is filtered, centrifuged, or the like to remove the solid portion, and if necessary, the nucleic acid is removed with streptomycin sulfate, protamine sulfate, manganese sulfate, or the like, and then ammonium sulfate, alcohol, acetone, or the like is added to fractionate, and the precipitate is collected to obtain a crude enzyme.
  • a further purified enzyme sample from the crude enzyme for example, a gel filtration method using Sephadex, Superdex, or Ultrogel, etc., an adsorption elution method using an ion-exchange carrier, a hydrophobic carrier, or hydroxyapatite, an electrophoresis method using a polyacrylamide gel, a sedimentation method such as a sucrose density gradient centrifugation method, an affinity chromatography method, a fractionation method using a molecular sieve membrane or a hollow fiber membrane, etc., can be appropriately selected, or a combination of these methods can be used to obtain purified GL.
  • An OD enzyme preparation can be obtained.
  • the GLOD variants of the disclosure are for example (i) FAD as a coenzyme, (ii) recognizes glutamate as a substrate, (iii) act to oxidize glutamic acid to produce 2-oxoglutarate, ammonia and hydrogen peroxide; can be
  • the GLOD mutant of the present disclosure may have a residual activity of 50% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, for example 90% or more after heat treatment at 30 to 40°C, for example, 35°C for 30 minutes or 35 minutes, when the activity before heat treatment is taken as 100%.
  • the GLOD mutant of the present disclosure can have a residual activity of, for example, 50% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, for example, 90% or more, after heat treatment at 60° C. for 30 minutes or 35 minutes, when the activity before heat treatment is taken as 100%.
  • the GLOD mutant of the present disclosure can have a residual activity of, for example, 50% or more, 60% or more, 65% or more, 70% or more, such as 75% or more, after heat treatment at 65° C. for 30 minutes or 35 minutes, when the activity before heat treatment is taken as 100%.
  • the GLOD mutant of the present disclosure can have a residual activity of, for example, 10% or more, 15% or more, 20% or more, 25% or more, 30% or more, such as 35% or more, after heat treatment at 70° C. for 30 minutes or 35 minutes, when the activity before heat treatment is taken as 100%.
  • GLOD mutants of the present disclosure exclude GLOD that does not exhibit activity on glutamic acid.
  • the present invention provides a reagent composition for measuring glutamate, a measuring reagent, an electrode, a sensor or a kit containing GLOD.
  • the compositions, reagents, electrodes, sensors or kits may contain reagents for measuring reduced compounds, reagents for measuring hydrogen peroxide, buffers, surfactants, salts, preservatives and the like.
  • solubilizers, stabilizers, reactivity improvers, glycated hemoglobin modifiers, reducing agents, bovine serum albumin, sugars (glycerin, lactose, sucrose, etc.) and the like may be added.
  • compositions, reagent, electrode, sensor or kit can be supplemented with other known stabilizers, contaminant elimination systems, and the like.
  • Techniques used for various conventional reagents, electrodes, sensors, and kits can be appropriately modified and used for the compositions, reagents, electrodes, sensors, and kits of the present disclosure.
  • surfactants include nonionic surfactants and ionic surfactants, such as cationic surfactants, anionic surfactants, and amphoteric surfactants.
  • nonionic surfactants include polyoxyethylene alkyl ethers, fatty acid sorbitan esters, alkyl polyglucosides, fatty acid diethanolamides, and alkyl monoglyceryl ethers.
  • cationic surfactants include alkyltrimethylammonium salts, dialkyldimethylammonium salts, alkylbenzyldimethylammonium salts, pyridinium salts, such as alkylpyridinium salts, phosphonium salts, such as alkylphosphonium salts, imidazolium salts, such as alkylimidazolium salts, isoquinonium salts, such as alkylisoquinonium salts.
  • a reagent for measuring hydrogen peroxide may contain peroxidase and/or a chromogenic substrate.
  • chromogenic substrates other than 4-aminoantipyrine include ADOS (N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-anisidine), ALOS (N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)aniline), TOOS (N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine sodium), DA-67 (10-(carboxymethylaminocarbonyl)-3,7-bis(dimethylamino) -phenocyanazine), DA-64 (N-(carboxymethylaminocarbonyl)-4,4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine) and the like.
  • the present disclosure provides methods of measuring glutamate.
  • Glutamate determination can be a qualitative or quantitative method.
  • a method of quantification may comprise contacting a sample containing glutamate with a GLOD of the present disclosure and measuring the reaction product or consumable.
  • the term "contact" as used in the quantification method includes all aspects of physically bringing the enzyme and the sample together so that GLOD can catalyze the oxidation reaction of glutamic acid. For example, it includes not only mixing free enzyme and glutamic acid in a solution, but also adding or dropping a solution sample containing glutamic acid to an enzyme supported on a solid phase carrier.
  • the sample (sample) used for measurement can be any sample that may contain glutamic acid.
  • the sample can be processed as appropriate.
  • the absorbance of the detected chromogenic substrate decreases proportionally.
  • the lowest detectable glutamic acid concentration (detection limit concentration) when using the GLOD can be determined.
  • the enzyme amount and reaction time can be set so that the detection limit is lower than the glutamic acid concentration in the measurement sample or blood.
  • a calibration curve in advance by performing regression analysis such as the least squares method from the measured values such as the absorbance of a control containing glutamic acid with a known concentration.
  • the glutamic acid concentration in the sample can be quantified by plotting the measured values of the sample with unknown glutamic acid concentration against the prepared calibration curve.
  • the time for which GLOD is allowed to act on a sample containing glutamic acid can be, for example, 5 seconds or more, 10 seconds or more, 20 seconds or more, 30 seconds or more, 1 minute or more, less than 60 minutes, less than 30 minutes, less than 10 minutes, for example, less than 5 minutes, for example, 0.5 minutes to less than 60 minutes, 1 minute to less than 30 minutes, 1 minute to less than 20 minutes, for example, 1 minute to less than 10 minutes, for example, 1 minute to less than 5 minutes.
  • the working temperature depends on the optimum temperature of the enzyme used, it is, for example, 20 to 45° C., and the temperature used in ordinary enzymatic reactions can be appropriately selected.
  • the amount of GLOD enzyme used depends on the amount of substrate contained in the sample solution, but can be added so that the final concentration is 0.1 to 50 U/ml, for example 0.2 to 10 U/ml.
  • the pH at which GLOD can act can be adjusted using a buffer, considering the pH at which GLOD can act, for example, the optimum pH.
  • the reaction pH is eg 3-11, 5-9, eg 6-8.
  • the measurement of hydrogen peroxide can be performed simultaneously with the process of generating hydrogen peroxide, and can proceed simultaneously with the action of GLOD.
  • a consumable product may be measured instead of the product, and the consumable product to be measured includes dissolved oxygen, and the dissolved oxygen amount in the reaction solution can be measured using a dissolved oxygen meter or the like.
  • a method for measuring GLOD activity using glutamic acid as a substrate is exemplified below, but the method is not limited to this.
  • Glutamic acid can be commercially available.
  • the enzyme titer is defined as 1 U as the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of hydrogen peroxide per minute when measured at 30° C. and pH 7.4 using glutamic acid as a substrate.
  • A: Activity measurement reagent 250 mM potassium phosphate buffer pH 7.4 (Reagent 2) 30 mM 4-aminoantipyrine (4-AA) solution (Reagent 3) 15 mM N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline sodium salt (TOOS) solution (Reagent 4) 300 U/ml horseradish peroxidase (POD) solution (Reagent 5) 300 mM sodium hydrogen glutamate solution 25 ⁇ l of Reagent 3, 12.5 ⁇ l of Reagent 4, ⁇ l of deionized water (375-V), and V ⁇ l of GLOD solution are mixed and incubated at 30° C. for 5 minutes.
  • POD horseradish peroxidase
  • the absorbance of light at a wavelength of 555 nm (A 555 ) was measured using a spectrophotometer U-3900 (manufactured by Hitachi High-Tech Science) with the cell holder kept at 30° C., and the amount of change in A 555 per minute ( ⁇ A S ) was calculated.
  • a control experiment 25 ⁇ l of deionized water was added instead of 25 ⁇ l of Reagent 5, the absorbance of light at a wavelength of 555 nm (A 555 ) was measured, and the amount of change in A 555 per minute ( ⁇ A 0 ) was calculated.
  • the present disclosure provides polynucleotides encoding glutamate oxidase variants.
  • the disclosure provides vectors comprising such polynucleotides.
  • the disclosure provides host cells transformed with, or containing, such vectors.
  • the present disclosure provides methods of producing a glutamate oxidase variant, comprising culturing such host cells to produce the glutamate oxidase variant, and obtaining the produced glutamate oxidase variant.
  • the present disclosure provides methods of contacting a glutamate oxidase variant, or composition, reagent, electrode, sensor or kit comprising the same, with a sample containing glutamate to oxidize the glutamate contained in the sample.
  • the method can detect glutamate.
  • the method can measure glutamate.
  • GLOD preparation method The inventors created GLOD ⁇ by introducing specific amino acid sequence deletions into GLOD.
  • GLOD ⁇ -T was prepared by introducing a specific amino acid substitution into GLOD ⁇ .
  • the deletions and mutations of this disclosure can be combined as appropriate. Further variants can also be generated based on the findings of the present disclosure.
  • the present invention provides a method of engineering GLOD or GLOD ⁇ to create a thermostable GLOD variant comprising the steps of: (i) obtaining a GLOD gene or a GLOD ⁇ gene; (ii) incorporating the GLOD gene or GLOD ⁇ gene into a vector, transforming a host cell to express GLOD or GLOD ⁇ , and isolating the expression product; (iii) confirming the activity of the expression product; (iv) measuring residual activity of the expression product after heat treatment; (v) substitution of amino acids at positions corresponding to positions selected from the group consisting of positions 87, 103, 133, 186, 297, 376, 393, 428, 516, 566, 568, 585, and 615 of SEQ ID NO: 1 when the amino acid sequence of GLOD or GLOD ⁇ is aligned with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; modifying the GLOD gene or GLOD ⁇ gene to substitute an amino
  • a peptide linker may be inserted in the region where the amino acid sequence has been deleted.
  • a peptide linker can be, for example, a linker composed of 1-20 amino acid residues.
  • a peptide linker may be composed of an amino acid sequence different from the partial amino acid sequence of GLOD.
  • Peptide linkers can be composed of, for example, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 or 20 amino acid residues.
  • Peptide linkers can be composed of, for example, 2-19, 3-18, 4-17, 5-16, 6-15, such as 7-14 amino acid residues.
  • the amino acid residues that make up the peptide linker can be natural amino acids and glycine. Examples include Ala, Asn, Cys, Gln, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val, Asp, Glu, Arg, His, and Lys. Examples include Gly, Ala, Ser, and Thr.
  • the peptide linker can be GGGGS or repeats thereof. The number of repetitions can be 2, 3, 4 times.
  • a GLOD variant of the disclosure eg, GLOD ⁇ or GLOD ⁇ -T, does not have a peptide linker.
  • a GLOD variant of the disclosure eg, GLOD ⁇ or GLOD ⁇ -T
  • the GLOD variants of the present disclosure eg, GLOD ⁇ or GLOD ⁇ -T, exclude sequences having 90% or greater amino acid sequence identity with SEQ ID NO:1.
  • a GLOD variant of the present disclosure eg, GLOD ⁇ or GLOD ⁇ -T
  • the GLOD variants of this disclosure eg, GLOD ⁇ or GLOD ⁇ -T
  • a GLOD variant of the disclosure, eg, GLOD ⁇ or GLOD ⁇ -T excludes a known GLOD or a known GLOD variant.
  • Amino acid numbering is shifted in the mutant in which positions 459 to 507 of SEQ ID NO: 1 are deleted.
  • the position corresponding to position 516 in SEQ ID NO: 1 is the 467th position counting from the N-terminus in the deletion mutant.
  • the position corresponding to position 566 in SEQ ID NO: 1 is the 517th position counting from the N-terminus in the deletion mutant.
  • the position corresponding to position 568 in SEQ ID NO: 1 is the 519th position counted from the N-terminus in the deletion mutant.
  • the position corresponding to position 585 in SEQ ID NO: 1 is the 536th position counting from the N-terminus in the deletion mutant.
  • the position corresponding to position 615 in SEQ ID NO: 1 is the 566th position counting from the N-terminus in the deletion mutant.
  • the GLOD of the present disclosure is further illustrated by the following examples. However, this is for illustrative purposes only and the present disclosure is in no way limited thereto.
  • Streptomyces sp Improving heat resistance of glutamate oxidase (StGLOD) derived from X-119-61. Construction of Glutamate Oxidase (GLOD) Expression Plasmid Streptomyces sp. An X-119-6-derived glutamate oxidase (StGLOD) expression plasmid (pKK223-3-StGLOD) was constructed using NEBuilder HiFi DNA assembly (New England Biolabs).
  • the StGLOD gene having the base sequence of SEQ ID NO: 2 was divided into 3 fragments, SEQ ID NO: 3 (StGLOD-f1), SEQ ID NO: 4 (StGLOD-f2) and SEQ ID NO: 5 (StGLOD-f3), and the synthesis was entrusted to Integrated DNA Technologies.
  • the 3'-terminal 15 bases of StGLOD-f1 and the 5'-terminal 15 bases of StGLOD-f2 are overlapping sequences for gene assembly.
  • the 3'-terminal 15 bases of StGLOD-f2 and the 5'-terminal 15 bases of StGLOD-f3 are overlapping sequences for gene assembly.
  • a plasmid fragment was prepared by PCR using the pKK223 plasmid as a template and primers of SEQ ID NO: 6 (ggtcatttcattcatgaattctgtttcctgtgtgaaattg) and SEQ ID NO: 7 (gcgttaacttcttaagcttggctgttttggcggatgag).
  • the SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 primer has a 15-base sequence overlapping with StGLOD-f1 or StGLOD-f3, respectively, added to the 5' end of the sequence that anneals with pKK223-3.
  • the amplified fragment was purified using the GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (manufactured by Cytiva).
  • a reaction was performed at 50°C for 60 minutes with the composition shown in the table below to obtain a plasmid for expression of StGLOD (pKK223-3-StGLOD).
  • the resulting plasmid is an E. E. coli JM109 strain was transformed. It was confirmed by DNA sequence analysis that the nucleotide sequence of the plasmid extracted by culturing the obtained transformant had the intended sequence.
  • the amino acid sequences of StGLOD ⁇ 49Ai or StGLOD ⁇ 49C are shown in SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 13, respectively.
  • a cycle of "98°C for 10 seconds ⁇ 55°C for 5 seconds ⁇ 68°C for 35 seconds" was repeated seven times.
  • the GLOD-producing strain was inoculated into 2.5 ml of LB-amp medium (ampicillin concentration: 50 ⁇ g/ml) in a test tube and seed-cultured overnight at 37°C and 160 rpm.
  • 2.5 ml of the seed culture was inoculated into 250 ml of LB-amp medium (ampicillin concentration: 50 ⁇ g/ml) containing 0.1 mM IPTG in a Sakaguchi flask and cultured at 25° C. and 130 rpm for 16 hours.
  • the pellet obtained by centrifuging the culture solution at 8,000 rpm for 10 minutes was resuspended in 4 ml of 10 mM potassium phosphate buffer (PPB) pH 7.5. After sonicating the cell suspension, it was centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes, and the resulting supernatant was collected to obtain a GLOD crude enzyme solution.
  • PPB potassium phosphate buffer
  • GLOD Activity As reagents for measuring GLOD activity, 4-aminoantipyrine (4-AA) (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries), TOOS (manufactured by Dojindo Laboratories) and horseradish peroxidase (POD) (manufactured by Toyobo) were used. Table 2 shows the composition of the activity measurement reagent. 10 mM PPB (pH 7.4) containing 0.15% bovine serum albumin (BSA, Sigma-Aldrich) was used to dilute the GLOD solution.
  • BSA bovine serum albumin
  • Oxidase activity (U/ml) was calculated based on the following formula. "39.2" in the formula indicates the millimolar absorption coefficient (mM -1 cm -1 ) of the quinoneimine dye formed by condensing 4-AA and TOOS with respect to light having a wavelength of 555 nm.
  • the GLOD crude enzyme solution was diluted with 10 mM PPB pH 6.0 so that the final concentration of GLOD was 0.05 U/ml. Subsequently, 240 ⁇ l of 0.05 U/ml GLOD solution and 160 ⁇ l of 250 mM PPB pH 6.0 were mixed and heated in a water bath maintained at a predetermined temperature for 30 or 35 minutes. After heating, the GLOD solution was quickly cooled on ice, and the activity was measured using 375 ⁇ l of the GLOD solution. Taking the activity of the sample that had been cooled on ice without heating as 1, the residual activity of the sample after heating was calculated. The residual activity was calculated three times for each GLOD, and the average value was used to evaluate thermal stability.
  • Table 3 shows the residual activity of the StGLOD deletion mutants after heating at 45°C for 30 minutes.
  • the residual activity of the StGLOD deletion mutants shown in the table above was increased by 0.11 to 0.37 compared to StGLOD, and all of the StGLOD deletion mutants had improved thermostability. Stated another way, the residual activity was improved by about 20% and about 65% compared to the wild type.
  • Example 2 Improvement of heat resistance of StGLOD ⁇ 49C by amino acid substitution6. Preparation of Modified StGLOD ⁇ 49C Expression and residual activity of StGLOD ⁇ 49C could be confirmed. Therefore, further modified mutants based on StGLOD ⁇ 49C were generated.
  • PCR reaction solution was prepared by mixing 10 ⁇ l of KOD one PCR Master Mix (manufactured by Toyobo), 3 ⁇ l of 2 ⁇ M Fw primer, 3 ⁇ l of 2 ⁇ M Rv primer, 0.5 ⁇ l of 40 ⁇ g/ml template DNA (pKK223-3-StGLOD), and 3.5 ⁇ l of deionized water.
  • Table 4 shows the names of the produced mutants and the combinations of Fw primers and Rv primers.
  • PCR reaction conditions a cycle of "98°C for 10 seconds ⁇ 55°C for 5 seconds ⁇ 68°C for 35 seconds" was repeated 15 times.
  • a plasmid for expression of multiple mutant StGLOD ⁇ 49C was constructed by repeatedly introducing single mutations.
  • PCR was performed using pKK223-3-StGLOD ⁇ 49C/F87Y as a template and the primers of SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 16 to construct a plasmid for expression of the double mutant StGLOD ⁇ 49C/F87Y/Y103I.
  • the residual activity of the modified StGLOD ⁇ 49C shown in the table above was increased by 0.02 to 0.72 compared to StGLOD ⁇ 49C, and all modified StGLOD ⁇ 49C had improved thermal stability.
  • the residual activity of the prepared modified enzyme was improved by about 9% or more to about 325% or more compared to StGLOD ⁇ 49C before modification.
  • An octuply mutant was prepared by combining eight types of amino acid substitutions (F87Y, Y103I, F133Y, F297M, F393L, F428Y, Y517F, Y536L) that contributed to the improvement of the thermal stability of StGLOD ⁇ 49C.
  • the residual activity of the body is shown in the table below.
  • the StGLOD ⁇ 49C octuple mutant shown in the table above was stable even after heating at 60°C for 35 minutes, and remained at least 1/3 of the activity after heating at 70°C for 35 minutes. It was revealed that the combination of the amino acid substitutions shown in Table 9 dramatically improves the thermal stability of StGLOD ⁇ 49C.
  • Example 3 Acquisition of thermally stable StGLOD homologs7. Construction of Plasmid for Expression of StGLOD Homolog with Thermostability-Enhancing Mutation Streptomyces sp. MOE7-derived putative glutamate oxidase (M7GLOD) was deleted in the same manner as StGLOD ⁇ 49C to design an amino acid sequence (M7GLOD ⁇ 49C, SEQ ID NO: 59), and an amino acid sequence (M 7GLOD ⁇ 49C-T8, SEQ ID NO: 60) was designed.
  • M7GLOD putative glutamate oxidase
  • the M7GLOD ⁇ 49C-T8 expression plasmid (pET22b-M7GLOD ⁇ 49C-T8) was prepared using the In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Clontech).
  • the M7GLOD ⁇ 49C-T8 gene having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 61 was divided into three fragments of SEQ ID NO: 62 (M7GLOD ⁇ 49C-T8-f1), SEQ ID NO: 63 (M7GLOD ⁇ 49C-T8-f2) and SEQ ID NO: 64 (M7GLOD ⁇ 49C-T8-f3), and the synthesis was entrusted to Integrated DNA Technologies. did.
  • the 5' terminal 15 bases of M7GLOD ⁇ 49C-T8-f1 are overlapping sequences for assembly into pET-22b(+).
  • the 3′-terminal 15 bases of M7GLOD ⁇ 49C-T8-f1 and the 5′-terminal 15 bases of M7GLOD ⁇ 49C-T8-f2 are overlapping sequences for gene assembly.
  • the 3′-terminal 15 bases of M7GLOD ⁇ 49C-T8-f2 and the 5′-terminal 15 bases of M7GLOD ⁇ 49C-T8-f3 are overlapping sequences for gene assembly.
  • the 3' terminal 15 bases of M7GLOD ⁇ 49C-T8-f3 are overlapping sequences for assembly into pET-22b(+).
  • a plasmid fragment was prepared by PCR using the pET-22b(+) plasmid as a template and primers of SEQ ID NO: 65 (catatgtatatctccttcttaaag) and SEQ ID NO: 66 (taacaaagcccgaaaggaag). After adding 1.0 ⁇ l of DpnI (manufactured by New England BioLabs) to the solution after PCR and treating at 37° C. for 1 hour, the amplified fragment was purified using the GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (manufactured by Cytiva).
  • a reaction was performed at 50°C for 15 minutes with the composition shown in the table below to obtain an M7GLOD ⁇ 49C-T8 expression plasmid (pET22b-M7GLOD ⁇ 49C-T8).
  • the resulting plasmid is an E. E. coli JM109 strain was transformed. It was confirmed by DNA sequence analysis that the nucleotide sequence of the plasmid extracted by culturing the obtained transformant had the intended sequence. Subsequently, E. coli was transformed with pET22b-M7GLOD ⁇ 49C-T8. E. coli BL21 (DE3) strain was transformed to prepare a production strain of M7GLOD ⁇ 49C-T8.
  • M7GLOD ⁇ 49C-T8 As a template, using primers of SEQ ID NO: 67 (atcgaggtcttttatactggagctggacaa) and SEQ ID NO: 68 (aaagacctcgatgcggcggccatggaccga), according to the method described in "6. Production of modified StGLOD ⁇ 49C", M7GLOD ⁇ 49 without Y536L amino acid substitution A plasmid (pET22b-M7GLOD ⁇ 49C-T7) carrying the gene encoding C-T8 was obtained. M7GLOD ⁇ 49C-T8, which does not contain the Y536L amino acid substitution, is referred to as M7GLOD ⁇ 49C-T7 (SEQ ID NO:69).
  • pET22b-M7GLOD ⁇ 49C-T7 or various modified M7GLOD ⁇ 49C-T7 expression plasmids were used to transform E. E. coli BL21 (DE3) strain was transformed to prepare production strains of M7GLOD ⁇ 49C-T7 and various modified M7GLOD ⁇ 49C-T7.
  • M7GLOD ⁇ 49C-T7 and modified M7GLOD ⁇ 49C-T7 producing strains were inoculated into 2.5 ml of LB-amp medium (ampicillin concentration: 50 ⁇ g/ml) in a test tube and seed cultured overnight at 37° C. and 180 rpm.
  • 2.5 ml of the seed culture was inoculated into 250 ml of LB-amp medium (ampicillin concentration: 100 ⁇ g/ml) charged in a Sakaguchi flask and cultured at 37° C. and 130 rpm. Incubated at pm for 16 hours.
  • the pellet obtained by centrifuging the culture solution at 8,000 rpm for 10 minutes was resuspended in 4-25 ml of 10 mM potassium phosphate buffer (PPB) pH 6.0. After sonicating the cell suspension, it was centrifuged at 15,000 rpm for 15 minutes, and the resulting supernatant was collected to obtain a crude enzyme solution of M7GLOD ⁇ 49C-T7 and modified M7GLOD ⁇ 49C-T7.
  • PPB potassium phosphate buffer
  • M7GLOD ⁇ 49C-T7 and modified M7GLOD ⁇ 49C-T7 were heated at 70°C for 30 minutes, and their residual activity was calculated according to the method described above (Table 13). M7GLOD ⁇ 49C-T7 was heated at 60°C or 65°C for 30 minutes, and its residual activity was calculated.
  • M7GLOD ⁇ 49C-T7 had a residual activity of 0.93 after heating at 60° C. for 30 minutes and a residual activity of 0.69 after heating at 65° C. for 30 minutes, demonstrating high thermal stability. It was demonstrated that the combination of amino acid substitutions shown in Table 9 improves the thermal stability of GLOD, not limited to StGLOD.
  • the residual activity of various modified M7GLOD ⁇ 49C-T7 was increased by 0.05 to 0.58 compared to M7GLOD ⁇ 49C-T7, and all modified M7GLOD ⁇ 49C-T7 had improved thermal stability.
  • the residual activity of the modified enzyme produced was improved by about 29% to about 341% compared to M7GLOD ⁇ 49C-T7 before modification.
  • a pET-22b(+) plasmid fragment amplified using SEQ ID NO: 65 and SEQ ID NO: 66 was combined with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 86 by in-fusion reaction to obtain pET22b-M7GLOD.
  • the resulting plasmid is an E. E. coli strain JM109 was transformed. It was confirmed by DNA sequence analysis that the nucleotide sequence of the plasmid extracted by culturing the obtained transformant had the intended sequence.
  • a plasmid for expression of M7GLOD-T8 (SEQ ID NO: 87) was prepared by introducing 8 kinds of amino acid substitutions (F87Y, Y103I, F133Y, F297M, F393L, F428Y, Y566F, Y585L) into M7GLOD. .
  • the Y566F and Y585L amino acid substitutions are introduced as Y517F and Y536L in M7GLOD ⁇ 49C-T8 (SEQ ID NO: 60).
  • a fragment was amplified by PCR using pET22b-M7GLOD as a template and primers of SEQ ID NO: 88 (ccgtcgttggtgggaattc) and SEQ ID NO: 89 (gcgctcagcatcgtcaaag).
  • SEQ ID NO:90 cttttgacgatgctgagcgc
  • SEQ ID NO:91 gaattccccacaacgacgg.
  • Both fragments were treated with DpnI, purified, and ligated by in-fusion reaction to obtain pET22b-M7GLOD-T8.
  • the resulting plasmid is an E. E. coli JM109 strain was transformed. It was confirmed by DNA sequence analysis that the nucleotide sequence of the plasmid extracted by culturing the obtained transformant had the intended sequence.
  • deletion types M7GLOD-T8 were prepared by deleting all or part of the region encoding positions 460 to 508 of SEQ ID NO: 87 by performing PCR in the same manner as in "6. Production of modified StGLOD ⁇ 49C" using pET22b-M7GLOD-T8 as a template. PCR was carried out for 35 cycles of "98°C for 10 seconds, 68°C for 40 seconds". The primers used are listed in Table 14.
  • E . E. coli BL21 (DE3) strain was transformed to produce strains producing M7GLOD-T8 and various deletion types of M7GLOD-T8, which were recombinantly produced according to "8. Recombinant production of M7GLOD ⁇ 49C-T7".
  • M7GLOD-T8 and various deletion forms of M7GLOD-T8 were heated at 65° C. for 30 minutes, and their residual activities were calculated according to the method described above (Table 15).
  • the residual activity of various deletion types of M7GLOD-T8 was increased by 0.05 to 0.54 compared to M7GLOD-T8, and all deletion types of M7GLOD-T8 had improved thermal stability. In other words, the residual activity of the modified enzyme produced was improved by about 38% to about 415% compared to M7GLOD ⁇ 49C-T7 before modification.
  • StGLOD StGLOD (SEQ ID NO: 1) expression plasmid (pET22b-StGLOD) was constructed in the same manner as in “7.
  • a fragment containing the StGLOD gene was amplified by PCR using pKK223-3-StGLOD as a template and primers of SEQ ID NO: 99 (gaaggagatatacatatgaatgaaatgacctacgagcaattg) and SEQ ID NO: 100 (tcctttcgggctttgttaagaagttaacgctcctc).
  • Both fragments were treated with DpnI, purified, and ligated by in-fusion reaction to obtain pET22b-StGLOD.
  • the resulting plasmid is an E. E. coli JM109 strain was transformed. It was confirmed by DNA sequence analysis that the nucleotide sequence of the plasmid extracted by culturing the obtained transformant had the intended sequence.
  • StGLOD Mutants Using the StGLOD expression plasmid (pET22b-StGLOD) as a template, site-directed mutagenesis was performed to construct various modified StGLOD expression plasmids in the same manner as in “6. Preparation of modified StGLOD ⁇ 49C”. Table 16 shows the names of the produced mutants and the combinations of Fw primers and Rv primers.
  • pET22b-StGLOD or various modified StGLOD expression plasmids were used to transform E. E. coli BL21 (DE3) strain was transformed to produce StGLOD and various modified StGLOD production strains, which were recombinantly produced according to "8. Recombinant production of M7GLOD ⁇ 49C-T7". StGLOD and various modified StGLODs were heated at 50° C. for 30 minutes, and their residual activities were calculated according to the method described above (Table 17).
  • the residual activity of various modified StGLODs was increased by 0.01 to 0.76 compared to StGLOD, and all modified StGLODs had improved thermal stability. In other words, the residual activity of the prepared modified enzyme was improved by about 6% to about 422% compared to StGLOD before modification. It was demonstrated that the thermostability-enhancing amino acid substitutions found in StGLOD ⁇ 49C or M7GLOD ⁇ 49C-T7 are not limited to their parent enzymes and also contribute to the improvement of the thermostability of StGLOD. Therefore, it is considered that introduction of these amino acid substitutions into GLOD derived from other sources or GLOD having high sequence identity with them will similarly improve thermostability.
  • the glutamate oxidase mutants of the present disclosure can be produced on a large scale without the need for treatment with proteases.
  • the glutamate oxidase mutants of the present disclosure may also be used in glutamate oxidation reactions.
  • SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence of Streptomyces sp. X-119-6-derived glutamate oxidase (StGLOD) MNEMTYEQLARELLLVGPAPTNEDLKLRYLDVLIDNGLNPPGPPKRILIVGAGIAGLVAG DLLTRAGHDVTILEANANRVGGRIKTFHAKKGEPSPFADPAQYAEAGAMRLPSFHPLTLA LIDKLGLKRRLFFNVDIDPQTGNQDAPVPPVFYKSFKDGKTWTNGAPSPEFKEPDKRNHT WIRTNREQVRRAQYATDPSSINEGFHLTGCETRLTVSDMVNQALEPVRDYYSVKQDDGTR VNKPFKEWLAGWADVVRDFDGYSMGRFLREYAEFSDEAVEAIGTIENMTSRLHLAFFHSF LGRSDIDPRATYWEIEGGSRMLPETLAKDLRDQIVMGQRMVRLEYYDPGRDGHHGELTGP GGPAVAIQ
  • SEQ ID NO: 2 Base sequence of Streptomyces sp. X-119-6-derived glutamate oxidase (StGLOD) atgaatgaaatgacctacgagcaattggcccgcgaattgttattggttggtccggcccgacgaaggatctttaaattacgctatttggatgtgctgattgataacgggctgaacccgccgggtccgctaagcgtatcttgatcgtcggggctggtattgcaggccttgttgtgccggagatttgtgacccgcgctgggcatgatgttactattcttga agctaatgccaaccgtgtgggagggcgtatcaagacgttccatgcaaaaaaaaaaaggagagccat
  • SEQ ID NO: 12 Amino acid sequence of StGLOD ⁇ 49Ai MNEMTYEQLARELLLVGPAPTNEDLKLRYLDVLIDNGLNPPGPPKRILIVGAGIAGLVAGDLLTRAGHDVTILEANANRVGGRIKTFHAKKGEPSPFADPAQYAEAGAMRLPSFHPLTLALIDKLGLKRRLFFNVDIDPQTGNQDAPVPPVFYKSFKDGKTWTNGAPSPEFKEPDKRNHTWIRTNREQVRRAQYATDPSSINEGFHLTGCETRLTVSDMVNQALE PVRDYYSVKQDDGTRVNKPFKEWLAGWADVVRDFDGYSMGRFLREYAEFSDEAVEAIGTIENMTSRLHLAFFHSFLGRSDIDPRATYWEIEGGSRMLPETLAKDLRDQIVMGQRMVRLEYYDPGRDGHHGELTGPGGPAVAIQTVPEGEPYAATQTWTGDLAIVTIPFSSLRFVKVTPPFSYKKRRAVIETHYDQATK
  • SEQ ID NO: 13 Amino acid sequence of StGLOD ⁇ 49C MNEMTYEQLARELLLVGPAPTNEDLKLRYLDVLIDNGLNPPGPPKRILIVGAGIAGLVAGDLLTRAGHDVTILEANANRVGGRIKTFHAKKGEPSPFADPAQYAEAGAMRLPSFHPLTLALIDKLGLKRRLFFNVDIDPQTGNQDAPVPPVFYKSFKDGKTWTNGAPSPEFKEPDKRNHTWIRTNREQVRRAQYATDPSSINEGFHLTGCETRLTVSDMVNQALE PVRDYYSVKQDDGTRVNKPFKEWLAGWADVVRDFDGYSMGRFLREYAEFSDEAVEAIGTIENMTSRLHLAFFHSFLGRSDIDPRATYWEIEGGSRMLPETLAKDLRDQIVMGQRMVRLEYYDPGRDGHHGELTGPGGPAVAIQTVPEGEPYAATQTWTGDLAIVTIPFSSLRFVKVTPPFSYKKRRAVIETHYDQATKV
  • SEQ ID NO: 58 Amino acid sequence of putative glutamate oxidase (M7GLOD) derived from Streptomyces sp. MOE7 MDDKTYQQLARELLLVGPEPANEDLKLRYLDVLIDNGLEPPVDRKRILIVGAGIAGLVAGHLLTRAGHDVTILEANANRVGGRIKTFHAKKGEPAPFTDPAQYAEAGAMRLPSFHPLTLALIDKLGLKRRLFFNVDIDPKTGNQGAALPPVVYKSFKDGKTWTYGKPSPEFREPDKRNHTWIRTNRTQVRRAQYVKDPSAINEGFHLTGCSRLTVSDMVNQ ALEPVRDYYSVLQSDGRRVNKPFKEWLDGWAGVIRDFDGFSMGRFLREYAGFSDEAVEAIGTIENMTSRLHLAFFHSFLGRSDIDPSATYWEIEGGSRQLPEALAKDLRDQIVMGQRMVRLEYYDPGRDGHHGGLAGPSGPAVAIETV
  • SEQ ID NO: 60 Amino acid sequence of M7GLOD ⁇ 49C (M7GLOD ⁇ 49C-T8) introduced with 8 types of thermostable mutations MDDKTYQQLARELLLVGPEPANEDLKLRYLDVLIDNGLEPPVDRKRILIVGAGIAGLVAGHLLTRAGHDVTILEANANRVGGRIKTYHAKKGEPAPFTDPAQIAEAGAMRLPSFHPLTLALIDKLGLKRRLFYNVDIDPKTGNQGAALPPVVYKSFKDGKTWTYGKPSPEFREPDKRNHTWIRTNRTQVRRAQYVKDPSAINEGFHLTGCSRLTVSDMVN QALEPVRDYYSVLQSDGRRVNKPFKEWLDGWAGVIRDFDGFSMGRFLREYAGFSDEAVEAIGTIENMTSRLHLAFMHSFLGRSDIDPSATYWEIEGGSRQLPEALAKDLRDQIVMGQRMVRLEYYDPGRDGHHGGLAGPSGPAVAIETVPENEPSAEPQ
  • SEQ ID NO: 69 Amino acid sequence of M7GLOD ⁇ 49C (M7GLOD ⁇ 49C-T7) introduced with seven thermostable mutations MDDKTYQQLARELLLVGPEPANEDLKLRYLDVLIDNGLEPPVDRKRILIVGAGIAGLVAGHLLTRAGHDVTILEANANRVGGRIKTYHAKKGEPAPFTDPAQIAEAGAMRLPSFHPLTLALIDKLGLKRRLFYNVDIDPKTGNQGAALPPVVYKSFKDGKTWTYGKPSPEFREPDKRNHTWIRTNRTQVRRAQYVKDPSAINEGFHLTGCSRLTVSDMVN QALEPVRDYYSVLQSDGRRVNKPFKEWLDGWAGVIRDFDGFSMGRFLREYAGFSDEAVEAIGTIENMTSRLHLAFMHSFLGRSDIDPSATYWEIEGGSRQLPEALAKDLRDQIVMGQRMVRLEYYDPGRDGHHGGLAGPSGPAVAIETVPENEPSAEPQT
  • SEQ ID NO: 87 Amino acid sequence of M7GLOD-T8 MDDKTYQQLARELLLVGPEPANEDLKLRYLDVLIDNGLEPPVDRKRILIVGAGIAGLVAGHLLTRAGHDVTILEANANRVGGRIKTYHAKKGEPAPFTDPAQIAEAGAMRLPSFHPLTLALIDKLGLKRRLFNVDIDPKTGNQGAALPPVVYKSFKDGKTWTYGKPSPEFREPDKRNHTWIRTNRTQVRRAQYVKDPSAINEGFHLTGCSRLTVSDMVNQ ALEPVRDYYSVLQSDGRRVNKPFKEWLDGWAGVIRDFDGFSMGRFLREYAGFSDEAVEAIGTIENMTSRLHLAFMHSFLGRSDIDPSATYWEIEGGSRQLPEALAKDLRDQIVMGQRMVRLEYYDPGRDGHHGGLAGPSGPAVAIETVPENEPSAEPQTWTADLAIVTVPLSSLRFVAVTPPFSYKKRRAVIETHY

Abstract

プロテアーゼ処理を必要としないグルタミン酸オキシダーゼを製造すること。　所定のアミノ酸配列を欠失したグルタミン酸オキシダーゼ変異体。

Description

組換え発現グルタミン酸オキシダーゼ
　本発明は、組換え発現グルタミン酸オキシダーゼに関する。
　Ｌ－グルタミン酸測定は、古くはＬ－グルタミン酸脱炭酸酵素及びＬ－グルタミン酸脱水素酵素を用いて行われていた。しかしながら、脱炭酸酵素の測定系にあって二酸化炭素の測定が手間であることや、脱水素酵素の測定系にあっては補酵素の吸光度変化を測定するため、いずれも煩雑であった。
　その後、放線菌の固体培養により、Ｌ－グルタミン酸のみに作用するＬ－グルタミン酸オキシダーゼが報告された（非特許文献１）。Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼは、α鎖、γ鎖、及びβ鎖を有する１本のポリペプチドとしてコードされており、２つのポリペプチドがホモ２量体を形成する。このホモ２量体がプロテアーゼによって切断され、成熟型となる。成熟型は、α２β２γ２から構成されるヘテロ六量体構造である。
　組換え発現されたホモ二量体は、Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼとしての活性が弱く、元の放線菌Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼと比較して基質親和性に劣り、熱にも不安定であった。この組換え発現されたホモ二量体酵素をプロテアーゼ処理すると、元の放線菌Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼと同じ構造となり、酵素化学的性質も同等となった（非特許文献２）。この前駆体を遺伝子組換え大腸菌を用いて大量生産し、プロテアーゼ処理する方法が工業的に用いられている。
　特許文献１はL－グルタミン酸オキシダーゼ変異体を記載している。特許文献１には作製されているL－グルタミン酸オキシダーゼ変異体の熱安定性に関する記載はない。
国際公開第２０２１／１９３５９８号パンフレット
Ｋｕｓａｋａｂｅ　Ｈ　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｇｒｉｃ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　４７，　１３２３－１３２８（１９８３） Ａｒｉｍａ　Ｊ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１３４，８０５－８１２（２００３）
　特定の実施形態において、本開示は、簡便にＬ－グルタミン酸オキシダーゼを製造する方法を提供することを目的とする。また、特定の実施形態において、本開示は、Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼを提供することを目的とする。また、特定の実施形態において、本開示は、配列番号５８と高い配列同一性を有するＬ－グルタミン酸オキシダーゼを提供することを目的とする。
　Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼを組換え発現する場合、特に産業用途で大規模にＬ－グルタミン酸オキシダーゼを組換え発現する場合、Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼを成熟型とするためには従来の工業的製造法ではプロテアーゼでの処理が必要であった。しかしながら、プロテアーゼ処理工程は煩雑であり、高コスト化を招いていた。
　本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、一例として、遺伝子操作された放線菌由来のグルタミン酸オキシダーゼを用いることにより、上記課題を少なくとも部分的に解決し得ることを見出し、これを一実施形態として包含する本発明を完成した。また、本発明者らは、特定の変異を有するグルタミン酸オキシダーゼを用いることにより、上記課題を少なくとも部分的に解決し得ることを見出し、これを一実施形態として包含する本発明を完成した。
　本開示は、以下の実施形態を提供する。
[１]　欠失領域を有するグルタミン酸オキシダーゼ変異体であって、
野生型グルタミン酸オキシダーゼのγ鎖領域とβ鎖領域との間に存在するγ－β間領域の全部又は一部を欠失しており、
野生型グルタミン酸オキシダーゼのγ鎖領域のカルボキシ末端側のアミノ酸を１～１０アミノ酸欠失しており若しくは欠失しておらず、
野生型グルタミン酸オキシダーゼのβ鎖領域のアミノ末端側のアミノ酸を１～４アミノ酸欠失しており若しくは欠失しておらず、
欠失領域が１つの連続する欠失領域であり、グルタミン酸オキシダーゼ活性を有する、グルタミン酸オキシダーゼ変異体。
[２]　３１～５４の連続するアミノ酸を欠失している、実施形態１に記載のグルタミン酸オキシダーゼ変異体。
[３]　欠失領域のC末端が配列番号１の５１０位に対応する位置、５０８位に対応する位置、又は５０７位に対応する位置である、実施形態１に記載のグルタミン酸オキシダーゼ変異体。
[４]　配列番号１の４５９位～５０７位に対応する領域のアミノ酸配列を欠失しており、配列番号１の４５９位～５０７位に対応する領域の全部又は一部を欠失していないグルタミン酸オキシダーゼと比較して、熱安定性が向上している、実施形態１に記載の変異体。
[５]　配列番号１の４５９位～５０７位に対応する領域のアミノ酸配列を欠失しており、配列番号１の４５９位～４６６位に対応する領域までのアミノ酸配列を欠失していないグルタミン酸オキシダーゼと比較して、熱安定性が向上している、実施形態４に記載の変異体。
[６]　熱安定性の向上が、４５℃で３０分若しくは３５分の熱処理、又は、６５℃で３０分の熱処理の熱処理後の残存活性により評価されるものであり、
　アミノ酸配列を欠失していないグルタミン酸オキシダーゼの４５℃で３０分若しくは３５分の熱処理、又は６５℃で３０分の熱処理後の残存活性を１００％としたときに、変異体の残存活性が１１０％以上である、実施形態４に記載の変異体、又は
アミノ酸配列を欠失していないグルタミン酸オキシダーゼの４５℃で３０分若しくは３５分の熱処理、又は６５℃で３０分の熱処理後の残存活性を１００％としたときに、変異体の残存活性が１１０％以上である、実施形態５に記載の変異体。
[７]　配列番号５８、配列番号５９、配列番号１２又は配列番号１３のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、アミノ酸配列を欠失しており、グルタミン酸オキシダーゼ活性を有する、実施形態１～６のいずれかに記載の変異体。
[８]　さらに、
配列番号１の８７位に対応する位置、
配列番号１の１０３位に対応する位置、
配列番号１の１３３位に対応する位置、
配列番号１の１８６位に対応する位置、
配列番号１の２９７位に対応する位置、
配列番号１の３７６位に対応する位置、
配列番号１の３９３位に対応する位置、
配列番号１の４２８位に対応する位置、
配列番号１の５１６位に対応する位置、
配列番号１の５６６位に対応する位置、
配列番号１の５６８位に対応する位置、
配列番号１の５８５位に対応する位置、及び
配列番号１の６１５位に対応する位置、
からなる群より選択される１以上の位置において、配列番号１及び又は配列番号５８のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換を有し、
　置換前のグルタミン酸オキシダーゼと比較して、アミノ酸置換後の変異体の熱安定性が向上している、実施形態１～７のいずれかに記載の変異体。
[９]　配列番号１の８７位に対応する位置へのアミノ酸置換が、チロシンである、
配列番号１の１０３位に対応する位置へのアミノ酸置換が、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
配列番号１の１３３位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン及びチロシンからなる群より選択される、
配列番号１の１８６位に対応する位置へのアミノ酸置換が、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、グルタミン、アスパラギン、アラニン、ロイシン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ヒスチジン及びトレオニンからなる群より選択される、
配列番号１の２９７位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
配列番号１の３７６位に対応する位置へのアミノ酸置換が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
配列番号１の３９３位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
配列番号１の４２８位に対応する位置へのアミノ酸置換が、チロシン及びメチオニンからなる群より選択される、
配列番号１の５１６位に対応する位置へのアミノ酸置換が、フェニルアラニンである、
配列番号１の５６６位に対応する位置へのアミノ酸置換が、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びメチオニンからなる群より選択される、
配列番号１の５６８位に対応する位置へのアミノ酸置換が、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
配列番号１の５８５位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、又は
配列番号１の６１５位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン、バリン、及びフェニルアラニンからなる群より選択される、
実施形態８に記載の変異体。
[１０]　配列番号６９のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、
かつ、アミノ酸配列を欠失しており、かつ、
配列番号１の８７位に対応する位置、
配列番号１の１０３位に対応する位置、
配列番号１の１３３位に対応する位置、
配列番号１の１８６位に対応する位置、
配列番号１の２９７位に対応する位置、
配列番号１の３７６位に対応する位置、
配列番号１の３９３位に対応する位置、
配列番号１の４２８位に対応する位置、
配列番号１の５１６位に対応する位置、
配列番号１の５６６位に対応する位置、
配列番号１の５６８位に対応する位置、
配列番号１の５８５位に対応する位置、及び
配列番号１の６１５位に対応する位置、
からなる群より選択される１以上の位置において、配列番号５８のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換を有し、該アミノ酸置換が実施形態９に記載のアミノ酸置換のいずれかであり、グルタミン酸オキシダーゼ活性を有する、実施形態９に記載の変異体。
[１１]　さらに、配列番号１の６７０位～６８７位に対応する領域のアミノ酸配列を欠失している、実施形態１～１０のいずれかに記載のグルタミン酸オキシダーゼ変異体。
[１２]　実施形態１～１０のいずれかに記載のグルタミン酸オキシダーゼ変異体を含む組成物、試薬、電極、センサ又はキット。
[１３]　実施形態１～１１のいずれかに記載のグルタミン酸オキシダーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
[１４]　実施形態１３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
[１５]　実施形態１４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
[１６]　実施形態１５に記載の宿主細胞を培養し実施形態１～１１のいずれかに記載のグルタミン酸オキシダーゼ変異体を産生する工程、及び、
　産生されたグルタミン酸オキシダーゼ変異体を取得する工程、
を含む、グルタミン酸オキシダーゼ変異体の製造方法。
[１７]　実施形態１～１１のいずれかに記載のグルタミン酸オキシダーゼ変異体、又は実施形態１２に記載の組成物、試薬、電極、センサ又はキットと、グルタミン酸を含む試料とを接触させ、該試料に含まれるグルタミン酸を酸化させる方法。
[１８]　グルタミン酸を検出する、実施形態１７に記載の方法。
[１９]　アミノ酸置換を含むグルタミン酸オキシダーゼ変異体であって、置換前のグルタミン酸オキシダーゼと比較して、アミノ酸置換後のグルタミン酸オキシダーゼ変異体の熱安定性が向上しており、
(i)　配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１の８７位、１０３位、１３３位、１８６位、２９７位、３７６位、３９３位、４２８位、５１６位、５６６位、５６８位、５８５位、及び６１５位からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている、
(ii)　前記(i)において、配列番号１の８７位、１０３位、１３３位、１８６位、２９７位、３７６位、３９３位、４２８位、５１６位、５６６位、５６８位、５８５位、及び６１５位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されているアミノ酸配列からなる、
(iii)　前記(i)若しくは(ii)において、当該グルタミン酸オキシダーゼ変異体の全長アミノ酸配列が配列番号１または配列番号５８のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、又は９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する、或いは、
(iv)　前記(i)、又は(ii)において、当該グルタミン酸オキシダーゼ変異体の全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号５８のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、又は９０％以上のアミノの配列同一性を有し、当該グルタミン酸オキシダーゼ変異体における、配列番号１の２９１位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の５１～５６位に対応する位置のアミノ酸配列がＧｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｇｌｙ（ここでＸａａは任意のアミノ酸を示す）である、
からなる群より選択される、グルタミン酸オキシダーゼ変異体。
[２０]　配列番号１の８７位に対応する位置へのアミノ酸置換が、チロシンである、
配列番号１の１０３位に対応する位置へのアミノ酸置換が、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
配列番号１の１３３位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン及びチロシンからなる群より選択される、
配列番号１の１８６位に対応する位置へのアミノ酸置換が、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、ロイシン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ヒスチジン及びトレオニンからなる群より選択される、
配列番号１の２９７位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
配列番号１の３７６位に対応する位置へのアミノ酸置換が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
配列番号１の３９３位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
配列番号１の４２８位に対応する位置へのアミノ酸置換が、チロシン及びメチオニンからなる群より選択される、
配列番号１の５１６位に対応する位置へのアミノ酸置換が、フェニルアラニンである、
配列番号１の５６６位に対応する位置へのアミノ酸置換が、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びメチオニンからなる群より選択される、
配列番号１の５６８位に対応する位置へのアミノ酸置換が、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
配列番号１の５８５位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、又は
配列番号１の６１５位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン、バリン、及びフェニルアラニンからなる群より選択される、
実施形態１９に記載のグルタミン酸オキシダーゼ変異体。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-005869号の開示内容を包含する。
　特定の実施形態において、本発明の効果として、プロテアーゼでの処理を必要としない組換え発現グルタミン酸オキシダーゼが得られる。特定の実施形態において、熱安定性が向上したグルタミン酸オキシダーゼが得られる。
　Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼは、α鎖、γ鎖、及びβ鎖を有する１本のポリペプチドとしてＧＬＯＤ遺伝子によりコードされており、２つのポリペプチドがホモ２量体を形成する。天然では、このホモ２量体がプロテアーゼによって切断され成熟型となる。成熟型は、α２β２γ２から構成されるヘテロ六量体構造である。
　本明細書において、ＧＬＯＤという場合、特に断らない限り、これはＬ－グルタミン酸オキシダーゼのことをいうものとする。Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼはＥＣ　１．４．３．１１に分類される酸化還元酵素であり、以下の化学反応を触媒する。
［化１］
Ｌ－グルタミン酸＋Ｏ２＋Ｈ２Ｏ→２－オキソグルタル酸＋ＮＨ３＋Ｈ２Ｏ２
　ＧＬＯＤはフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）を補酵素とする。ＦＡＤを補酵素とする酸化還元酵素は、ＦＡＤ結合モチーフ配列、例えばＧｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｇｌｙモチーフを有することが知られている（式中、Ｘａａは任意のアミノ酸）。例えば配列番号１を基準配列とすると、配列番号１の５１位から５６位のアミノ酸配列「Ｇｌｙ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｉｌｅ－Ａｌａ－Ｇｌｙ」はＧｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｘａａ－ＧｌｙなるＦＡＤ結合モチーフ配列に該当する。ある実施形態において、本開示の変異体に関し、配列番号１を基準として、５１位、５３位、及び５６位にそれぞれ対応する位置のＧｌｙは、アミノ酸置換せずともよい。ある実施形態において、Ｌ－グルタミン酸オキシダーゼ配列番号１の５１位、５３位、及び５６位のＧｌｙは、アミノ酸置換しない。
　ＧＬＯＤはアルギニン残基により基質であるグルタミン酸を認識することが知られている。例えば配列番号１を基準として、２９１位のＡｒｇ（Ｒ）はグルタミン酸の認識に重要な位置である。ある実施形態において、本開示の変異体に関し、配列番号１の２９１位に対応する位置はアミノ酸置換せずともよい。ある実施形態において、本開示の変異体に関し、配列番号１の２９１位に対応する位置のアミノ酸がＡｒｇ（Ｒ）である場合、当該アミノ酸は置換しない。
（基準配列）
　本明細書では便宜上、配列番号１を基準配列として、ＧＬＯＤの各位置を規定する。配列番号１は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．　Ｘ－１１９－６由来グルタミン酸オキシダーゼ（ＳｔＧＬＯＤ）のアミノ酸配列であるが、ただし、天然配列におけるＮ末端側の分泌シグナル配列（ＭＴＴＤＴＡＲＲＨＴＧＡＥＲ）は除去してある。また、配列番号１では、野生型において分泌シグナル配列が切断された直後のα鎖領域の第１アミノ酸を野生型のＡｌａからＭｅｔに変更してある。このＭｅｔの位置を本明細書では、配列番号１の１位に対応する位置とする。
（ＧＬＯＤの各サブユニットについて）
　本明細書において便宜上、配列番号１を基準配列として、ＧＬＯＤのα鎖を１位から３７５位までの３７５アミノ酸残基から構成されるポリペプチドとする（ＡＮＥＭ・・・ＥＧＥＰ）。本明細書において便宜上、配列番号１を基準配列として、ＧＬＯＤのγ鎖を３７６位から４６６位のまでの９１アミノ酸から構成されるポリペプチドとする（ＹＡＡＴ・・・ＡＥＡＡ）。本明細書において便宜上、配列番号１を基準配列として、ＧＬＯＤのβ鎖を５０７位から６６９位までの１６３アミノ酸から構成されるポリペプチドとする。配列番号１を基準配列として、４６７位から５０６位までは、天然ではプロテアーゼで除去される領域である（ＬＡＬＰ・・・ＳＥＬＲ）。また、配列番号１を基準配列として、６７０位から６８７位のＣ末端配列（ＲＲＧＡＡＡＡＴＥＰＭＲＥＥＡＬＴＳ）はプロテアーゼにより除去される領域である。
（アミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体）
　本発明者らは、ＧＬＯＤのアミノ酸配列のうち、プロテアーゼで除去される領域がＧＬＯＤの機能発現を妨げているのではないかと考え、γ領域及びβ領域の間のアミノ酸配列を欠失させたＧＬＯＤ変異体配列を作製し、これを発現させた。プロテアーゼで除去される領域を欠失させる際、ある実施形態では、変異体から、γ領域の最後の８アミノ酸（ＧＥＤＤＡＥＡＡ）も除去した。また、β鎖の最初のアミノ酸残基Ｇも変異体では除去した。したがって、作製した変異体のγ鎖領域－β鎖領域の間の境界は、γ鎖のＣ末端ＱＱＷとβ鎖のＮ末端ＧＶＲＰとを連結した、γ鎖領域・・・ＱＱＷ－ＧＶＲＰ・・・β鎖領域という配列とした。その結果、ＧＬＯＤ活性を示す変異体が得られた。このアミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体は、活性の発現のために、プロテアーゼでの処理を必要としない。ある実施形態において、アミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体を組換え発現するときに、プロテアーゼでの処理を行わない。
　さらに本発明者らは開発を続け、前記境界配列（γ鎖領域・・・ＱＱＷ－ＧＶＲＰ・・・β鎖領域）を、種々のアミノ酸配列と置き換えた連結領域置換型変異体を作製した。具体的には、前記境界配列（γ鎖領域・・・ＱＱＷ－ＧＶＲＰ・・・β鎖領域）を改変した変異体として配列番号５９のアミノ酸配列を有する変異体Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ、配列番号１２のアミノ酸配列を有する変異体ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ａｉ、又は配列番号１３のアミノ酸配列を有する変異体ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃを作製し、組換え発現を行い、変異体の活性を確認した。その結果、驚くべきことにいずれの変異体もＧＬＯＤ活性を示した。これらのアミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体もまた、活性の発現のために、プロテアーゼでの処理を必要としない。
　配列番号５９のアミノ酸配列を有する変異体Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号５８のアミノ酸配列を有するＭ７ＧＬＯＤの４５６位～５１１位の５６アミノ酸を欠失させ、その位置にＭ７ＧＬＯＤの配列とは異なる７アミノ酸（ＱＤＡＡＥＰＰ）を挿入したと見なすこともできる。別の言い方をすれば、Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号５８の４５６位～５０４位を欠失し、５０５位～５１１位がＱＤＡＡＥＰＰに置換されている。または、Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号５８の４５７位～５０５位を欠失し、４５６位がＱに置換され、５０６位～５１１位がＤＡＡＥＰＰに置換されている。または、Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号５８の４５８位～５０６位を欠失し、４５６～４５７位がＱＤに置換され、５０７位～５１１位がＡＡＥＰＰに置換されている。または、Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号５８の４５９位～５０７位を欠失し、４５６～４５８位がＱＤＡに置換され、５０８位～５１１位がＡＥＰＰに置換されている。または、Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号５８の４６０位～５０８位を欠失し、４５６～４５９位がＱＤＡＡに置換され、５０９位～５１１位がＥＰＰに置換されている。または、Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号５８の４６１位～５０９位を欠失し、４５６～４６０位がＱＤＡＡＥに置換され、５１０位～５１１位がＰＰに置換されている。または、Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号５８の４６２位～５１０位を欠失し、４５６～４６１位がＱＤＡＡＥＰに置換され、５１１位がＰに置換されている。または、Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号５８の４６２位～５１０位を欠失し、４５６～４６２位がＱＤＡＡＥＰＰに置換されている。
　配列番号１２のアミノ酸配列を有する変異体ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ａｉは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＳｔＧＬＯＤの４５６位～５１１位の５６アミノ酸を欠失させ、その位置にＳｔＧＬＯＤの配列とは異なる７アミノ酸（ＲＫＬＤＫＴＥ）を挿入したと見なすこともできる。別の言い方をすれば、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ａｉは、配列番号１の４５６位～５０４位を欠失し、５０５位～５１１位がＲＫＬＤＫＴＥに置換されている。または、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ａｉは、配列番号１の４５７位～５０５位を欠失し、４５６位がＲに置換され、５０６位～５１１位がＫＬＤＫＴＥに置換されている。または、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ａｉは、配列番号１の４５８位～５０６位を欠失し、４５６～４５７位がＲＫに置換され、５０７位～５１１位がＬＤＫＴＥに置換されている。または、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ａｉは、配列番号１の４５９位～５０７位を欠失し、４５６～４５８位がＲＫＬに置換され、５０８位～５１１位がＤＫＴＥに置換されている。または、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ａｉは、配列番号１の４６０位～５０８位を欠失し、４５６～４５９位がＲＫＬＤに置換され、５０９位～５１１位がＫＴＥに置換されている。または、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ａｉは、配列番号１の４６１位～５０９位を欠失し、４５６～４６０位がＲＫＬＤＫに置換され、５１０位～５１１位がＴＥに置換されている。または、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ａｉは、配列番号１の４６２位～５１０位を欠失し、４５６～４６１位がＲＫＬＤＫＴに置換され、５１１位がＥに置換されている。または、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ａｉは、配列番号１の４６２位～５１０位を欠失し、４５６～４６２位がＲＫＬＤＫＴＥに置換されている。
　配列番号１３のアミノ酸配列を有する変異体ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号１のアミノ酸配列を有するＳｔＧＬＯＤの４５６位～５１１位の５６アミノ酸を欠失させ、その位置にＳｔＧＬＯＤの配列とは異なる７アミノ酸（ＱＤＡＡＥＰＰ）を挿入したと見なすこともできる。別の言い方をすれば、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号１の４５６位～５０４位を欠失し、５０５位～５１１位がＱＤＡＡＥＰＰに置換されている。または、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号１の４５７位～５０５位を欠失し、４５６位がＱに置換され、５０６位～５１１位がＤＡＡＥＰＰに置換されている。または、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号１の４５８位～５０６位を欠失し、４５６～４５７位がＱＤに置換され、５０７位～５１１位がＡＡＥＰＰに置換されている。または、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号１の４５９位～５０７位を欠失し、４５６～４５８位がＱＤＡに置換され、５０８位～５１１位がＡＥＰＰに置換されている。または、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号１の４６０位～５０８位を欠失し、４５６～４５９位がＱＤＡＡに置換され、５０９位～５１１位がＥＰＰに置換されている。または、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号１の４６１位～５０９位を欠失し、４５６～４６０位がＱＤＡＡＥに置換され、５１０位～５１１位がＰＰに置換されている。または、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号１の４６２位～５１０位を欠失し、４５６～４６１位がＱＤＡＡＥＰに置換され、５１１位がＰに置換されている。または、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃは、配列番号１の４６２位～５１０位を欠失し、４５６～４６２位がＱＤＡＡＥＰＰに置換されている。
　さらに本発明者らは開発を続け、欠失させる領域の長さを変えながら複数の変異体を作製した。ある実施形態において、本開示は、
　欠失領域を有するグルタミン酸オキシダーゼ変異体であって、
野生型グルタミン酸オキシダーゼのγ鎖領域とβ鎖領域との間に存在するγ－β間領域の全部又は一部を欠失しており、
野生型グルタミン酸オキシダーゼのγ鎖領域のカルボキシ末端側のアミノ酸を１～１０アミノ酸欠失しており若しくは欠失しておらず、
野生型グルタミン酸オキシダーゼのβ鎖領域のアミノ末端側のアミノ酸を１～４アミノ酸欠失しており若しくは欠失しておらず、
欠失領域が１つの連続する欠失領域であり、グルタミン酸オキシダーゼ活性を有する、グルタミン酸オキシダーゼ変異体を提供する。
　さらに本発明者らは開発を続け、欠失させる領域の長さが異なる変異体を多数作製した。ある実施形態において、欠失変異体は、
配列番号１の４５７位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ54）、
配列番号１の４５８位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ53）、
配列番号１の４５９位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ52）、
配列番号１の４６０位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ51）、
配列番号１の４６１位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ50）、
配列番号１の４６２位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ49）、
配列番号１の４６３位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ48）、
配列番号１の４６４位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ47）、
配列番号１の４６５位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ46）、
配列番号１の４６６位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ45）、
配列番号１の４６７位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ44）、
配列番号１の４６８位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ43）、
配列番号１の４６９位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ42）、
配列番号１の４７０位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ41）、
配列番号１の４７１位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ40）、
配列番号１の４７２位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ39）、
配列番号１の４７３位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ38）、
配列番号１の４７４位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ37）、
配列番号１の４７５位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ36）、
配列番号１の４７６位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ35）、
配列番号１の４７７位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ34）、
配列番号１の４７８位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ33）、
配列番号１の４７９位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ32）、又は
配列番号１の４８０位～５１０位に対応する位置を欠失している（dΔ31）。
　別の実施形態において、欠失変異体は、
配列番号１の４５５位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ54）、
配列番号１の４５６位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ53）、
配列番号１の４５７位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ52）、
配列番号１の４５８位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ51）、
配列番号１の４５９位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ50）、
配列番号１の４６０位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ49）、
配列番号１の４６１位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ48）、
配列番号１の４６２位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ47）、
配列番号１の４６３位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ46）、
配列番号１の４６４位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ45）、
配列番号１の４６５位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ44）、
配列番号１の４６６位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ43）、
配列番号１の４６７位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ42）、
配列番号１の４６８位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ41）、
配列番号１の４６９位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ40）、
配列番号１の４７０位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ39）、
配列番号１の４７１位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ38）、
配列番号１の４７２位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ37）、
配列番号１の４７３位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ36）、
配列番号１の４７４位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ35）、
配列番号１の４７５位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ34）、
配列番号１の４７６位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ33）、
配列番号１の４７７位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ32）、又は
配列番号１の４７８位～５０８位に対応する位置を欠失している（DΔ31）。
　ある実施形態において、本開示は、配列番号５８を基準として、
RWGEDDAEAALTVPESVRNLPTGLLGAHPSVDEQLIDDEQVEYLRNSTLRGGVR
を欠失させた変異体を提供する。この欠失変異体を本明細書において便宜上、M7GLOD－dΔ54ということがある。ある実施形態において本開示は、配列番号５８を基準として、鎖長の異なる以下の欠失領域を欠失させた変異体を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　別の実施形態において本開示は、配列番号５８を基準として、鎖長の異なる以下の欠失領域を欠失させた変異体を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ある実施形態において本開示は、配列番号１を基準として、鎖長の異なる以下の欠失領域を欠失させた変異体を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　別の実施形態において本開示は、配列番号１を基準として、鎖長の異なる以下の欠失領域を欠失させた変異体を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記の変異体は、本明細書にいう３１～５４の連続するアミノ酸を欠失しているグルタミン酸オキシダーゼ変異体に包含されるものとする。
　ある実施形態において、欠失領域のC末端は、配列番号１の５１２位、５１１位、５１０位、５０９位、５０８位、５０７位、５０６位、又は５０５位に対応する位置とすることができる。ある実施形態において、欠失領域のC末端は、配列番号１の５１０位、５０８位、又は５０７位に対応する位置とすることができる。便宜上、本明細書において、欠失領域のC末端の位置を起点ということがある。ある実施形態において、欠失変異体は、起点から３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３又は５４の連続するアミノ酸が欠失していてもよい。起点は欠失されるため、グルタミン酸オキシダーゼ欠失変異体は起点を有しない。また、グルタミン酸オキシダーゼ欠失変異体は、起点から３１～５４の連続するアミノ酸を有しない（すなわち、起点アミノ酸を含めた３１～５４アミノ酸を有しない）。
　特定の理論に拘束されることを望むものではないが、天然ではグルタミン酸オキシダーゼのγ－β間領域はプロテアーゼにより除去される（excised）。したがって、当該除去領域(excised region)を組換え発現グルタミン酸オキシダーゼから予め欠失させても、活性を有するグルタミン酸オキシダーゼが同様に得られるであろうと考えられる。このとき、除去領域は成熟タンパク質には存在しないことから、除去領域が活性なタンパク質において役割を果たしている可能性は低いと考えられる。したがって、除去領域のアミノ酸配列について、長い配列を欠失させた欠失変異体と短い配列を欠失させた欠失変異体の両方について活性が確認された場合（例えばΔ５４変異体とΔ３１変異体について活性が確認された場合）、中間的な長さの領域を欠失させた変異体（例えばΔ５３～Δ３２変異体）についても、同様に活性を示す蓋然性が高い、と合理的に考えられる。
　変異体を作製したところ、ＧＬＯＤ活性が確認された。当業者であれば本明細書の開示に基づき類似の欠失変異体を作製し、その活性の有無をルーチンな試験により確認し得る。活性を有しない欠失変異体は、グルタミン酸オキシダーゼ活性を有するグルタミン酸オキシダーゼ変異体から除かれる。
　ある実施形態において、本開示は、配列番号１の４５９位～５０７位に対応する領域を欠失しており、グルタミン酸オキシダーゼ活性を有する、アミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体を提供する。特定の実施形態において、変異体はさらに、６７０位～６８７位に対応する領域を欠失し得る。
　ある実施形態において、本開示は、配列番号１の４５９位～５０７位に対応する領域を欠失しており、グルタミン酸オキシダーゼ活性を有し、配列番号１の４５９位～５０７位に対応する領域の全部又は一部を欠失していないグルタミン酸オキシダーゼと比較して、熱安定性が向上している、アミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体を提供する。特定の実施形態において、変異体はさらに、６７０位～６８７位に対応する領域を欠失し得る。
　ある実施形態において、本開示は、配列番号１の４５９位～５０７位に対応する領域を欠失しており、グルタミン酸オキシダーゼ活性を有し、配列番号１の４５９位～４６６位に対応する領域を欠失していないグルタミン酸オキシダーゼと比較して、熱安定性が向上している、アミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体を提供する。特定の実施形態において、変異体はさらに、６７０位～６８７位に対応する領域を欠失し得る。
　ある実施形態において、欠失変異体は、配列番号５８に基づき作製し得る。ある実施形態において、欠失変異体は、配列番号５８と９０％以上、例えば９１％以上、９２%以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するグルタミン酸オキシダーゼに基づき作製し得る。
　別の実施形態において、欠失変異体は、配列番号１に基づき作製し得る。ある実施形態において、欠失変異体は、配列番号１と９０％以上、例えば９１％以上、９２%以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するグルタミン酸オキシダーゼに基づき作製し得る。
　別の実施形態において、欠失変異体は、公知のグルタミン酸オキシダーゼまたはこれと９０％以上、例えば９１％以上、９２%以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上の配列同一性を有するグルタミン酸オキシダーゼに基づき作製し得る。
（熱安定性向上効果）
　さらに、これらのアミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体について、熱処理を行ったところ、驚くべきことに、いずれの変異体も、アミノ酸配列を欠失させる前のそれぞれ対応するＧＬＯＤ配列と比較して、残存活性が向上していた。残存活性とは、冷蔵（例えば４℃）保存されているＧＬＯＤ試料の活性を１とした時の、熱処理後のＧＬＯＤ試料の活性の値を示す。残存活性は０以上１以下の値となり得るが、熱処理によりＧＬＯＤが活性化された場合には、１を超える値になり得る。
　本明細書において、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃ、Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ、及びＳｔＧＬＯＤΔ４９Ａｉのようなγ鎖とβ鎖の間のアミノ酸配列を欠失させた変異体、並びに表１－４に記載の変異体のことを、γ鎖－β鎖間アミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体、或いは単にアミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体ということがある。また、アミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体を「ＧＬＯＤΔ」と表記することがある。また、欠失させたアミノ酸残基の数ＸＸをＧＬＯＤΔの後ろに記載することがある（ＧＬＯＤΔＸＸ）。例えば４９アミノ酸残基を欠失させたＧＬＯＤ変異体をＧＬＯＤΔ４９と表記することがある。また、配列番号１の５１０位に対応する位置を起点とする欠失変異体を「ＧＬＯＤ－ｄΔ」と表記することがある。例えば、配列番号５８に基づいており、配列番号１の５１０位に対応する位置を起点とし、５４アミノ酸が欠失している変異体をＭ７ＧＬＯＤ－ｄΔ５４と表記することがある。また、配列番号１の５０８位に対応する位置を起点とする欠失変異体を「ＧＬＯＤ－ＤΔ」と表記することがある。例えば、配列番号５８に基づいており、配列番号１の５０８位に対応する位置を起点とし、５４アミノ酸が欠失している変異体をＭ７ＧＬＯＤ－ＤΔ５４と表記することがある。本明細書においてアミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体という場合、これには、ＳｔＧＬＯＤ及びＭ７ＧＬＯＤのみならず、それらの改変体や、それらと９０％以上のアミノ酸配列同一性を有するＧＬＯＤや、他の由来のＧＬＯＤであって、配列番号１や配列番号１２、１３の欠失領域に対応する領域が欠失しているＧＬＯＤ変異体も包含されるものとする。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体は、改変前のＧＬＯＤの熱処理後の残存活性を１００％とした場合、改変後のＧＬＯＤ変異体の熱処理後の残存活性が、例えば１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上、１５０％以上、２００％以上、２５０％以上、３００％以上、３５０％以上、例えば４００％以上、向上し得る。ここで残存活性が１０％向上する、とは、改変前のＧＬＯＤの熱処理後の残存活性を１００％としたときに、改変後のＧＬＯＤ変異体の熱処理後の残存活性が１１０％であることを言う。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体の熱安定性は４５℃で３０分若しくは３５分の熱処理、又は、６５℃で３０分の熱処理の熱処理後の残存活性により評価し得る。ある実施形態において、配列番号１の所定の領域に対応する領域を欠失しているＧＬＯＤΔは、当該所定の領域を欠失していないＧＬＯＤの４５℃で３０分又は３５分の熱処理後の残存活性を１００％としたときに、変異体の残存活性が１０５％以上、１１０％以上、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、２００％以上、３００％以上、例えば４００％以上であり得る。欠失される所定の領域は、Ｃ末端側として、配列番号１の５１０位、５０８位、又は５０７位に対応する位置を起点とすることができ、（起点を含めて）３１～５４連続アミノ酸を有し得る。ある実施形態において、配列番号１の４５９位～５０７位に対応する領域を欠失しているＧＬＯＤΔは、配列番号１の４５９位～５０７位の全部又は一部を欠失していないＧＬＯＤの４５℃で３０分又は３５分の熱処理後の残存活性を１００％としたときに、変異体の残存活性が１０５％以上、１１０％以上、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、２００％以上、３００％以上、例えば４００％以上であり得る。別の実施形態において、配列番号１の４５９位～５０７位に対応する領域を欠失しているＧＬＯＤΔは、配列番号１の４５９位～４６６位のアミノ酸配列を欠失していないＧＬＯＤの４５℃で３０分又は３５分の熱処理後の残存活性を１００％としたときに、変異体の残存活性が１０５％以上、１１０％以上、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、２００％以上、３００％以上、例えば４００％以上であり得る。特定の実施形態において、変異体はさらに、６７０位～６８７位に対応する領域を欠失し得る。別の実施形態において、配列番号１の４５７位～５１０位に対応する領域の全部又は一部（例えば配列番号１の５１０位、５０８位、若しくは５０７位に対応する位置をＣ末端側の起点として３１～５４の連続するアミノ酸からなる領域）を欠失しているＧＬＯＤΔは、当該欠失を有しないＧＬＯＤの６５℃で３０分の熱処理後の残存活性を１００％としたときに、変異体の残存活性が１０５％以上、１１０％以上、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、２００％以上、３００％以上、例えば４００％以上であり得る。特定の実施形態において、変異体はさらに、６７０位～６８７位に対応する領域を欠失し得る。
　本発明者らは、配列番号１の４５９位～５０７位に対応する領域、又は、配列番号１の５１０位、５０８位、若しくは５０７位に対応する位置をＣ末端側の起点として３１～５４の連続するアミノ酸からなる所定の領域を欠失したＧＬＯＤΔ変異体が、改変前のＧＬＯＤと比較して、熱安定性が向上していることを見出した。当業者であれば、これらの知見に基づき、９０％以上の配列同一性を有する他のＧＬＯＤや、他の由来のＧＬＯＤについても、対応する領域アミノ酸配列を欠失したΔ変異体は同様に熱安定性が向上し、各種の反応に用いることができると理解する。配列番号１の６７０位～６８７位に対応する領域についても同様である。
　ある実施形態において、本開示は、配列番号５９、１２、又は１３のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、所定の領域を欠失しており、グルタミン酸オキシダーゼ活性を有する、ＧＬＯＤΔを提供する。所定の領域は、配列番号１の５１０位、５０８位、若しくは５０７位に対応する位置をＣ末端側の起点として３１～５４の連続するアミノ酸からなる領域であり得る。このＧＬＯＤΔは、さらに配列番号１の６７０位～６８７位に対応する領域を欠如し得る。
　ＧＬＯＤは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、放線菌、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。本明細書においてＧＬＯＤの由来は特に限定されず、例えばストレプトマイセス属、例えばStreptomyces sp. X-119-6、及びStreptomyces sp. MOE7、アゾトバクター属、Embleya属、Kitasatospora属、Saccharothrix属、Alloactinosynnema属、Streptoalloteichus属、Actinoalloteichus属、Catenulispora属、Nannocystis属、Actinobacteria属、Actinophytocola属、Sphaerisporangium属、Microbispora属、Streptosporangium属、Phytohabitans属、Haliangium属、Archangium属、Streptacidiphilus属、Saccharothrix属又はTrichoderma属の微生物由来であるＧＬＯＤを意味し、特に断らない限り、野生型及びその改変体のいずれをも含む。
（ＧＬＯＤをコードする遺伝子の取得）
　ＧＬＯＤをコードする遺伝子（以下、単に「ＧＬＯＤ遺伝子」ともいう）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、ＧＬＯＤ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
　次いで、上記ＧＬＯＤのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからＧＬＯＤ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（Polymerase Chain Reaction、ＰＣＲ法）により、ＧＬＯＤをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のＧＬＯＤ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
　ＧＬＯＤ遺伝子の一例として、Streptomyces sp. X-119-6由来のＧＬＯＤ遺伝子、及びStreptomyces sp. MOE7由来のＧＬＯＤ遺伝子が挙げられるがこれに限らない。
　ＧＬＯＤ遺伝子は、ベクターに連結されていてもよい。ベクターとしては、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド等の任意のベクターが挙げられ、例えば、pBluescriptII SK+（Stratagene社製）が挙げられる。プラスミドは、常法に従い取得しうる。例えばGenElute Plasmid Miniprep Kit（Sigma-Aldrich社製）を用いることにより、ＧＬＯＤ遺伝子を含むプラスミドを、抽出、精製し得る。得られたＧＬＯＤ遺伝子を操作してＧＬＯＤ変異体遺伝子を作製したり精製酵素を得ることができる。
（ＧＬＯＤ遺伝子の変異処理）
　ＧＬＯＤ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、ＧＬＯＤ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；または蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
　上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５－ブロモウラシル等を挙げることができる。
　この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をＧＬＯＤ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５～１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０～８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０～１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる。
　蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Site-Specific Mutagenesisとして知られる手法を用いることができる。例えば、Kramer法（Nucleic Acids Res., 12, 9441-9456 (1984))、Eckstein法(Nucleic Acids Res., 13, 8749 -8764 (1985)：Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985)： Nucleic Acids Res, 14, 9679 (1986))、Kunkel法(Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A., 82, 488-492 (1985))等が挙げられる。
　なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変ＧＬＯＤ遺伝子を合成することもできる。
　ＧＬＯＤ遺伝子の塩基配列は、例えばマルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3730xlＤＮＡアナライザ（Thermo Fisher Scientific社製）により確認し得る。
（形質転換・形質導入）
　ＧＬＯＤ遺伝子は、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込むことができる。これを用いて、各々のベクターに対応する宿主を、常法により形質転換又は形質導入しうる。
　ある実施形態において、ＧＬＯＤを原核細胞、例えばEscherichia属の微生物、例えば大腸菌(Escherichia coli)、Brevibacillus属の微生物、例えばBrevibacillus choshinensis、Corynebacterium属の微生物、例えばCorynebacterium glutamicum、Streptomyces属の微生物、例えばStreptomyces violaceoruberを用いて発現しうる。大腸菌の宿主としては、各種大腸菌株、例えばＫ－１２株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、BL21株、JM109(DE3)株、DH5α(DE3)株、BL21(DE3)株、TG1株、1100株、W3110株、C600株等が挙げられるがこれに限らない。宿主を形質転換し、又は、宿主に形質導入して、ＧＬＯＤ遺伝子が導入された宿主細胞（形質転換体）を得る。こうした宿主細胞に組み換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主細胞がエシェリヒア・コリーに属する微生物の場合には、カルシウムイオンの存在下で組み換えDNAの移入を行う方法などを採用することができる、更にエレクトロポレーション法を用いても良い。更には市販のコンピテントセル（例えばECOS Competent エシェリヒア・コリーBL21(DE3)；ニッポンジーン製）を用いても良い。なおＧＬＯＤ遺伝子は、発現宿主に応じてコドン最適化されたものであり得る。
　ある実施形態において、ＧＬＯＤを真核細胞を用いて発現しうる。真核宿主細胞の一例としては、酵母が挙げられる。酵母に分類される微生物としては、例えば、チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属、シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、ピキア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属などに属する酵母が挙げられる。挿入遺伝子には、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、URA3、TRP1のような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子等が挙げられる。また、挿入遺伝子は、宿主細胞中で目的遺伝子を発現することのできるプロモーター又はその他の制御配列（例えば、エンハンサー配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列等）を含むことが望ましい。プロモーターとしては、具体的には、例えば、GAL1プロモーター、ADH1プロモーター等が挙げられる。酵母への形質転換方法としては、公知の方法、例えば、酢酸リチウムを用いる方法(Methods Mol. Cell. Biol., 5, 255-269(1995))やエレクトロポレーション(J Microbiol Methods 55 (2003)481-484)等を好適に用いることができるが、これに限定されず、スフェロプラスト法やガラスビーズ法等を含む各種任意の手法を用いて形質転換を行えばよい。
　また、例えば、真核宿主細胞の他の例としては、アスペルギルス(Aspergillus)属やトリコデルマ(Trichoderma)属のようなカビ細胞（糸状菌を含む）が挙げられる。カビ細胞の形質転換体の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、ＧＬＯＤをコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法が挙げられる。具体的には、ＧＬＯＤをコードする遺伝子を発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いでＧＬＯＤをコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトで宿主糸状菌を形質転換することにより、ＧＬＯＤをコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。
　ＧＬＯＤをコードする遺伝子が発現する態様で宿主糸状菌に挿入する方法は特に限定されないが、例えば、相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主糸状菌内に導入する手法などが挙げられる。
　相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主糸状菌のゲノム中に挿入することができる。自身の高発現プロモーター制御下で宿主糸状菌内で過剰発現することにより、セルフクローニングによる形質転換体を得ることができる。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域などが挙げられる。
　ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、糸状菌の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主糸状菌を常法により形質転換することができる。
　そのような、好適なベクター－宿主系としては、宿主糸状菌中でＧＬＯＤを生産させ得る系であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989）及び糸状菌の系などが挙げられる。
　ＤＮＡコンストラクトは宿主糸状菌の染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ozeki et al. Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 1133 (1995)）にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で用いることもできる。
　ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢオリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主細胞中でＧＬＯＤをコードする遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されないが、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、ｔｅｆ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されないが、例えば、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
　ＤＮＡコンストラクトにおいて、ＧＬＯＤをコードする遺伝子の発現制御配列は、挿入するＧＬＯＤをコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
　ＤＮＡコンストラクトの一実施態様は、例えば、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、ＧＬＯＤをコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
　糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主糸状菌のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989、特開２００７－２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。形質転換糸状菌を再生させるための培地は、用いる宿主糸状菌と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主糸状菌としてアスペルギルス・ソーヤを用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換糸状菌の再生は、例えば、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社）で行うことができる。
　また、例えば、本発明の形質転換糸状菌を得るために、相同組換えを利用して、宿主糸状菌が本来染色体上に有するＧＬＯＤをコードする遺伝子のプロモーターをｔｅｆ１などの高発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、ｐｙｒＧなどの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、特開２０１１－２３９６８１に記載の実施例１や図１を参照して、ＧＬＯＤをコードする遺伝子の上流領域－形質転換マーカー遺伝子－高発現プロモーター－ＧＬＯＤをコードする遺伝子の全部又は部分からなる形質転換用カセットなどが利用できる。この場合、ＧＬＯＤをコードする遺伝子の上流領域及びＧＬＯＤをコードする遺伝子の全部又は部分が相同組換えのために利用される。ＧＬＯＤをコードする遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから途中の領域を含むものが使用できる。相同組換えに適した領域の長さは０．５ｋｂ以上あることが好ましい。
　本発明の形質転換糸状菌が作製されたことの確認は、ＧＬＯＤの酵素活性が認められる条件下で本発明の形質転換糸状菌を培養し、次いで培養後に得られた培養物におけるＧＬＯＤの活性を確認することにより行うことができる。
　また、本発明の形質転換糸状菌が作製されたことの確認は、形質転換糸状菌から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行ってもよい。
　例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
　宿主は公知微生物、公知株及び本明細書に記載の公知微生物や公知株の同等物や均等物であり得る。同等物とはタンパク質の組換え発現に関し、同等の機能を発揮する宿主をいう。均等物は、本願の出願時に公知であった宿主に基づき作製され改変された宿主であって、本願の出願後に開発されたものや、本願の出願時に公知であった宿主と性質の類似する宿主であって本願の出願後に発見されたものを含む。微生物の学名や分類に関し、本願の出願後に学名の変更や属名の変更、分類の変更等があった場合には本明細書の記載が優先するものとし、本願の出願時を基準とする。
（ハイスループットスクリーニング）
　ＧＬＯＤはさらに、機能性ＧＬＯＤ変異体を取得するためにハイスループットスクリーニングに供することができる。例えば変異導入したＧＬＯＤ遺伝子を有する形質転換又は形質導入株のライブラリーを作製し、これをマイクロタイタープレートに基づくハイスループットスクリーニングに供してもよく、又は液滴型マイクロ流体に基づく超ハイスループットスクリーニングに供してもよい。例としてはバリアントをコードする変異遺伝子のコンビナトリアルライブラリーを構築し、次いでファージディスプレイ（例えばChem. Rev. 105 (11): 4056-72, 2005）、イーストディスプレイ（例えばComb Chem High Throughput Screen. 2008;11(2): 127-34）、バクテリアルディスプレイ（例えばCurr Opin Struct Biol 17: 474-80, 2007）等を用いて、変異ＧＬＯＤの大きな集団をスクリーニングする方法が挙げられる。またAgresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107 (9): 4004-4009 (Mar, 2010)を参照のこと。ＧＬＯＤバリアントのスクリーニングに使用しうる超ハイスループットスクリーニング手法についての同文献の記載を参照により本明細書に組み入れる。例えばエラープローンPCR法によりライブラリーを構築することができる。また飽和突然変異誘発を用いて、本明細書に記載の領域や位置又はそれらに対応する領域や位置を標的として変異導入しライブラリーを構築してもよい。ライブラリーを用いて電気コンピテントEBY-100細胞等の適当な細胞を形質転換し、約10の7乗の変異体を取得しうる（一千万）。該ライブラリーで形質転換した酵母細胞を次いでセルソーティングに供しうる。標準ソフトリトグラフィー法を用いて作製したポリジメトキシルシロキサン(PDMS)マイクロ流体デバイスを用いてもよい。フローフォーカスデバイスを用いて単分散の液滴を形成することができる。個別の変異体を含有する形成された液滴を適当なソーティングデバイスに供しうる。細胞を選別する際にはＧＬＯＤ活性の有無を利用しうる。これには例えば上記のＧＬＯＤが作用すれば発色する組成とした反応液を用いてもよい。例えばDCIPを用いる場合は、96ウェルプレート、192ウェルプレート、384ウェルプレート、9600ウェルプレート等及びプレートリーダーを用いて600nmの吸光度を測定してもよい。変異導入と選別は複数回反復してもよい。ここでいう変異は、アミノ酸の置換、挿入、欠失、及び／又は付加を包含する。
　例えば、ＧＬＯＤに１～１０の変異を導入し、ＧＬＯＤ活性を確認し得る。次いで、活性を有することが確認されたＧＬＯＤ変異体から出発し、さらに１～１０の変異を導入し、活性を確認し得る。一連のハイスループットスクリーニング（例えば約10の7乗の変異体を取得しスクリーニングする上記の手法）を２ラウンド以上、５ラウンド以上、１０ラウンド以上、１５ラウンド以上、例えば２０ラウンド以上反復しうる。各ラウンドで１変異以上、５変異以上、例えば１０変異以上を導入するハイスループットスクリーニングを例えば１０ラウンド反復することにより、出発ＧＬＯＤから見て、１０変異以上、５０変異以上、例えば１００以上の変異が導入され、なおかつ活性を有する変異体を迅速に取得し得る。また２０ラウンド反復することにより、出発ＧＬＯＤから見て２０変異以上、１００変異以上、例えば２００以上の変異が導入され、なおかつ活性を有する変異体を迅速に取得し得る。かかる作業はルーチンなプロセスの繰り返しにより行い得る。
　変異は、ＧＬＯＤの全長アミノ酸配列のうち、第１番目のアミノ酸～最後のアミノ酸のいずれか１以上の位置に導入し得る。ただし、活性中心、基質認識部位、補酵素認識モチーフ及びこれらの近傍等の酵素の機能に重要な領域は除く。ＧＬＯＤは広く産業利用されており、当業者はその活性中心、基質認識部位、及び補酵素認識モチーフを含む酵素の機能に重要な領域を熟知している。特定の実施形態では、例えばＧＬＯＤの全長配列のうち、まず、第１～１０位の部分に１又は複数の変異を導入し得る。次いで、活性を有することが確認されたＧＬＯＤ変異体から出発し、さらに第１１～２０位に１又は複数の変異を導入し、活性を確認し得る。これをｎ回繰り返し得る（n≦68）。例えば６８回目に第６８０～６８７位に１又は複数の変異を導入し得る。途中、酵素の機能に重要な領域や改変を意図しない領域は適宜、飛ばしてもよい。これにより、酵素の機能に重要な領域を除き、全長配列中のいずれの位置にも任意の変異を導入することができ、また、例えば５以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、１１０以上、１２０以上、１３０以上、１４０以上、１５０以上、１６０以上、１７０以上、１８０以上、１９０以上、例えば２００以上の変異を有し、活性を有するＧＬＯＤ変異体を迅速に取得し得る。
　変異はランダムに導入してもよく、又は、合理的設計により導入してもよい。ある実施形態において、合理的設計により導入する変異、又はランダムに導入される変異は保存的アミノ酸置換であり得る。保存的アミノ酸置換は、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸とが類似する化学的特性を有するアミノ酸置換を含む(例えば、Stryerら、Biochemistry、第5版、2002、44～49頁)。例えば保存的アミノ酸置換は、(i)塩基性アミノ酸の、異なる種類の塩基性アミノ酸との置換；(ii)酸性アミノ酸の、異なる種類の酸性アミノ酸との置換；(iii)芳香族アミノ酸の、異なる種類の芳香族アミノ酸との置換；(iv)非極性脂肪族アミノ酸の、異なる種類の非極性脂肪族アミノ酸との置換；及び(v)極性非荷電アミノ酸の、異なる種類の極性非荷電アミノ酸との置換からなる群から選択され得る。塩基性アミノ酸は、例えばアルギニン、ヒスチジン、及びリシンから選択され得る。酸性アミノ酸は、例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸であり得る。芳香族アミノ酸は、例えばフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンから選択され得る。非極性脂肪族アミノ酸は、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンから選択され得る。極性非荷電アミノ酸は、例えばセリン、トレオニン、システイン、プロリン、アスパラギン及びグルタミンから選択され得る。
　ある実施形態において、合理的設計により導入する変異、又はランダムに導入される変異は、機能的に類似するアミノ酸での置換を含む。機能的に類似するアミノ酸の表は、当技術分野において広く知られている。ある実施形態において、機能的に類似するアミノ酸での置換では、置換前のアミノ酸と置換後のアミノ酸とが、以下に特定されるアミノ酸分類のいずれかに該当し得る：
1)グリシン(G)、アラニン(A)；
2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；
3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；
4)アルギニン(N)、リシン(K)；
5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)、プロリン(P)；
6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；
7)セリン(S)、トレオニン(T)；および
8)システイン(C)、メチオニン(M)。
　典型的な実施形態において、保存的アミノ酸置換、又は機能的に類似するアミノ酸での置換は、ＧＬＯＤの活性中心、基質認識部位、補酵素認識モチーフ及びこれらの近傍等の酵素の機能に重要な領域に存在せず、したがって、酵素の活性に有意に影響しない。
　ＧＬＯＤ変異体はまた、変異前の配列と比較して追加のアミノ酸が挿入されるものを含み得る。典型的な実施形態において、アミノ酸挿入は活性中心、基質認識部位、補酵素認識モチーフ及びこれらの近傍等の酵素の機能に重要な領域に存在せず、したがって、酵素の活性に有意に影響しない。ＧＬＯＤ変異体はまた、変異前の配列と比較して追加のアミノ酸が付加されるものを含み得る。ある実施形態において、アミノ酸付加は、ＧＬＯＤのＮ末端又はＣ末端に行われ、酵素の活性に有意に影響しない。付加の例として、ＧＬＯＤの精製を補助するためのヒスチジン残基の短いストレッチ(例えば2～6のヒスチジン残基)が挙げられるが、これに限らない。また、付加の例として、ＧＬＯＤの発現を補助するためのシグナルペプチドの付加が挙げられるが、これに限らない。シグナルペプチドとしては公知のシグナル配列又はその機能的同等物が挙げられる。
　ＧＬＯＤ変異体はまた、変異前の配列と比較してアミノ酸の欠失を含み得る。典型的な実施形態において、アミノ酸欠失は酵素の機能に重要な領域に存在せず、したがって、酵素の活性に有意に影響しない。ある実施形態において、欠失は１～２アミノ酸の短い欠失であり得る。ある実施形態において、あるＧＬＯＤのアミノ酸配列を他のＧＬＯＤのアミノ酸配列と比較し、一方の配列においてアミノ酸が欠失している場合、当該欠失を他のＧＬＯＤに導入し得る。両方のＧＬＯＤが活性を示すため、このような欠失は酵素の活性に有意に影響しない可能性が高い。
　ＧＬＯＤへの変異導入は、αヘリックス構造や、βシート構造などの二次構造や構造モチーフが破壊されないように行い得る。二次構造の領域は、例えば二次構造予測アルゴリズムにより特定し得る。予測アルゴリズムとしては、例えばNetSurfP - 2.0が挙げられるがこれに限らない。ネスト（nest）、ニッチ（niche）等の他の構造モチーフについても同様である。
（熱安定性向上型変異）
　ある実施形態において、本開示は熱安定性向上型変異を導入したＧＬＯＤ変異体を提供する。この変異体は、該変異導入前のＧＬＯＤと比較して、熱安定性が向上している。ここで、本開示のＧＬＯＤ変異体に関し、熱安定性が向上しているとは、所定の温度及び時間にてＧＬＯＤを熱処理に供したときの、熱処理後のＧＬＯＤ変異体の残存活性が、該変異導入前のＧＬＯＤの熱処理後の残存活性と比較して向上していることを言う。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体は、
配列番号１の８７位に対応する位置、
配列番号１の１０３位に対応する位置、
配列番号１の１３３位に対応する位置、
配列番号１の１８６位に対応する位置、
配列番号１の２９７位に対応する位置、
配列番号１の３７６位に対応する位置、
配列番号１の３９３位に対応する位置、
配列番号１の４２８位に対応する位置、
配列番号１の５１６位に対応する位置、
配列番号１の５６６位に対応する位置、
配列番号１の５６８位に対応する位置、
配列番号１の５８５位に対応する位置、
配列番号１の６１５位に対応する位置、
からなる群より選択される１以上の位置、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３の位置において、配列番号１若しくは５８と比較してアミノ酸置換を有し、置換前の変異体と比較して、アミノ酸置換後の変異体の熱安定性が向上している。上記の位置に関し、アミノ酸が置換されている（アミノ酸置換を有し）、とは、野生型アミノ酸が別のアミノ酸に置換されることを意味し、そのため、置換後のアミノ酸から野生型アミノ酸は除かれる。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体に関し、配列番号１の８７位に対応する位置に導入される置換アミノ酸（置換後のアミノ酸）は、チロシンであり得る。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体に関し、配列番号１の１０３位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体に関し、配列番号１の１３３位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、ロイシン及びチロシンからなる群より選択され得る。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体に関し、配列番号１の１８６位に対応する位置に導入されるアミノ酸置換は、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、グルタミン、アスパラギン、アラニン、ロイシン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ヒスチジン及びトレオニンからなる群より選択され得る。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体に関し、配列番号１の２９７位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体に関し、配列番号１の３７６位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体に関し、配列番号１の３９３位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体に関し、配列番号１の４２８位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、チロシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体に関し、配列番号１の５１６位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、フェニルアラニンであり得る。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体に関し、配列番号１の５６６位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びメチオニンからなる群より選択され得る。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体に関し、配列番号１の５６８位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体に関し、配列番号１の５８５位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、ロイシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体に関し、配列番号１の６１５位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、ロイシン、バリン、及びフェニルアラニンからなる群より選択され得る。対応する位置については後述する。
　ある実施形態において、上記の熱安定性向上型変異を、野生型ＧＬＯＤや従来型ＧＬＯＤに導入し得る。ここでいう従来型ＧＬＯＤとは、活性タンパク質の発現にプロテアーゼでの処理を必要とする従来のＧＬＯＤをいう。かかる熱安定性向上型変異を導入したＧＬＯＤは、野生型ＧＬＯＤや従来型ＧＬＯＤと同様にプロテアーゼでの処理後に活性を発揮するのみならず、変異導入前のＧＬＯＤと比較して、熱安定性が向上すると考えられる。便宜上、このような変異体を本明細書においてＧＬＯＤ－Ｔと表記することがある。また、そのような熱安定性向上型変異を複数導入することもできる。本明細書において、上記の熱安定性向上型変異を１つ導入したＧＬＯＤを、ＧＬＯＤ－Ｔ１と表記することがある。以下、同様に、変異を２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３導入した変異体を、それぞれＧＬＯＤ－Ｔ２、ＧＬＯＤ－Ｔ３、ＧＬＯＤ－Ｔ４、ＧＬＯＤ－Ｔ５、ＧＬＯＤ－Ｔ６、ＧＬＯＤ－Ｔ７、ＧＬＯＤ－Ｔ８、ＧＬＯＤ－Ｔ９、ＧＬＯＤ－Ｔ１０、ＧＬＯＤ－Ｔ１１、ＧＬＯＤ－Ｔ１２、又はＧＬＯＤ－Ｔ１３と表記することがある。
　本発明者らは、配列番号１の８７位、１０３位、１３３位、１８６位、２９７位、３７６位、３９３位、４２８位、５１６位、５６６位、５６８位、５８５位、６１５位に対応する位置に、アミノ酸置換を導入したＧＬＯＤ変異体が、改変前のＧＬＯＤと比較して、熱安定性が向上していることを見出した。当業者であれば、これらの知見に基づき、配列番号１の８７位等に対応する位置に、同様のアミノ酸置換を導入した他の由来のＧＬＯＤも同様に熱安定性が向上し、各種の反応に用いることができると理解する。
　ある実施形態において、上記の熱安定性向上型変異を、本開示のアミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体（ＧＬＯＤΔ）に導入し得る。特に断らない限り、本開示のアミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体は、活性タンパク質の発現にプロテアーゼでの処理を必要としない。本開示のアミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体は、上述したとおり、アミノ酸配列欠失前の対応するＧＬＯＤと比較して、驚くべきことに熱安定性が向上している。このような本開示のアミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体（ＧＬＯＤΔ）に、上記の熱安定性向上型変異をさらに導入し得る。便宜上、このような変異体を本明細書においてＧＬＯＤΔ－Ｔと表記することがある。本明細書において、熱安定性向上型変異を１つ導入したＧＬＯＤΔを、ＧＬＯＤΔ－Ｔ１と表記することがある。以下、同様に、変異を２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３導入したΔ変異体を、それぞれＧＬＯＤΔ－Ｔ２、ＧＬＯＤΔ－Ｔ３、ＧＬＯＤΔ－Ｔ４、ＧＬＯＤΔ－Ｔ５、ＧＬＯＤΔ－Ｔ６、ＧＬＯＤΔ－Ｔ７、ＧＬＯＤΔ－Ｔ８、ＧＬＯＤΔ－Ｔ９、ＧＬＯＤΔ－Ｔ１０、ＧＬＯＤΔ－Ｔ１１、ＧＬＯＤΔ－Ｔ１２、又はＧＬＯＤΔ－Ｔ１３と表記することがある。
（予備的アミノ酸置換）
　予備的実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体、例えばＧＬＯＤ－ＴやＧＬＯＤ－Ｔ１～ＧＬＯＤ－Ｔ１３等の熱安定性向上型変異体や、アミノ酸配列欠失型ＧＬＯＤ変異体、例えばＧＬＯＤΔ－ＴやＧＬＯＤΔ－Ｔ１～ＧＬＯＤΔ－Ｔ１３、例えば配列番号１２、１３、５８、５９若しくは６０又はこれらのいずれかと７０％以上、８０％以上、若しくは９０％以上のアミノ酸配列同一性有するＧＬＯＤ変異体は、場合により国際公開第２０２１／１９３５９８に記載のアミノ酸置換を有し得る。例えば、本開示のＧＬＯＤ変異体に関し、本明細書の配列番号１を基準として１０６位のＡｌａをＳｅｒに置換し得る。このアミノ酸置換を本明細書においてＡ１０６Ｓと記載する。以下、同様に、本明細書の配列番号１を基準として、本開示のＧＬＯＤ変異体は、Ａ１０６Ｓ、Ｃ２１０Ｓ、Ｑ２３５Ｅ、Ｄ２３６Ｅ、Ｄ２３７Ｅ、Ｐ２４４Ｈ、Ｔ３１１Ｓ、Ｗ３１３Ｆ、Ｑ３３３Ｅ、Ｉ３３４Ｖ、Ｉ３３４Ｌ、Ｍ３３６Ｌ、Ｑ３３８Ｅ、Ｒ３３９Ｋ、Ｔ４１６Ｓ、Ａ４３８Ｐ、Ｋ４４１Ｅ、Ｙ４５５Ｆ、Ｑ４５６Ｒ、Ｑ４５７Ｅ、Ｑ４５７Ｋ、Ｌ５０５Ｉ、Ｐ５９８Ａ、Ｃ６０１Ｓ、およびＰ６０９Ａからなる群より選択されるアミノ酸置換を１以上、例えば１～２５有し得る。これらの位置に対応する位置についても同様とする。
　便宜上、本開示の熱安定性向上型アミノ酸欠失Δや本開示の熱安定性向上型変異Ｔと区別するために、国際公開第２０２１／１９３５９８に記載のアミノ酸置換をＪと表記することがある。すなわちＪを国際公開第２０２１／１９３５９８に記載のアミノ酸置換の集合（セット、set）とし、各構成要素の順序は問わないものとする。
[数１]
Ｊ＝{Ａ１０６Ｓ、Ｃ２１０Ｓ、Ｑ２３５Ｅ、Ｄ２３６Ｅ、Ｄ２３７Ｅ、Ｐ２４４Ｈ、Ｔ３１１Ｓ、Ｗ３１３Ｆ、Ｑ３３３Ｅ、Ｉ３３４Ｖ、Ｉ３３４Ｌ、Ｍ３３６Ｌ、Ｑ３３８Ｅ、Ｒ３３９Ｋ、Ｔ４１６Ｓ、Ａ４３８Ｐ、Ｋ４４１Ｅ、Ｙ４５５Ｆ、Ｑ４５６Ｒ、Ｑ４５７Ｅ、Ｑ４５７Ｋ、Ｌ５０５Ｉ、Ｐ５９８Ａ、Ｃ６０１Ｓ、Ｐ６０９Ａ}
　また、Ｊに含まれる変異を１つ有する変異体をＪ１とし、ｎ個有する変異体をＪｎとし、以下同様にＪ２５まで規定する。ある実施形態において本開示は、以下の組み合わせ変異体を提供する。当業者であれば、これらの有限の組み合わせの変異体を一つ一つ作製し、それらの活性や熱安定性を確認し得る。下記において欠失されるΔは３１～５４の長さの配列であり得る。また、下記において、欠失されるΔのＣ末端側の起点は配列番号１の５１０位、５０８位又は５０７位に対応する位置であり得る。
［数２］
ＧＬＯＤ－Ｔ　∩　Ｊ
 ［数３］
ＧＬＯＤ－Ｔ　∩　｛Ｊ１～Ｊ２５｝
 ［数４］
｛ＧＬＯＤ－Ｔ１～ＧＬＯＤ－Ｔ１３｝　∩　Ｊ
 ［数５］
｛ＧＬＯＤ－Ｔ１～ＧＬＯＤ－Ｔ１３｝　∩　｛Ｊ１～Ｊ２５｝
 ［数６］
ＧＬＯＤΔ－Ｔ　∩　Ｊ
 ［数７］
ＧＬＯＤΔ－Ｔ　∩　｛Ｊ１～Ｊ２５｝
 ［数８］
｛ＧＬＯＤΔ－Ｔ１～ＧＬＯＤΔ－Ｔ１３｝　∩　Ｊ
 ［数９］
｛ＧＬＯＤΔ－Ｔ１～ＧＬＯＤΔ－Ｔ１３｝　∩　｛Ｊ１～Ｊ２５｝
（ＧＬＯＤ変異体）
　ＧＬＯＤ遺伝子に本開示のアミノ酸配列欠失を導入することによりＧＬＯＤΔ変異体を作製し、プロテアーゼ処理を行うことなく、ＧＬＯＤ、例えば熱安定性の高いＧＬＯＤを製造し得る。ＧＬＯＤ遺伝子に本開示のアミノ酸置換Ｔを導入することによりＧＬＯＤ－Ｔ変異体を作製し、熱安定性の高いＧＬＯＤを製造し得る。ＧＬＯＤ遺伝子に本開示のアミノ酸配列欠失及びアミノ酸置換を導入することによりＧＬＯＤΔ－Ｔ変異体を作製し、プロテアーゼ処理を行うことなく、ＧＬＯＤ、例えば熱安定性の高いＧＬＯＤを製造し得る。
　一部の限定的な実施形態では、置換後のアミノ酸から、天然ＧＬＯＤ配列におけるアミノ酸（天然アミノ酸）への復帰変異は除かれる。別の実施形態では、例えば配列番号１の８７位等に対応する位置の置換後のアミノ酸は、天然ＧＬＯＤ配列における当該位置のアミノ酸（天然アミノ酸）と同一でありうる。
（対応する位置）
　本明細書において、ある基準となるアミノ酸配列中の特定の位置が別の類似するアミノ酸配列中の特定の位置と対応する場合、これを対応する位置という。また対応する位置のアミノ酸を対応アミノ酸という。本明細書では便宜上、配列番号１に示すStreptomyces sp. X-119-6由来のＧＬＯＤのアミノ酸配列を基準として説明する。この場合、アミノ酸配列における「対応する位置」とは、配列番号１に示すStreptomyces sp. X-119-6由来のＧＬＯＤのアミノ酸配列の特定の位置に対応する他の生物種由来のＧＬＯＤのアミノ酸配列における位置をいう。
　アミノ酸配列における「対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン－パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各ＧＬＯＤのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行うことができる。ＧＬＯＤのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各ＧＬＯＤ配列における配列中の位置を決めることが可能である。対応する位置（相同位置）は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるＧＬＯＤの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
（変異の対応位置）
　本明細書において、「配列番号１のアミノ酸配列の８７位に対応する位置」とは、対象のＧＬＯＤのアミノ酸配列を、配列番号１のアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１の８７位に対応する位置をいう。配列番号１の他の位置、例えば１０３位、１３３位、１８６位、２９７位、３７６位、３９３位、４２８位、５１６位、５６６位、５６８位、５８５位、６１５位についても同様である。配列番号１の１０６位、２１０位、２３５位、２３６位、２３７位、２４４位、３１１位、３１３位、３３３位、３３４位、３３４位、３３６位、３３８位、３３９位、４１６位、４３８位、４４１位、４５５位、４５６位、４５７位、４５７位、５０５位、５９８位、６０１位、および６０９位についても同様である。例えば配列番号１のアミノ酸配列の８７位に対応する位置は、配列番号５８で言うと８７位である。
（対応する領域）
　アミノ酸配列における「対応する領域」についても、上記の「対応する位置」と同様に規定される。例えば配列番号１の４５９位～５０７位に対応する領域は配列番号５８でいうと４５９位～５０７位である。また、配列番号１の４５９位～４６６位に対応する領域は配列番号５８でいうと４５９位～４６６位である。また、配列番号１の４５７位～５１０位に対応する領域は配列番号５８でいうと４５７位～５１０位である。また、配列番号１の６７０位～６８７位に対応する領域は配列番号５８でいうと６７３位～６９０位である。
（アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性）
　アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性は、GENETYX（GENETYX社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはDNASIS Pro（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント、またはCLUSTAL Wのマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のＧＬＯＤをアライメントしたときに、該２以上のＧＬＯＤにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。ここで２以上のアミノ酸配列について、同一性％とは、Blosum62等のアルゴリズムを利用して２以上のアミノ酸配列のアライメントを行った際に、アライメント可能であった領域の総アミノ酸数を分母とし、そのうち同一のアミノ酸によって占められる位置の数を分子としたときのパーセンテージをいう。故に、通常、２以上のアミノ酸配列に同一性が全く見られない領域がある場合、例えばＣ末端に同一性が全く見られない付加配列が一方のアミノ酸配列にある場合、当該同一性のない領域はアライメント不可能であるため、同一性％の算出には利用されない。
　また、２以上のＧＬＯＤにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばCLUSTALWを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてBlosum62を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似（similar）と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本開示の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域（保存領域）を決定できる。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体は、配列番号１又は配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有するＧＬＯＤとアライメントしたときに５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、かつ、改変前のＧＬＯＤと比較して、熱安定性が向上している。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ改変体は、配列番号１の８７位、１０３位、１３３位、１８６位、２９７位、３７６位、３９３位、４２８位、５１６位、５６６位、５６８位、５８５位、６１５位に対応する位置以外の位置に、１又は数個のアミノ酸が改変若しくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつ改変前のＧＬＯＤと比較して熱安定性が向上している。ここで１又は数個のアミノ酸とは、１～１５個、１～１０個、１～７個、１～５個、１～４個、例えば１～３個、例えば１又は２個のアミノ酸をいう。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤΔは、
(i)　配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１の所定の領域のアミノ酸配列を欠失しており、場合により配列番号１の６７０位～６８７位に対応する領域のアミノ酸配列を欠失しており、グルタミン酸オキシダーゼ活性を有する、ここで該所定の領域は、配列番号１の５１０位、５０８位、若しくは５０７位に対応する位置をＣ末端側の起点とし３１～５４の連続するアミノ酸からなる領域である、
(ii)　前記(i)において、配列番号１の所定の領域以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されているアミノ酸配列からなる、或いは、配列番号１の所定の領域及び６７０位～６８７位に対応する領域以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されているアミノ酸配列からなる、
(iii)　前記(i)若しくは(ii)において、当該ＧＬＯＤΔの全長アミノ酸配列が配列番号１２、配列番号１３または配列番号５９のアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有する、
(iv)　前記(i)、又は(ii)において、当該ＧＬＯＤΔの全長アミノ酸配列が配列番号１２、配列番号１３又は配列番号５９のアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有し、当該ＧＬＯＤΔにおける、配列番号１の２９１位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の５１～５６位に対応する位置のアミノ酸配列がＧｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｇｌｙ（ここでＸａａは任意のアミノ酸を示す）である、或いは、(v)　前記(i)又は(ii)において、当該ＧＬＯＤΔの全長アミノ酸配列が配列番号１２、配列番号１３又は配列番号５９のアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有し、当該ＧＬＯＤΔにおける、配列番号１の２９１位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の５１～５６位に対応する位置のアミノ酸配列がＧｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｇｌｙ（ここでＸａａは任意のアミノ酸を示す）であり、改変前のＧＬＯＤと比較して、熱安定性が向上している。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ－Ｔは、
(i)　配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１の８７位、１０３位、１３３位、１８６位、２９７位、３７６位、３９３位、４２８位、５１６位、５６６位、５６８位、５８５位、６１５位からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている、
(ii)　前記(i)において、配列番号１の８７位、１０３位、１３３位、１８６位、２９７位、３７６位、３９３位、４２８位、５１６位、５６６位、５６８位、５８５位、６１５位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されているアミノ酸配列からなる、
(iii)　前記(i)若しくは(ii)において、当該ＧＬＯＤ－Ｔの全長アミノ酸配列が配列番号１または配列番号５８のアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有する、
(iv)　前記(i)、又は(ii)において、当該ＧＬＯＤ－Ｔの全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号５８のアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有し、当該ＧＬＯＤ－Ｔにおける、配列番号１の２９１位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の５１～５６位に対応する位置のアミノ酸配列がＧｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｇｌｙ（ここでＸａａは任意のアミノ酸を示す）である、或いは、
(v)　前記(i)又は(ii)において、当該ＧＬＯＤ－Ｔの全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号５８のアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有し、当該ＧＬＯＤ－Ｔにおける、配列番号１の２９１位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の５１～５６位に対応する位置のアミノ酸配列がＧｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｇｌｙ（ここでＸａａは任意のアミノ酸を示す）であり、改変前のＧＬＯＤと比較して、熱安定性が向上している。
　特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤ－T変異体に関し、配列番号１の８７位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、チロシンであり得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤ－T変異体に関し、配列番号１の１０３位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤ－T変異体に関し、配列番号１の１３３位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、ロイシン及びチロシンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤ－T変異体に関し、配列番号１の１８６位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、グルタミン、アスパラギン、アラニン、ロイシン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ヒスチジン及びトレオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤ－T変異体に関し、配列番号１の２９７位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤ－T変異体に関し、配列番号１の３７６位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤ－T変異体に関し、配列番号１の３９３位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤ－T変異体に関し、配列番号１の４２８位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、チロシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤ－T変異体に関し、配列番号１の５１６位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、フェニルアラニンであり得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤ－T変異体に関し、配列番号１の５６６位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びメチオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤ－T変異体に関し、配列番号１の５６８位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤ－T変異体に関し、配列番号１の５８５位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、ロイシン、及びメチオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤ－T変異体に関し、配列番号１の６１５位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、ロイシン、バリン、及びフェニルアラニンからなる群より選択され得る。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤΔ－Ｔは、
(i)　配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１の所定の領域のアミノ酸配列を欠失しており、場合により配列番号１の６７０位～６８７位に対応する領域のアミノ酸配列を欠失しており、グルタミン酸オキシダーゼ活性を有し、ここで該所定の領域は、配列番号１の５１０位、５０８位、若しくは５０７位に対応する位置をＣ末端側の起点とし３１～５４の連続するアミノ酸からなる領域であり、かつ、
　配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１の８７位、１０３位、１３３位、１８６位、２９７位、３７６位、３９３位、４２８位、５１６位、５６６位、５６８位、５８５位、６１５位からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている、例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、バリン及びメチオニン並びに、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、アラニン、及びトレオニンからなる群より選択されるアミノ酸に改変されている、
(ii)　前記(i)において、配列番号１の８７位、１０３位、１３３位、１８６位、２９７位、３７６位、３９３位、４２８位、５１６位、５６６位、５６８位、５８５位、６１５位に対応する位置、並びに、配列番号１の該所定の領域以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されているアミノ酸配列からなる、或いは、配列番号１の８７位、１０３位、１３３位、１８６位、２９７位、３７６位、３９３位、４２８位、５１６位、５６６位、５６８位、５８５位、６１５位に対応する位置、並びに、配列番号１の所定の領域及び６７０位～６８７位に対応する領域以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されているアミノ酸配列からなる、
(iii)　前記(i)若しくは(ii)において、当該ＧＬＯＤΔ－Ｔの全長アミノ酸配列が配列番号１２、配列番号１３、配列番号５９又は配列番号６０又は配列番号６９のアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有する、
(iv)　前記(i)、又は(ii)において、当該ＧＬＯＤΔ－Ｔの全長アミノ酸配列が配列番号１２、配列番号１３、配列番号５９又は配列番号６０又は配列番号６９のアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有し、当該ＧＬＯＤΔ－Ｔにおける、配列番号１の２９１位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の５１～５６位に対応する位置のアミノ酸配列がＧｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｇｌｙ（ここでＸａａは任意のアミノ酸を示す）である、或いは、
(v)　前記(i)又は(ii)において、当該ＧＬＯＤΔ－Ｔの全長アミノ酸配列が配列番号１２、配列番号１３、配列番号５９又は配列番号６０又は配列番号６９のアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、例えば９９％以上の配列同一性を有し、当該ＧＬＯＤΔ－Ｔにおける、配列番号１の２９１位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の５１～５６位に対応する位置のアミノ酸配列がＧｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｇｌｙ（ここでＸａａは任意のアミノ酸を示す）であり、改変前のＧＬＯＤと比較して、熱安定性が向上している。
　ある実施形態において、本開示は、配列番号６０又は配列番号６９のアミノ酸配列と７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、配列番号１の所定の領域を欠失しており、ここで該所定の領域は、配列番号１の５１０位、５０８位、若しくは５０７位に対応する位置をＣ末端側の起点とし３１～５４の連続するアミノ酸からなる領域であり、かつ、
配列番号１の８７位に対応する位置、
配列番号１の１０３位に対応する位置、
配列番号１の１３３位に対応する位置、
配列番号１の１８６位に対応する位置、
配列番号１の２９７位に対応する位置、
配列番号１の３７６位に対応する位置、
配列番号１の３９３位に対応する位置、
配列番号１の４２８位に対応する位置、
配列番号１の５１６位に対応する位置、
配列番号１の５６６位に対応する位置、
配列番号１の５６８位に対応する位置、
配列番号１の５８５位に対応する位置、及び
配列番号１の６１５位に対応する位置、
からなる群より選択される１以上の位置において、配列番号５８のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換を有し、グルタミン酸オキシダーゼ活性を有する、ＧＬＯＤ変異体を提供する。ただし、特定の実施形態において、置換アミノ酸から野生型アミノ酸は除かれる。特定の実施形態において、変異体はさらに、６７０位～６８７位に対応する領域を欠失し得る。
　特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤΔ－T変異体に関し、配列番号１の８７位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、チロシンであり得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤΔ－T変異体に関し、配列番号１の１０３位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤΔ－T変異体に関し、配列番号１の１３３位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、ロイシン及びチロシンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤΔ－T変異体に関し、配列番号１の１８６位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、グルタミン、アスパラギン、アラニン、ロイシン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ヒスチジン及びトレオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤΔ－T変異体に関し、配列番号１の２９７位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤΔ－T変異体に関し、配列番号１の３７６位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤΔ－T変異体に関し、配列番号１の３９３位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤΔ－T変異体に関し、配列番号１の４２８位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、チロシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤΔ－T変異体に関し、配列番号１の５１６位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、フェニルアラニンであり得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤΔ－T変異体に関し、配列番号１の５６６位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びメチオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤΔ－T変異体に関し、配列番号１の５６８位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤΔ－T変異体に関し、配列番号１の５８５位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、ロイシン、及びメチオニンからなる群より選択され得る。特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤΔ－T変異体に関し、配列番号１の６１５位に対応する位置に導入される置換アミノ酸は、ロイシン、バリン、及びフェニルアラニンからなる群より選択され得る。
（ＧＬＯＤの生産）
　ある実施形態において、本発明は、ＧＬＯＤ産生能を有する菌株を当該ＧＬＯＤを発現しうる条件下で培養する工程、及び培養物又は培養液からＧＬＯＤを単離する工程を含む、ＧＬＯＤの製造方法を提供する。この方法には、本開示のＧＬＯＤをコードする遺伝子を組み込んだベクターで形質転換された宿主細胞を用いることができる。ここでＧＬＯＤを発現しうる条件とは、ＧＬＯＤ遺伝子が転写、翻訳され、当該遺伝子によりコードされるポリペプチドが産生されることをいう。
　また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
　また、培地に当該ＧＬＯＤが作用し得る基質やその類似化合物、例えば糖化アミノ酸、糖化ペプチド類、糖化タンパク質分解物、若しくは糖化ヘモグロビンや糖化アルブミン等の糖化タンパク質を添加することにより目的の酵素の製造量を向上させることができる。
　培地の初発ｐＨは、ｐＨ７～９に調整するのが適当である。培養は、２０～４２℃の培養温度、好ましくは２５～３７℃前後の培養温度で４～２４時間、さらに好ましくは２５～３７℃前後の培養温度で８～１６時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
　培養終了後、該培養物よりＧＬＯＤを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、粗酵素を得る。
　粗酵素よりさらに精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換性担体、疎水性担体、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフィニティクロマトグラフィー法、分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたＧＬＯＤ酵素標品を得ることができる。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体は、例えば
(i)ＦＡＤを補酵素とし、
(ii)基質としてグルタミン酸を認識し、
(iii)作用としてグルタミン酸を酸化して、２－オキソグルタル酸、アンモニア及び過酸化水素を生成する、
ものであり得る。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体は、３０～４０℃、例えば３５℃で３０分又は３５分熱処理後の残存活性が、熱処理前の活性を１００％としたときに、５０％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、例えば９０％以上でありうる。ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体は、例えば６０℃で３０分又は３５分熱処理後の残存活性が、熱処理前の活性を１００％としたときに、５０％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、例えば９０％以上でありうる。ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体は、例えば６５℃で３０分又は３５分熱処理後の残存活性が、熱処理前の活性を１００％としたときに、５０％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、例えば７５％以上でありうる。ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体は、例えば７０℃で３０分又は３５分熱処理後の残存活性が、熱処理前の活性を１００％としたときに、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、３０％以上、例えば３５％以上でありうる。
　本開示のＧＬＯＤ変異体からは、グルタミン酸に対する活性を示さないＧＬＯＤは除くものとする。
（組成物、試薬、電極、センサ、及びキット）
　ある実施形態において本発明は、ＧＬＯＤを含む、グルタミン酸測定用試薬組成物、測定試薬、電極、センサ又はキットを提供する。該組成物、試薬、電極、センサ又はキットは、還元型化合物の測定用試薬、過酸化水素の測定用試薬、緩衝剤、界面活性剤、塩類、防腐剤などを含み得る。また、溶解補助剤、安定化剤、反応性向上剤、糖化ヘモグロビン変性剤、還元剤、牛血清アルブミン、糖類（グリセリン、乳糖、シュークロース等）等を添加してもよい。該組成物、試薬、電極、センサ又はキットは、必要に応じ、その他の公知の安定化剤や夾雑物質の消去系などを追加しうる。従来の各種の試薬、電極、センサやキットに用いられている技術を、適宜改変して本開示の組成物、試薬、電極、センサ又はキットに用いることができる。
　界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、イオン性の界面活性剤、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。
　非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどが挙げられる。
　カチオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、ピリジニウム塩、例えばアルキルピリジニウム塩、ホスホニウム塩、例えばアルキルホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、例えばアルキルイミダゾリウム塩、イソキノニウム塩、例えばアルキルイソキノニウム塩などが挙げられる。
　過酸化水素の測定用試薬は、ペルオキシダーゼ及び／又は発色基質を含みうる。発色基質としては、４－アミノアンチピリンの他に、例えば、ＡＤＯＳ（Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－ｍ－アニシジン）、ＡＬＯＳ（Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）アニリン）、ＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム）、ＤＡ－６７（１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３、７－ビス（ジメチルアミノ）－フェノシアジン）、ＤＡ－６４（Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４、４’－ビス（ジメチルアミノ）－ジフェニルアミン）等が挙げられる。
（グルタミン酸の測定方法）
　ある実施形態において、本開示はグルタミン酸の測定方法を提供する。グルタミン酸測定は、定性的又は定量的な方法であり得る。定量法は、グルタミン酸を含む試料と本開示のＧＬＯＤとを接触させる工程、及び反応生成物又は消費物を測定する工程を含み得る。該定量法についていう接触とは、ＧＬＯＤがグルタミン酸の酸化反応を触媒しうるように、該酵素と試料とを物理的に一緒にするあらゆる態様を包含し、例えば溶液中で遊離の酵素とグルタミン酸を混合する場合のみならず、固相担体に担持された酵素にグルタミン酸を含む溶液試料を添加又は滴下するような態様も包含する。
　測定に用いる試料（サンプル）は、グルタミン酸を含む可能性のあるあらゆる試料とすることができる。試料は適宜、加工処理されたものでありうる。
　用いる酵素量及び反応時間を一定とし、添加するグルタミン酸の量を変化させた場合に、グルタミン酸添加量が減少するにつれて、検出される発色基質の吸光度も比例的に減少するグルタミン酸濃度範囲を調べることで、当該ＧＬＯＤを用いた場合の検出可能な最低グルタミン酸濃度（検出限界濃度）を決定することができる。検出限界が、測定試料中又は血中のグルタミン酸濃度よりも低くなるよう酵素量及び反応時間を設定しうる。
　定量的測定では、予め、濃度既知のグルタミン酸を含む対照の吸光度等の測定値から最小二乗法などの回帰分析を行うことによって検量線を作成しておくこともできる。作成した検量線に対し、グルタミン酸濃度が未知である試料の測定値をプロットすることで、当該試料中のグルタミン酸濃度を定量できる。
　グルタミン酸を含む試料にＧＬＯＤを作用させる時間は、例えば５秒以上、１０秒以上、２０秒以上、３０秒以上、１分以上、６０分未満、３０分未満、１０分未満、例えば５分未満、例えば０．５分以上～６０分未満、１分以上～３０分未満、１分以上～２０分未満、例えば１分以上～１０分未満、例えば１分以上～５分未満としうる。作用温度は、用いる酵素の至適温度にもよるが、例えば、２０～４５℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択できる。
　使用するＧＬＯＤの酵素量は、試料溶液中に含まれる基質の量にもよるが、例えば、終濃度が、０．１～５０Ｕ／ｍｌ、例えば０．２～１０Ｕ／ｍｌとなるように添加しうる。作用させる際のｐＨは、ＧＬＯＤが作用可能なｐＨ、例えば至適ｐＨを考慮して、緩衝剤を用いて調整しうる。反応pHは、例えば３～１１、５～９、例えば６～８である。
　過酸化水素の測定は、過酸化水素を生成する工程と同時に行うことができ、ＧＬＯＤの作用時と同時に進行させることができる。生成物の代わりに消費物を測定してもよく、測定する消費物としては溶存酸素が挙げられ、溶存酸素計等を用いて反応液中の溶存酸素量を測定することができる。
（ＧＬＯＤ活性の測定方法）
　以下に、基質としてグルタミン酸を用いた、ＧＬＯＤ活性の測定方法を例示するが、測定方法はこれに限らない。グルタミン酸は市販のものであり得る。本明細書において、特に断らない限り、酵素力価は、グルタミン酸を基質として３０℃、ｐＨ７．４で測定した時の、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。
Ａ：活性測定用試薬
（試薬１）２５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー　ｐＨ７．４
（試薬２）３０ｍＭ　４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）溶液
（試薬３）１５ｍＭ　Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリンナトリウム塩（ＴＯＯＳ）溶液
（試薬４）３００Ｕ／ｍｌ　西洋わさびペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）溶液
（試薬５）３００ｍＭ　グルタミン酸水素ナトリウム溶液
Ｂ：活性測定法
　３００μｌの試薬１、１２．５μｌの試薬２、２５μｌの試薬３、１２．５μｌの試薬４、脱イオン水（３７５－Ｖ）μｌ、及びＶμｌのＧＬＯＤ溶液を混和し、３０℃で５分間保温する。その後、試薬５を２５μｌ加えて良く混ぜた後、セルホルダーを３０℃に保温した分光光度計Ｕ－３９００（日立ハイテクサイエンス製）を使用して波長５５５ｎｍの光の吸光度（Ａ５５５）を測定し、１分間あたりのＡ５５５変化量（ΔＡＳ）を算出した。なお、対照実験として、２５μｌの試薬５の代わりに脱イオン水２５μｌを添加して波長５５５ｎｍの光の吸光度（Ａ５５５）を測定し、１分間あたりのＡ５５５変化量（ΔＡ０）を算出した。
　オキシダーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）は下記計算式に基づいて算出し得る。式中の「３９．２」は、４－ＡＡとＴＯＯＳが縮合して形成されるキノンイミン色素の、波長５５５ｎｍの光に対するミリモル吸光係数（ｍＭ－１ｃｍ－１）を示す。
[式]
Ｕ／ｍｌ＝（ΔＡＳ－ΔＡ０）×６００×ｄｆ／（３９．２×０．５×Ｖ）
　　　　＝３０．６×（ΔＡＳ－ΔＡ０）×ｄｆ／Ｖ
　異なる発色試薬を用いる場合は、当該発色試薬に応じた波長と当該波長でのミリモル吸光係数を使用し得る。
　ある実施形態において本開示は、グルタミン酸オキシダーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。ある実施形態において本開示は、そのようなポリヌクレオチドを有するベクターを提供する。有る実施形態において本開示は、そのようなベクターにより形質転換された宿主細胞、すなわちそのようなベクターを含む宿主細胞を提供する。有る実施形態において本開示は、そのような宿主細胞を培養し、グルタミン酸オキシダーゼ変異体を産生する工程、及び、産生されたグルタミン酸オキシダーゼ変異体を取得する工程を含む、グルタミン酸オキシダーゼ変異体の製造方法を提供する。ある実施形態において本開示は、グルタミン酸オキシダーゼ変異体、又はこれを含む組成物、試薬、電極、センサ又はキットと、グルタミン酸を含む試料とを接触させ、該試料に含まれるグルタミン酸を酸化させる方法を提供する。ある実施形態において、この方法はグルタミン酸を検出し得る。ある実施形態においてこの方法はグルタミン酸を測定しうる。
（さらなるＧＬＯＤの作製方法）
　本発明者は、ＧＬＯＤに特定のアミノ酸配列欠失を導入したＧＬＯＤΔを作製した。また、ＧＬＯＤΔに特定のアミノ酸置換を導入したＧＬＯＤΔ－Ｔを作製した。本開示の欠失及び変異は適宜組み合わせることができる。また本開示の知見に基づいてさらなる変異体を作製することもできる。したがってある実施形態において本発明は、以下の工程を含む、ＧＬＯＤ又はＧＬＯＤΔを改変して熱安定性向上型ＧＬＯＤ変異体を作製する方法を提供する：
(i) ＧＬＯＤ遺伝子又はＧＬＯＤΔ遺伝子を取得する、
(ii) ＧＬＯＤ遺伝子又はＧＬＯＤΔ遺伝子をベクターに組み入れ、宿主細胞を形質転換し、ＧＬＯＤ又はＧＬＯＤΔを発現させ、発現産物を単離する、
(iii) 発現産物の活性を確認する、
(iv) 発現産物の熱処理後の残存活性を測定する、
(v) ＧＬＯＤ又はＧＬＯＤΔのアミノ酸配列を、配列番号１に記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１の８７位、１０３位、１３３位、１８６位、２９７位、３７６位、３９３位、４２８位、５１６位、５６６位、５６８位、５８５位、６１５位からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸を置換する、例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、イソロイシン、バリン及びメチオニンからなる群より選択されるアミノ酸に置換するよう、前記ＧＬＯＤ遺伝子又はＧＬＯＤΔ遺伝子を改変する、
(vi) 改変後の遺伝子をベクターに組み入れ、宿主細胞を形質転換し、改変体を発現させ、発現産物を単離する、
(vii) 改変体の発現産物の熱処理後の残存活性を測定し、工程(iv)の値と比較する、
(viii) 改変前のＧＬＯＤ若しくはＧＬＯＤΔの熱処理後の残存活性と比較して、改変後の改変体の熱処理後の残存活性が５％、６％、７％、８％、９％、又は１０％以上増大している場合、当該改変体を熱安定性向上型ＧＬＯＤ変異体とする、
(ix) 必要に応じて、工程(viii)の改変体について、工程(v)～(vii)を繰り返す、並びに
(x)工程(viii)又は(ix)の熱安定性向上型ＧＬＯＤ変異体をキット又は組成物に配合する。
　特定の実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体、例えばＧＬＯＤΔ又はＧＬＯＤΔ－Ｔについて、アミノ酸配列を欠失させた領域に、ペプチドリンカーを挿入し得る。ペプチドリンカーは、例えば１～２０個のアミノ酸残基から構成されるリンカーであり得る。ペプチドリンカーは、ＧＬＯＤの部分アミノ酸配列と異なるアミノ酸配列により構成され得る。ペプチドリンカーは、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸残基から構成され得る。ペプチドリンカーは、例えば２－１９、３－１８、４－１７、５～１６、６－１５、例えば７－１４のアミノ酸残基から構成され得る。ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基は、天然アミノ酸、およびグリシンであり得る。例えば、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、およびＬｙｓが挙げられる。例えばＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒが挙げられる。ある実施形態において、ペプチドリンカーは、ＧＧＧＧＳまたはその繰り返し配列であり得る。繰り返し回数は、２、３、４回であり得る。ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体、例えばＧＬＯＤΔ又はＧＬＯＤΔ－Ｔはペプチドリンカーを有しない。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体、例えばＧＬＯＤΔ又はＧＬＯＤΔ－Ｔは、配列番号１と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。欠失Δがある場合は、これを配列同一性の計算に含めないものとする。別の実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体、例えばＧＬＯＤΔ又はＧＬＯＤΔ－Ｔから、配列番号１と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する配列は除かれる。
　ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体、例えばＧＬＯＤΔ又はＧＬＯＤΔ－Ｔは、配列番号５８と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する。欠失Δがある場合は、これを配列同一性の計算に含めないものとする。別の実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体、例えばＧＬＯＤΔ又はＧＬＯＤΔ－Ｔから、配列番号５８と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する配列は除かれる。ある実施形態において、本開示のＧＬＯＤ変異体、例えばＧＬＯＤΔ又はＧＬＯＤΔ－Ｔから、公知のＧＬＯＤや、公知のＧＬＯＤ変異体は除かれる。
　配列番号１の４５９位～５０７位を欠失させた変異体では、アミノ酸のナンバリングがずれる。配列番号１の５１６位に対応する位置は、欠失変異体ではN末端から数えて４６７番目の位置となる。配列番号１の５６６位に対応する位置は、欠失変異体ではN末端から数えて５１７番目の位置となる。配列番号１の５６８位に対応する位置は、欠失変異体ではN末端から数えて５１９番目の位置となる。配列番号１の５８５位に対応する位置は、欠失変異体ではN末端から数えて５３６番目の位置となる。配列番号１の６１５位に対応する位置は、欠失変異体ではN末端から数えて５６６番目の位置となる。
　本開示のＧＬＯＤを以下の実施例によりさらに例証する。但し、これはあくまで例証目的であり、本開示はこれに何ら限定されるものではない。
[実施例１] アミノ酸配列の欠失による、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．　Ｘ－１１９－６由来のグルタミン酸オキシダーゼ（ＳｔＧＬＯＤ）の耐熱性向上
１．グルタミン酸オキシダーゼ（ＧＬＯＤ）発現用プラスミドの構築
　配列番号１のアミノ酸配列を有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．　Ｘ－１１９－６由来のグルタミン酸オキシダーゼ（ＳｔＧＬＯＤ）の発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＳｔＧＬＯＤ）は、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡアセンブリ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を使用して作製した。
　配列番号２の塩基配列を有するＳｔＧＬＯＤ遺伝子は、配列番号３（ＳｔＧＬＯＤ－ｆ１）、配列番号４（ＳｔＧＬＯＤ－ｆ２）および配列番号５（ＳｔＧＬＯＤ－ｆ３）の３断片に分割してＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に合成委託した。ＳｔＧＬＯＤ－ｆ１の３’末端側の１５塩基とＳｔＧＬＯＤ－ｆ２の５’末端側の１５塩基は、遺伝子をアセンブリするための重複配列である。ＳｔＧＬＯＤ－ｆ２の３’末端側の１５塩基とＳｔＧＬＯＤ－ｆ３の５’末端側の１５塩基は、遺伝子をアセンブリするための重複配列である。
　プラスミド断片は、鋳型としてｐＫＫ２２３プラスミドを使用し、配列番号６（ggtcatttcattcatgaattctgtttcctgtgtgaaattg）および配列番号７（gcgttaacttcttaagcttggctgttttggcggatgag）のプライマーを使用してＰＣＲにより調製した。配列番号６もしくは配列番号７プライマーには、ｐＫＫ２２３－３とアニールする配列の５’末端側に、それぞれＳｔＧＬＯＤ－ｆ１もしくはＳｔＧＬＯＤ－ｆ３と重複する１５塩基配列が付加されている。ＰＣＲ後の溶液にＤｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製）を１．０μｌ添加して３７℃で１時間処理した後、ＧＦＸ　ＰＣＲ　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｇｅｌ　Ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｙｔｉｖａ製）を用いて増幅した断片を精製した。
　下記の表の組成で５０℃６０分間反応を行い、ＳｔＧＬＯＤの発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＳｔＧＬＯＤ）を得た。得られたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養して抽出したプラスミドの塩基配列は、目的通りの配列となっていることをＤＮＡシーケンス解析により確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
２．ＳｔＧＬＯＤ欠失変異体の作製
　ｐＫＫ２２３－３－ＳｔＧＬＯＤを鋳型として部位特異的変異導入を行い、ＳｔＧＬＯＤ欠失変異体をコードする遺伝子を保持するプラスミドを得た。ＰＣＲの反応液は、ＫＯＤ　ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡製）を１０μｌ、２μＭのＦｗプライマーを３μｌ、２μＭのＲｖプライマーを３μｌ、４０μｇ／ｍｌの鋳型ＤＮＡ（ｐＫＫ２２３－３－ＳｔＧＬＯＤ）を０．５μｌ、イオン交換水を３．５μｌ混ぜて調製した。配列番号８（gataagaccgaagcgaccaatgcgtacgga）及び配列番号９（cagcttacgataatagtcgtacagacccgg）のプライマーを用いて作製した欠失変異体をＳｔＧＬＯＤΔ４９Ａｉ、配列番号１０（gcagagccacctgcgaccaatgcgtacgga）及び配列番号１１（cgcatcttgataatagtcgtacagacccgg）のプライマーを用いて作製した欠失変異体をＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃと名付けた。ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ａｉ又はＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１２又は配列番号１３に示した。ＰＣＲの反応条件は「９８℃１０秒→５５℃５秒→６８℃３５秒」のサイクルを７回繰り返した。
　ＰＣＲ後の溶液にＤｐｎＩを１μｌ添加して３７℃で１時間処理し、鋳型であるｐＫＫ２２３－３－ＳｔＧＬＯＤを分解させた。得られたＤｐｎＩ処理溶液２μｌを、５μｌのＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ　Ｖｅｒ．２（東洋紡製）、１μｌの５Ｕ／μｌ　Ｔ４　ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｋｉｎａｓｅ、７μｌのイオン交換水と混ぜ、１６℃で１時間反応させた後、その反応液を用いてＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養して抽出したプラスミドの塩基配列は、目的通りの配列となっていることをＤＮＡシーケンス解析により確認した。
　ＰＣＲ後の溶液にＤｐｎＩを１μｌ添加して３７℃で１時間処理し、鋳型であるｐＫＫ２２３－３－ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃを分解させた。得られたＤｐｎＩ処理溶液を用いてＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養して抽出したプラスミドの塩基配列は、目的通りの配列となっていることをＤＮＡシーケンス解析により確認した。
３．ＧＬＯＤの組換え生産
　ＧＬＯＤ生産株を、試験管に仕込んだＬＢ－ａｍｐ培地（アンピシリン濃度５０μｇ／ｍｌ）２．５ｍｌに接種して３７℃、１６０ｒｐｍで一晩種培養した。種培養液２．５ｍｌを、坂口フラスコに仕込んだ０．１ｍＭ　ＩＰＴＧを含むＬＢ－ａｍｐ培地（アンピシリン濃度５０μｇ／ｍｌ）２５０ｍｌに接種して２５℃、１３０ｒｐｍで１６時間培養した。
　培養液を８，０００ｒｐｍで１０分間遠心して得たペレットを、４ｍｌの１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ＰＰＢ）ｐＨ７．５に再懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕した後、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心して得た上清を回収し、ＧＬＯＤ粗酵素液とした。
４．ＧＬＯＤ活性の測定
　ＧＬＯＤの活性測定試薬には4-アミノアンチピリン (４－ＡＡ) （富士フイルム和光純薬製）、ＴＯＯＳ（同仁化学研究所製）、西洋わさびペルオキシダーゼ (ＰＯＤ) （東洋紡製）を用いた。活性測定試薬組成を表２に示した。ＧＬＯＤ溶液の希釈には、０．１５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製）を含む１０ｍＭ　ＰＰＢ（ｐＨ７．４）を用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　上記の表の試薬７２５μｌを３０℃で５分間保温した後、３００ｍＭグルタミン酸水素ナトリウム（ＧｌｕＮａ、富士フイルム和光純薬製）溶液２５μｌを添加して混合し、セルホルダーを３０℃に保温した分光光度計Ｕ－３９００（日立ハイテクサイエンス製）を使用して波長５５５ｎｍの光の吸光度（Ａ５５５）を測定し、１分間あたりのＡ５５５変化量（ΔＡＳ）を算出した。基質溶液（ＧｌｕＮａ溶液）の代わりにイオン交換水２５μｌを添加した測定も行い、１分間あたりのＡ５５５変化量（ΔＡ０）を算出した。
　オキシダーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）は下記計算式に基づいて算出した。式中の「３９．２」は、４－ＡＡとＴＯＯＳが縮合して形成されるキノンイミン色素の、波長５５５ｎｍの光に対するミリモル吸光係数（ｍＭ－１ｃｍ－１）を示す。
[式]
Ｕ／ｍｌ＝（ΔＡＳ－ΔＡ０）×６００×ｄｆ／（３９．２×０．５×Ｖ）
＝３０．６×（ΔＡＳ－ΔＡ０）×ｄｆ／Ｖ
５．ＧＬＯＤの熱安定性の評価
 ＧＬＯＤの終濃度が０．０５Ｕ／ｍｌになるように、ＧＬＯＤ粗酵素液を１０ｍＭ　ＰＰＢ　ｐＨ６．０で希釈した。続いて、２４０μｌの０．０５Ｕ／ｍｌのＧＬＯＤ溶液と１６０μｌの２５０ｍＭ　ＰＰＢ　ｐＨ６．０を混合し、所定の温度に保温した水浴中で３０分間もしくは３５分間加熱した。加熱後は速やかに氷上でＧＬＯＤ溶液を冷却し、ＧＬＯＤ溶液３７５μｌを使用して活性を測定した。加熱せず氷上で冷却しておいた試料の活性を１として、加熱後の試料の残存活性（Ｒｅｓｉｄｕａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を算出した。各ＧＬＯＤについて残存活性を３回算出し、その平均値で熱安定性を評価した。
　４５℃３０分間加熱後の、ＳｔＧＬＯＤ欠失変異体の残存活性を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　上記の表に示したＳｔＧＬＯＤ欠失変異体の残存活性は、ＳｔＧＬＯＤと比較して、０．１１～０．３７増加しており、ＳｔＧＬＯＤ欠失変異体はいずれも熱安定性が向上した。別の言い方をすると、残存活性は野生型と比較して約２０％、及び、約６５％、向上していた。
[実施例２] アミノ酸置換によるＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃの耐熱性向上
６．改変型ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃの作製
　ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃの発現と残存活性を確認することができた。そこで、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃに基づく改変型変異体をさらに作製した。
　ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃ発現用プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃ）を鋳型として部位特異的変異導入を行い、改変型ＳｔＧＬＯＤをコードする遺伝子を保持するプラスミドを得た。ＰＣＲの反応液は、ＫＯＤ　ｏｎｅ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（東洋紡製）を１０μｌ、２μＭのＦｗプライマーを３μｌ、２μＭのＲｖプライマーを３μｌ、４０μｇ／ｍｌの鋳型ＤＮＡ（ｐＫＫ２２３－３－ＳｔＧＬＯＤ）を０．５μｌ、イオン交換水を３．５μｌ混ぜて調製した。作製した変異体名と、Ｆｗプライマー、Ｒｖプライマーの組み合わせは表４に示した。ＰＣＲの反応条件は「９８℃１０秒→５５℃５秒→６８℃３５秒」のサイクルを１５回繰り返した。多重変異型ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃの発現用プラスミドは、単変異導入を繰り返して構築した。例えば、ｐＫＫ２２３－３－ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃ／Ｆ８７Ｙを鋳型とし、配列番号２０及び配列番号１６のプライマーを用いてＰＣＲを行うことで、二重変異型であるＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃ／Ｆ８７Ｙ／Ｙ１０３Ｉの発現用プラスミドを構築した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　作製した変異体のＰＣＲ、ＧＬＯＤの組換え生産、活性の測定及び熱安定性の評価はいずれも上記のＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃと同様に行った。５０℃３５分間加熱後の、改変型ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃの残存活性を下記の表に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　上記の表に示した改変型ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃの残存活性は、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃと比較して、０．０２～０．７２増加しており、改変型ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃはいずれも熱安定性が向上した。別の言い方をすると作製した改変型酵素の残存活性は、改変前のＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃと比較して約９％以上～約３２５％以上、向上していた。
　ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃの熱安定性向上に寄与した８種類のアミノ酸置換（Ｆ８７Ｙ、Ｙ１０３Ｉ、Ｆ１３３Ｙ、Ｆ２９７Ｍ、Ｆ３９３Ｌ、Ｆ４２８Ｙ、Ｙ５１７Ｆ、Ｙ５３６Ｌ）を組み合わせた８重変異体を作製し、表９よりも過酷な熱処理条件（６０℃、６５℃又は７０℃で３５分間）で加熱後の、ＳｔＧＬＯＤ欠失変異体の残存活性を下記の表に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　上記の表に示したＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃの８重変異体は、６０℃で３５分間加熱しても安定であり、７０℃で３５分間加熱しても１／３以上の活性が残存した。表９に示したアミノ酸置換を組み合わせることで、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃの熱安定性が飛躍的に向上にすることが明らかとなった。
[実施例３] 熱安定性向上型ＳｔＧＬＯＤホモログの取得
７．熱安定性向上変異を有するＳｔＧＬＯＤホモログの発現用プラスミドの構築
　配列番号５８のアミノ酸配列を有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．　ＭＯＥ７由来の推定グルタミン酸オキシダーゼ（Ｍ７ＧＬＯＤ）を、ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃと同様に欠失させたアミノ酸配列（M7GLODΔ49C、配列番号５９）をデザインし、さらに８種類のアミノ酸置換（Ｆ８７Ｙ、Ｙ１０３Ｉ、Ｆ１３３Ｙ、Ｆ２９７Ｍ、Ｆ３９３Ｌ、Ｆ４２８Ｙ、Ｙ５１７Ｆ、Ｙ５３６Ｌ）を導入したアミノ酸配列（Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８、配列番号６０）をデザインした。
　Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８発現用プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８）は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を使用して作製した。配列番号６１の塩基配列を有するＭ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８遺伝子は、配列番号６２（Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８－ｆ１）、配列番号６３（Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８－ｆ２）および配列番号６４（Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８－ｆ３）の３断片に分割してＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に合成委託した。Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８－ｆ１の５’末端側の１５塩基は、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）にアセンブリするための重複配列である。Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８－ｆ１の３’末端側の１５塩基とＭ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８－ｆ２の５’末端側の１５塩基は、遺伝子をアセンブリするための重複配列である。Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８－ｆ２の３’末端側の１５塩基とＭ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８－ｆ３の５’末端側の１５塩基は、遺伝子をアセンブリするための重複配列である。Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８－ｆ３の３’末端側の１５塩基は、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）にアセンブリするための重複配列である。
　プラスミド断片は、鋳型としてｐＥＴ－２２ｂ（＋）プラスミドを使用し、配列番号６５（catatgtatatctccttcttaaag）および配列番号６６（taacaaagcccgaaaggaag）のプライマーを使用してＰＣＲにより調製した。ＰＣＲ後の溶液にＤｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ製）を１．０μｌ添加して３７℃で１時間処理した後、ＧＦＸ　ＰＣＲ　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｇｅｌ　Ｂａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｃｙｔｉｖａ製）を用いて増幅した断片を精製した。
　下記の表の組成で５０℃１５分間反応を行い、Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８発現用プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８）を得た。得られたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養して抽出したプラスミドの塩基配列は、目的通りの配列となっていることをＤＮＡシーケンス解析により確認した。その後、ｐＥＴ２２ｂ－Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８でＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８の生産株を作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　ｐＥＴ２２ｂ－Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８を鋳型として、配列番号６７（atcgaggtcttttatactggagctggacaa）および配列番号６８（aaagacctcgatgcggcggccatggaccga）のプライマーを使用して、「６．改変型ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃの作製」に記載の方法に従い、Ｙ５３６Ｌのアミノ酸置換を含まないＭ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８をコードする遺伝子を保持するプラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７）を得た。Ｙ５３６Ｌのアミノ酸置換を含まないＭ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８をＭ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７（配列番号６９）と称する。
　ｐＥＴ２２ｂ－Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７を鋳型とし、表１２のプライマーを用いて、「６．改変型ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃの作製」と同様の方法で各種改変型Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７の発現用プラスミドを構築した。作製した変異体名と、Ｆｗプライマー、Ｒｖプライマーの組み合わせは表１２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　続いて、ｐＥＴ２２ｂ－Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７、もしくは各種改変型Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７の発現用プラスミドでＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７および各種改変型Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７の生産株を作製した。
８．Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７の組換え生産および熱安定性評価
　Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７および改変型Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７生産株を、試験管に仕込んだＬＢ－ａｍｐ培地（アンピシリン濃度５０μｇ／ｍｌ）２．５ｍｌに接種して３７℃、１８０ｒｐｍで一晩種培養した。種培養液２．５ｍｌを、坂口フラスコに仕込んだＬＢ－ａｍｐ培地（アンピシリン濃度１００μｇ／ｍｌ）２５０ｍｌに接種して３７℃、１３０ｒｐｍで培養し、培養液のＯＤ６００が０．６～１．０に到達した段階でイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍＭもしくは０．１ｍＭとなるように加え、１５℃、１３０ｒｐｍで１６時間培養した。
　培養液を８，０００ｒｐｍで１０分間遠心して得たペレットを、４～２５ｍｌの１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ＰＰＢ）ｐＨ６．０に再懸濁した。菌体懸濁液を超音波破砕した後、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心して得た上清を回収し、Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７および改変型Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７粗酵素液とした。
　Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７および改変型Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７を、７０℃で３０分間加熱し、前述した方法に従って、その残存活性を算出した（表１３）。Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７は、６０℃又は６５℃でも３０分間加熱し、その残存活性を算出した
Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７は、６０℃で３０分間加熱後の残存活性が０．９３、６５℃で３０分間加熱後の残存活性が０．６９であり、高い熱安定性を示した。表９に示したアミノ酸置換を組み合わせることで、ＳｔＧＬＯＤに限定されず、ＧＬＯＤの熱安定性が向上することが実証された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　さらに、各種改変型Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７の残存活性は、Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７と比較して、０．０５～０．５８増加しており、改変型Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７はいずれも熱安定性が向上した。換言すると作製した改変型酵素の残存活性は、改変前のＭ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７と比較して約２９％～約３４１％向上していた。
[実施例４] Ｍ７ＧＬＯＤ－Ｔ８を対象とした、欠失による熱安定性向上効果の検証
９．Ｍ７ＧＬＯＤ発現用プラスミドの構築
　Ｍ７ＧＬＯＤ（配列番号５８）の発現用プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｍ７ＧＬＯＤ）は、「７．熱安定性向上変異を有するＳｔＧＬＯＤホモログの発現用プラスミドの構築」と同様の方法で作製した。Ｍ７ＧＬＯＤ遺伝子（配列番号８５）を含むＤＮＡ断片（配列番号８６）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社に合成委託した。配列番号８６の５’末端側の１５塩基、および３’末端側の１５塩基は、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）にアセンブリするための重複配列である。配列番号６５および配列番号６６を用いて増幅させたｐＥＴ－２２ｂ（＋）プラスミド断片を、ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ反応により、配列番号８６の塩基配列と結合させてｐＥＴ２２ｂ－Ｍ７ＧＬＯＤを得た。得られたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養して抽出したプラスミドの塩基配列は、目的通りの配列となっていることをＤＮＡシーケンス解析により確認した。
１０．Ｍ７ＧＬＯＤ－Ｔ８発現用プラスミドの構築
　同様の手法により、Ｍ７ＧＬＯＤに８種類のアミノ酸置換（Ｆ８７Ｙ、Ｙ１０３Ｉ、Ｆ１３３Ｙ、Ｆ２９７Ｍ、Ｆ３９３Ｌ、Ｆ４２８Ｙ、Ｙ５６６Ｆ、Ｙ５８５Ｌ）を導入したＭ７ＧＬＯＤ－Ｔ８（配列番号８７）の発現用プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｍ７ＧＬＯＤ－Ｔ８）を作製した。なお、Ｙ５６６ＦおよびＹ５８５Ｌのアミノ酸置換は、Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８（配列番号６０）においては、Ｙ５１７ＦおよびＹ５３６Ｌとして導入されている。
　ｐＥＴ２２ｂ－Ｍ７ＧＬＯＤを鋳型として、配列番号８８（ccgtcgttggtgggaattc）および配列番号８９（gcgctcagcatcgtcaaaag）のプライマーを使用して、ＰＣＲにより断片を増幅させた。ｐＥＴ２２ｂ－Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ８を鋳型として、配列番号９０（cttttgacgatgctgagcgc）および配列番号９１（gaattcccaccaacgacgg）のプライマーを使用して、ＰＣＲにより断片を増幅させた。両断片をＤｐｎＩ処理した後に精製して、ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ反応により結合させてｐＥＴ２２ｂ－Ｍ７ＧＬＯＤ－Ｔ８を得た。得られたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養して抽出したプラスミドの塩基配列は、目的通りの配列となっていることをＤＮＡシーケンス解析により確認した。
１１. 各種欠失型Ｍ７ＧＬＯＤ－Ｔ８の作製および熱安定性評価
　各種欠失型Ｍ７ＧＬＯＤ－Ｔ８は、ｐＥＴ２２ｂ－Ｍ７ＧＬＯＤ－Ｔ８を鋳型として、「６．改変型ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃの作製」と同様にＰＣＲを行い、配列番号８７の４６０位から５０８位をコードする領域の全てもしくは一部を欠失させて作製した。ＰＣＲは「９８℃１０秒、６８℃４０秒」を３５サイクル行った。用いたプライマーは表１４に記載する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　ＰＣＲ産物をＤｐｎＩで処理したのち、そのうち２μＬを、５μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ　Ｖｅｒ．２（東洋紡製）、１μＬのＴ４　ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｋｉｎａｓｅ（東洋紡製）、７μＬのイオン交換水と混ぜて、１６℃にて６０分ライゲーション反応を行った。得られた反応産物でＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養して抽出したプラスミドの塩基配列は、目的通りの配列となっていることをＤＮＡシーケンス解析により確認した。
　その後、Ｍ７ＧＬＯＤ－Ｔ８および各種欠失型Ｍ７ＧＬＯＤ－Ｔ８の発現用プラスミドでＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換してＭ７ＧＬＯＤ－Ｔ８および各種欠失型Ｍ７ＧＬＯＤ－Ｔ８の生産株を作製し、「８．Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７の組換え生産」に従って組換え生産した。Ｍ７ＧＬＯＤ－Ｔ８および各種欠失型Ｍ７ＧＬＯＤ－Ｔ８を、６５℃で３０分間加熱し、前述した方法に従って、その残存活性を算出した（表１５）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　各種欠失型Ｍ７ＧＬＯＤ－Ｔ８の残存活性は、Ｍ７ＧＬＯＤ－Ｔ８と比較して、０．０５～０．５４増加しており、欠失型Ｍ７ＧＬＯＤ－Ｔ８はいずれも熱安定性が向上した。換言すると作製した改変型酵素の残存活性は、改変前のＭ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７と比較して約３８％～約４１５％向上していた。
[実施例５] アミノ酸置換によるＳｔＧＬＯＤの熱安定性向上
１２．ＳｔＧＬＯＤの発現用プラスミドの構築
　ＳｔＧＬＯＤ（配列番号１）の発現用プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＳｔＧＬＯＤ）は、「７．熱安定性向上変異を有するＳｔＧＬＯＤホモログの発現用プラスミドの構築」と同様の方法で作製した。ｐＫＫ２２３－３－ＳｔＧＬＯＤを鋳型として、配列番号９９（gaaggagatatacatatgaatgaaatgacctacgagcaattg）および配列番号１００（tcctttcgggctttgttaagaagttaacgcctcctc）のプライマーを用いて、ＳｔＧＬＯＤ遺伝子を含む断片をＰＣＲにより増幅させた。ｐＥＴ－２２ｂ（＋）プラスミドを鋳型として、配列番号１０１（caaagcccgaaaggaagctgagttggctgc）および配列番号１０２（tcctttcgggctttgttaagaagttaacgcctcctc）のプライマーを使用してＰＣＲにより増幅させた。ＰＣＲは、「２．ＳｔＧＬＯＤ欠失変異体の作製」と同様に実施した。
　両断片をＤｐｎＩ処理した後に精製して、ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ反応により結合させてｐＥＴ２２ｂ－ＳｔＧＬＯＤを得た。得られたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９株を形質転換した。得られた形質転換体を培養して抽出したプラスミドの塩基配列は、目的通りの配列となっていることをＤＮＡシーケンス解析により確認した。
１３．ＳｔＧＬＯＤ変異体の作製
　ＳｔＧＬＯＤ発現用プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＳｔＧＬＯＤ）を鋳型として部位特異的変異導入を行い、「６．改変型ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃの作製」と同様の方法で各種改変型ＳｔＧＬＯＤの発現用プラスミドを構築した。作製した変異体名と、Ｆｗプライマー、Ｒｖプライマーの組み合わせは表１６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000018
　続いて、ｐＥＴ２２ｂ－ＳｔＧＬＯＤ、もしくは各種改変型ＳｔＧＬＯＤの発現用プラスミドでＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ＳｔＧＬＯＤおよび各種改変型ＳｔＧＬＯＤの生産株を作製し、「８．Ｍ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７の組換え生産」に従って組換え生産した。ＳｔＧＬＯＤおよび各種改変型ＳｔＧＬＯＤを、５０℃で３０分間加熱し、前述した方法に従って、その残存活性を算出した（表１７）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　各種改変型ＳｔＧＬＯＤの残存活性は、ＳｔＧＬＯＤと比較して、０．０１～０．７６増加しており、改変型ＳｔＧＬＯＤはいずれも熱安定性が向上した。換言すると作製した改変型酵素の残存活性は、改変前のＳｔＧＬＯＤと比較して約６％～約４２２％向上していた。ＳｔＧＬＯＤΔ４９Ｃ、もしくはＭ７ＧＬＯＤΔ４９Ｃ－Ｔ７を対象に見出した、熱安定性を向上させるアミノ酸置換は、それらの親酵素に限定されず、ＳｔＧＬＯＤの熱安定性向上にも寄与することが実証された。したがってこれらのアミノ酸置換を他の由来のＧＬＯＤや、これらと高い配列同一性を有するＧＬＯＤに導入した場合も同様に熱安定性が向上すると考えられる。
　本開示のグルタミン酸オキシダーゼ変異体はプロテアーゼでの処理を必要とすることなく、大規模産生が可能である。また、本開示のグルタミン酸オキシダーゼ変異体はグルタミン酸の酸化反応に利用し得る。
　本明細書においては、特許出願および製造業者のマニュアルを含む種々の文書が引用されている。これらの文書の開示は、本開示の特許性に関連するとはみなされないが、その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。より詳細には、全ての参照文書を、各個の文書が参照により組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。
[配列表]
配列番号１　Streptomyces sp. X-119-6由来グルタミン酸オキシダーゼ (StGLOD)のアミノ酸配列
MNEMTYEQLARELLLVGPAPTNEDLKLRYLDVLIDNGLNPPGPPKRILIVGAGIAGLVAG
DLLTRAGHDVTILEANANRVGGRIKTFHAKKGEPSPFADPAQYAEAGAMRLPSFHPLTLA
LIDKLGLKRRLFFNVDIDPQTGNQDAPVPPVFYKSFKDGKTWTNGAPSPEFKEPDKRNHT
WIRTNREQVRRAQYATDPSSINEGFHLTGCETRLTVSDMVNQALEPVRDYYSVKQDDGTR
VNKPFKEWLAGWADVVRDFDGYSMGRFLREYAEFSDEAVEAIGTIENMTSRLHLAFFHSF
LGRSDIDPRATYWEIEGGSRMLPETLAKDLRDQIVMGQRMVRLEYYDPGRDGHHGELTGP
GGPAVAIQTVPEGEPYAATQTWTGDLAIVTIPFSSLRFVKVTPPFSYKKRRAVIETHYDQ
ATKVLLEFSRRWWEFTEADWKRELDAIAPGLYDYYQQWGEDDAEAALALPQSVRNLPTGL
LGAHPSVDESRIGEEQVEYYRNSELRGGVRPATNAYGGGSTTDNPNRFMYYPSHPVPGTQ
GGVVLAAYSWSDDAARWDSFDDAERYGYALENLQSVHGRRIEVFYTGAGQTQSWLRDPYA
CGEAAVYTPHQMTAFHLDVVRPEGPVYFAGEHVSLKHAWIEGAVETAVRAAIAVNEAPVG
DTGVTAAAGRRGAAAATEPMREEALTS
配列番号２　Streptomyces sp. X-119-6由来グルタミン酸オキシダーゼ (StGLOD)の塩基配列
atgaatgaaatgacctacgagcaattggcccgcgaattgttattggttggtccggccccgacgaacgaggatcttaaattacgctatttggatgtgctgattgataacgggctgaacccgccgggtccgcctaagcgtatcttgatcgtcggggctggtattgcaggccttgttgccggagatttgttgacccgcgctgggcatgatgttactattcttgaagctaatgccaaccgtgtgggagggcgtatcaagacgttccatgcaaaaaaaggagagccatctccattcgctgatccagcgcagtacgcggaagctggggcgatgcgtcttccttcctttcacccacttaccttggcacttatcgacaagctgggcttaaaacgccgcctgttttttaatgtagatattgacccacaaactggaaatcaagatgctccagtcccaccggtcttctataagtcttttaaggacggcaagacgtggacaaatggagccccgagccctgagtttaaagagcccgataaacgtaatcacacctggatccgtacgaatcgcgaacaagtacgccgcgcccaatacgccacagacccgagctccatcaatgaaggcttccatctgacgggatgtgagacccgccttactgtctccgacatggttaaccaagcgcttgaaccggtacgcgactattattcagtcaagcaggacgatggaactcgtgtgaataagcctttcaaagaatggcttgcagggtgggccgacgtcgtgcgtgatttcgacggttattctatgggccgcttcttacgtgaatatgccgagttttcggatgaggcagtggaagcaattggcacaattgaaaacatgacctcgcgcctgcaccttgccttttttcattcgtttttgggccgttccgatatcgatccgcgcgccacttactgggagatcgagggggggtcacgcatgcttcctgaaacactggcaaaggacctgcgcgatcagatcgttatgggtcagcgcatggtacgcttagagtactatgacccgggccgcgatggccatcatggtgagcttactgggcctgggggtccggccgtggccattcagacggttccagagggagagccttacgccgcaactcaaacgtggacaggagacctggcgattgttactatcccctttagctctttacgctttgttaaagtaacgccacccttctcttataaaaagcgccgcgcggtaattgagacccattatgatcaggccaccaaagtcttacttgaatttagccgtcgttggtgggaattcacagaggcggactggaagcgtgagcttgatgctatcgccccgggtctgtacgactattatcaacagtggggtgaagacgacgccgaagcagcgcttgcactgccgcagtcagtccgcaacttgcctaccggcttgcttggggcccacccaagcgtcgacgaatcgcgtatcggagaggagcaagttgagtattatcgtaacagcgaactgcgtggcggagtgcgccctgcgaccaatgcgtacggagggggtagtacgaccgataatcctaatcgtttcatgtactatccctcccaccccgttccaggcacgcaggggggggtcgtacttgcagcatacagttggagcgatgatgcagctcgttgggattcttttgacgatgctgagcgctatggctatgcgcttgaaaacttacagtctgtccacggccgtcgtattgaggtgttctatacaggagcgggacagacccaatcatggctgcgcgatccgtacgcatgcggcgaggcagctgtctatacaccccatcaaatgaccgcgtttcacttagatgtggtgcgtcccgaggggcccgtctattttgcgggtgagcacgtttcattaaaacatgcctggatcgagggggcggtggaaacagccgttcgtgcggcgatcgctgtaaatgaagcccccgtaggtgacactggggtcacagccgctgctgggcgccgtggggcggccgccgctactgagcctatgcgcgaggaggcgttaacttcttaa
配列番号３　StGLOD-f1
atgaatgaaatgacctacgagcaattggcccgcgaattgttattggttggtccggccccgacgaacgaggatcttaaattacgctatttggatgtgctgattgataacgggctgaacccgccgggtccgcctaagcgtatcttgatcgtcggggctggtattgcaggccttgttgccggagatttgttgacccgcgctgggcatgatgttactattcttgaagctaatgccaaccgtgtgggagggcgtatcaagacgttccatgcaaaaaaaggagagccatctccattcgctgatccagcgcagtacgcggaagctggggcgatgcgtcttccttcctttcacccacttaccttggcacttatcgacaagctgggcttaaaacgccgcctgttttttaatgtagatattgacccacaaactggaaatcaagatgctccagtcccaccggtcttctataagtcttttaaggacggcaagacgtggacaaatggagccccgagccctgagtttaaagagcccgataaacgtaatcacacctggatccgtacgaatcgcgaacaagtacgccgcgcccaatacgccacagacccgagctccatcaatgaaggcttccatctgacgggatgtgagacccgccttactgtctccgacatggttaaccaagcgcttgaaccggtacgcgactattattcagtcaagcaggac
配列番号４　StGLOD-f2
tcagtcaagcaggacgatggaactcgtgtgaataagcctttcaaagaatggcttgcagggtgggccgacgtcgtgcgtgatttcgacggttattctatgggccgcttcttacgtgaatatgccgagttttcggatgaggcagtggaagcaattggcacaattgaaaacatgacctcgcgcctgcaccttgccttttttcattcgtttttgggccgttccgatatcgatccgcgcgccacttactgggagatcgagggggggtcacgcatgcttcctgaaacactggcaaaggacctgcgcgatcagatcgttatgggtcagcgcatggtacgcttagagtactatgacccgggccgcgatggccatcatggtgagcttactgggcctgggggtccggccgtggccattcagacggttccagagggagagccttacgccgcaactcaaacgtggacaggagacctggcgattgttactatcccctttagctctttacgctttgttaaagtaacgccacccttctcttataaaaagcgccgcgcggtaattgagacccattatgatcaggccaccaaagtcttacttgaatttagccgtcgttggtgggaattcacagaggcggactggaagcgtgagcttgatgctatcgccccgggtctgtacgactattatcaacagtggggtgaagac
配列番号５　StGLOD-f3
cagtggggtgaagacgacgccgaagcagcgcttgcactgccgcagtcagtccgcaacttgcctaccggcttgcttggggcccacccaagcgtcgacgaatcgcgtatcggagaggagcaagttgagtattatcgtaacagcgaactgcgtggcggagtgcgccctgcgaccaatgcgtacggagggggtagtacgaccgataatcctaatcgtttcatgtactatccctcccaccccgttccaggcacgcaggggggggtcgtacttgcagcatacagttggagcgatgatgcagctcgttgggattcttttgacgatgctgagcgctatggctatgcgcttgaaaacttacagtctgtccacggccgtcgtattgaggtgttctatacaggagcgggacagacccaatcatggctgcgcgatccgtacgcatgcggcgaggcagctgtctatacaccccatcaaatgaccgcgtttcacttagatgtggtgcgtcccgaggggcccgtctattttgcgggtgagcacgtttcattaaaacatgcctggatcgagggggcggtggaaacagccgttcgtgcggcgatcgctgtaaatgaagcccccgtaggtgacactggggtcacagccgctgctgggcgccgtggggcggccgccgctactgagcctatgcgcgaggaggcgttaacttcttaa
配列番号６～１１　プライマー配列
配列番号１２　StGLODΔ49Aiのアミノ酸配列
MNEMTYEQLARELLLVGPAPTNEDLKLRYLDVLIDNGLNPPGPPKRILIVGAGIAGLVAGDLLTRAGHDVTILEANANRVGGRIKTFHAKKGEPSPFADPAQYAEAGAMRLPSFHPLTLALIDKLGLKRRLFFNVDIDPQTGNQDAPVPPVFYKSFKDGKTWTNGAPSPEFKEPDKRNHTWIRTNREQVRRAQYATDPSSINEGFHLTGCETRLTVSDMVNQALEPVRDYYSVKQDDGTRVNKPFKEWLAGWADVVRDFDGYSMGRFLREYAEFSDEAVEAIGTIENMTSRLHLAFFHSFLGRSDIDPRATYWEIEGGSRMLPETLAKDLRDQIVMGQRMVRLEYYDPGRDGHHGELTGPGGPAVAIQTVPEGEPYAATQTWTGDLAIVTIPFSSLRFVKVTPPFSYKKRRAVIETHYDQATKVLLEFSRRWWEFTEADWKRELDAIAPGLYDYYRKLDKTEATNAYGGGSTTDNPNRFMYYPSHPVPGTQGGVVLAAYSWSDDAARWDSFDDAERYGYALENLQSVHGRRIEVFYTGAGQTQSWLRDPYACGEAAVYTPHQMTAFHLDVVRPEGPVYFAGEHVSLKHAWIEGAVETAVRAAIAVNEAPVGDTGVTAAAGRRGAAAATEPMREEALTS
配列番号１３　StGLODΔ49Cのアミノ酸配列
MNEMTYEQLARELLLVGPAPTNEDLKLRYLDVLIDNGLNPPGPPKRILIVGAGIAGLVAGDLLTRAGHDVTILEANANRVGGRIKTFHAKKGEPSPFADPAQYAEAGAMRLPSFHPLTLALIDKLGLKRRLFFNVDIDPQTGNQDAPVPPVFYKSFKDGKTWTNGAPSPEFKEPDKRNHTWIRTNREQVRRAQYATDPSSINEGFHLTGCETRLTVSDMVNQALEPVRDYYSVKQDDGTRVNKPFKEWLAGWADVVRDFDGYSMGRFLREYAEFSDEAVEAIGTIENMTSRLHLAFFHSFLGRSDIDPRATYWEIEGGSRMLPETLAKDLRDQIVMGQRMVRLEYYDPGRDGHHGELTGPGGPAVAIQTVPEGEPYAATQTWTGDLAIVTIPFSSLRFVKVTPPFSYKKRRAVIETHYDQATKVLLEFSRRWWEFTEADWKRELDAIAPGLYDYYQDAAEPPATNAYGGGSTTDNPNRFMYYPSHPVPGTQGGVVLAAYSWSDDAARWDSFDDAERYGYALENLQSVHGRRIEVFYTGAGQTQSWLRDPYACGEAAVYTPHQMTAFHLDVVRPEGPVYFAGEHVSLKHAWIEGAVETAVRAAIAVNEAPVGDTGVTAAAGRRGAAAATEPMREEALTS
配列番号１４～５７　プライマー配列
配列番号５８　Streptomyces sp. MOE7由来推定グルタミン酸オキシダーゼ(M7GLOD)のアミノ酸配列
MDDKTYQQLARELLLVGPEPANEDLKLRYLDVLIDNGLEPPVDRKRILIVGAGIAGLVAGHLLTRAGHDVTILEANANRVGGRIKTFHAKKGEPAPFTDPAQYAEAGAMRLPSFHPLTLALIDKLGLKRRLFFNVDIDPKTGNQGAALPPVVYKSFKDGKTWTYGKPSPEFREPDKRNHTWIRTNRTQVRRAQYVKDPSAINEGFHLTGCESRLTVSDMVNQALEPVRDYYSVLQSDGRRVNKPFKEWLDGWAGVIRDFDGFSMGRFLREYAGFSDEAVEAIGTIENMTSRLHLAFFHSFLGRSDIDPSATYWEIEGGSRQLPEALAKDLRDQIVMGQRMVRLEYYDPGRDGHHGGLAGPSGPAVAIETVPENEPSAEPQTWTADLAIVTVPFSSLRFVAVTPPFSYKKRRAVIETHYDQATKVLLEFSRRWWEFTEEDWKRELDAIAPGLYEYYQRWGEDDAEAALTVPESVRNLPTGLLGAHPSVDEQLIDDEQVEYLRNSTLRGGVRPATQVHGGGSTTDNPNRFMYYPSHAVPGSKGGVVLAAYSWSDDAARWDSFDDAERYGYALENLQSVHGRRIEVFYTGAGQTQSWLRDPYACGEAAVYTPHQMTSFHLDVVRPEGPVYFAGEHVSLKHAWIEGAVETAVRAAIAVNEAPVPYDTAAARAEAPRERAGTASATRTREKAVTS
配列番号５９　欠失型M7GLOD（M7GLODΔ49C）のアミノ酸配列
MDDKTYQQLARELLLVGPEPANEDLKLRYLDVLIDNGLEPPVDRKRILIVGAGIAGLVAGHLLTRAGHDVTILEANANRVGGRIKTFHAKKGEPAPFTDPAQYAEAGAMRLPSFHPLTLALIDKLGLKRRLFFNVDIDPKTGNQGAALPPVVYKSFKDGKTWTYGKPSPEFREPDKRNHTWIRTNRTQVRRAQYVKDPSAINEGFHLTGCESRLTVSDMVNQALEPVRDYYSVLQSDGRRVNKPFKEWLDGWAGVIRDFDGFSMGRFLREYAGFSDEAVEAIGTIENMTSRLHLAFFHSFLGRSDIDPSATYWEIEGGSRQLPEALAKDLRDQIVMGQRMVRLEYYDPGRDGHHGGLAGPSGPAVAIETVPENEPSAEPQTWTADLAIVTVPFSSLRFVAVTPPFSYKKRRAVIETHYDQATKVLLEFSRRWWEFTEEDWKRELDAIAPGLYEYYQDAAEPPATQVHGGGSTTDNPNRFMYYPSHAVPGSKGGVVLAAYSWSDDAARWDSFDDAERYGYALENLQSVHGRRIEVFYTGAGQTQSWLRDPYACGEAAVYTPHQMTSFHLDVVRPEGPVYFAGEHVSLKHAWIEGAVETAVRAAIAVNEAPVPYDTAAARAEAPRERAGTASATRTREKAVTS
配列番号６０　8種類の熱安定性変異を導入したM7GLODΔ49C（M7GLODΔ49C-T8）のアミノ酸配列
MDDKTYQQLARELLLVGPEPANEDLKLRYLDVLIDNGLEPPVDRKRILIVGAGIAGLVAGHLLTRAGHDVTILEANANRVGGRIKTYHAKKGEPAPFTDPAQIAEAGAMRLPSFHPLTLALIDKLGLKRRLFYNVDIDPKTGNQGAALPPVVYKSFKDGKTWTYGKPSPEFREPDKRNHTWIRTNRTQVRRAQYVKDPSAINEGFHLTGCESRLTVSDMVNQALEPVRDYYSVLQSDGRRVNKPFKEWLDGWAGVIRDFDGFSMGRFLREYAGFSDEAVEAIGTIENMTSRLHLAFMHSFLGRSDIDPSATYWEIEGGSRQLPEALAKDLRDQIVMGQRMVRLEYYDPGRDGHHGGLAGPSGPAVAIETVPENEPSAEPQTWTADLAIVTVPLSSLRFVAVTPPFSYKKRRAVIETHYDQATKVLLEYSRRWWEFTEEDWKRELDAIAPGLYEYYQDAAEPPATQVHGGGSTTDNPNRFMYYPSHAVPGSKGGVVLAAYSWSDDAARWDSFDDAERFGYALENLQSVHGRRIEVFLTGAGQTQSWLRDPYACGEAAVYTPHQMTSFHLDVVRPEGPVYFAGEHVSLKHAWIEGAVETAVRAAIAVNEAPVPYDTAAARAEAPRERAGTASATRTREKAVTS
配列番号６１　M7GLODΔ49C-T8の塩基配列
atggacgacaagacctatcagcagttagcacgcgaactgctgcttgtagggcccgagccagcgaatgaagatcttaaattgcgctatttagacgtacttattgataacgggctggagcccccagtcgatcgtaaacgtatcttaattgtgggggcagggatcgccggcctggtcgcgggacatttgttgacacgcgcgggacacgatgtcaccatcctggaggcgaatgcaaatcgcgttggaggtcgcattaagacatatcatgcaaagaaaggcgaaccggcccccttcaccgacccggctcaaattgcagaggcgggagctatgcgtttgccttcattccatcccttaacgttagcgctgattgataaattagggttgaagcgtcgcttgttctataatgttgacattgaccctaagacgggcaatcaaggtgcagcattgccgcctgtcgtttacaagagctttaaggacggtaaaacttggacgtatggtaaaccttctccggaattccgtgaaccagacaaacgtaaccacacttggattcgtaccaatcgcactcaagtacgtcgcgcccagtatgtgaaggacccgagtgcgattaacgaagggttccatttaaccgggtgcgagtcgcgtttgacagtttctgatatggtgaaccaagctttagaaccggttcgtgactactattctgtattgcagagcgacgggcgccgcgtaaataagccatttaaggagtggttagacggctgggccggtgtaatccgcgatttcgacggattctcaatgggacgttttctgcgcgagtacgctgggttttcggacgaggcggtagaagcaatcggtaccatcgagaatatgacaagtcgtttgcatttggcatttatgcacagcttcttaggtcgcagtgacattgaccccagcgcgacatattgggagattgaaggcggtagccgtcagctgcctgaggctctggcaaaagacctgcgtgatcagattgtaatgggccaacgcatggtgcgtttagagtactacgacccaggacgtgatggacaccatggaggtctggcaggaccctctggtcctgcggttgcaatcgaaactgtacccgagaacgagccaagtgcagagccgcagacgtggactgcggacctggcgattgtcactgtaccactttcgtctcttcgctttgttgcggtgactcccccattcagttataaaaaacgtcgtgcagttatcgaaactcactatgatcaggcaacaaaagtgctgttagagtattctcgtcgctggtgggagtttacagaagaggactggaagcgtgagttggacgcgattgcccccggcctgtatgaatactaccaggatgctgcagaaccgccggcaactcaagttcatggaggaggttcaacaactgacaatccaaaccgttttatgtattatccgagtcacgcggtgcctggttctaagggtggtgtggttttggccgcgtatagttggagtgacgatgcagcgcgttgggattcctttgatgacgccgaacgttttggctacgccctggaaaaccttcaatcggtccatggccgccgcatcgaggtctttttaactggagctggacaaactcagtcatggttgcgcgacccctacgcctgcggtgaggccgcagtttacacaccacatcagatgacatcttttcacttagacgtagtgcgcccggaggggccagtatactttgcgggagagcatgtctctcttaagcatgcgtggatcgagggggccgttgaaaccgcggtccgtgctgcgatcgcggttaacgaagcccccgtaccatacgacacagctgctgctcgtgcggaggcccctcgcgaacgtgccggtacagcatcagccactcgcacgcgcgagaaggccgtgacttcctaa
配列番号６２　M7GLODΔ49C-T8-f1
ggagatatacatatggacgacaagacctatcagcagttagcacgcgaactgctgcttgtagggcccgagccagcgaatgaagatcttaaattgcgctatttagacgtacttattgataacgggctggagcccccagtcgatcgtaaacgtatcttaattgtgggggcagggatcgccggcctggtcgcgggacatttgttgacacgcgcgggacacgatgtcaccatcctggaggcgaatgcaaatcgcgttggaggtcgcattaagacatatcatgcaaagaaaggcgaaccggcccccttcaccgacccggctcaaattgcagaggcgggagctatgcgtttgccttcattccatcccttaacgttagcgctgattgataaattagggttgaagcgtcgcttgttctataatgttgacattgaccctaagacgggcaatcaaggtgcagcattgccgcctgtcgtttacaagagctttaaggacggtaaaacttggacgtatggtaaaccttctccggaattccgtgaaccagacaaacgtaaccacacttggattcgtaccaatcgcactcaagtacgtcgcgcccagtatgtgaaggacccgagtgcgattaacgaagggttccatttaaccgggtgcgagtcgcgtttga
配列番号６３　M7GLODΔ49C-T8-f2
gcgagtcgcgtttgacagtttctgatatggtgaaccaagctttagaaccggttcgtgactactattctgtattgcagagcgacgggcgccgcgtaaataagccatttaaggagtggttagacggctgggccggtgtaatccgcgatttcgacggattctcaatgggacgttttctgcgcgagtacgctgggttttcggacgaggcggtagaagcaatcggtaccatcgagaatatgacaagtcgtttgcatttggcatttatgcacagcttcttaggtcgcagtgacattgaccccagcgcgacatattgggagattgaaggcggtagccgtcagctgcctgaggctctggcaaaagacctgcgtgatcagattgtaatgggccaacgcatggtgcgtttagagtactacgacccaggacgtgatggacaccatggaggtctggcaggaccctctggtcctgcggttgcaatcgaaactgtacccgagaacgagccaagtgcagagccgcagacgtggactgcggacctggcgattgtcactgtaccactttcgtctcttcgctttgttgcggtgactcccccattcagttataaaaaacgtcgtgcagttatcgaaactcactatgatcaggcaacaaaagtgctgttagagtattctcgtcgctggtg
配列番号６４　M7GLODΔ49C-T8-f3
ttctcgtcgctggtgggagtttacagaagaggactggaagcgtgagttggacgcgattgcccccggcctgtatgaatactaccaggatgctgcagaaccgccggcaactcaagttcatggaggaggttcaacaactgacaatccaaaccgttttatgtattatccgagtcacgcggtgcctggttctaagggtggtgtggttttggccgcgtatagttggagtgacgatgcagcgcgttgggattcctttgatgacgccgaacgttttggctacgccctggaaaaccttcaatcggtccatggccgccgcatcgaggtctttttaactggagctggacaaactcagtcatggttgcgcgacccctacgcctgcggtgaggccgcagtttacacaccacatcagatgacatcttttcacttagacgtagtgcgcccggaggggccagtatactttgcgggagagcatgtctctcttaagcatgcgtggatcgagggggccgttgaaaccgcggtccgtgctgcgatcgcggttaacgaagcccccgtaccatacgacacagctgctgctcgtgcggaggcccctcgcgaacgtgccggtacagcatcagccactcgcacgcgcgagaaggccgtgacttcctaacaaagcccgaaa
配列番号６５～６８　プライマー配列
配列番号６９　7種類の熱安定性変異を導入したM7GLODΔ49C（M7GLODΔ49C-T7）のアミノ酸配列
MDDKTYQQLARELLLVGPEPANEDLKLRYLDVLIDNGLEPPVDRKRILIVGAGIAGLVAGHLLTRAGHDVTILEANANRVGGRIKTYHAKKGEPAPFTDPAQIAEAGAMRLPSFHPLTLALIDKLGLKRRLFYNVDIDPKTGNQGAALPPVVYKSFKDGKTWTYGKPSPEFREPDKRNHTWIRTNRTQVRRAQYVKDPSAINEGFHLTGCESRLTVSDMVNQALEPVRDYYSVLQSDGRRVNKPFKEWLDGWAGVIRDFDGFSMGRFLREYAGFSDEAVEAIGTIENMTSRLHLAFMHSFLGRSDIDPSATYWEIEGGSRQLPEALAKDLRDQIVMGQRMVRLEYYDPGRDGHHGGLAGPSGPAVAIETVPENEPSAEPQTWTADLAIVTVPLSSLRFVAVTPPFSYKKRRAVIETHYDQATKVLLEYSRRWWEFTEEDWKRELDAIAPGLYEYYQDAAEPPATQVHGGGSTTDNPNRFMYYPSHAVPGSKGGVVLAAYSWSDDAARWDSFDDAERFGYALENLQSVHGRRIEVFYTGAGQTQSWLRDPYACGEAAVYTPHQMTSFHLDVVRPEGPVYFAGEHVSLKHAWIEGAVETAVRAAIAVNEAPVPYDTAAARAEAPRERAGTASATRTREKAVTS
配列番号７０～８４　プライマー配列
配列番号８５　M7GLODの塩基配列
ATGGACGACAAGACCTATCAGCAGTTAGCACGCGAACTGCTGCTTGTAGGGCCCGAGCCAGCGAATGAAGATCTTAAATTGCGCTATTTAGACGTACTTATTGATAACGGGCTGGAGCCCCCAGTCGATCGTAAACGTATCTTAATTGTGGGGGCAGGGATCGCCGGCCTGGTCGCGGGACATTTGTTGACACGCGCGGGACACGATGTCACCATCCTGGAGGCGAATGCAAATCGCGTTGGAGGTCGCATTAAGACATTTCATGCAAAGAAAGGCGAACCGGCCCCCTTCACCGACCCGGCTCAATATGCAGAGGCGGGAGCTATGCGTTTGCCTTCATTCCATCCCTTAACGTTAGCGCTGATTGATAAATTAGGGTTGAAGCGTCGCTTGTTCTTTAATGTTGACATTGACCCTAAGACGGGCAATCAAGGTGCAGCATTGCCGCCTGTCGTTTACAAGAGCTTTAAGGACGGTAAAACTTGGACGTATGGTAAACCTTCTCCGGAATTCCGTGAACCAGACAAACGTAACCACACTTGGATTCGTACCAATCGCACTCAAGTACGTCGCGCCCAGTATGTGAAGGACCCGAGTGCGATTAACGAAGGGTTCCATTTAACCGGGTGCGAGTCGCGTTTGACAGTTTCTGATATGGTGAACCAAGCTTTAGAACCGGTTCGTGACTACTATTCTGTATTGCAGAGCGACGGGCGCCGCGTAAATAAGCCATTTAAGGAGTGGTTAGACGGCTGGGCCGGTGTAATCCGCGATTTCGACGGATTCTCAATGGGACGTTTTCTGCGCGAGTACGCTGGGTTTTCGGACGAGGCGGTAGAAGCAATCGGTACCATCGAGAATATGACAAGTCGTTTGCATTTGGCATTTTTTCACAGCTTCTTAGGTCGCAGTGACATTGACCCCAGCGCGACATATTGGGAGATTGAAGGCGGTAGCCGTCAGCTGCCTGAGGCTCTGGCAAAAGACCTGCGTGATCAGATTGTAATGGGCCAACGCATGGTGCGTTTAGAGTACTACGACCCAGGACGTGATGGACACCATGGAGGTCTGGCAGGACCCTCTGGTCCTGCGGTTGCAATCGAAACTGTACCCGAGAACGAGCCAAGTGCAGAGCCGCAGACGTGGACTGCGGACCTGGCGATTGTCACTGTACCATTTTCGTCTCTTCGCTTTGTTGCGGTGACTCCCCCATTCAGTTATAAAAAACGTCGTGCAGTTATCGAAACTCACTATGATCAGGCAACAAAAGTGCTGTTAGAGTTTTCTCGTCGCTGGTGGGAGTTTACAGAAGAGGACTGGAAGCGTGAGTTGGACGCGATTGCCCCCGGCCTGTATGAATACTACCAGCGTTGGGGCGAGGACGATGCCGAAGCAGCCCTTACGGTACCCGAAAGTGTACGCAATCTTCCAACGGGATTGTTAGGGGCCCATCCTTCCGTTGACGAGCAACTGATTGATGACGAGCAGGTAGAGTATCTGCGTAATTCAACATTGCGTGGAGGCGTACGCCCGGCAACTCAAGTTCATGGAGGAGGTTCAACAACTGACAATCCAAACCGTTTTATGTATTATCCGAGTCACGCGGTGCCTGGTTCTAAGGGTGGTGTGGTTTTGGCCGCGTATAGTTGGAGTGACGATGCAGCGCGTTGGGATTCCTTTGATGACGCCGAACGTTATGGCTACGCCCTGGAAAACCTTCAATCGGTCCATGGCCGCCGCATCGAGGTCTTTTATACTGGAGCTGGACAAACTCAGTCATGGTTGCGCGACCCCTACGCCTGCGGTGAGGCCGCAGTTTACACACCACATCAGATGACATCTTTTCACTTAGACGTAGTGCGCCCGGAGGGGCCAGTATACTTTGCGGGAGAGCATGTCTCTCTTAAGCATGCGTGGATCGAGGGGGCCGTTGAAACCGCGGTCCGTGCTGCGATCGCGGTTAACGAAGCCCCCGTACCATACGACACAGCTGCTGCTCGTGCGGAGGCCCCTCGCGAACGTGCCGGTACAGCATCAGCCACTCGCACGCGCGAGAAGGCCGTGACTTCCTAA
配列番号８６　M7GLODの塩基配列を含むDNA断片
GGAGATATACATATGGACGACAAGACCTATCAGCAGTTAGCACGCGAACTGCTGCTTGTAGGGCCCGAGCCAGCGAATGAAGATCTTAAATTGCGCTATTTAGACGTACTTATTGATAACGGGCTGGAGCCCCCAGTCGATCGTAAACGTATCTTAATTGTGGGGGCAGGGATCGCCGGCCTGGTCGCGGGACATTTGTTGACACGCGCGGGACACGATGTCACCATCCTGGAGGCGAATGCAAATCGCGTTGGAGGTCGCATTAAGACATTTCATGCAAAGAAAGGCGAACCGGCCCCCTTCACCGACCCGGCTCAATATGCAGAGGCGGGAGCTATGCGTTTGCCTTCATTCCATCCCTTAACGTTAGCGCTGATTGATAAATTAGGGTTGAAGCGTCGCTTGTTCTTTAATGTTGACATTGACCCTAAGACGGGCAATCAAGGTGCAGCATTGCCGCCTGTCGTTTACAAGAGCTTTAAGGACGGTAAAACTTGGACGTATGGTAAACCTTCTCCGGAATTCCGTGAACCAGACAAACGTAACCACACTTGGATTCGTACCAATCGCACTCAAGTACGTCGCGCCCAGTATGTGAAGGACCCGAGTGCGATTAACGAAGGGTTCCATTTAACCGGGTGCGAGTCGCGTTTGACAGTTTCTGATATGGTGAACCAAGCTTTAGAACCGGTTCGTGACTACTATTCTGTATTGCAGAGCGACGGGCGCCGCGTAAATAAGCCATTTAAGGAGTGGTTAGACGGCTGGGCCGGTGTAATCCGCGATTTCGACGGATTCTCAATGGGACGTTTTCTGCGCGAGTACGCTGGGTTTTCGGACGAGGCGGTAGAAGCAATCGGTACCATCGAGAATATGACAAGTCGTTTGCATTTGGCATTTTTTCACAGCTTCTTAGGTCGCAGTGACATTGACCCCAGCGCGACATATTGGGAGATTGAAGGCGGTAGCCGTCAGCTGCCTGAGGCTCTGGCAAAAGACCTGCGTGATCAGATTGTAATGGGCCAACGCATGGTGCGTTTAGAGTACTACGACCCAGGACGTGATGGACACCATGGAGGTCTGGCAGGACCCTCTGGTCCTGCGGTTGCAATCGAAACTGTACCCGAGAACGAGCCAAGTGCAGAGCCGCAGACGTGGACTGCGGACCTGGCGATTGTCACTGTACCATTTTCGTCTCTTCGCTTTGTTGCGGTGACTCCCCCATTCAGTTATAAAAAACGTCGTGCAGTTATCGAAACTCACTATGATCAGGCAACAAAAGTGCTGTTAGAGTTTTCTCGTCGCTGGTGGGAGTTTACAGAAGAGGACTGGAAGCGTGAGTTGGACGCGATTGCCCCCGGCCTGTATGAATACTACCAGCGTTGGGGCGAGGACGATGCCGAAGCAGCCCTTACGGTACCCGAAAGTGTACGCAATCTTCCAACGGGATTGTTAGGGGCCCATCCTTCCGTTGACGAGCAACTGATTGATGACGAGCAGGTAGAGTATCTGCGTAATTCAACATTGCGTGGAGGCGTACGCCCGGCAACTCAAGTTCATGGAGGAGGTTCAACAACTGACAATCCAAACCGTTTTATGTATTATCCGAGTCACGCGGTGCCTGGTTCTAAGGGTGGTGTGGTTTTGGCCGCGTATAGTTGGAGTGACGATGCAGCGCGTTGGGATTCCTTTGATGACGCCGAACGTTATGGCTACGCCCTGGAAAACCTTCAATCGGTCCATGGCCGCCGCATCGAGGTCTTTTATACTGGAGCTGGACAAACTCAGTCATGGTTGCGCGACCCCTACGCCTGCGGTGAGGCCGCAGTTTACACACCACATCAGATGACATCTTTTCACTTAGACGTAGTGCGCCCGGAGGGGCCAGTATACTTTGCGGGAGAGCATGTCTCTCTTAAGCATGCGTGGATCGAGGGGGCCGTTGAAACCGCGGTCCGTGCTGCGATCGCGGTTAACGAAGCCCCCGTACCATACGACACAGCTGCTGCTCGTGCGGAGGCCCCTCGCGAACGTGCCGGTACAGCATCAGCCACTCGCACGCGCGAGAAGGCCGTGACTTCCTAACAAAGCCCGAAA
配列番号８７　M7GLOD-T8のアミノ酸配列
MDDKTYQQLARELLLVGPEPANEDLKLRYLDVLIDNGLEPPVDRKRILIVGAGIAGLVAGHLLTRAGHDVTILEANANRVGGRIKTYHAKKGEPAPFTDPAQIAEAGAMRLPSFHPLTLALIDKLGLKRRLFNVDIDPKTGNQGAALPPVVYKSFKDGKTWTYGKPSPEFREPDKRNHTWIRTNRTQVRRAQYVKDPSAINEGFHLTGCESRLTVSDMVNQALEPVRDYYSVLQSDGRRVNKPFKEWLDGWAGVIRDFDGFSMGRFLREYAGFSDEAVEAIGTIENMTSRLHLAFMHSFLGRSDIDPSATYWEIEGGSRQLPEALAKDLRDQIVMGQRMVRLEYYDPGRDGHHGGLAGPSGPAVAIETVPENEPSAEPQTWTADLAIVTVPLSSLRFVAVTPPFSYKKRRAVIETHYDQATKVLLEYSRRWWEFTEEDWKRELDAIAPGLYEYYQRWGEDDAEAALTVPESVRNLPTGLLGAHPSVDEQLIDDEQVEYLRNSTLRGGVRPATQVHGGGSTTDNPNRFMYYPSHAVPGSKGGVVLAAYSWSDDAARWDSFDDAERFGYALENLQSVHGRRIEVFLTGAGQTQSWLRDPYACGEAAVYTPHQMTSFHLDVVRPEGPVYFAGEHVSLKHAWIEGAVETAVRAAIAVNEAPVPYDTAAARAEAPRERAGTASATRTREKAVTS
配列番号８８～１１７　プライマー配列
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (20)

  1. 　欠失領域を有するグルタミン酸オキシダーゼ変異体であって、
    野生型グルタミン酸オキシダーゼのγ鎖領域とβ鎖領域との間に存在するγ－β間領域の全部又は一部を欠失しており、
    野生型グルタミン酸オキシダーゼのγ鎖領域のカルボキシ末端側のアミノ酸を１～１０アミノ酸欠失しており若しくは欠失しておらず、
    野生型グルタミン酸オキシダーゼのβ鎖領域のアミノ末端側のアミノ酸を１～４アミノ酸欠失しており若しくは欠失しておらず、
    欠失領域が１つの連続する欠失領域であり、グルタミン酸オキシダーゼ活性を有する、グルタミン酸オキシダーゼ変異体。
  2. 　３１～５４の連続するアミノ酸を欠失している、請求項１に記載のグルタミン酸オキシダーゼ変異体。
  3. 　欠失領域のC末端が配列番号１の５１０位に対応する位置、５０８位に対応する位置、又は５０７位に対応する位置である、請求項１に記載のグルタミン酸オキシダーゼ変異体。
  4. 　配列番号１の４５９位～５０７位に対応する領域のアミノ酸配列を欠失しており、配列番号１の４５９位～５０７位に対応する領域の全部又は一部を欠失していないグルタミン酸オキシダーゼと比較して、熱安定性が向上している、請求項１に記載の変異体。
  5. 　配列番号１の４５９位～５０７位に対応する領域のアミノ酸配列を欠失しており、配列番号１の４５９位～４６６位に対応する領域までのアミノ酸配列を欠失していないグルタミン酸オキシダーゼと比較して、熱安定性が向上している、請求項４に記載の変異体。
  6. 　熱安定性の向上が、４５℃で３０分若しくは３５分の熱処理、又は、６５℃で３０分の熱処理の熱処理後の残存活性により評価されるものであり、
    　アミノ酸配列を欠失していないグルタミン酸オキシダーゼの４５℃で３０分若しくは３５分の熱処理、又は６５℃で３０分の熱処理後の残存活性を１００％としたときに、変異体の残存活性が１１０％以上である、請求項４に記載の変異体、又は
    アミノ酸配列を欠失していないグルタミン酸オキシダーゼの４５℃で３０分若しくは３５分の熱処理、又は６５℃で３０分の熱処理後の残存活性を１００％としたときに、変異体の残存活性が１１０％以上である、請求項５に記載の変異体。
  7. 　配列番号５８、配列番号５９、配列番号１２又は配列番号１３のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、かつ、アミノ酸配列を欠失しており、グルタミン酸オキシダーゼ活性を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の変異体。
  8. 　さらに、
    配列番号１の８７位に対応する位置、
    配列番号１の１０３位に対応する位置、
    配列番号１の１３３位に対応する位置、
    配列番号１の１８６位に対応する位置、
    配列番号１の２９７位に対応する位置、
    配列番号１の３７６位に対応する位置、
    配列番号１の３９３位に対応する位置、
    配列番号１の４２８位に対応する位置、
    配列番号１の５１６位に対応する位置、
    配列番号１の５６６位に対応する位置、
    配列番号１の５６８位に対応する位置、
    配列番号１の５８５位に対応する位置、及び
    配列番号１の６１５位に対応する位置、
    からなる群より選択される１以上の位置において、配列番号１及び又は配列番号５８のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換を有し、
    　置換前のグルタミン酸オキシダーゼと比較して、アミノ酸置換後の変異体の熱安定性が向上している、請求項１～７のいずれか１項に記載の変異体。
  9. 　配列番号１の８７位に対応する位置へのアミノ酸置換が、チロシンである、
    配列番号１の１０３位に対応する位置へのアミノ酸置換が、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
    配列番号１の１３３位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン及びチロシンからなる群より選択される、
    配列番号１の１８６位に対応する位置へのアミノ酸置換が、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、グルタミン、アスパラギン、アラニン、ロイシン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ヒスチジン及びトレオニンからなる群より選択される、
    配列番号１の２９７位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
    配列番号１の３７６位に対応する位置へのアミノ酸置換が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
    配列番号１の３９３位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
    配列番号１の４２８位に対応する位置へのアミノ酸置換が、チロシン及びメチオニンからなる群より選択される、
    配列番号１の５１６位に対応する位置へのアミノ酸置換が、フェニルアラニンである、
    配列番号１の５６６位に対応する位置へのアミノ酸置換が、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びメチオニンからなる群より選択される、
    配列番号１の５６８位に対応する位置へのアミノ酸置換が、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
    配列番号１の５８５位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、又は
    配列番号１の６１５位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン、バリン、及びフェニルアラニンからなる群より選択される、
    請求項８に記載の変異体。
  10. 　配列番号６９のアミノ酸配列と９０％以上のアミノ酸配列同一性を有し、
    かつ、アミノ酸配列を欠失しており、かつ、
    配列番号１の８７位に対応する位置、
    配列番号１の１０３位に対応する位置、
    配列番号１の１３３位に対応する位置、
    配列番号１の１８６位に対応する位置、
    配列番号１の２９７位に対応する位置、
    配列番号１の３７６位に対応する位置、
    配列番号１の３９３位に対応する位置、
    配列番号１の４２８位に対応する位置、
    配列番号１の５１６位に対応する位置、
    配列番号１の５６６位に対応する位置、
    配列番号１の５６８位に対応する位置、
    配列番号１の５８５位に対応する位置、及び
    配列番号１の６１５位に対応する位置、
    からなる群より選択される１以上の位置において、配列番号５８のアミノ酸配列と比較してアミノ酸置換を有し、該アミノ酸置換が請求項９に記載のアミノ酸置換のいずれかであり、グルタミン酸オキシダーゼ活性を有する、請求項９に記載の変異体。
  11. 　さらに、配列番号１の６７０位～６８７位に対応する領域のアミノ酸配列を欠失している、請求項１～１０のいずれか１項に記載のグルタミン酸オキシダーゼ変異体。
  12. 　請求項１～１０のいずれか１項に記載のグルタミン酸オキシダーゼ変異体を含む組成物、試薬、電極、センサ又はキット。
  13. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載のグルタミン酸オキシダーゼ変異体をコードするポリヌクレオチド。
  14. 　請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
  15. 　請求項１４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
  16. 　請求項１５に記載の宿主細胞を培養し請求項１～１１のいずれか１項に記載のグルタミン酸オキシダーゼ変異体を産生する工程、及び、
    　産生されたグルタミン酸オキシダーゼ変異体を取得する工程、
    を含む、グルタミン酸オキシダーゼ変異体の製造方法。
  17. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載のグルタミン酸オキシダーゼ変異体、又は請求項１２に記載の組成物、試薬、電極、センサ又はキットと、グルタミン酸を含む試料とを接触させ、該試料に含まれるグルタミン酸を酸化させる方法。
  18. 　グルタミン酸を検出する、請求項１７に記載の方法。
  19. 　アミノ酸置換を含むグルタミン酸オキシダーゼ変異体であって、置換前のグルタミン酸オキシダーゼと比較して、アミノ酸置換後のグルタミン酸オキシダーゼ変異体の熱安定性が向上しており、
    (i)　配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１の８７位、１０３位、１３３位、１８６位、２９７位、３７６位、３９３位、４２８位、５１６位、５６６位、５６８位、５８５位、及び６１５位からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸が置換されている、
    (ii)　前記(i)において、配列番号１の８７位、１０３位、１３３位、１８６位、２９７位、３７６位、３９３位、４２８位、５１６位、５６６位、５６８位、５８５位、及び６１５位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されているアミノ酸配列からなる、
    (iii)　前記(i)若しくは(ii)において、当該グルタミン酸オキシダーゼ変異体の全長アミノ酸配列が配列番号１または配列番号５８のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、又は９０％以上のアミノ酸配列同一性を有する、或いは、
    (iv)　前記(i)、又は(ii)において、当該グルタミン酸オキシダーゼ変異体の全長アミノ酸配列が配列番号１又は配列番号５８のアミノ酸配列と７０％以上、８０％以上、又は９０％以上のアミノの配列同一性を有し、当該グルタミン酸オキシダーゼ変異体における、配列番号１の２９１位に対応する位置のアミノ酸がアルギニンであり、配列番号１の５１～５６位に対応する位置のアミノ酸配列がＧｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｇｌｙ（ここでＸａａは任意のアミノ酸を示す）である、
    からなる群より選択される、グルタミン酸オキシダーゼ変異体。
  20. 　配列番号１の８７位に対応する位置へのアミノ酸置換が、チロシンである、
    配列番号１の１０３位に対応する位置へのアミノ酸置換が、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
    配列番号１の１３３位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン及びチロシンからなる群より選択される、
    配列番号１の１８６位に対応する位置へのアミノ酸置換が、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アスパラギン、グルタミン、アラニン、ロイシン、システイン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、ヒスチジン 及びトレオニン及びトレオニンからなる群より選択される、
    配列番号１の２９７位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
    配列番号１の３７６位に対応する位置へのアミノ酸置換が、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
    配列番号１の３９３位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン、バリン、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
    配列番号１の４２８位に対応する位置へのアミノ酸置換が、チロシン及びメチオニンからなる群より選択される、
    配列番号１の５１６位に対応する位置へのアミノ酸置換が、フェニルアラニンである、
    配列番号１の５６６位に対応する位置へのアミノ酸置換が、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びメチオニンからなる群より選択される、
    配列番号１の５６８位に対応する位置へのアミノ酸置換が、イソロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、
    配列番号１の５８５位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン及びメチオニンからなる群より選択される、又は
    配列番号１の６１５位に対応する位置へのアミノ酸置換が、ロイシン、バリン、及びフェニルアラニンからなる群より選択される、
    請求項１９に記載のグルタミン酸オキシダーゼ変異体。
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