CN102994467A - L-谷氨酸氧化酶及该酶催化生产α-酮戊二酸 - Google Patents

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牛盼清
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Abstract

本发明阐述了一种具有底物特异性的L-谷氨酸氧化酶以及该酶催化生产α-酮戊二酸，属于酶法催化生产精细化学品领域。本发明是利用一种只对L-谷氨酸、L-谷氨酸钠及谷氨酰胺具有底物专一性的L-谷氨酸氧化酶，在发酵60h的含L-谷氨酸氧化酶的发酵液中，添加20g/L的L-谷氨酸钠溶液，在通气条件下，30℃，pH8.5，添加5％(v/v)异丙醇条件下转化12h，通过高效液相色谱法测得α-酮戊二酸含量达到14.5g/L。

Description

L-谷氨酸氧化酶及该酶催化生产α-酮戊二酸
技术领域
本发明涉及微生物酶法一步转化L-谷氨酸生成α-酮戊二酸生产方法，属于催化法生产精细化学品领域。
背景技术
α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)，又称α-胶酮酸，2-氧代戊二酸或α-羰基戊二酸，分子式为C5H6O5，相对分子量为146.1，α-KG为白色或类白色结晶或结晶性粉末，无色，易溶于水，在微生物细胞的代谢中起着重要的作用，是三羧酸循环(TCA)的重要中间产物之一，在生物体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成以及能量代谢。α-KG在各个领域有着重要的应用前景，作为一种营养强化剂，广泛应用于食品、医药、有机合成、化妆品和饲料等工业中。
微生物催化是通过微生物整体细胞或酶将复杂的底物进行结构修饰，本质就是利用生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶将一种物质(底物)转化成另一种物质(产物)的过程。微生物催化法有以下优势：(1)环境友好型。由于酶催化反应条件比较温和，通常在常温、常压、pH值近中性的条件下进行，可减少或避免强酸、强碱或有毒物质的使用，从而减轻对环境的污染。(2)转化率高。通过对用于某一转化的微生物进行菌种选育和转化条件的优化，可以得到极高的转化率。(3)微生物生物量积累快，产生的酶量也相应多，转化时间短，能够提高生产效率。(4)集团专一性强，不需要对集团进行保护，所形成的副产物少，手性和旋光性好。
L-谷氨酸氧化酶首先由Hitoshi Kusakabe等人在链霉菌x-119-6中发现，该酶在反应过程中不需要外来因素，它是一种胞外酶，可以氧化L-谷氨酸生产α-KG，研究还表明，该酶具有很高的底物专一性，氧化1moL L-谷氨酸需要1moL O2和1moL和H2O，生成1moLα-KG、1moL NH3和1moL H2O2。1989年，Annette Buhmer等内涂链霉菌以可溶性淀粉、甘油、酵母提取物、无机盐等为培养基，发酵后用硫酸铵沉淀，葡聚糖凝胶等方法，将酶提纯。之后，台湾的Chen chien-yuan等人用普拉特链霉菌NTU3304也成功地提纯了L-谷氨酸氧化酶，并应用于传感器中。1993年，华东化工学院生化工程研究所的徐水清和李友荣，用链霉菌p-26，经L-谷氨酸诱导培养能形成胞外L-谷氨酸氧化酶，其粗酶液活力大约为0.2U/mL。
随着α-KG应用范围不断扩大，市场需求也在不断增长。目前工业化生产采用的是有机合成法，涉及一系列复杂的化学反应过程，从而引起原料来源、环境污染等方面一系列问题。目前国内外利用生物催化法生产α-KG还未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用生物酶工程技术制备α-酮戊二酸的方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种生物酶催化生产α-酮戊二酸的方法，将一定浓度的谷氨酸钠水溶液加入含有L-谷氨酸氧化酶的发酵液中，并在通空气条件下30℃反应12h，经分离得到α-酮戊二酸。
本发明的反应方程式如下：
Figure BSA00000828373100021
由上述技术方案可知，本发明采用的是生物酶工程技术，利用L-谷氨酸钠一步催化生成α-酮戊二酸，所用原料为廉价的L-谷氨酸钠，俗称味精。由此可见，本发明生产工艺简单，生产成本低，且生产过程中没有环境污染。
本发明的技术方案：
本发明涉及了一种生物酶法催化L-谷氨酸钠生产α-酮戊二酸的方法，在添加20g/L的L-谷氨酸钠的条件下转化12h生成14.5g/L的α-酮戊二酸，转化率达到0.84mol/mol。
1、L-谷氨酸氧化酶的酶学性质：
由本发明的方程式可知，本反应所需的L-谷氨酸氧化酶，该酶由链霉菌(Streptomycesghanaensis FMME067)生产，一般发酵48～72h，一般情况下发酵60h可用于本发明。该酶具有底物专一性，可专一性的转化L-谷氨酸、L-谷氨酸钠和谷氨酰胺；该酶在80℃下存放1h会完全失去转化能力，28℃下存放3d，酶转化能力在90％以上，含酶的发酵液在4℃下存放10d，酶的转化能力在90％以上；Km值为0.11mol/L。
2、L-谷氨酸钠转化生产α-酮戊二酸的工艺：
本发明利用含有L-谷氨酸氧化酶的发酵液生产α-酮戊二酸，底物可为L-谷氨酸和L-谷氨酸钠，由于L-谷氨酸在水溶液中溶解度低，价格比L-谷氨酸钠昂贵，作为本发明的优选方案，以L-谷氨酸钠作为转化底物，食品级含量≥99％，这种情况下，可以减少后续操作难度。
L-谷氨酸钠底物浓度可控制在10～30g/L，为提高底物的转化率、节约原料底物L-谷氨酸钠以及后期分离提取的成本，作为本发明的优选方案，L-谷氨酸钠添加量为20g/L，这样既不会影响转化率，也不会浪费底物。
含有L-谷氨酸氧化酶的发酵液转化pH控制在7.5～9.5。作为本发明的优选方案，pH控制在8.5，这样pH8.5既接近于发酵液pH，又可以保证较高的转化率。
底物L-谷氨酸钠溶液和发酵液混合后在通气条件下28～37℃时反应12h，既可以停止转化分离提取α-酮戊二酸，作为本发明的优选方案，反应温度为30℃，L-谷氨酸氧化酶在该温度下保持最高的转化活力，转化率最高。
L-谷氨酸氧化酶主要存在于胞内，发酵液中也有少量一部分，为充分利用该酶，提高转化能力，可以改变细胞膜通透性，方法有酶法，冻融及研磨法，化学法；由于酶法成本较高；物理法虽然效果价高，无毒无害，但是放大以及工业化中有一定的难度；化学法中常用甲苯、乙醇、异丙醇，其中以异丙醇效果最好，并且沸点较低，有利于后期操作，作为本发明的优选方案，添加5％异丙醇(v/v)。
α-酮戊二酸含量测定方法采用高效液相色谱法，HPLC条件：Thermo UltiMate 3000system、Aminex HPX-87H色谱柱、流动相：5mmol/L稀硫酸、流速：0.6mL/min；柱温：35℃：进样量：20μL；紫外检测器，波长210nm。
附图说明
图1色谱检测结果，0.5g/Lα-酮戊二酸标准样品。
图2色谱检测结果，转化12h发酵液中α-酮戊二酸含量。
图3Km值测定结果。
具体实施方式：
1、L-谷氨酸氧化酶底物特异性实验：
根据Trinder反应，用pH7.0的磷酸盐缓冲液配制浓度11mg/mL的L型氨基酸溶液进行显色反应测定，30℃准确反应30min后，100℃下煮沸5min，在550nm下进行测定。
Figure BSA00000828373100031
2、不同pH对L-谷氨酸氧化酶催化转化的影响：
将含有L-谷氨酸氧化酶的发酵液调制不同的pH范围梯度5.5～10.5，添加20g/L的L-谷氨酸钠溶液，转化12h，测定发酵液中α-酮戊二酸的含量。作为本发明的优选方案，选择8.5作为转化pH，此时转化率最高，与发酵液pH最接近。
Figure BSA00000828373100032
Figure BSA00000828373100041
3、在250mL的三角摇瓶中装40mL的含酶发酵液，添加20g/L的谷氨酸钠溶液，摇床转速200r/min，30℃转化12h，结果测得α-酮戊二酸的含量为10.3g/L，添加10g/L的谷氨酸钠溶液，转化12h测得α-酮戊二酸的含量为6.3g/L。添加30g/L的谷氨酸钠溶液转化12h，测得α-酮戊二酸的含量为12.9g/L。
4、改变细胞膜透性对转化的影响。
通过物理法，化学法等方法来改变细胞膜透性，结果发现添加5％(v/v)甲苯、异丙醇效果最好，在添加20g/L的L-谷氨酸钠、30℃下转化12h，α-酮戊二酸含量最高达到了14.5g/L。

Claims (5)

1.L-谷氨酸氧化酶，该酶由链霉菌生产，一般发酵48～72h，该酶具有底物专一性，在室温下可存放2～4d，4℃下可存放7～10d，该酶转化能力保持在90％以上。
2.酶法转化生产α-酮戊二酸工艺，将L-谷氨酸钠添加到含有L-谷氨酸氧化酶的发酵液进行转化，pH可控制在7.5～9.5。
3.根据权利要求2所述，转化过程中，L-谷氨酸钠底物浓度可控制在10～30g/L。
4.根据权利要求2、3所述，以L-谷氨酸钠作为底物，添加到含酶发酵液中进行转化，转化温度可控制在28～37℃，转化12～16h。
5.根据权利要求2、3、4所述，为提高转化能力，可以改变细胞膜通透性，方法有酶法，冻融及研磨法，化学法；由于酶法成本较高；物理法虽然效果价高，无毒无害，但是放大以及工业化中有一定的难度；化学法中常用甲苯、乙醇、异丙醇，并且沸点较低，有利于后期操作。
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