CN101948878B - 一种氧化葡萄糖酸杆菌在制备1,3-二羟基丙酮中的应用 - Google Patents
一种氧化葡萄糖酸杆菌在制备1,3-二羟基丙酮中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌在制备1，3-二羟基丙酮中的应用，所述的氧化葡萄糖酸杆菌其分类命名为氧化葡糖杆菌NH-10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册的编号是CGMCC No.2709，保藏日期是2008年10月14日。本发明发现氧化葡糖杆菌NH-10能够在高浓度的甘油浓度条件下高效的转化甘油产1，3-二羟基丙酮，在本发明工艺条件下，甘油的转化率最高可达到99.7％(w/w)，1，3-二羟基丙酮的得率最高可达97％，转化液中1，3-二羟基丙酮浓度可达166.2g/L，转化液中几乎不含其它的成分。本发明中的微生物菌株适用于二羟基丙酮的工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程和酶工程技术领域，涉及一种产甘油脱氢酶的微生物氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)，以及将它用于生产二羟基丙酮的方法
背景技术
1，3-二羟基丙酮，或二羟基丙酮(1，3-dihydroxyaeetone或dihydroxyacetone，简写为DHA)是最简单的三碳酮糖，是一种带有甜味的白色粉末状结晶，易溶于水、乙醇、丙酮等溶剂，其分子中含有两个羟基和一个酮基，化学性质活泼，是重要的医药、化学合成中间体及原料，在精细化工、食品工业和化妆品工业等多种行业发挥着重要的作用。
生产DHA的方法有化学法和生物法两种，相比化学合成法高耗能，高污染，生物法则是一种比较低碳，环保的制备方法，因此研究的比较多的是生物法制备二羟基丙酮。其原理就是利用微生物代谢产生的甘油脱氢酶或二羟基丙酮合成酶的作用将甘油转化为二羟基丙酮。其中用于生产二羟基丙酮的微生物有醋酸杆菌属(Acetobacter)(US4976589)，葡萄糖酸杆菌属(Gluconobacter)(US 5770411)，根霉属(Rhizopus)(US4576913)，单孢丝菌属(Micromonospora)(JP 62210994)，芽孢杆菌属(Bacillus)(JP2286089)等。其中氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans，G.oxydans)研究的比较多，是工业发酵生产DHA的重要菌种。
G.oxydans是专性好氧的微生物，在催化甘油生成DHA的反应时以氧气为电子受体，因此氧气供应成为影响G.oxydans转化甘油生产DHA的关键问题，除此之外底物甘油和产物DHA均会抑制菌体的生长和DHA的生产。为了解决这些问题研究人员通过改变生产DHA的生产方式，改进发酵设备等方法，如Hekmat(Bioprocess Biosyt Eng，2003，26：109-116)等通过改进发酵设备，将传统的补料分批发酵发展为重复补料分批发酵，最终使得DHA的产率提高75％。而Bauer(Bioprocess Biosyt Eng，2005，5：37-43)等通过进一步改良发酵设备，采用半连续双阶重复补料分批发酵法来解除底物和DHA的抑制作用，从而使得DHA的浓度最高可达220g/L，两阶段的转化率分分别为85％和83％。通过选择比较好的生产方式可以得到比较高产的DHA，这些方法应用到良好的菌种会使得DHA的产量更加高，华东理工大学(CN 101092604A)利用基因工程技术在G.oxydans中克隆表达了透明颤菌血红蛋白基因来提高细胞的摄氧率从而提高DHA的生长效率，但与原始菌相比，基因工程菌的稳定性较差，不适合于工业化生产。冯屏(食品与发酵工业，2005，31(6)：22-26)等人利用醋酸杆菌静止细胞转化甘油生产DHA，甘油起始浓度为60g/L时，转化12批，9批期稳定，平均转化率为91％，当甘油起始浓度增加为100g/L时，菌体稳定性下降，只能维持5批次。郑裕国(CN 101591681A)等人利用外循环气升式反应器转化甘油产DHA，采用流加甘油至总浓度为300g/L，最终得到200.4g/L的DHA，平均转化率为67％。
以上的方法中生产菌的转化率都较低，且不能耐受高浓度甘油，从而要采用其它的生产方式来提高产量，增加了工艺的难度和成本，不利于工业化生产。
申请人于2009年2月20日申请了专利“一种氧化葡糖杆菌及利用其制备木酮糖的方法”(申请号200910024579.4)，并公开了一株氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)NH-10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：中国.北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。登记入册的编号是CGMCC No.2709，保藏日期是2008年10月14日。申请人发现上述菌株能够高效转化D-阿拉伯糖醇生成D-木酮糖。通过一个偶然的实验，申请人发现上述菌株能高产甘油脱氢酶，其可耐高浓度甘油并可高效率转化甘油制备1，3-二羟基丙酮，并完成了本发明。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种氧化葡萄糖酸杆菌在制备1，3-二羟基丙酮中的新应用，该菌株为CGMCC No.2709。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种氧化葡萄糖酸杆菌在制备1，3-二羟基丙酮中的应用，所述的氧化葡萄糖酸杆菌其分类命名为氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)NH-10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册的编号是CGMCC No.2709，保藏日期是2008年10月14日。
上述应用是将菌株CGMCC No.2709接种于含碳源、氮源、甘油、无机盐和水的无菌培养基中进行培养产酶，离心或超滤获得含甘油脱氢酶的CGMCC No.2709细胞，进而利用游离的或经固定化的含甘油脱氢酶的CGMCC No.2709细胞转化甘油生成1，3-二羟基丙酮。
具体来说上述方法包括产酶和转化两个阶段。
产酶阶段：
将氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC No.2709斜面活化一天后(斜面培养基成分除含有碳源、氮源等之外，还含有20g/L的琼脂)，接种于含碳源、氮源、甘油、无机盐和水的无菌培养基中。碳源用量为10～100g/L，氮源用量为1～10g/L，甘油用量为40～200g/L，无机盐用量为0.1～10g/L，其余为水。培养基中的碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、山梨糖醇和淀粉水解液中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4和NH4Cl中的一种或多种；无机盐为钠盐、镁盐、钙盐、磷酸盐和磷酸二氢盐中的一种或多种。培养基的初始pH范围为4.0～8.0，发酵温度25～35℃，摇床转速100～250r/min，培养24～60h，细胞湿重达20g/L，发酵液酶活达5.2～10.3U/mL，然后离心或超滤获得含甘油脱氢酶的细胞，离心条件：室温条件下，7000～12000r/min，10～30min。采用超滤法时，所用超滤膜孔径0.01～0.1μm，操作压力0.1～0.6MPa，超滤膜截流分子量为105～106道尔顿。
甘油脱氢酶酶活测定方法：
发酵液在8000r/min下离心10min收集细胞，用pH 7.0的100mM的磷酸钾缓冲液洗涤3次每次洗涤之后在8000r/min，4℃离心10min。
超声破碎：将洗涤后的菌体悬浮在缓冲液中，超声破碎10min，工作强度为40％，工作4min冰浴6min，随后在4℃下10000r/min离心15min，除去细胞碎片，所得上清液即为粗酶液。
反应体系：50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0)，0.25mM DCIP(2，6-dichlorophenolindophenol，二氯酚靛酚)，0.2M甘油，0.325mM PMS(phenazine methosulphate，硫酸甲酯吩嗪)。30℃在600nm处测定吸光度的改变。在pH6.0的溶液中，DCIP的消光系数为10.8mM-1。
酶活定义：
一个酶活单位定义为：在30℃、pH6.0条件下，一分钟内还原1μM DICP所用的酶量。
酶法转化阶段：
将游离的含甘油脱氢酶的CGMCC No.2709细胞用40～200g/L的甘油溶液悬浮，于试管或三角瓶中转化，转化时温度为25～35℃，转化时间16～60h，转速为150～250r/min。或者将CGMCC No.2709细胞装入到含有1.5～2.5L的40～200g/L的甘油溶液的发酵罐中进行转化，发酵罐的通风量为0.4～1.0vvm，搅拌转速为200～800r/min，温度为25～35℃，流加甘油维持发酵罐内甘油浓度为10～15g/L，甘油总流加量至200～300g/L(以流加结束时发酵液体积计)时结束流加，总转化时间为16～60h。
或者将固定化的含甘油脱氢酶的CGMCC No.2709细胞装入鼓泡填充床式柱反应器中，该反应器以0.5～5mL/min的流速单向流加或循环连续流加30～100g/L的甘油溶液，进行酶转化反应，反应温度25～35℃，每批转化时间12～24h。通过调整流速，控制甘油的转化率在90～100％之间，收集流出液，浓缩结晶得到DHA。
含甘油脱氢酶的细胞进行固定化的方法为：配制1～3％(即10～30g/L)浓度的海藻酸钠，加入10～25％的细胞(即每100mL海藻酸钠溶液中加入10～25克的细胞)，并添加5～10％硅藻土(即每升海藻酸钠溶液中加入50～100克的硅藻土)，再用浓度为1～4％的CaCl2溶液(10～40g/L)将包埋材料海藻酸钠固定成型，以此作为酶源进行反应。除了海藻酸钠作为固定化载体包埋外，还可以用卡拉胶、甲壳素等载体包埋细胞。
DHA的分析方法采用二苯胺显色法和高效液相色谱法进行。
二苯胺显色法：试剂包括二苯胺0.6g，冰醋酸54ml，98％的浓硫酸6ml，将样品用去离子水稀释到适当的浓度，取0.5ml的稀释液置于20ml具塞试管内，加入4.5ml的二苯胺试剂，加塞密封后于沸水浴煮15～30min，迅速用冷水冷却，以同样处理的去离子水对照，分光光度计中于615nm波长下比色，通过DHA与A615的标准曲线计算DHA的含量。
高效液相色谱法：将发酵液离心(8000rpm，10min)，上清液经0.22μm针式滤膜过滤后进样。色谱柱：Aminex HPX-87H，流动相：0.04mol/L H2SO4溶液，流速：0.6mL/min，柱温：60℃。检测器为紫外，波长215nm，利用DHA与峰面积的标准曲线计算DHA的含量。
本发明的有益效果：
本发明中的微生物菌株氧化葡萄糖酸杆菌NH-10(CGMCC No.2709)能在比较高浓度的甘油条件下将甘油转化为DHA，而且对甘油进行脱氢反应能力较强；利用氧化葡萄糖酸杆菌NH-10生产DHA，在起始甘油浓度为120～200g/L的条件下，甘油转化率最高可达99.7％，DHA得率可达95％，转化液中DHA浓度可达166.2g/L，转化液中几乎不含其它成分，利于DHA的分离纯化，因此，氧化葡萄糖酸杆菌NH-10(CGMCCNo.2709)适用于DHA的工业化生产。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
斜面培养基：葡萄糖30g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏3g/L，琼脂20g/L。
发酵培养基(同摇瓶培养基)：山梨糖醇10g/L，甘油40g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏3g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCO30.5g/L，起始pH为5.0，121℃灭菌15min。
将氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC No.2709在斜面培养基30℃培养24h，后用接种环从斜面上接一环菌与摇瓶培养基中，30℃培养24h，摇瓶转速为200r/min，离心收集发酵液中的菌体，以游离细胞转化，称取1.5g离心后的湿细胞加入10mL 100g/L的甘油溶液中(细胞的添加量按每150g细胞转化1L 100g/L的甘油溶液计)，在30℃条件下，于200r/min的摇床上转化24h，反应结束后测定底物转化率和产物的浓度。甘油的转化率为99.5％，DHA的产率为96.9g/L。
实施例2：
培养基成分同实施例1。将氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC No.2709在斜面培养基30℃培养24h，后用接种环从斜面上接一环菌与摇瓶培养基中，28℃培养30h，摇瓶转速为120r/min，离心收集发酵液中的菌体，pH7.0磷酸钾缓冲液洗涤两遍，称取1.5g离心后的湿细胞加入10mL 160g/L的甘油溶液中(细胞的添加量按每150g细胞转化1L 160g/L的甘油溶液计)，在28℃条件下，于120r/min中摇床中转化生产DHA，转化48h，反应结束后测定底物的转化率和产物的浓度。甘油的转化率为97％，DHA浓度为154g/L。实施例3：
培养基成分同实施例1。将氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC No.2709在斜面培养基30℃培养24h，后用接种环从斜面上接一环菌与摇瓶培养基中，32℃培养40h，摇瓶转速为220r/min，离心收集发酵液中的菌体，pH7.0磷酸钾缓冲液洗涤两遍，称取1.5g离心后的湿细胞加入10mL 200g/L的甘油溶液中(细胞的添加量按每150g细胞转化1L 200g/L的甘油溶液计)，在30℃条件下，于200r/min中摇床中转化生产DHA，转化60h，反应结束后测定底物的转化率和产物的浓度。甘油的转化率为90％，DHA产率为166.2g/L。
实施例4：
斜面培养基同实施例1。
发酵培养基：葡萄糖10g/L，甘油40g/L，酵母膏2.5g/L，(NH4)2SO42.0g/L，K2HPO40.1g/L，KH2PO40.9g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，CaCl21.5g/L，pH8.0。
将氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC No.2709在斜面培养基30℃培养24h，后用接种环从斜面上接一环菌与摇瓶培养基中，30℃培养24h，摇瓶转速为200r/min，离心收集发酵液中的菌体，pH7.0磷酸钾缓冲液洗涤两遍，称取7.5g离心后的湿细胞加入50mL100g/L的甘油溶液中，30℃条件下，200r/min中摇床进行重复批次转化生产DHA，即每转化24h后，离心收集菌体和发酵液，再次用50mL 100g/L的甘油溶液悬浮，如此重复10批次，收集10次发酵液混合，测定底物的转化率和产物的浓度。甘油的平均转化率96％，DHA平均得率为92％，DHA总产量为46g，具体数据见表1。
表1利用氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC No.2709重复批次转化甘油产DHA
实施例5：
斜面培养基同实施例1。
发酵培养基：蔗糖50g/L、玉米浆5.0g/L，蛋白胨5.0g/L，K2HPO42.0g/L，(NH4)2HPO41.0g/L，MgSO40.125g/L，甘油40g/L，pH7.0。
将氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC No.2709在斜面培养基30℃培养24h，后用接种环从斜面上接一环菌到装有100mL的500mL的摇瓶中，接种2瓶30℃培养24h，摇瓶转速为200r/min，培养24h后接种到装有5L的7.5L的发酵罐中培养24h，离心收集菌体，菌体用pH7.0磷酸钾缓冲液洗涤两遍，称取225g湿细胞用1.5L浓度为60g/L的甘油溶液悬浮于3L的发酵中，通风量1.0vvm，搅拌转速600r/min，流加甘油维持发酵罐内甘油浓度为10-15g/L，流加甘油总量至300g/L时停止流加(流加结束时发酵液总体积2L)，转化60h，检测发酵液中甘油的转化率和产物浓度。甘油的转化率为97％，DHA的产量为564g，得率94％。
实施例6：
斜面培养基同实施例1。
发酵培养基：果糖80g/L，甘油100g/L，酵母膏5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCO30.5g/L，起始pH5.0，121℃灭菌15min。
将氧化葡萄糖酸杆菌CGMCC No.2709在斜面培养基30℃培养24h，后用接种环从斜面上接一环菌到装有100mL的500mL的摇瓶中，接种2瓶30℃培养24h，摇瓶转速为200r/min，培养24h后接种到装有5L的7.5L的发酵罐中培养24h，离心收集菌体，菌体用pH7.0磷酸钾缓冲液洗涤两遍。称取100g湿菌体，加无菌水100mL，于30℃水浴保温；称取10g卡拉胶，加无菌水200mL，充分浸泡，加热溶解。将两者迅速混合，铺平板，于4℃冰箱放置30min，凝固后切成2×2×2cm左右大小的颗粒，再于2mol/L KCl溶液中浸泡30min，使其充分凝固。滤出颗粒用生理盐水洗涤2-3次，4℃保存备用。所得菌体形成固定化细胞300g，装入
4×45cm的鼓泡填充床式柱反应器中，该反应器以1mL/min的流速单向流加100g/L的甘油溶液，通风量1vvm，30℃下进行酶转化，24h为一个批次。转化30d，转化100g/L的甘油溶液30L，得到甘油平均转化率为95％，DHA产量为2700g，得率为90％。
Claims (8)
1.一种氧化葡萄糖酸杆菌在制备1，3-二羟基丙酮中的应用，所述的氧化葡萄糖酸杆菌其分类命名为氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)NH-10，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册的编号是CGMCC No.2709，保藏日期是2008年10月14日。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将菌株CGMCC No.2709接种于含碳源、氮源、甘油、无机盐和水的无菌培养基中进行培养，离心或超滤获得含甘油脱氢酶的CGMCC No.2709细胞，进而利用游离的或经固定化的含甘油脱氢酶的CGMCCNo.2709细胞转化甘油生成1，3-二羟基丙酮。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述培养基中，各组分用量为：碳源用量为10～100g/L，氮源用量1～10g/L，甘油用量40～200g/L，无机盐用量为0.1～10g/L，其余为水。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述培养基中，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、山梨糖醇和淀粉水解液中的一种或多种，所述氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4和NH4Cl中的一种或多种，所述无机盐为钠盐、镁盐、钙盐、磷酸盐和磷酸二氢盐中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于将菌株CGMCC No.2709进行培养的条件是：培养基的初始pH范围为4.0～8.0，发酵温度25～35℃，摇床转速100～250r/min，培养24～60h。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于利用游离的含甘油脱氢酶的CGMCCNo.2709细胞转化甘油生成1，3-二羟基丙酮是将CGMCC No.2709细胞用40～200g/L的甘油溶液悬浮，于试管或三角瓶中转化，转化时温度为25～35℃，转化时间16～60h，转速为150～250r/min；或者将CGMCC No.2709细胞装入到含有1.5～2.5L的40～200g/L的甘油溶液的发酵罐中进行转化，发酵罐的通风量为0.4～1.0vvm，搅拌转速为200～800r/min，温度为25～35℃，流加甘油维持发酵罐内甘油浓度为10～15g/L，甘油总流加量至200～300g/L时结束流加，总转化时间为16～60h。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于利用经固定化的含甘油脱氢酶的CGMCC No.2709细胞转化甘油生成1，3-二羟基丙酮是将固定化的含甘油脱氢酶的CGMCC No.2709细胞装入鼓泡填充床式柱反应器中，该反应器以0.5～5mL/min的流速单向流加或循环连续流加30～100g/L的甘油溶液，进行酶转化反应，反应温度25～35℃，每批转化时间12～24h。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于固定化的细胞是采用海藻酸钙或卡拉胶作为固定化载体。
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