CN106467919A - 一种提高丁醇发酵总溶剂产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高丁醇发酵总溶剂产量的方法，包括（1）将丁醇发酵菌的孢子液接种到RCM培养基中，得到发酵菌种子液；（2）制备P2发酵培养基，其中初始发酵培养基中总糖浓度为30-60g/L，pH自然；补料发酵培养基中总糖浓度为70-100g/L，pH为7.0-9.0；（3）在发酵罐中，预先装入1/4-1/2发酵罐有效体积的初始发酵培养基，按照体积比2%-5%的接种量接入发酵菌种子液，当发酵菌生长至对数期，按照流加时间16-24h匀减速流加剩余体积的补料发酵培养基，流加结束后继续发酵60-72h。本发明在丁醇发酵菌的生长对数期，通过匀减速补加高pH值培养基的方式，促进菌种的二次生长，延长了产酸期的时间，在碳源用量相同的条件下，提高了发酵周期内溶剂的产率，增加了总溶剂产量。

Description

一种提高丁醇发酵总溶剂产量的方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种提高丁醇发酵总溶剂产量的方法。
背景技术
随着汽油和化石燃料存储的消耗，生物丁醇作为一种新的可再生资源越来越受到人们的关注。丁醇的热值、辛烷值与汽油相当，蒸汽压低，可与汽油任意比混溶，使用安全性能高；不会腐蚀管道、不易吸水、便于管道运输，是一种非常理想的能源替代品。此外，丁醇也是一种重要的化工原料，广泛用于各种塑料和橡胶制品的制造和丁醛、丁酸、丁胺和乳酸丁酯等化学品的合成。近年来，随着下游产业的发展，丁醇的市场需求直线上升，2011年我国丁醇的进口量在49万吨左右，成为世界最大的丁醇进口国。
现阶段，微生物发酵生产丁醇作为重要的生物转化技术极具发展和产业化的潜力。微生物发酵生产工艺主要包括批次发酵工艺，连续发酵工艺及批次补料发酵工艺。其中，批次补料发酵工艺是指在微生物批次发酵过程中，以某种方式向发酵系统中补加一定物料，但并不连续地向外放出发酵液的发酵技术，发酵液的体积随时间逐渐增加，是介于批次发酵和连续发酵之间的一种发酵技术。
目前提到的丁醇发酵批次补料工艺中，发酵培养基的补加均采用恒流速补加方式或者多批次直接补加方式，无法最大限度满足菌种生长发酵的需要，发酵产物的产量受到一定的限制。
CN200510122181.6公开了一种补料发酵生产D-核糖的方法，在发酵培养期间采用间歇递减流加方式和间歇定量流加的方式流加葡萄糖补料液和硫酸铵补料液，其中葡萄糖补料是在发酵培养进行到25-45小时时开始采用间歇递减流加方式，每隔5小时流加浓度为400-1000g/L的葡萄糖补料液，共流加3次，每次分别为50mL、40mL和30mL， 硫酸铵补料是在发酵培养进行到30-40小时，在葡萄糖补料的同时，采用间歇定量流加的方式，开始每隔5小时流加浓度为200-300g/L的硫酸铵补料液，共流加 2次，每次流加12mL补料液，最终得到D-核糖产物。该方法采用补料法发酵生产D-核糖，发酵结束时葡萄糖基本被耗尽，与不补料相比，D-核糖产量提高了95.9%。
CN200810162759.4公开了一种补料发酵法生产辅酶Q10，采用红色酵母菌HY-05用于发酵生长辅酶Q10，从发酵第24h开始，在减速流加蔗糖的同时以7.5mL/(L·h)的速度流加玉米浆，CoQ10的积累可达到最大为156.2mg/L，与不补料相比产量提高了58.1%。采用补料分批发酵方式不仅可减少底物的反馈抑制，而且可增大发酵过程中的溶氧，进一步提高CoQ10的合成量。
Xue等（Xue C, Zhao J B, Lu C C, et al. BioetchBioeng, 2012, 109, 2746-2756.）。将批次补料的工艺方法应用在在丁醇发酵中，从而得到了相对于分批发酵更高的丁醇产量和产率。
上述批次补料工艺都是根据不同发酵菌株、发酵底物和发酵产物的特性研究出的相关补料工艺过程，在用于丁醇发酵时，总溶剂产量提高并不显著。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种提高丁醇发酵总溶剂产量的方法。本发明在丁醇发酵菌的生长对数期，通过匀减速补加高pH值培养基的方式，促进菌种的二次生长，延长了产酸期的时间，在碳源用量相同的条件下，提高了发酵周期内溶剂的产率，增加了发酵的总溶剂产量。
为了达到上述的目的，本发明采用以下技术方案。
一种提高丁醇发酵总溶剂产量的方法，包括以下步骤：
（1）将丁醇发酵菌的孢子液接种到RCM培养基中，得到发酵菌种子液；
（2）制备P2发酵培养基，其中初始发酵培养基中的总糖浓度为30-60g/L，pH自然；补料发酵培养基中的总糖浓度为70-100g/L，pH为7.0-9.0；
（3）在发酵罐中，预先装入1/4-1/2发酵罐有效体积（可加入发酵培养基的总体积，V）的初始发酵培养基，按照体积比2%-5%的接种量接入发酵菌种子液，当发酵菌生长至对数期，按照流加时间16-24h匀减速流加3/4-1/2发酵罐有效体积（V）的补料发酵培养基，流加结束后继续发酵60-72h。
本发明步骤（1）所述的丁醇发酵菌为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)或拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），优选丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824，购于美国模式菌种收集中心；或者采用CN201410731297.9所述的拜氏梭菌CM20，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9354。本发明提供的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CM20菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 9354；保藏日期： 2014年06月17日。本发明优选使用拜氏梭菌CM20，该菌株由于自身的特异性，在该发酵体系中适应性更好，总溶剂产量更高。
本发明步骤（1）所述的RCM培养基的具体配方，以g/L计为：蛋白胨10，牛肉粉10，酵母粉 3.0，葡萄糖5，可溶性淀粉 1.0，氯化钠5.0，醋酸钠 3.0，L-半胱氨酸盐酸盐 0.5，琼脂 0.5，以纯水配置，115℃灭菌20min。
本发明步骤（1）所述的发酵菌种子液是在RCM培养基中接入丁醇发酵菌的孢子液，厌氧环境下于36-38℃下培养16-24h获得的。
本发明步骤（2）所述的P2培养基为本领域人员所熟知的用于丁醇发酵的发酵培养基，培养基配方以g/L计为：总糖60-80，酵母1.0，CH3COONH4 2.2，KH2PO4 0.5，K2HPO4 0.5，MnSO4 0.01，NaCl 0.01，MgSO4·7H2O 0.2，FeSO4 0.01，对氨基苯甲酸 0.001，维生素B1 0.001，生物素0.001e-3。
本发明步骤（2）所述的糖可以为葡萄糖、蔗糖、木糖等中的一种或几种，也可以使用纤维素、半纤维素等的水解糖液，优选葡萄糖或含葡萄糖的水解糖液。
本发明步骤（2）所述的发酵培养基制备好后，初始发酵培养基的pH为自然，通常为6.0左右；补料发酵培养基的pH为7.0-9.0，优选为7.0-8.0。调节pH可以采用无机碱或有机碱调节pH，如无机碱可以采用氢氧化钠等，优选采用有机碱三羟甲基氨基甲烷（Tris），不仅能够调节pH，而且有助于增强发酵体系的缓冲能力，有助于延长产酸期的时间，提高糖转化率。
本发明步骤（3）所述的初始发酵液在搅拌条件下，36-38℃厌氧培养18-24h后进入对数生长期。本发明首先根据加入的补料发酵培养基体积（1/4V-1/2V）以及补料所需流加时间（16-24h），确定培养基流加的加速度k，然后根据流速v=v 0-kt的方式设定泵的流加速度，使其以匀减速方式流加，其中v 0为初始流加速度，t为流加时间，流加完毕后，继续培养发酵60-72h结束。发酵过程中搅拌转速为100-200rpm。
本发明步骤（3）的发酵过程中，发酵培养基中总糖的投放量不因批次补料的工艺的不同而产生变化，即使初始发酵培养基和补料发酵培养基的体积及糖浓度不同，但是总糖量为固定量，优选为60V-80V(g)，也就是说在总糖量相同的条件下进行发酵过程的调控，从而可以增加了发酵的总溶剂产量。
本发明在丁醇发酵菌的生长对数期，通过匀减速一次性补加高pH值培养基的方式，最大限度地满足菌种生长发酵的需要，从而更好地解决了批次发酵中发酵底物抑制及菌种代谢产物阻遏等问题，促进菌种的二次生长，延长了产酸期的时间，在总糖量相同的条件下，提高了糖转化率，显著增加了发酵的总溶剂产量。本领域技术人员知道，通常丁醇发酵中溶剂生成比例为：丁醇:丙酮:乙醇=6:3:1，经本发明处理后，在提升丁醇和丙酮产量的同时，大大提高了乙醇的产量，乙醇与丙酮的比例从1:3提高为接近1:1。本发明方法提高了发酵周期内总溶剂产量，降低了发酵工艺的成本。
生物材料保藏说明
本发明提供的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CM20菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 9354；保藏日期： 2014年06月17日。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。实施例中所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不以任何方式限制本发明的范围。
以下各实施例中的RCM培养基（g/L）组成如下：蛋白胨10，牛肉粉10，酵母粉 3.0，葡萄糖 5，可溶性淀粉 1.0，氯化钠5.0，醋酸钠 3.0，L-半胱氨酸盐酸盐 0.5，琼脂 0.5，以纯水配置，115℃灭菌20min。
以下各实施例中所采用的P2发酵培养基（g/L）组成如下：总糖（根据不同实施例具体确定），酵母1.0，CH3COONH4 2.2，KH2PO4 0.5，K2HPO4 0.5，MnSO4 0.01，NaCl 0.01，MgSO4·7H2O 0.2，FeSO4 0.01，对氨基苯甲酸 0.001，维生素B1 0.001，生物素0.001e-3，以纯水配置，其中糖和酵母粉115℃灭菌30min，其他物质用0.22μm的滤膜过滤添加。
以下各实施例中采用的发酵罐有效体积为4L，虽然丁醇发酵菌的发酵工艺不同，但发酵所投放的总糖量控制为65×V =65×4 =260(g)。
实施例1
（1）将丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824菌株孢子液接种到RCM培养基中，厌氧环境下于37℃下培养20h获得发酵菌种子液。
（2）制备初始发酵培养基，采用葡萄糖，糖浓度为30g/L；制备补料发酵培养基，糖浓度为100g/L，采用氢氧化钠调节pH为7.5。
（3）采用发酵罐有效体积4L的发酵罐，预先装入2L的初始发酵培养基，按照体积比4%的接种量接入发酵菌种子液，发酵温度37℃，搅拌速率100rpm，在发酵20h后，发酵菌进入对数期。开始流加补料发酵培养基，体积为2L，流加时间为24h，计算得到k=1.93×10-3ml•(min)-2，初始流加速度v 0=2.78mL/min，匀减速流加完毕后，继续培养发酵72h。
发酵液中的糖含量及丁醇含量通过高效液相色谱法分析测定，丙酮含量通过气相色谱法分析测定，乙醇含量通过生物传感分析仪（乙醇酶膜）测定，总溶剂含量为乙醇、丙酮、丁醇三者含量的总和。经检测，发酵液中丁醇、丙酮及乙醇的产量分别为11.041g/L、5.021g/L及4.9g/L，总溶剂产量为20.962g/L，溶剂转化率（糖转化溶剂量与糖加入量的比例，下同）为32.25%。
实施例2
（1）将丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824菌株孢子液接种到RCM培养基中，厌氧环境下于37℃下培养20h获得发酵菌种子液。
（2）制备初始发酵培养基，采用葡萄糖，糖浓度为30g/L；制备补料发酵培养基，糖浓度为100g/L，采用氢氧化钠调节pH为7.0。
（3）采用发酵罐有效体积4L的发酵罐，预先装入2.0L的初始发酵培养基，按照体积比4%的接种量接入发酵菌种子液，发酵温度37℃，搅拌速率100rpm，在发酵20h后，发酵菌进入对数期。开始流加补料发酵培养基，体积为2.0L，流加时间为20h，计算得到k=2.78×10-3ml•(min)-2，初始流加速度v 0=3.33mL/min，匀减速流加完毕后，继续培养发酵60h。
发酵液中的糖含量及丁醇含量通过高效液相色谱法分析测定，丙酮含量通过气相色谱法分析测定，乙醇含量通过生物传感分析仪（乙醇酶膜）测定，总溶剂含量为乙醇、丙酮、丁醇三者含量的总和。经检测，发酵液中丁醇、丙酮及乙醇的产量分别为11.224 g/L、5.031g/L及4.5g/L，溶剂总产量为20.755g/L，溶剂转化率为31.9%。
实施例3
（1）将丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824菌株孢子液接种到RCM培养基中，厌氧环境下于37℃下培养20h获得发酵菌种子液。
（2）制备初始发酵培养基，采用葡萄糖，糖浓度为40g/L；制备补料发酵培养基，糖浓度为80g/L，采用氢氧化钠调节pH为8.0。
（3）采用发酵罐有效体积4L的发酵罐，预先装入1.5L的初始发酵培养基，按照体积比3%的接种量接入发酵菌种子液，发酵温度37℃，搅拌速率100rpm，在发酵20h后，发酵菌进入对数期。开始流加补料发酵培养基，体积为2.5L，流加时间为24h，计算得到k=2.41×10-3ml•(min)-2，初始流加速度v 0=3.47mL/min，匀减速流加完毕后，继续培养发酵72h。
发酵液中的糖含量及丁醇含量通过高效液相色谱法分析测定，丙酮含量通过气相色谱法分析测定，乙醇含量通过生物传感分析仪（乙醇酶膜）测定，总溶剂含量为乙醇、丙酮、丁醇三者含量的总和。经检测，发酵液中丁醇、丙酮及乙醇的产量分别为11.388g/L、5.161g/L及4.7/L，溶剂总产量为21.199g/L，溶剂转化率为32.6%。
实施例4
处理流程及操作条件同实施例1，不同之处在于：采用CN201410731297.9所述的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CM20。发酵结束后，经检测，发酵液中丁醇、丙酮及乙醇的产量分别为11.579 g/L、5.267g/L及5.0g/L，溶剂总产量为21.846g/L，溶剂转化率为33.6%。
实施例5
处理流程及操作条件同实施例1，不同之处在于：采用有机碱三羟甲基氨基甲烷（Tris）调节pH。发酵结束后，经检测，发酵液中丁醇、丙酮及乙醇的产量分别为11.885 g/L、5.324g/L及5.1g/L，溶剂总产量为22.309g/L，溶剂转化率为34.3%。
实施例6
处理流程及操作条件同实施例4，不同之处在于：采用有机碱三羟甲基氨基甲烷（Tris）调节pH。发酵结束后，经检测，发酵液中丁醇、丙酮及乙醇的产量分别为12.127g/L、5.504g/L及5.2g/L，溶剂总产量为22.831g/L，溶剂转化率为35.1%。
比较例1
处理流程及操作条件同实施例1，不同之处在于：采用恒流速流加葡萄糖浓度为100g/L的发酵培养基，流速始终为1.39mL/min，流加时间24h，流加完毕后，继续培养发酵72 h。经检测，发酵液中丁醇、丙酮及乙醇的产量分别为10.896 g/L、3.925g/L及3.4g/L，溶剂总产量为18.221g/L，溶剂转化率为28.0%。
比较例2
处理流程及操作条件同实施例1，不同之处在于：补料发酵培养基的pH为自然的6.2，不进行调节。经检测，发酵液中丁醇、丙酮及乙醇的产量分别为10.871g/L、3.911g/L及2.9g/L，溶剂总产量为17.682g/L，溶剂转化率为27.2%。

Claims (12)

1.一种提高丁醇发酵总溶剂产量的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将丁醇发酵菌的孢子液接种到RCM培养基中，得到发酵菌种子液；
（2）制备P2发酵培养基，其中初始发酵培养基中的总糖浓度为30-60g/L，pH自然；补料发酵培养基中的总糖浓度为70-100g/L，pH为7.0-9.0；
（3）在发酵罐中，预先装入1/4-1/2发酵罐有效体积的初始发酵培养基，按照体积比2%-5%的接种量接入发酵菌种子液，当发酵菌生长至对数期，按照流加时间为16-24h匀减速流加剩余3/4-1/2发酵罐有效体积（V）的补料发酵培养基，流加结束后继续发酵60-72h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的丁醇发酵菌为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)或拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的丁醇发酵菌为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824，购于美国模式菌种收集中心。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的丁醇发酵菌采用CN201410731297.9所述的拜氏梭菌CM20，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9354。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的RCM培养基配方以g/L计为：蛋白胨10，牛肉粉10，酵母粉 3.0，葡萄糖 5，可溶性淀粉 1.0，氯化钠5.0，醋酸钠 3.0，L-半胱氨酸盐酸盐 0.5，琼脂 0.5，以纯水配置，115℃灭菌20min。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的发酵菌种子液是在RCM培养基中接入丁醇发酵菌的孢子液，厌氧环境下于36-38℃下培养16-24h获得的。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的P2培养基为的配方以g/L计为：总糖60-80，酵母1.0，CH3COONH4 2.2，KH2PO4 0.5，K2HPO4 0.5，MnSO4 0.01，NaCl 0.01，MgSO4·7H2O 0.2，FeSO4 0.01，对氨基苯甲酸 0.001，维生素B1 0.001，生物素0.001e-3。
8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的糖为葡萄糖、蔗糖、木糖中的一种或几种，或者使用纤维素、半纤维素的水解糖液。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的发酵培养基制备好后，初始发酵培养基的pH为6.0，补料发酵培养基的pH为7.0-8.0。
10.根据权利要求1或9所述的方法，其特征在于：步骤（2）调节pH采用有机碱三羟甲基氨基甲烷。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述的初始发酵液在搅拌条件下，36-38℃厌氧培养18-24h后进入对数生长期。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）的发酵过程中，发酵培养基中总糖的投放量不因批次补料的工艺的不同而产生变化，即使初始发酵培养基和补料发酵培养基的体积及糖浓度不同，但是总糖量为固定量，为60V-80V(g)。
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