WO2021125494A1 - 다중약물 유출펌프 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 변이체를 포함하는 미생물, 및 이를 이용하여 비올라세인 또는 디옥시비올라세인을 제조하는 방법 - Google Patents

다중약물 유출펌프 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 변이체를 포함하는 미생물, 및 이를 이용하여 비올라세인 또는 디옥시비올라세인을 제조하는 방법 Download PDF

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WO2021125494A1
WO2021125494A1 PCT/KR2020/011317 KR2020011317W WO2021125494A1 WO 2021125494 A1 WO2021125494 A1 WO 2021125494A1 KR 2020011317 W KR2020011317 W KR 2020011317W WO 2021125494 A1 WO2021125494 A1 WO 2021125494A1
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ptrc
variant
violacein
microorganism
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PCT/KR2020/011317
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류규리
배현애
전애지
장재우
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씨제이제일제당(주)
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    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
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    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0073—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen 1.14.13
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
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    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/165—Heterorings having nitrogen atoms as the only ring heteroatoms
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    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/13—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with NADH or NADPH as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.13)

Definitions

  • the present application relates to a multidrug efflux pump (mepA) variant, a polynucleotide encoding the variant, a microorganism including the variant, and violacein or deoxyviolacein using the same it's about how to
  • Violacein is a purple dye that is a bis-indole molecular compound generated by the fusion of two L-tryptophan molecules.
  • Five polypeptides from L-tryptophan act as an enzyme. biosynthesized The genes encoding these polypeptides form a cluster and are denoted as vioABCDE, and this gene cluster is the genes vioA and VioB (N-[2-(carboxylatoamino)-1,2-bis) encoding VioA (L-tryptophan oxidase).
  • Deoxyviolacein which has a structure similar to that of violacein, is also a bis-indole molecular compound generated by fusion of L-tryptophan molecules, and has a blue color than violacein in a solid state.
  • Deoxyviolacein is biosynthesized by four polypeptides VioA, VioB, VioC, and VioE, except for VioD, among the above five polypeptides, and during violacein biosynthesis, a specific ratio of deoxyviolacein is always biosynthesized together, but vioD is mutated or deleted When the activity of the VioD polypeptide is removed, only deoxyviolacein can be produced.
  • Violacein and deoxyviolacein have various physiological activities such as anticancer, antiulcer, antibacterial, antifungal, antibiotic, and antiviral, so the need for mass production is also increasing.
  • Violacein or deoxyviolacein is well soluble in polar organic solvents, insoluble in water, and does not flow out of the cells of the production strain, so the cells of the strain producing the compounds were recovered and resuspended in a polar organic solvent. After shaking, extraction method is mainly used.
  • studies on the exocytosis of violacein or deoxyviolacein are insignificant, and there is a need to develop a new method for commercial mass production of these compounds by increasing the efficiency of excretion of these compounds to the outside of the cell.
  • the present application provides a mepA mutant, a polynucleotide encoding the mutant, a recombinant microorganism comprising the mepA mutant, and a method for producing a target product using the same.
  • One aspect is any one or more amino acids selected from the group consisting of serine at position 32, glycine at position 36, asparagine at position 39, leucine at position 59, phenylalanine at position 62, aspartic acid at position 183 and leucine at position 288 from the N-terminus of SEQ ID NO: 1
  • a multidrug efflux pump (mepA) variant comprising amino acid substitutions at residues and having at least 90% and less than 100% homology to SEQ ID NO: 1 is provided.
  • the multi-drug efflux pump may be derived from the genus Staphylococcus , for example, may be derived from Staphylococcus aureus , but even if it is derived from other microorganisms. It is not limited as long as it is expressed in the host cell into which it is introduced and shows the same enzyme activity.
  • multi-drug efflux pump (mepA) variant may refer to a protein in which one or more amino acids in the amino acid sequence of the mepA protein are mutated, for example, substituted.
  • the mepA mutant may be a protein in which the activity of the mepA protein is increased efficiently by the mutation of the present application as compared to the wild-type or before modification. Mutation in the present application is a method for improving enzymes in general, and known methods known in the art can be used without limitation, and there are strategies such as rational design and directed evolution.
  • a rational design strategy includes a method of site-directed mutagenesis or site-specific mutagenesis of an amino acid at a specific position
  • a directed evolution strategy includes a method of causing random mutagenesis, etc.
  • the mepA mutant may be an isolated one, a recombinant protein, or a non-naturally occurring one. However, it is not limited thereto.
  • a 'polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1' may belong to a 'polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1' if it has the same or corresponding activity.
  • the protein having the activity of mepA in the present application does not exclude the addition of meaningless sequences before and after the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or mutations that may occur naturally, or silent mutations thereof, and SEQ ID NO: 1 It may be apparent to those skilled in the art that if the protein has the same or corresponding activity as the protein comprising the amino acid sequence of the present application, it corresponds to the protein having the mepA activity of the present application.
  • the mepA before the modification may be a polypeptide having 90% or more, 95% or more, 97% or more, 99% or more, or 100% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the gene encoding the mepA is a polynucleotide having at least 90%, for example, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 99% or more, or 100% homology to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 3 may be
  • the mepA variant of the present application may be a polypeptide having 90% or more, 95% or more, 97% or more, or 99% or more, and less than 100% homology to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the gene encoding the mepA variant is at least 90% and less than 100%, for example, 90% or more, 95% or more, 97% or more, or 99% or more, and less than 100% of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 3 It may be a polynucleotide having homology of
  • the term "homology” refers to the percent identity between two polynucleotide or polypeptide moieties. Homology between sequences from one moiety to another can be determined by known art. A homologous sequence having the same or similar activity to a given amino acid sequence or base sequence is expressed as "% homology". For example, using standard software that calculates parameters such as score, identity and similarity, specifically BLAST 2.0, or by Southern hybridization experiments under defined stringent conditions. can be confirmed by comparing As used herein, the term “stringent conditions” refers to conditions that allow specific hybridization between polynucleotides. Appropriate hybridization conditions defined are within the skill of the art, and methods well known to those skilled in the art (eg, J.
  • the term "gene” refers to a nucleic acid fragment that expresses a specific protein, and includes a 5'-non-coding sequence and/or a 3'-non-coding sequence. It may or may not include a regulatory sequence of a coding sequence.
  • polynucleotide comprehensively includes DNA and RNA molecules such as gDNA and cDNA, and nucleotides, which are the basic structural units of polynucleotides, include natural nucleotides as well as analogs in which sugar or base sites are modified. (analogue) may also be included.
  • the polynucleotide may be a polynucleotide isolated from a cell or an artificially synthesized polynucleotide, but is not limited thereto.
  • the amino acid substitution is a substitution of methionine for methionine at position 32 from the N-terminus of SEQ ID NO: 1 (S32M), substitution of glycine at position 36 with asparagine (G36N), substitution of asparagine at position 39 with aspartic acid (N39D), leucine at position 59 with phenylalanine (L59F), leucine at position 59 with methionine (L59M), leucine at position 59 with asparagine (L59N), phenylalanine at position 62 with methionine (F62M), at position 183 consisting of aspartic acid to alanine substitution (D183A), aspartic acid at position 183 to glutamate (D183E), aspartic acid at position 183 to leucine (D183L), and leucine at position 288 to methionine (L288M) It may include any one or more selected from the group.
  • the mepA variant is at least 90% with any one or more amino acid sequences selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 14, for example, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 99 % or more, or 100% homology. Even when some of the amino acid sequences have an amino acid sequence deleted, modified, substituted or added at the same time as the amino acid substitution, if they exhibit the same or corresponding activity as the mepA mutant of the present application, they may be included in the scope of the present application.
  • Another aspect provides a polynucleotide encoding the mepA variant.
  • the polynucleotide encoding the mepA variant may be derived from the genus Staphylococcus , for example, may be derived from Staphylococcus aureus.
  • the mepA variant is as described above.
  • the mepA variant has a serine at position 32 from the N-terminus of SEQ ID NO: 1 to methionine (S32M), a glycine at position 36 to asparagine (G36N), and an asparagine at position 39 to aspartic acid substitution (S32M) N39D), leucine at position 59 to phenylalanine (L59F), leucine at position 59 to methionine (L59M), leucine at position 59 to asparagine (L59N), phenylalanine at position 62 to methionine (F62M) , aspartic acid at position 183 to alanine (D183A), aspartic acid at position 183 to glutamate (D183E), aspartic acid at position 183 to leucine (D183L), and leucine at position 288 to methionine (L288M) ) may include amino acid substitutions including any one or more selected from the group
  • the mepA variant is at least 90% with any one or more amino acid sequences selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4 to 14, for example, 90% or more, 95% or more, 97% or more, 99 % or more, or 100% homology.
  • the polynucleotide may be codon-optimized for the host cell recombinant microorganism. Codon optimization refers to the creation of a gene encoding the same amino acid but in which one or more of the endogenous codons are substituted with a codon favorable for expression in that host.
  • the polynucleotide is, for example, at least 90% and less than 100% of any one or more nucleotide sequences selected from the group consisting of nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 15 to 25, for example, 90% or more, 95% or more, 97 % or greater, 99% or greater, or 100% homology.
  • Another aspect is a recombinant microorganism comprising a mepA variant, wherein the mepA variant is, from the N-terminus of SEQ ID NO: 1, serine at position 32, glycine at position 36, asparagine at position 39, leucine at position 59, phenylalanine at position 62, aspartic acid at position 183, and It provides a microorganism comprising an amino acid substitution at any one or more amino acid residues selected from the group consisting of leucine at position 288, and having at least 90% and less than 100% homology with SEQ ID NO: 1.
  • the recombinant microorganism may have one or more of the violacein-producing ability and the deoxyviolacein-producing ability increased compared to the parent strain.
  • the recombinant microorganism may include one or more of the violacein-producing ability and the deoxyviolacein-producing ability, compared to the parent strain, by including the mepA mutant.
  • the term "parent cell” or “parent strain” refers to an original cell, eg, a non-genetically engineered cell of the same type relative to the engineered microorganism. indicates.
  • the "parent cell” is a cell that does not have the particular genetic modification, but for other circumstances it may be the same. Accordingly, the parent cell may be a cell used as a starting material to produce a genetically engineered microorganism comprising a given protein, for example, a protein having about 90% or more homology with a variant of mepA.
  • the parent strain or unmodified strain may be a microorganism containing wild-type mepA, and the microorganism may be a microorganism producing violacein or deoxyviolacein.
  • the term "genetic modification" includes artificially changing the composition or structure of a cell's genetic material.
  • the term "increase in productivity” may mean an increase in production, production efficiency, or productivity of a target product.
  • the increase in the production capacity may mean an increase compared to the production capacity of the microorganism without the specific genetic modification.
  • the recombinant microorganism including the mepA mutant may be a microorganism into which a polynucleotide encoding the mepA mutant is introduced.
  • Introduction of the polynucleotide may be performed by known methods such as transformation, transfection, and electroporation.
  • the polynucleotide may be introduced via a carrier or introduced as such.
  • the term "carrier” includes a nucleic acid molecule capable of delivering another nucleic acid to which it has been linked. In the context of a nucleotide sequence that mediates the introduction of a particular gene, it is contemplated herein that a carrier may be used interchangeably with a vector, a nucleic acid construct, and a cassette.
  • Vectors may include, for example, plasmid expression vectors, viral expression vectors, such as replication defective retroviruses, adenoviruses, and adeno-associated viruses, or combinations thereof. Specifically, it may be a vector that is operably linked by an appropriate promoter so that the polynucleotide can be expressed in a host cell, and includes at least one selectable marker.
  • operably linked means that a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding a target protein of the present application and the polynucleotide sequence are functionally linked.
  • the amino acid substitution is serine at position 32 from the N-terminal of SEQ ID NO: 1 to methionine (S32M), glycine at position 36 to asparagine (G36N), position 39 asparagine to aspartic acid (N39D), leucine at position 59 to phenylalanine (L59F), leucine at position 59 to methionine (L59M), leucine at position 59 to asparagine (L59N), phenylalanine at position 62 of aspartic acid at position 183 (F62M), aspartic acid at position 183 with alanine (D183A), aspartic acid at position 183 with glutamate (D183E), aspartic acid at position 183 with leucine (D183L) and at position 288 It may include any one or more selected from the group consisting of substitution of leucine with methionine (L288M).
  • the microorganism may be Escherichia (Escherichia) in, for example, E. coli (Escherichia coli).
  • the Escherichia coli may be strain W3110, but is not limited as long as it is a microorganism capable of producing violacein or deoxybiolacein by the genetic modification.
  • the microorganism may have a gene for biosynthesis of violacein or deoxyviolacein.
  • the microorganism may include an endogenous or exogenous violacein or deoxybiolacein biosynthesis gene.
  • the microorganism may be a microorganism transformed to have the gene by a molecular biological method known in the art.
  • the exogenous violacein or deoxybiolacein biosynthesis gene may be a vioABCDE gene, or a vioABCD*E or vioABCE gene in which the vioD gene is mutated or deleted among the vioABCDE genes.
  • the recombinant microorganism may include an exogenous violacein or deoxyviolacein biosynthesis gene by including a genetic modification in which the activity of the gene clusters vioABCDE , vioABCD*E or vioABCE is enhanced.
  • the genetic modification may be one into which the gene clusters vioABCDE , vioABCD*E or vioABCE are introduced, for example, those introduced through a vehicle such as a vector.
  • the vioABCDE , vioABCD * E or vioABCE is a Chromobacterium genus, for example, Chromobacterium violaceum ) It may be derived from, but the same enzyme is expressed in the introduced host cell even if it is derived from another microorganism. There is no limitation as long as it shows activity
  • the polypeptide encoded by the Chromobacterium violaceum- derived genes vioA , vioB , vioC , vioD and vioE may be composed of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 26 to 30, respectively.
  • the gene cluster vioABCDE , vioABCD*E or vioABCE may function to participate in the biosynthesis of violacein in microorganisms.
  • Another aspect comprises the steps of culturing a microorganism in a recombinant microorganism comprising the mepA variant; and recovering the target product from the medium or the microorganism, wherein the target product is violacein, deoxyviolacein, or a combination thereof.
  • the recombinant microorganism containing the mepA mutant is as described above.
  • the culture of the microorganism may be made according to a suitable medium and culture conditions known in the art. This culture process can be easily adjusted and used according to the selected microorganism.
  • the method of culturing may include one or more culturing selected from the group consisting of batch, continuous, and fed-batch culture.
  • the medium used for the culture may be a medium that can satisfy the requirements of a specific microorganism.
  • the medium may be a medium selected from the group consisting of a carbon source, a nitrogen source, a trace element component, and a combination thereof.
  • the carbon source may be a carbon source selected from the group consisting of carbohydrates, fats, fatty acids, alcohols, organic acids, and combinations thereof.
  • the carbohydrate may be glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, and combinations thereof.
  • the fat may be soybean oil, sunflower oil, pajama oil, coconut oil, and combinations thereof.
  • the fatty acid may be palmitic acid, stearic acid, linoleic acid, or a combination thereof.
  • the alcohol may be glycerol or ethanol.
  • the organic acid may include acetic acid.
  • the nitrogen source may include an organic nitrogen source, an inorganic nitrogen source, or a combination thereof.
  • the organic nitrogen source may be selected from the group consisting of peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor (CSL), soybean wheat, and combinations thereof.
  • the inorganic nitrogen source may be selected from the group consisting of urea, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate, ammonium nitrate, and combinations thereof.
  • the medium may include one selected from the group consisting of phosphorus, metal salts, amino acids, vitamins, precursors, and combinations thereof.
  • the source of phosphorus may include potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • the metal salt may be magnesium sulfate or iron sulfate.
  • the medium or individual components constituting it may be added in a batch, continuous, or fed-batch culture.
  • the pH of the culture can be adjusted.
  • the adjustment of the pH may be made by adding ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, or sulfuric acid to the culture.
  • the culturing method may include suppression of bubble production.
  • the suppression of the foaming can be achieved through the use of an antifoaming agent.
  • the antifoaming agent may include a fatty acid polyglycol ester.
  • the culture method may include injection of gas into the culture.
  • the gas may include any gas for maintaining the aerobic state of the culture.
  • the gas may be oxygen or an oxygen-containing gas.
  • the oxygen-containing gas includes air.
  • the temperature of the culture may be 20 to 45 °C, for example, 22 to 42 °C, or 25 to 40 °C.
  • the incubation period may be continued until a desired production amount of at least one of violacein and deoxyviolacein is obtained.
  • the step of recovering the target product from the medium or the microorganism may be performed by, for example, treating the medium with sulfuric or hydrochloric acid and then using processes such as anion exchange chromatography, concentration, crystallization, and isoelectric point precipitation have.
  • a multidrug efflux pump (mepA) variant a polynucleotide encoding the variant, a microorganism comprising the variant, and a method for producing violacein or deoxyviolacein using the same It can be usefully used for mass production of violacein or deoxybiolacein.
  • 1 is a diagram showing the three-dimensional structure of the mepA membrane protein.
  • Example 1-1 Violacein biosynthesis gene cluster for the production of strains having violacein and deoxyviolacein-producing ability vioABCDE Construction of overexpression vectors
  • vioABCDE a violacein biosynthetic gene cluster
  • genomic DNA derived from Chromobacterium violaceum ATCC 12472.
  • a primer having an NdeI restriction site inserted into the 5' end region (SEQ ID NO: 31) and a primer with a BamHI restriction enzyme site inserted at the 3' end region (SEQ ID NO: 32) were synthesized, and this primer pair was used as a primer and amplified the violacein biosynthesis gene cluster vioABCDE (SEQ ID NO: 33) through a polymerase chain reaction (PCR) using genomic DNA derived from Chromobacterium violaceum ATCC 12472 as a template.
  • PCR conditions were denaturation at 94°C for 5 minutes, denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 60°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 10 minutes were repeated 30 times, followed by polymerization at 72°C for 7 minutes.
  • a strong promoter a trc promoter (SEQ ID NO: 34) in which a KpnI restriction site was inserted at the 5' end and an NdeI restriction site was inserted at the 3' end was synthesized.
  • the vioABCDE gene cluster fragment amplified by PCR as described above was digested with restriction enzymes NdeI and BamHI, and the synthesized trc promoter fragment was digested with restriction enzymes KpnI and NdeI to obtain each DNA fragment.
  • This was ligated to the overexpression vector pECCG117 (Biotechnology letters vol. 13, No.10, p.721-726 (1991) or Korean Patent Publication No. 92-7401) having restriction enzymes KpnI and BamHI ends, and then transformed into E. coli DH5 ⁇ .
  • Plasmids were obtained from each transformed E. coli DH5 ⁇ using a commonly known plasmid extraction method.
  • the plasmid isolated from the purple colony was named pECCG117-Ptrc-vioABCDE.
  • Example 1-2 Violacein biosynthesis gene cluster for the production of strains having deoxyviolacein-producing ability vioABCE Construction of overexpression vectors
  • vioABCE overexpression vector for the construction of a strain having deoxybiolacein- producing ability
  • vioABC and vioE except for vioD in the violacein biosynthesis gene cluster from genomic DNA derived from Chromobacterium violaceum ATCC 12472 were amplified.
  • a primer with an NdeI restriction site inserted into the 5' end region (SEQ ID NO: 31) and a primer with an NheI restriction enzyme site inserted into the 3' end region (SEQ ID NO: 35) were synthesized and , PCR was performed in the same manner as described in Example 1-1, except that this primer pair was used as a primer.
  • a strong promoter for the gene a trc promoter (SEQ ID NO: 36) in which a KpnI restriction site was inserted at the 5' end and an NdeI restriction site was inserted at the 3' end was synthesized.
  • a primer with an NdeI restriction site inserted into the 5' end region (SEQ ID NO: 37) and a primer with a BamHI restriction enzyme site inserted into the 3' end region (SEQ ID NO: 38) were synthesized, PCR was performed in the same manner as described in Example 1-1, except that this primer pair was used as a primer.
  • a strong promoter for the gene a trc promoter (SEQ ID NO: 39) in which an NheI restriction site was inserted at the 5' end and an NdeI restriction site was inserted at the 3' end was synthesized.
  • the vioABC gene amplified by PCR as described above was digested with restriction enzymes NdeI and NheI, and the vioE gene was digested with restriction enzymes NdeI and BamHI.
  • the synthesized trc promoter fragment (SEQ ID NO: 36) was digested with restriction enzymes KpnI and NdeI, and the trc promoter fragment (SEQ ID NO: 39) was digested with restriction enzymes NheI and NdeI to obtain each DNA fragment.
  • the trc-vioABC-trc-vioE sequence was added to the overexpression vector pECCG117 (Biotechnology letters vol. 13, No.10, p.721-726 (1991) or Korean Patent Publication No.
  • a plasmid was obtained by culturing in the same manner as described in Example 1-1, except that it was linked to and transformed into E. coli DH5 ⁇ . It was confirmed that the colony color of the transformed E. coli DH5 ⁇ was mostly indigo, and the plasmid isolated from the indigo colony was named pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE.
  • the violacein biosynthesis gene cluster overexpression vectors pECCG117-Ptrc-vioABCDE and pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE prepared in Example 1 were transformed into Escherichia coli W3110 strain according to a known method, respectively, and kanamycin was administered at 25 mg/L Transformation was confirmed by growth in LB medium containing The finally produced strains were named W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE and W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE, respectively.
  • each strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of titer medium containing kanamycin at a concentration of 25 mg/L, 1 platinum each, and cultured with shaking at 37° C. for 30 hours at 200 rpm. did.
  • the composition of the titer medium is glucose 40 g/L, calcium carbonate 30 g/L, ammonium sulfate 10 g/L, potassium monophosphate 1 g/L, magnesium sulfate 1.5 g/L, and yeast extract 4 g/L.
  • strain name OD (660 nm absorbance) Violacein (mg per liter of culture) Deoxyviolacein (mg per liter of culture) W3110 15.8 0 0 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 29.7 521.2 78.1 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE 32.1 0 617.4
  • the wild-type E. coli W3110 strain did not produce violacein and deoxyviolacein at all, but when pECCG117-Ptrc-vioABCDE was transformed into the E. coli W3110 strain, violacein and deoxyviolacein were approximately It was confirmed that it was produced in a ratio of 8:2, and when pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE was transformed, it was confirmed that only deoxyviolacein was produced.
  • mepA gene overexpression vector To construct a mepA gene overexpression vector, the mepA gene of Staphylococcus aureus , which transports bis-indole-based substances, was used.
  • the mepA gene of Staphylococcus aureus was synthesized by requesting Cosmogene Tech (Korea). Codon optimization for the wild-type mepA gene of Staphylococcus aureus (hereinafter 'mepA_WT', SEQ ID NO: 2) and Escherichia coli in consideration of the difference in preference for codons that designate specific amino acids between Staphylococcus aureus and E. coli
  • the synthesized mepA gene (hereinafter, 'mepA_opti', SEQ ID NO: 3) was synthesized by inserting an XbaI restriction site at each 5' end and a SacI restriction site at the 3' end.
  • Colonies transformed with the vector into which the desired gene was inserted were selected through PCR, and plasmids were obtained from each transformed E. coli DH5 ⁇ using a commonly known plasmid extraction method, and this plasmid was named pCL-DtrpL.
  • the primer pairs of SEQ ID NOs: 41 and 42 were synthesized, respectively, and then PCR was performed using pCL-DtrpL as a template to amplify the pCL-DtrpL vector.
  • the PCR reaction was performed under conditions of denaturation at 94°C for 5 minutes, denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 15 minutes, followed by polymerization at 72°C for 5 minutes. did.
  • the PCR-amplified pCL-DtrpL DNA fragment was digested with restriction enzyme XbaI, and the synthesized mepA_WT and mepA_opti were digested with XbaI and Eco53kI, a blunt-end restriction enzyme that recognizes the same nucleotide sequence as SacI.
  • XbaI restriction enzyme
  • Eco53kI Eco53kI
  • Colonies transformed with the vector into which the desired gene was inserted were selected through PCR, and plasmids were obtained from each transformed E. coli DH5 ⁇ using a commonly known plasmid extraction method, and the plasmid into which mepA_WT was inserted was pCL-DtrpL-mepA_WT (SEQ ID NO: 43), the plasmid into which mepA_opti was inserted was named pCL-DtrpL-mepA_opti (SEQ ID NO: 44).
  • Viola which are hexanes and deoxy Viola hexanes production mepA
  • one strain produced a mepA over-expression vector pCL-DtrpL-mepA_WT or pCL-DtrpL-mepA_opti prepared in Example 3 to determine the effect of the gene over-expression in Example 2 for the feature W3110 / pECCG117-Ptrc-vioABCDE and W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE were transformed by known methods, respectively.
  • W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_WT W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti
  • W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-DtrpL-mepA_WT W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti
  • W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_WT W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_WT , W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc
  • the empty vector pCL1920 was also transformed into W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE and W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE, respectively, and used as a control.
  • Control strains were named W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL1920 and W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL1920, respectively.
  • the vector When the vector is transformed, it has both kanamycin and spectinomycin resistance, so the transformation was confirmed by growth in LB medium containing 25 mg/L of kanamycin and spectinomycin, respectively.
  • the violacein-producing ability was analyzed and shown in Table 2.
  • Example 5 Derivation of variants to increase the selective specificity of mepA protein for violaceins
  • PSI-BLAST using the structure of the NorM protein that exhibits high homology with the mepA protein and releases verapamil with high selectivity among the transport membrane proteins of the same MATE (Multidrug and toxic compound extrusion) type as a template.
  • MATE Multidrug and toxic compound extrusion
  • PSI-BLAST using the structure of the NorM protein that exhibits high homology with the mepA protein and releases verapamil with high selectivity among the transport membrane proteins of the same MATE (Multidrug and toxic compound extrusion) type as a template.
  • S32M, G36N, N39D, L59F, F62M, D183A and L288M were derived as a total of 7 mutations of the mepA protein.
  • MepA gene mutants each reflecting the above-derived seven types of mutations in the mepA_opti gene of SEQ ID NO: 3 synthesized in Example 3-1, were requested to Cosmogenetec (Korea) and synthesized. Specifically, by inserting an XbaI restriction enzyme site at the 5' end of each of the seven gene variants consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 15 to 21 and a SacI restriction site at the 3' end, a gene variant for the production of an expression vector These were synthesized and named mepA_opti_S32M, mepA_opti_G36N, mepA_opti_N39D, mepA_opti_L59F, mepA_opti_F62M, mepA_opti_D183A and mepA_opti_L288M.
  • An expression vector was prepared in the same manner as described in Examples 3-2 and 3-3 using the synthesized mepA gene mutant, and the prepared plasmids were respectively pCL-DtrpL-mepA_opti_S32M, pCL-DtrpL-mepA_opti_G36N, pCL-DtrpL They were named -mepA_opti_N39D, pCL-DtrpL-mepA_opti_L59F, pCL-DtrpL-mepA_opti_F62M, pCL-DtrpL-mepA_opti_D183A, pCL-DtrpL-mepA_opti_L288M.
  • W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_S32M W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_G36N
  • W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_F62M W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-MepAp-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepAp_ -mepA_opti_L288M
  • D183A and L59F which confirmed the effect of increasing the yield of violacein and deoxyviolacein in Experimental Example 3, other additional mutations at the same position were effective in increasing the yield of violacein.
  • Vectors expressing D183E, D183L, L59M and L59N variants and strains introduced thereto were prepared as follows.
  • mepA gene variants in the same manner as described in Example 6-1 except that mepA gene variants respectively represented by SEQ ID NOs: 22 to 25 were synthesized for D183E, D183L, L59M and L59N mutations of the mepA protein. were synthesized and named mepA_opti_D183E, mepA_opti_D183L, mepA_opti_L59M and mepA_opti_L59N, respectively.
  • the violacein and deoxyviolacein-producing ability of the strains prepared in Example 8 was evaluated in the same manner as described in Experimental Example 2, and compared with the violacein-producing ability of the D183A mutant and L59F mutant, respectively, and the results are shown in Table 4 is shown.

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Abstract

다중약물 유출펌프(multidrug efflux pump, mepA) 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 변이체를 포함하는 미생물, 및 이를 이용하여 비올라세인(violacein) 또는 디옥시비올라세인(deoxyviolacein)을 제조하는 방법에 관한 것으로, 비올라세인 또는 디옥시비올라세인의 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

다중약물 유출펌프 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 변이체를 포함하는 미생물, 및 이를 이용하여 비올라세인 또는 디옥시비올라세인을 제조하는 방법
본 출원은 다중약물 유출펌프(multidrug efflux pump, mepA) 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 변이체를 포함하는 미생물, 및 이를 이용하여 비올라세인(violacein) 또는 디옥시비올라세인(deoxyviolacein)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
비올라세인은 두 개의 L-트립토판(L-tryptophan) 분자의 융합(fusion)에 의해 발생되는 비스-인돌(bis-indole) 분자 화합물인 보라색 염료로, L-트립토판으로부터 5개의 폴리펩티드가 효소 작용을 하여 생합성된다. 이들 폴리펩티드를 코딩하고 있는 유전자들은 클러스터를 이루고 있어 vioABCDE로 표기하며, 이 유전자 클러스터는 VioA(L-tryptophan oxidase)를 코딩하는 유전자 vioA, VioB(N-[2-(carboxylatoamino)-1,2-bis(1H-indol-3-yl)ethyl]carbamate synthase)를 코딩하는 유전자 vioB, VioC(violacein synthase)를 코딩하는 유전자 vioC, VioD(protoviolaceinate synthase)를 코딩하는 유전자 vioD, 그리고 VioE를 코딩하는 유전자 vioE의 5개 유전자로 이루어져 있다(August PR et al., 2000, J Mol Microbiol Biotechnol. 2(4):513-519).
비올라세인과 유사한 구조를 갖는 디옥시비올라세인도 L-트립토판 분자의 융합에 의해 발생되는 비스-인돌 분자 화합물이며 고체 상태에서 비올라세인보다 남색을 띤다. 디옥시비올라세인은 상기 5개의 폴리펩티드 중 VioD를 제외한 4개의 폴리펩티드 VioA, VioB, VioC 및 VioE에 의해 생합성되며, 비올라세인 생합성 중에는 항상 특정 비율의 디옥시비올라세인이 함께 생합성되나, vioD가 변이 또는 결실되어 VioD 폴리펩티드의 활성이 제거되면 디옥시비올라세인만 생산될 수 있다.
비올라세인 및 디옥시비올라세인은 항암, 항궤양, 항균, 항진균, 항원생동물, 항바이러스 등 다양한 생리활성이 있어 그 양산 필요성 또한 증가하고 있다. 비올라세인 또는 디옥시비올라세인은 극성 유기 용매에 잘 용해되고 물에는 용해되지 않으며, 생산 균주의 세포 외부로 유출되지 못하는 특성이 있어 상기 화합물들을 생산하는 균주의 균체를 회수하여 극성 유기용매에 재현탁한 후 진탕하여 추출하는 방법이 주로 사용된다. 그러나, 비올라세인 또는 디옥시비올라세인의 세포 외부 유출에 관한 연구는 미미한 실정인 바, 이들 화합물의 세포 외부로의 유출 효율을 증가시켜 상기 화합물들을 상업적으로 양산하기 위한 새로운 방법을 개발할 필요가 있다.
본 출원은 mepA 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 mepA 변이체를 포함하는 재조합 미생물, 및 이를 이용하여 목적산물을 제조하는 방법을 제공한다.
일 양상은 서열번호 1의 N-말단으로부터 32번째 세린, 36번째 글리신, 39번째 아스파라긴, 59번째 루신, 62번째 페닐알라닌, 183번째 아스파르트산 및 288번째 루신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 치환(substitution)을 포함하고, 서열번호 1과 적어도 90% 및 100% 미만의 상동성을 갖는 다중약물 유출펌프(multidrug efflux pump, mepA) 변이체를 제공한다.
본 명세서에서 다중약물 유출펌프(mepA)는 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속 유래인 것일 수 있고, 예를 들면, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래일 수 있으나, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "다중약물 유출펌프(mepA) 변이체"란 상기 mepA 단백질의 아미노산 서열상 하나 또는 그 이상의 아미노산이 변이, 예를 들어, 치환된 단백질을 의미할 수 있다. 구체적으로, 상기 mepA 변이체는 mepA 단백질이 본 출원의 변이에 의해서 그 활성이 야생형(wild-type) 또는 변형 전과 비교하여 효율적으로 증가된 단백질일 수 있다. 본 출원에서 변이는 일반적으로 효소를 개량하기 위한 방법으로 당업계의 알려진 공지된 방법들이 제한없이 사용될 수 있으며, 이에는 합리적 설계(rational design)와 유도 진화(directed evolution) 등의 전략이 있다. 예를 들어, 합리적 설계 전략에는 특정 위치의 아미노산을 위치-지정 돌연변이도입(site-directed mutagenesis 또는 site-specific mutagenesis)하는 방법 등이 있고, 유도 진화 전략에는 무작위적 변이(random mutagenesis)를 일으키는 방법 등이 있다. 또한, 자연적인 돌연변이에 의해 외부의 조작 없이 돌연변이된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 mepA 변이체는 분리된 것이거나, 재조합 단백질일 수 있으며, 비자연적으로 발생된 것일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드', '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드와 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명할 수 있다. 예를 들어, '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'는, 이와 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 '서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드'에 속할 수 있음은 자명할 수 있다. 따라서, 본 출원에서의 mepA 의 활성을 갖는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 또는 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 mepA 활성을 갖는 단백질에 해당됨은 당업자에게 자명할 수 있다.
상기 변형 전의 mepA는 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 mepA를 코딩하는 유전자는 서열번호 2 또는 3의 염기서열과 적어도 90%, 예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.
본 출원의 mepA 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 99% 이상, 및 100% 미만의 상동성을 갖는 폴리펩티드인 것일 수 있다. 상기 mepA 변이체를 코딩하는 유전자는 서열번호 2 또는 3의 염기서열과 적어도 90% 및 100% 미만, 예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 또는 99% 이상, 및 100% 미만의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드인 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다. 상기에서 용어 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "유전자"는 특정 단백질을 발현하는 핵산 단편을 의미하며, 5'-비코딩 서열(5'-non coding sequence) 및/또는 3'-비코딩 서열(3'-non coding sequence)의 조절 서열(regulatory sequence)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "폴리뉴클레오티드"는 gDNA 및 cDNA와 같은 DNA 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하며, 폴리뉴클레오티드의 기본 구성 단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 세포로부터 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 인위적으로 합성된 폴리뉴클레오티드일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 아미노산 치환은 상기 서열번호 1의 N-말단으로부터 32번째 세린의 메티오닌으로의 치환(S32M), 36번째 글리신의 아스파라긴으로의 치환(G36N), 39번째 아스파라긴의 아스파르트산으로의 치환(N39D), 59번째 루신의 페닐알라닌으로의 치환(L59F), 59번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L59M), 59번째 루신의 아스파라긴으로의 치환(L59N), 62번째 페닐알라닌의 메티오닌으로의 치환(F62M), 183번째 아스파르트산의 알라닌으로의 치환(D183A), 183번째 아스파르트산의 글루타메이트로의 치환(D183E), 183번째 아스파르트산의 루신으로의 치환(D183L) 및 288번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L288M)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 mepA 변이체는 서열번호 4 내지 14의 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열과 적어도 90%, 예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 아미노산 치환과 동시에 아미노산 서열 중 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우에도 본 출원의 mepA 변이체와 동일하거나 상응하는 활성을 나타낸다면 본 출원의 범주에 포함될 수 있다.
다른 양상은 상기 mepA 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 mepA 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 속 유래인 것일 수 있고, 예를 들면, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 유래일 수 있다.
상기 mepA 변이체는 상기한 바와 같다. 예를 들어, 상기 mepA 변이체는 서열번호 1의 N-말단으로부터 32번째 세린의 메티오닌으로의 치환(S32M), 36번째 글리신의 아스파라긴으로의 치환(G36N), 39번째 아스파라긴의 아스파르트산으로의 치환(N39D), 59번째 루신의 페닐알라닌으로의 치환(L59F), 59번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L59M), 59번째 루신의 아스파라긴으로의 치환(L59N), 62번째 페닐알라닌의 메티오닌으로의 치환(F62M), 183번째 아스파르트산의 알라닌으로의 치환(D183A), 183번째 아스파르트산의 글루타메이트로의 치환(D183E), 183번째 아스파르트산의 루신으로의 치환(D183L) 및 288번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L288M)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 아미노산 치환을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 mepA 변이체는 서열번호 4 내지 14의 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 서열과 적어도 90%, 예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포인 재조합 미생물에 대하여 코돈 최적화된 것일 수 있다. 코돈 최적화란 동일한 아미노산을 코딩하지만 내재적 코돈 중 하나 이상이 해당 숙주에서 발현에 유리한 코돈으로 치환된 유전자를 생성하는 것을 나타낸다.
상기 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 서열번호 15 내지 25의 염기서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 염기서열과 적어도 90% 및 100% 미만, 예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
다른 양상은 mepA 변이체를 포함하는 재조합 미생물로서, 상기 mepA 변이체는, 서열번호 1의 N-말단으로부터 32번째 세린, 36번째 글리신, 39번째 아스파라긴, 59번째 루신, 62번째 페닐알라닌, 183번째 아스파르트산 및 288번째 루신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 치환(substitution)을 포함하고, 서열번호 1과 적어도 90% 및 100% 미만의 상동성을 갖는 것인, 미생물을 제공한다. 상기 재조합 미생물은 모균주에 비하여 비올라세인 생산능 및 디옥시비올라세인 생산능 중 하나 이상이 증가된 것일 수 있다. 상기 재조합 미생물은 mepA 변이체를 포함함으로써 모균주에 비하여 비올라세인 생산능 및 디옥시비올라세인 생산능 중 하나 이상이 증가된 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "모세포(parent cell)" 또는 "모균주(parent strain)"는 본래 세포(original cell), 예를 들면, 조작된 미생물에 대하여 동일 타입의 유전적으로 조작되지 않은 세포를 나타낸다. 특정한 유전적 변형에 대하여, 상기 "모세포"는 상기 특정 유전적 변형을 갖지 않은 세포이지만, 다른 상황에 대하여는 동일한 것일 수 있다. 따라서, 상기 모세포는 주어진 단백질, 예를 들면, mepA의 변이체와 약 90% 이상의 상동성을 갖는 단백질을 포함하는 유전적으로 조작된 미생물을 생산하는데 출발 물질(starting material)로 사용된 세포일 수 있다. 예를 들면, 상기 모균주 또는 비변형 균주는 야생형의 mepA를 포함하는 미생물일 수 있으며, 상기 미생물은 비올라세인 또는 디옥시비올라세인을 생산하는 미생물 일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "유전적 변형(genetic modification)"이란 세포의 유전물질의 구성 또는 구조를 인위적으로 변경시키는 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "생산능(productivity)의 증가"는 목적산물의 생산량, 생산효율, 또는 생산성 등이 증가된 것을 의미할 수 있다. 상기 생산능의 증가는 상기 특정 유전적 변형을 갖지 않는 미생물이 갖는 생산능에 비하여, 증가된 것을 의미할 수 있다.
상기 mepA 변이체를 포함하는 재조합 미생물은 상기 mepA 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 미생물일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 도입은 형질전환, 형질도입(transfection), 전기천공(electroporation)과 같은 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 운반체를 통하여 도입되거나, 그 자체로서 도입될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "운반체"란 연결되어 있는 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 특정한 유전자의 도입을 매개하는 뉴클레오티드 서열이라는 관점에서, 본 명세서에서 운반체는, 벡터, 핵산 구조체, 및 카세트와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 것으로 해석된다. 벡터에는 예를 들면, 플라스미드 발현벡터, 바이러스 발현벡터, 예를 들면, 복제결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노 연관 바이러스, 또는 그 조합이 포함될 수 있다. 구체적으로, 숙주세포에서 상기 폴리뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 의해 작동 가능하게 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
상기 mepA 변이체를 포함하는 재조합 미생물에 있어서, 상기 아미노산 치환은 상기 서열번호 1의 N-말단으로부터 32번째 세린의 메티오닌으로의 치환(S32M), 36번째 글리신의 아스파라긴으로의 치환(G36N), 39번째 아스파라긴의 아스파르트산으로의 치환(N39D), 59번째 루신의 페닐알라닌으로의 치환(L59F), 59번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L59M), 59번째 루신의 아스파라긴으로의 치환(L59N), 62번째 페닐알라닌의 메티오닌으로의 치환(F62M), 183번째 아스파르트산의 알라닌으로의 치환(D183A), 183번째 아스파르트산의 글루타메이트로의 치환(D183E), 183번째 아스파르트산의 루신으로의 치환(D183L) 및 288번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L288M)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 미생물은 에세리키아(Escherichia) 속, 예를 들면 대장균(Escherichia coli)일 수 있다. 일 구체예에서 상기 대장균은 W3110 균주일 수 있으나, 상기 유전적 변형에 의해 비올라세인 또는 디옥시비올라세인을 생산할 수 있는 미생물이라면 제한되지 않는다.
상기 미생물은 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자를 가지고 있는 것일 수 있다. 상기 미생물은 내인성 또는 외인성의 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자를 포함하고 있는 것일 수 있다. 상기 미생물이 내인성 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자를 가지고 있지 않는 것일 경우, 당업계에 공지된 분자생물학적 방법에 의해 상기 유전자를 갖도록 형질전환된 미생물일 수 있다.
상기 외인성 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자는 vioABCDE 유전자, 또는 vioABCDE 유전자 중 vioD 유전자가 변이 또는 결실된 vioABCD*E 또는 vioABCE 유전자일 수 있다. 일 구체예에서, 재조합 미생물은 유전자 클러스터 vioABCDE, vioABCD*E 또는 vioABCE의 활성이 강화된 유전적 변형을 포함하는 것에 의해 외인성 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 유전적 변형은 유전자 클러스터 vioABCDE, vioABCD*E 또는 vioABCE가 도입된 것, 예를 들면 벡터와 같은 비히클을 통하여 도입된 것일 수 있다. 상기 vioABCDE, vioABCD*E 또는 vioABCE는 크로모박테리움(Chromobacterium) 속, 예를 들면 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum) 유래일 수 있으나, 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 효소 활성을 나타내는 한 제한이 없다. 일 구체예에서, 상기 크로모박테리움 비올라세움 유래 유전자 vioA, vioB, vioC, vioD 및 vioE에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 각각 서열번호 26 내지 30의 아미노산 서열로 구성되는 것일 수 있다. 상기 유전자 클러스터 vioABCDE, vioABCD*E 또는 vioABCE는 미생물에서 비올라세인 생합성에 관여하는 기능을 할 수 있다.
다른 양상은 상기 mepA 변이체를 포함하는 재조합 미생물을 미생물을 배양하는 단계; 및 배지 또는 상기 미생물로부터 목적산물을 회수하는 단계를 포함하고, 상기 목적산물은, 비올라세인, 디옥시비올라세인, 또는 이들의 조합인, 목적산물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 방법에서, mepA 변이체를 포함하는 재조합 미생물에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 미생물의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지 및 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양의 방법은 회분식, 연속식, 및 유가식 배양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양을 포함할 수 있다.
상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소 성분, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 배지일 수 있다.
상기 탄소원은 탄수화물, 지방, 지방산, 알코올, 유기산, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소원일 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스, 및 이들의 조합일 수 있다. 상기 지방은 대두유, 해바라기유, 파자마유, 코코넛유, 및 이들의 조합일 수 있다. 상기 지방산은 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 알코올은 글리세롤 또는 에탄올일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산을 포함할 수 있다.
상기 질소원은 유기 질소원, 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 유기 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 대두밀, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 무기 질소원은 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄, 및 이들의 조 합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 배지는 인, 금속염, 아미노산, 비타민, 전구체 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포 함할 수 있다. 상기 인의 공급원은 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 또는 이들에 상응하는 소듐-함유염을 포함 할 수 있다. 상기 금속염은 황산마그네슘 또는 황산철일 수 있다.
상기 배지 또는 이를 이루는 개별 성분은 회분식, 연속식, 또는 유가식 배양으로 첨가될 수 있다.
상기 배양 방법에 있어서, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 상기 pH의 조정은 상기 배양물에 수산화암모늄, 수산 화칼륨, 암모니아, 인산, 또는 황산을 첨가하여 이루어질 수 있다. 또한, 상기 배양 방법은 기포 생성 억제를 포함할 수 있다. 상기 기포 생성 억제는 소포제의 사용을 통하여 이루어질 수 있다. 상기 소포제는 지방산 폴리글리콜 에스테르를 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양 방법은 배양물 내로 기체의 주입을 포함할 수 있다. 상기 기체는 배양물의 호기 상태를 유지하기 위한 어떤 기체도 포함할 수 있다. 상기 기체는 산소 또는 산소 함유 기체일 수 있다. 상기 산소 함유 기체는 공기를 포함한다. 상기 배양에 있어서, 배양물의 온도는 20 내지 45℃, 예를 들면, 22 내지 42℃, 또는 25 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 원하는 비올라세인 및 디옥시비올라세인 중 하나 이상의 생성량을 획득할 때까지 지속될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 배지 또는 상기 미생물로부터 목적산물을 회수하는 단계는 예를 들면, 배지에 황산 또는 염산 처리한 후에 음이온 교환 크로마토그래피, 농축, 정석, 등전점 침전 등의 공정을 병용하여 수행되는 것일 수 있다.
다중약물 유출펌프(multidrug efflux pump, mepA) 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 변이체를 포함하는 미생물, 및 이를 이용하여 비올라세인(violacein) 또는 디옥시비올라세인(deoxyviolacein)을 제조하는 방법은 비올라세인 또는 디옥시비올라세인의 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 mepA 막단백질의 3차원 구조를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터의 제작
실시예 1-1. 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 갖는 균주의 제작을 위한 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 vioABCDE 과발현 벡터의 제작
비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터를 제작하기 위하여 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum) ATCC 12472 유래의 게놈 DNA로부터 비올라세인 생합성 유전자 클러스터인 vioABCDE를 증폭하였다.
구체적으로, 5' 말단 영역에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 31)와 3' 말단 영역에 BamHⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 32)를 합성하고, 이 프라이머 쌍을 프라이머로 하고 크로모박테리움 비올라세움 ATCC 12472 유래의 게놈 DNA를 주형으로 한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 vioABCDE(서열번호 33)를 증폭하였다. PCR 조건은 94℃에서 5 분간 변성 후, 94℃ 30 초 변성, 60℃ 30 초 어닐링, 72℃ 10 분 중합을 30 회 반복한 후, 72℃에서 7 분간 중합반응을 수행하였다. 또한 강한 프로모터로서, 5' 말단에 KpnⅠ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 34)를 합성하였다.
상기와 같이 PCR로 증폭된 vioABCDE 유전자 클러스터 단편을 제한효소 NdeⅠ과 BamHⅠ으로 절단하고, 상기 합성된 trc 프로모터 단편을 제한효소 KpnⅠ과 NdeⅠ으로 절단하여 각각의 DNA 절편을 획득하였다. 이를 제한효소 KpnⅠ과 BamHⅠ 말단을 가지는 과발현 벡터 pECCG117(Biotechnology letters vol. 13, No.10, p.721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 카나마이신이 25 ㎎/L로 포함된 LB(Luria Bertani, 리터 당 트립톤 10 g, 효모추출물 5 g, NaCl 10 g, Agar 12 g, pH 7.0) 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16 시간 동안 배양하여 콜로니가 형성되는 것을 확인하였다.
PCR을 통해 목적한 유전자 클러스터가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하기 전, 이미 형질전환된 대장균 DH5α의 콜로니 색상이 대부분 보라색을 띠는 것을 확인하였다. 각각의 형질전환된 대장균 DH5α로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였다. 보라색 콜로니로부터 분리된 플라스미드를 pECCG117-Ptrc-vioABCDE로 명명하였다.
실시예 1-2. 디옥시비올라세인 생산능을 갖는 균주의 제작을 위한 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 vioABCE 과발현 벡터의 제작
디옥시비올라세인 생산능을 갖는 균주의 제작을 위한 vioABCE 과발현 벡터를 제작하기 위하여, 크로모박테리움 비올라세움 ATCC 12472 유래의 게놈 DNA로부터 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 중 vioD를 제외한 vioABC 및 vioE를 증폭하였다.
구체적으로, 유전자 vioABC를 증폭하기 위하여, 5' 말단 영역에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 31)와 3' 말단 영역에 NheⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 35)를 합성하고, 이 프라이머 쌍을 프라이머로 한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 상기 유전자에 대한 강한 프로모터로서, 5' 말단에 KpnⅠ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 36)를 합성하였다.
또한, 유전자 vioE를 증폭하기 위하여, 5' 말단 영역에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 37)와 3' 말단 영역에 BamHⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머(서열번호 38)를 합성하고, 이 프라이머 쌍을 프라이머로 한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 상기 유전자에 대한 강한 프로모터로서, 5' 말단에 NheⅠ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 trc 프로모터(서열번호 39)를 합성하였다.
상기와 같이 PCR로 증폭된 vioABC 유전자를 제한효소 NdeⅠ과 NheⅠ으로 절단하고, vioE 유전자를 제한효소 NdeⅠ와 BamHⅠ으로 절단하였다. 또한, 상기 합성된 trc 프로모터 단편(서열번호 36)을 제한효소 KpnⅠ과 NdeⅠ으로 절단하고, trc 프로모터 단편(서열번호 39)을 제한효소 NheⅠ과 NdeⅠ으로 절단하여 각각의 DNA 절편을 획득하였다. 이를 제한효소 KpnⅠ과 BamHⅠ 말단을 가지는 과발현 벡터 pECCG117(Biotechnology letters vol. 13, No.10, p.721-726(1991) 또는 대한민국 특허공고 제92-7401호)에 trc-vioABC-trc-vioE 순서로 연결하여 대장균 DH5α에 형질전환한 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 배양하여 플라스미드를 획득하였다. 형질전환된 대장균 DH5α의 콜로니 색상은 대부분 남색을 띠는 것을 확인하였으며, 남색 콜로니로부터 분리된 플라스미드를 pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE로 명명하였다.
실시예 2. 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터를 도입한 균주의 제작
상기 실시예 1에서 제조한 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터 pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE를 각각 공지된 방법에 따라 대장균 W3110 균주에 형질전환하고, 카나마이신이 25 ㎎/L로 포함된 LB 배지에서의 생장여부를 통해 형질전환을 확인하였다. 최종적으로 제작된 균주를 각각 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE로 명명하였다.
실험예 1. 비올라세인 생합성 유전자 클러스터 과발현 벡터를 도입한 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능 평가
상기 실시예 2에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 카나마이신이 25 ㎎/L의 농도로 포함된 역가 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 1 백금이씩 접종하고, 37℃에서 30 시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 역가 배지의 조성은 포도당 40g/L, 탄산칼슘 30g/L, 황산 암모늄 10g/L, 일인산칼륨 1g/L, 황산마그네슘 1.5g/L, 및 효모엑기스 4g/L이다. 비올라세인 및 디옥시비올라세인을 정량하기 위하여 각 세포가 포함된 배양물을 에탄올에 30배 희석하여 1 시간 동안 진탕 추출하고 13,000 rpm에서 5 분간 원심분리한 후 상층액을 HPLC로 분석하였다. 이 결과를 표 1에 나타내었다.
균주명 OD(660 ㎚ 흡광) 비올라세인(배양액 리터당 ㎎) 디옥시비올라세인(배양액 리터당 ㎎)
W3110 15.8 0 0
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 29.7 521.2 78.1
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE 32.1 0 617.4
상기 표 1에 나타낸 것과 같이, 야생형 대장균 W3110 균주는 비올라세인 및 디옥시비올라세인을 전혀 생산하지 못하였으나, 대장균 W3110 균주에 pECCG117-Ptrc-vioABCDE를 형질전환한 경우 비올라세인과 디옥시비올라세인이 약 8:2의 비율로 생산되는 것을 확인하였으며, pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE를 형질전환한 경우 디옥시비올라세인만 생산되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. mepA 유전자 과발현 벡터의 제작
실시예 3-1. mepA 유전자의 합성
mepA 유전자 과발현 벡터를 제작하기 위하여, bis-indole계 물질을 수송하는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 mepA 유전자를 사용하였다.
구체적으로, 코스모진텍사(대한민국)에 의뢰하여 스타필로코쿠스 아우레우스의 mepA 유전자를 합성하였다. 스타필로코쿠스 아우레우스와 대장균 간의 특정 아미노산을 지정하는 코돈에 대한 선호도 차이를 고려하여 스타필로코쿠스 아우레우스의 야생형 mepA 유전자(이하, 'mepA_WT', 서열번호 2) 및 대장균에 코돈 최적화된 mepA 유전자(이하, 'mepA_opti', 서열번호 3)의 각 5' 말단에 XbaI 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 SacI 제한효소 부위를 삽입하여 합성하였다.
실시예 3-2. 플라스미드 pCL-DtrpL의 제작
5' 말단에 KpnⅠ 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 XbaI 제한효소 부위를 삽입한 DtrpL 프로모터(서열번호 40)를 합성한 후, 제한효소 KpnI 및 XbaI으로 절단하여 DNA 절편을 획득하였다. 이를 제한효소 KpnI과 XbaI 말단을 가지는 과발현 벡터 pCL1920(GenBank No. AB236930)에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고 스펙티노마이신이 25 ㎎/L로 포함된 LB 고체배지에 도말하여 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후 콜로니가 형성되는 것을 확인하였다.
PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하여 각각의 형질전환된 대장균 DH5α로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pCL-DtrpL로 명명하였다.
실시예 3-3. mepA 유전자 과발현 벡터의 제작
합성한 mepA 유전자를 플라스미드 pCL-DtrpL에 연결하기 위하여, 서열번호 41 및 42의 프라이머 쌍을 각각 합성한 후, 이를 이용하여, pCL-DtrpL를 주형으로 PCR을 수행하여 pCL-DtrpL 벡터를 증폭하였다. PCR 반응은 94℃에서 5 분간 변성 후, 94℃에서 30 초 변성, 55℃에서 30 초 어닐링, 72℃에서 15 분 중합을 15 회 반복한 후, 72℃에서 5 분간 중합반응을 하는 조건으로 수행하였다. 상기 PCR로 증폭된 pCL-DtrpL DNA단편을 제한효소 XbaI으로 절단하고, 합성한 mepA_WT와 mepA_opti를 XbaI 및, SacI과 동일한 염기서열을 인식하는 평활말단 제한효소인　Eco53kI으로 절단하였다. 상기 각 mepA 유전자의 DNA절편을 각각 pCL-DtrpL DNA절편에 연결한 후 대장균 DH5α에 형질전환하고, 스펙티노마이신이 25 ㎎/L로 포함된 LB 고체배지에 도말하여 37℃에서 16 시간 동안 배양한 후 콜로니가 형성되는 것을 확인하였다.
PCR을 통해 목적한 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별하여 각각의 형질전환된 대장균 DH5α로부터 통상적으로 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, mepA_WT를 삽입한 플라스미드를 pCL-DtrpL-mepA_WT(서열번호 43)로, mepA_opti를 삽입한 플라스미드를 pCL-DtrpL-mepA_opti(서열번호 44)로 명명하였다.
실시예 4. mepA 유전자 과발현 벡터를 도입한 균주의 제작
비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능에 대한 mepA 유전자 과발현의 효과를 확인하기 위해 실시예 3에서 제조한 mepA 과발현 벡터 pCL-DtrpL-mepA_WT 또는 pCL-DtrpL-mepA_opti를 실시예 2에서 제작한 균주들인 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE에 공지된 방법으로 각각 형질전환하였다. 제작한 균주를 각각 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_WT, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_WT, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti로 명명하였다.
항생제에 대한 영향성을 최소화하여 비교하고자, 공벡터 pCL1920 또한 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE에 각각 형질전환하여 대조군으로 사용하였다. 대조군 균주를 각각 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL1920 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL1920으로 명명하였다. 상기 벡터가 형질전환될 경우 카나마이신과 스펙티노마이신 내성을 모두 가지게 되므로 카나마이신과 스펙티노마이신이 각각 25 ㎎/L로 포함된 LB 배지에서의 생장여부를 통해 형질전환을 확인하였다.
실험예 2. mepA 유전자 과발현 벡터를 도입한 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능 평가
상기 실시예 4에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 카나마이신과 스펙티노마이신이 각각 25 ㎎/L의 농도로 포함된 역가 배지를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시예 4에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 분석하여 표 2에 나타내었다.
균주명 OD(660 ㎚ 흡광) 비올라세인(배양액 리터당 ㎎) 디옥시비올라세인(배양액 리터당 ㎎)
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE /pCL1920 32.4 526.8 132.6
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL1920 35.6 0.0 672.2
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE /pCL-DtrpL-mepA_WT 30.8 473.1 136.2
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_WT 31.0 0.0 626.3
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE /pCL-DtrpL-mepA_opti 37.5 503.0 129.8
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti 35.8 0.0 648.2
상기 표 2에 나타낸 것과 같이, mepA 유전자 과발현 벡터를 도입한 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 각각의 대조군과 비교하였을 때, 비올라세인 생산능은 대조군 대비 유사한 수준이거나 감소하였고, 디옥시비올라세인 생산능은 대조군과 유사한 수준임을 확인하였다. 따라서, 야생형 mepA 유전자는 비올라세인류 분자를 선택특이적으로 배출하지 못 함을 알 수 있다.
실시예 5. mepA 단백질의 비올라세인류에 대한 선택특이성을 높이기 위한 변이형 도출
mepA 단백질의 구조 예측 및 분석을 통하여 mepA 단백질의 비올라세인류에 대한 선택특이성을 높이기 위한 변이형을 도출하였다.
구체적으로, mepA 단백질과 높은 상동성을 보이며, 같은 MATE(Multidrug and toxic compound extrusion) 유형의 트랜스포터 막단백질 중 베라파밀(verapamil)을 높은 선택특이성으로 배출하는 NorM 단백질의 구조를 주형으로 하여 PSI-BLAST(Position-Specific Iterative Basic Local Alignment Search Tool) 방법을 이용하여 mepA 단백질의 3차원 구조를 예측하였다. 예측된 mepA 막단백질 구조에서 비올라세인류 분자와의 친화성을 높이는 데 기여할 수 있을 것으로 추측되는 부위를 PSI-BLAST 프로그램을 이용하여 도출하였다.
그 결과, mepA 단백질의 총 7종 변이로 S32M, G36N, N39D, L59F, F62M, D183A 및 L288M을 도출하였다.
실시예 6. mepA 유전자 변이체 발현 벡터의 제작
실시예 6-1. mepA 유전자 변이체의 합성
실시예 3-1에서 합성한 서열번호 3의 mepA_opti 유전자에 상기 도출한 7종 변이를 각각 반영한 mepA 유전자 변이체를 코스모진텍사(대한민국)에 의뢰하여 합성하였다. 구체적으로, 각각 서열번호 15 내지 21의 염기서열로 구성되는 7종 유전자 변이체의 5' 말단에 XbaI 제한효소 부위를 삽입하고 3' 말단에 SacI 제한효소 부위를 삽입하여 발현 벡터 제작을 위한 유전자 변이체를 합성하였고, 이들을 mepA_opti_S32M, mepA_opti_G36N, mepA_opti_N39D, mepA_opti_L59F, mepA_opti_F62M, mepA_opti_D183A 및 mepA_opti_L288M으로 명명하였다.
실시예 6-2. mepA 유전자 변이체 발현 벡터의 제작
합성한 mepA 유전자 변이체를 이용하여 상기 실시예 3-2 및 3-3에 기재된 것과 동일한 방법으로 발현 벡터를 제작하였고, 제작한 플라스미드들을 각각 pCL-DtrpL-mepA_opti_S32M, pCL-DtrpL-mepA_opti_G36N, pCL-DtrpL-mepA_opti_N39D, pCL-DtrpL-mepA_opti_L59F, pCL-DtrpL-mepA_opti_F62M, pCL-DtrpL-mepA_opti_D183A, pCL-DtrpL-mepA_opti_L288M로 명명하였다.
실시예 7. mepA 유전자 변이체 발현 벡터를 도입한 균주의 제작
비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능에 대한 mepA 유전자 변이체 발현의 효과를 확인하기 위해 실시예 6에서 제조한 mepA 유전자 변이체 발현 벡터들을 이용한 것을 제외하고는 상기 실시예 4에 기재된 것과 동일한 방법으로 mepA 유전자 변이체 발현 벡터를 도입한 균주를 제작하고, 형질전환을 확인하였다. 제작한 균주들을 각각 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_S32M, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_G36N, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_N39D, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59F, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_F62M, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183A, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L288M, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_S32M, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_G36N, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE /pCL-DtrpL-mepA_opti_N39D, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59F, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_F62M, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183A 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L288M으로 명명하였다.
실험예 3. mepA 유전자 변이체 발현 벡터를 도입한 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능 평가
상기 실시예 6에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 실험예 2에 기재된 것과 동일한 방법으로 평가하여 표 3에 나타내었다.
균주명 OD(660 ㎚ 흡광) 비올라세인(배양액 리터당 ㎎) 디옥시비올라세인(배양액 리터당 ㎎)
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL1920 32.4 526.8 132.6
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_S32M 33.9 560.2 140.6
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_G36N 34.5 556.4 142.6
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_N39D 33.9 557.9 148.2
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59F 34.8 586.0 158.0
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_F62M 35.6 569.1 144.0
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183A 34.7 597.9 161.8
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L288M 32.9 566.9 142.3
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL1920 35.6 0.0 672.2
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_S32M 34.5 0.0 702.6
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_G36N 36.2 0.0 742.9
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_N39D 35.6 0.0 756.6
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59F 33.4 0.0 776.8
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_F62M 35.7 0.0 763.6
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183A 35.8 0.0 784.2
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L288M 36.2 0.0 749.8
상기 표 3에 나타낸 것과 같이, mepA 유전자 변이체 발현 벡터를 도입한 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 각각의 대조군과 비교하였을 때, 비올라세인 생산능은 대조군 대비 약 6 내지 14% 증가하였고, 디옥시비올라세인 생산능은 대조군 대비 약 5 내지 22% 증가하였다. mepA 유전자 변이 중 D183A 및 L59F 변이가 비올라세인 및 디옥시비올라세인 수율 증가에 우수한 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 8. 추가 mepA 유전자 변이체 발현 벡터 및 이를 도입한 균주의 제작
상기 실험예 3에서 우수한 비올라세인 및 디옥시비올라세인 수율 증가 효과를 확인한 D183A 및 L59F에 대하여, 동일한 위치의 다른 추가적인 변이가 비올라세인류 수율 증가에 효과가 있는지 여부를 확인하기 위하여, mepA_opti 아미노산 서열의 D183E, D183L, L59M 및 L59N 변이체를 발현하는 벡터 및 이를 도입한 균주를 하기와 같이 제작하였다.
구체적으로, mepA 단백질의 D183E, D183L, L59M 및 L59N 변이에 대하여 서열번호 22 내지 25로 각각 표시되는 mepA 유전자 변이체를 합성한 것을 제외하고는 상기 실시예 6-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 mepA 유전자 변이체를 합성하였고, 각각 mepA_opti_D183E, mepA_opti_D183L, mepA_opti_L59M 및 mepA_opti_L59N로 명명하였다.
합성한 mepA 유전자 변이체를 이용하여 실시예 6-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 mepA 유전자 변이체 벡터를 제작하였고, 각각 pCL-DtrpL-mepA_opti_D183E, pCL-DtrpL-mepA_opti_D183L, pCL-DtrpL-mepA_opti_L59M 및 pCL-DtrpL-mepA_opti_L59N으로 명명하였다.
제작한 mepA 유전자 변이체 발현 벡터들을 이용한 것을 제외하고는 상기 실시예 7에 기재된 것과 동일한 방법으로 mepA 유전자 변이체 발현 벡터를 도입한 균주를 제작하고, 형질전환을 확인하였다. 제작한 균주들을 각각 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183E, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183L, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59M, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59N, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183E, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183L, W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59M 및 W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59N으로 명명하였다.
실험예 4. 추가 mepA 유전자 변이체 발현 벡터를 도입한 균주의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능 평가
상기 실시예 8에서 제조한 균주들의 비올라세인 및 디옥시비올라세인 생산능을 실험예 2에 기재된 것과 동일한 방법으로 평가하여 각각 D183A 변이체 및 L59F 변이체의 비올라세인류 생산능과 비교하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.
균주명 OD(660 ㎚ 흡광) 비올라세인(배양액 리터당 ㎎) 디옥시비올라세인(배양액 리터당 ㎎)
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL1920 32.4 518.8 124.6
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183A 34.7 581.9 153.8
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183E 33.2 564.0 142.7
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183L 34.0 555.7 149.7
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59F 34.8 578.0 153.2
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59M 34.0 551.8 139.9
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABCDE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59N 33.5 569.3 141.4
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL1920 35.6 0.0 664.2
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183A 35.8 0.0 773.0
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183E 33.6 0.0 731.7
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_D183L 34.8 0.0 752.2
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59F 33.4 0.0 768.8
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59M 32.9 0.0 748.2
W3110/pECCG117-Ptrc-vioABC-Ptrc-vioE/pCL-DtrpL-mepA_opti_L59N 35.8 0.0 731.8
상기 표 4에 나타낸 것과 같이, 비올라세인류의 수율은 D183E 또는 D183L 변이 시, D183A 변이 대비 향상되지 않았으나, 대조군 균주보다는 향상되었고, L59M 또는 L59N 변이 시, L59F 변이 대비 향상되지 않았으나, 대조군 균주보다는 향상되었다. 따라서, mepA 유전자가 변이된 형질전환체를 이용하여 비올라세인 또는 디옥시비올라세인을 생산할 경우, mepA 단백질의 비올라세인류 수송에 따라 비올라세인류 생산능이 증가하는 것을 알 수 있다.

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 N-말단으로부터 32번째 세린, 36번째 글리신, 39번째 아스파라긴, 59번째 루신, 62번째 페닐알라닌, 183번째 아스파르트산 및 288번째 루신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 치환(substitution)을 포함하고,
    서열번호 1과 적어도 90% 및 100% 미만의 상동성을 갖는 다중약물 유출펌프(multidrug efflux pump, mepA) 변이체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아미노산 치환은 상기 서열번호 1의 N-말단으로부터 32번째 세린의 메티오닌으로의 치환(S32M), 36번째 글리신의 아스파라긴으로의 치환(G36N), 39번째 아스파라긴의 아스파르트산으로의 치환(N39D), 59번째 루신의 페닐알라닌으로의 치환(L59F), 59번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L59M), 59번째 루신의 아스파라긴으로의 치환(L59N), 62번째 페닐알라닌의 메티오닌으로의 치환(F62M), 183번째 아스파르트산의 알라닌으로의 치환(D183A), 183번째 아스파르트산의 글루타메이트로의 치환(D183E), 183번째 아스파르트산의 루신으로의 치환(D183L) 및 288번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L288M)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, mepA 변이체.
  3. 제1항 또는 제2항의 mepA 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  4. mepA 변이체를 포함하는 재조합 미생물로서,
    상기 mepA 변이체는, 서열번호 1의 N-말단으로부터 32번째 세린, 36번째 글리신, 39번째 아스파라긴, 59번째 루신, 62번째 페닐알라닌, 183번째 아스파르트산 및 288번째 루신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 잔기에서 아미노산 치환(substitution)을 포함하고, 서열번호 1과 적어도 90% 및 100% 미만의 상동성을 갖는 것인, 미생물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 아미노산 치환은 상기 서열번호 1의 N-말단으로부터 32번째 세린의 메티오닌으로의 치환(S32M), 36번째 글리신의 아스파라긴으로의 치환(G36N), 39번째 아스파라긴의 아스파르트산으로의 치환(N39D), 59번째 루신의 페닐알라닌으로의 치환(L59F), 59번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L59M), 59번째 루신의 아스파라긴으로의 치환(L59N), 62번째 페닐알라닌의 메티오닌으로의 치환(F62M), 183번째 아스파르트산의 알라닌으로의 치환(D183A), 183번째 아스파르트산의 글루타메이트로의 치환(D183E), 183번째 아스파르트산의 루신으로의 치환(D183L) 및 288번째 루신의 메티오닌으로의 치환(L288M)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 미생물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 미생물은 에세리키아(Escherichia) 속인 것인 미생물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 미생물은 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자를 가지고 있는 것인 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자는 크로모박테리움(Chromobacterium) 속 유래인, 미생물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 비올라세인 또는 디옥시비올라세인 생합성 유전자는 vioABCDE 또는 vioABCE를 포함하는 것인 미생물.
  10. 제4항의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
    배지 또는 상기 미생물로부터 목적산물을 회수하는 단계를 포함하고,
    상기 목적산물은, 비올라세인, 디옥시비올라세인, 또는 이들의 조합인, 목적산물을 제조하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023021108A1 (en) * 2021-08-17 2023-02-23 Justus-Liebig-Universität Giessen Chromosomal integrating cassette allowing inducible gene expression for production of compounds via fermentation

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110183384A1 (en) * 2008-07-11 2011-07-28 Xinhui Xing Recombinant bacteria for producing deoxyviolacein and uses thereof
US20110294183A1 (en) * 2010-05-25 2011-12-01 The Regents Of The University Of California Modified Host Cells with Efflux Pumps
KR20190005707A (ko) * 2017-07-07 2019-01-16 울산과학기술원 디옥시바이오라세인 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 그를 이용한 디옥시바이오라세인을 생산하는 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110183384A1 (en) * 2008-07-11 2011-07-28 Xinhui Xing Recombinant bacteria for producing deoxyviolacein and uses thereof
US20110294183A1 (en) * 2010-05-25 2011-12-01 The Regents Of The University Of California Modified Host Cells with Efflux Pumps
KR20190005707A (ko) * 2017-07-07 2019-01-16 울산과학기술원 디옥시바이오라세인 생산능이 향상된 재조합 미생물 및 그를 이용한 디옥시바이오라세인을 생산하는 방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE Protein GenPept; ANONYMOUS: "MULTISPECIES: multidrug efflux MATE transporter MepA [Staphylococcus] - Protein - NCBI", XP055824455, retrieved from NCBI *
SCHINDLER BRYAN D., SEO SUSAN M., BIRUKOU IVAN, BRENNAN RICHARD G., KAATZ GLENN W.: "Mutation within the mepa operator affect binding of the mepr regulatory protein and its induction by mepa substrates in staphylococcus aureus.", JOURNAL OF BACTERIOLOGY (PRINT), AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US, vol. 197, no. 6, 15 March 2015 (2015-03-15), US, pages 1104 - 1114, XP055824458, ISSN: 0021-9193, DOI: 10.1128/JB.02558-14 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023021108A1 (en) * 2021-08-17 2023-02-23 Justus-Liebig-Universität Giessen Chromosomal integrating cassette allowing inducible gene expression for production of compounds via fermentation

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