ES2754355T3 - Microorganismo que tiene un nivel de energía intracelular mejorado y procedimiento de producción de L-aminoácidos utilizando el mismo - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de producción de L-aminoácidos, comprendiendo el procedimiento: cultivar un microorganismo del género Escherichia en un medio y recuperar L-aminoácidos de los medios de cultivo o del microorganismo; en el que el microorganismo tiene un nivel de ATP intracelular aumentado, en comparación con una cepa no modificada, en el que una o más proteínas seleccionadas de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 y una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, que constituyen un sistema de absorción de hierro, están inactivadas en el microorganismo; en el que el microorganismo del género Escherichia tiene una capacidad mejorada para producir L-aminoácido, en comparación con una cepa no modificada; y en el que el L-aminoácido es L-treonina o L-triptófano.

Description

DESCRIPCIÓN

Microorganismo que tiene un nivel de energía intracelular mejorado y procedimiento de producción de L-aminoácidos utilizando el mismo

Campo técnico

La presente solicitud se refiere a un microorganismo recombinante que tiene un nivel de energía intracelular mejorado y a un procedimiento para producir L-aminoácidos utilizando el microorganismo.

Antecedentes de la técnica

Para la producción de un material deseado utilizando un microorganismo, se han utilizado principalmente planteamientos específicos del material deseado, tales como la mejora de la expresión de genes que codifican enzimas involucradas en la producción del material deseado o la eliminación de genes innecesarios. Por ejemplo, se han desarrollado varias cepas útiles que incluyen a E. coli capaces de producir un L-aminoácido deseado con un alto rendimiento mediante la mejora de una ruta biosintética del L-aminoácido. La producción de alto rendimiento de los materiales útiles deseados utilizando microorganismos requiere la producción y el mantenimiento de suficiente energía.

Para la biosíntesis in vivo de materiales tales como proteínas, ácidos nucleicos, etc., se utiliza energía conservada en forma de NADH, NADPH y ATP (adenosina-5'-trifosfato). Particularmente, el ATP es un portador de energía que transporta la energía química producida en reacciones metabólicas a diversas actividades de los organismos.

El ATP se produce principalmente en procesos metabólicos de microorganismos. Las principales vías de producción de ATP intracelular son la fosforilación a nivel de sustrato que tiene lugar a través de la glucólisis o la fosforilación oxidativa que produce ATP a través del sistema de transporte de electrones utilizando el poder reductor acumulado en el NADH, etc., a través de la glucólisis. El ATP generado se consume in vivo en actividades tales como la biosíntesis, movimiento, transducción de señales y división celular. Por lo tanto, los microorganismos industriales utilizados para la producción de los materiales útiles deseados generalmente muestran una alta demanda de ATP. Por consiguiente, se han realizado estudios para mejorar la productividad aumentando los niveles de energía intracelular en la producción en masa de materiales útiles deseados (Biotechnol Adv (2009) 27:94-101).

El hierro es uno de los elementos esenciales para el mantenimiento de la homeostasis de los microorganismos, y E. coli utiliza varias rutas para la absorción de hierro (Mol Microbiol (2006) 62:120-131). Una de las rutas de absorción de hierro es absorber hierro a través de canales complejos de FhuCDB formados por proteínas FhuC, FhuD y FhuB. Recientemente, se reveló que, en presencia de exceso de L-triptófano en las células, la proteína TrpR que regula la expresión de genes implicados en la biosíntesis de L-triptófano forma un complejo con L-triptófano y, a su vez, este complejo se une a una región reguladora del operón fhuCDB, sugiriendo la posibilidad de una correlación entre la absorción de hierro a través del complejo proteico FhuCDB y la biosíntesis de L-triptófano. Sin embargo, la función del complejo proteico FhuCDB en la biosíntesis de L-triptófano, y su efecto sobre la absorción de hierro aún no se tiene clara (Nat Chem Biol (2012) 8:65-71).

El documento EP 1829965 se refiere a una cepa mutante de E. coli que tiene un ADN cromosómico que es al menos 470 kpb más corto que el de una cepa de E. coli de tipo salvaje, y que muestra la propiedad de que el número de células después de un cierto período en cultivo es mayor que el de una cepa de tipo salvaje.

El documento WO 2007/024756 se refiere a cepas de E. coli MGl 655 con el genoma reducido. El documento WO 2007/024756 menciona cepas que tienen una o más de una tasa de crecimiento, eficiencia de transformación, expresión de proteínas, producción de ADN, rendimiento de ADN y/o calidad de ADN igual o mejorada en comparación con la cepa parental y las cepas disponibles comercialmente.

Mademidis y col., 1998, Molecular and General Genetics, 258 (12): 156-165 se refiere a la actividad transportadora de derivados de FhuA, FhuC, FhuD y FhuB en un sistema libre de efectos polares y a la estequiometría de los componentes involucrados en la absorción de ferricromo.

El documento WO 02/077183 se refiere a secuencias de ácidos nucleicos antisentido que inhiben la proliferación de procariotas.

Los presentes inventores han estudiado procedimientos para mejorar los niveles de ATP y aumentar la capacidad de producción de materiales deseados útiles tales como los L-aminoácidos, y descubrieron que los niveles de ATP intracelular pueden mejorarse mediante la inactivación de la función del complejo proteico FhuCDB mediante la eliminación del gen fhuCDB y, como resultado, se puede aumentar la capacidad de producción de los materiales deseados, completando de esta forma la presente solicitud.

Descripción detallada de la invención

PROBLEMA TÉCNICO

Un objeto de la presente solicitud es proporcionar un microorganismo que tiene un nivel de ATP intracelular mejorado.

Otro objeto de la presente solicitud es proporcionar un procedimiento para producir un material deseado utilizando el microorganismo que tiene el nivel de ATP intracelular mejorado.

SOLUCIÓN TÉCNICA

La invención es tal y como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención proporciona un procedimiento para producir L-aminoácidos, comprendiendo el procedimiento:

cultivar un microorganismo del género Escherichia en un medio y

recuperar L-aminoácidos de los medios de cultivo o del microorganismo;

en el que el microorganismo tiene un nivel de ATP intracelular aumentado, en comparación con una cepa no modificada, en el que una o más proteínas seleccionadas de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 y una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, que constituyen un sistema de absorción de hierro, están inactivadas en el microorganismo;

en el que el microorganismo del género Escherichia tiene una capacidad mejorada para producir L-aminoácido, en comparación con una cepa no modificada; y

en el que el L-aminoácido es L-treonina o L-triptófano.

El microorganismo es un microorganismo en el cual las actividades de una o más de la proteína FhuC, la proteína FhuD y la proteína FhuB que constituyen el sistema de absorción de hierro, están inactivadas y, por lo tanto, tiene un mayor nivel de ATP intracelular, en comparación con una cepa no modificada.

El término "FhuCDB", como se usa en el presente documento, es un componente de un sistema de absorción de hierro (sistema fhu) que incluye productos de expresión de fhuA, fhuC, fhuD y fhuB dispuestos en un operón. El fhuA codifica el OMP multifuncional FhuA (79 kDa) que actúa como un receptor para ferricromo-hierro, bacteriófagos, toxinas bacterianas y antibióticos. FhuA es específico de Fe3+-ferricromo, y actúa como un canal de apertura específica de ligando (Protein Sci 7, 1636-1638). Las otras proteínas del sistema fhu, en concreto, FhuD, FhuC y FhuB también son esenciales para las funciones del sistema de absorción de hierro. Una proteína periplásmica, FhuD y proteínas asociadas a la membrana citoplasmática, FhuC y FhuB forman el complejo FhuCDB, que funciona para transportar ferricromo y otros compuestos de Fe3+-hidroxamato (Fe3+-aerobactina, Fe3+-coprogen) a través de la membrana citoplasmática desde el periplasma al citoplasma (J Bacteriol 169, 3844-3849). La absorción de hierro a través del complejo FhuCDB consume una molécula de ATP, y para este proceso de absorción de hierro, un complejo proteico, TonB-ExbB-ExbD proporciona energía (FEBS Lett 274, 85-88).

FhuC codifica una proteína asociada a la membrana citoplasmática de 29 kDa y forma un canal para la absorción de hierro, junto con FhuD y FhuB. FhuC puede tener una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5 y, específicamente, FhuC puede estar codificado por la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1.

FhuD codifica una proteína asociada a la membrana citoplasmática de 31 kDa y forma un canal para la absorción de hierro, junto con FhuC y FhuB. FhuD puede tener una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 y, específicamente, FhuD puede estar codificado por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2.

FhuB codifica una proteína asociada a la membrana citoplasmática de 41 kDa y forma un canal para la absorción de hierro, junto con FhuC y FhuB. FhuB puede tener una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7 y, específicamente, FhuB puede estar codificado por una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 3.

Específicamente, aunque las proteínas tienen actividades idénticas, hay pequeñas diferencias en las secuencias de aminoácidos entre los sujetos. Por lo tanto, FhuC, FhuD y FhuB pueden tener las SEQ ID NO: 5, 6 y 7, respectivamente. Además, en las secuencias de nucleótidos, se pueden hacer varias modificaciones en la región codificante siempre que no cambien las secuencias de aminoácidos de las proteínas expresadas a partir de la región codificante, debido a la degeneración de codones o teniendo en cuanta los codones preferentes por el organismo en el que se van a expresar. La secuencia de nucleótidos descrita anteriormente se proporciona solo como un ejemplo de varias secuencias de nucleótidos elaboradas mediante un procedimiento bien conocido por los expertos en la materia, pero sin limitarse al mismo.

El término "homología", como se usa en el presente documento, se refiere a un grado de identidad entre bases o restos de aminoácidos después de que ambas secuencias se alinean para que coincidan mejor en ciertas regiones comparables en una secuencia de aminoácidos o nucleótidos de un gen que codifica una proteína. Si la homología es suficientemente alta, los productos de expresión de los genes correspondientes pueden tener una actividad idéntica o similar. El porcentaje de la identidad de secuencia puede determinarse usando un programa de comparación de secuencias conocido, por ejemplo, BLASTN (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign™ (DnAs TAR Inc), etc.

El término "microorganismo", como se usa en el presente documento, se refiere a un microorganismo que tiene el nivel de ATP intracelular mejorado y que es del género Escherichia. Específicamente, el microorganismo puede ser E. coli.

La "cepa no modificada", como se usa en el presente documento, se refiere a un microorganismo que no esta modificado por una técnica de biología molecular tal como la mutación o la recombinación. Específicamente, la cepa no modificada se refiere a un microorganismo antes de aumentar el nivel de ATP intracelular, en el cual el nivel intracelular de ATP se aumenta al inactivar uno o más de uno de FhuC, FhuD y FhuB que constituyen el sistema de absorción de hierro, complejo FhuCDB, teniendo así una reducción del consumo intracelular de ATP. Es decir, la cepa no modificada se refiere a un microorganismo original del cual deriva el microorganismo recombinante.

El microorganismo incluye la inactivación de uno o más de uno de FhuC, FhuD y FhuB y, específicamente, la inactivación de una combinación de FhuC, FhuD y FhuB y, más específicamente, la inactivación de todo FhuC, FhuD y FhuB.

El término "inactivación", como se usa en el presente documento, significa que la actividad de la proteína correspondiente se elimina o debilita por mutación debido a la deleción, sustitución o inserción de parte o la totalidad del gen que codifica la correspondiente proteína, por modificación de una secuencia reguladora de la expresión para reducir la expresión del gen, por modificación de la secuencia del gen cromosómico para debilitar o eliminar la actividad de la proteína, o por combinaciones de las mismas.

Específicamente, la deleción de parte o de la totalidad del gen que codifica la proteína puede realizarse mediante el reemplazo de un polinucleótido que codifica una proteína diana endógena en el cromosoma, con un polinucleótido del que se elimina una secuencia parcial o con un gen marcador a través de un vector de inserción en el cromosoma bacteriano. Además, se puede inducir una mutación usando un mutágeno tal como sustancias químicas o luz UV, obteniendo de este modo un mutante que tiene la deleción del gen correspondiente, pero sin limitarse al mismo.

La expresión "secuencia reguladora de la expresión", como se usa en el presente documento, una secuencia de nucleótidos que regula una expresión génica, se refiere a un segmento capaz de aumentar o disminuir la expresión de un gen particular en un sujeto, y puede incluir un promotor, un sitio de unión del factor de transcripción, un sitio de unión a ribosomas, y una secuencia que regula la terminación de la transcripción y la traducción, pero sin limitarse al mismo.

Específicamente, la modificación de la secuencia reguladora de la expresión para causar una disminución en la expresión génica puede realizarse induciendo mutaciones en la secuencia reguladora de la expresión mediante deleción, inserción, sustitución conservativa o no conservativa de la secuencia de nucleótidos o una combinación de las mismas para debilitar aún más la actividad de la secuencia reguladora de la expresión, o reemplazando la secuencia reguladora de la expresión con la secuencia que tiene una actividad más débil, pero sin limitarse al mismo.

El microorganismo es un microorganismo del género Escherichia que tiene una capacidad de producción mejorada de los L-aminoácidos L-treonina o L-triptófano, en comparación con una cepa no modificada. En el microorganismo del género Escherichia de la presente solicitud, una o más de las proteínas que constituyen el complejo FhuCDB se inactivan para inactivar la vía de absorción de hierro y, por lo tanto, la absorción de hierro a través de esta vía reduce el consumo de ATP. Como resultado, el microorganismo del género Escherichia tiene un nivel mejorado de ATP intracelular, en comparación con la cepa no modificada y, en consecuencia, el microorganismo tiene la capacidad de producción mejorada de los L-aminoácidos L-treonina o L-triptófano.

La expresión "microorganismo que tiene la capacidad de producción mejorada" se refiere a un microorganismo que tiene una capacidad de producción mejorada de los L-aminoácidos L-treonina o L-triptófano, en comparación con una cepa no modificada o una célula parental antes de la modificación.

En una realización específica, el microorganismo puede ser E. coli que tiene una capacidad de producción de L-triptófano mejorada, en el que dichas una o más de FhuC, FhuD y FhuB de E. coli que tienen una capacidad de producción de L-triptófano se inactivaron, y que tiene un nivel de ATP intracelular mejorado, en comparación con una cepa no modificada. La E. coli que tiene la capacidad de producción de L-triptófano se puede obtener aumentando la expresión de un gen del operón de L-triptófano, eliminando la inhibición por retroalimentación por producto final del L-triptófano, o eliminando la inhibición y la atenuación del gen del operón de L-triptófano a nivel transcripcional, pero sin limitarse al mismo.

En una realización específica de la presente solicitud, el microorganismo puede ser E. coli que tiene una capacidad de producción mejorada de L-treonina, en el que dichas una o más de FhuC, FhuD y FhuB de la E. coli que tiene una capacidad de producción de L-treonina se inactivaron y que tiene un nivel de ATP intracelular mejorado, en comparación con una cepa no modificada. La E. coli que tiene la capacidad de producción de L-treonina puede obtenerse aumentando la expresión de un gen del operón de L-treonina, eliminando la inhibición por retroalimentación por producto final de la L-treonina, o eliminando la inhibición y atenuación del gen del operón de L-treonina a nivel transcripcional, pero sin limitarse al mismo.

En el procedimiento para producir L-aminoácidos de acuerdo con una realización específica de la presente solicitud, el cultivo del microorganismo que tiene la capacidad de producción de L-aminoácidos puede realizarse de acuerdo con un medio apropiado y en condiciones de cultivo conocidas en la técnica. Los expertos en la materia pueden ajustar fácilmente los procedimientos de cultivo de acuerdo con el microorganismo seleccionado. Los ejemplos de los procedimientos de cultivo incluyen los de tipo discontinuo, tipo continuo y de tipo discontinuo alimentado, pero no se limita a los mismos.

Un medio utilizado para el cultivo debe cumplir los requisitos para el cultivo de un microorganismo específico. Los medios de cultivo para diversos microorganismos se describen en una referencia ("Manual of Methods for General Bacteriology" por la American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981.). Estos medios incluyen una variedad de fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno y oligoelementos. La fuente de carbono incluye hidratos de carbono tales como la glucosa, lactosa, sacarosa, fructosa, maltosa, almidón y celulosa; lípidos tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de ricino y aceite de coco; ácidos grasos tales como el ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico; alcoholes tales como glicerol y etanol; y ácidos orgánicos tales como el ácido acético. Estas fuentes de carbono pueden utilizarse solas o en conjunto, pero sin limitarse a las mismas. La fuente de nitrógeno incluye fuentes de nitrógeno orgánico, tales como peptona, extracto de levadura, jugo de carne, extracto de malta, licor de maceración de maíz (CSL) y harina de frijol y fuentes de nitrógeno inorgánico tales como urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Estas fuentes de nitrógeno pueden utilizarse solas o en conjunto, pero sin limitarse a las mismas. Adicionalmente, el medio puede incluir dihidrógeno fosfato de potasio, hidrogeno fosfato de dipotasio y las correspondientes sales que contienen sodio de los mismos como fuente de fósforo, pero sin limitarse al mismo. También, el medio puede incluir un metal tal como el sulfato de magnesio o el sulfato de hierro. Además, también se pueden agregar aminoácidos, vitaminas y precursores apropiados.

Además, para mantener el cultivo en condiciones aeróbicas, se puede inyectar oxígeno o gas que contiene oxígeno (por ejemplo, aire) en el cultivo. La temperatura del cultivo puede ser generalmente de 20 °C-45 °C y, específicamente, de 25 °C-40 °C. El cultivo puede continuar hasta que la producción de L-aminoácidos tales como L-treonina o L-triptófano alcance el nivel deseado y, específicamente, un tiempo de cultivo puede ser de 10 horas-100 horas.

El procedimiento para producir L-aminoácidos de acuerdo con la presente solicitud incluye la recuperación de los L-aminoácidos L-treonina o L-triptófano a partir de los medios de cultivo o del microorganismo así obtenido. La recuperación de L-aminoácidos puede realizarse mediante un procedimiento apropiado conocido en la técnica, dependiendo del procedimiento de cultivo del microorganismo de la presente solicitud, por ejemplo, de tipo discontinuo, tipo continuo o de tipo discontinuo alimentado, con el fin de purificar o recuperar los L-aminoácidos deseados del cultivo del microorganismo, pero sin limitarse al mismo.

Efectos ventajosos de la invención

De acuerdo con la presente solicitud, cuando un microorganismo del género Escherichia tiene un nivel mejorado de ATP intracelular, en comparación con una cepa no modificada, y se usa un procedimiento para producir un material deseado usando el mismo, el alto nivel de ATP intracelular mejora la expresión génica, la biosíntesis, el transporte de materiales, etc., produciendo eficientemente de esta manera el material útil deseado incluyendo proteínas, L-aminoácidos, etc.

Descripción de los dibujos

La figura 1 muestra los niveles de ATP intracelular de E. coli de acuerdo con una realización específica de la presente solicitud, en comparación con una cepa no modificada;

La figura 2 muestra los niveles de ATP intracelular de E. coli derivada del tipo salvaje que tiene una capacidad de producción de L-triptófano de acuerdo con una realización específica de la presente solicitud, en comparación con una cepa no modificada;

La figura 3 muestra los niveles intracelulares de ATP de E. coli que tiene una capacidad de producción de L-treonina de acuerdo con una realización específica de la presente solicitud, en comparación con una cepa no modificada;

La figura 4 muestra los niveles intracelulares de ATP de la E. coli que tiene una capacidad de producción de L-triptófano de acuerdo con una realización específica de la presente solicitud, en comparación con una cepa no modificada;

La figura 5 muestra la capacidad de producción de L-treonina de E. coli que tiene una capacidad de producción de L-treonina de acuerdo con una realización específica de la presente solicitud, en comparación con una cepa no modificada; y

La figura 6 muestra la capacidad de producción de L-triptófano de E. coli que tiene una capacidad de producción de L-triptófano de acuerdo con una realización específica de la presente solicitud, en comparación con una cepa no modificada.

Descripción de la invención

En lo sucesivo en el presente documento, la presente solicitud se describirá con más detalle con referencia a ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos son solo para fines ilustrativos y no se pretende que el ámbito de la presente solicitud esté limitado por estos ejemplos.

Ejemplo 1: Preparación de E. coli W3110 de tipo salvaje que tiene inactivación de proteínas codificadas por los genes fhuC, fhuD y fhuB

En este ejemplo, los genes fhuC, fhuD y fhuB de E. coli W3110 (ATCC® 39936™) de tipo salvaje se eliminaron mediante recombinación homóloga, respectivamente.

Los genes fhuC, fhuD y fhuB que van a ser eliminados tienen secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NO: 1, 2 y 3, respectivamente, y estos genes existen en la forma del operón de la SEQ ID NO: 4.

Para eliminar a fhuC, fhuD y fhuB, se realizó una inactivación en un solo paso utilizando la recombinasa lambda Red desarrollada por Datsenko KA, y col. (Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640-6645). A modo de marcador para confirmar la inserción en el gen, se utilizó un gen de cloranfenicol de pUCprmfmloxC, que se preparó ligando un promotor rmf a pUC19 (New England Biolabs (USA)) y ligando un casete mutado loxP-CmR-loxP obtenido de pACYC184 (New England Biolab) al mismo (solicitud de patente coreana N.° 2009-0075549).

Primero, la reacción primaria en cadena de la polimerasa (más adelante denominada 'PCR') se realizó usando el pUCprmfmloxC como una plantilla y combinaciones de cebadores de las SEQ ID NO: 8 y 9, 10 y 11, 12 y 13, y 8 y 13 que tienen una parte de los genes fhuC y fhuB y una secuencia parcial del gen de resistencia al cloranfenicol del gen pUCprmfmloxC bajo las condiciones de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y elongación a 72 °C durante 1 minuto, obteniendo de esta manera productos de PCR de aproximadamente 1,2 kb, AfhuC1st, AfhuD1st, AfhuB1st y AfhuCDB1st.

A continuación, los productos de PCR de 1,2 kb, AfhuC1st, AfhuD1st, AfhuB1st y AfhuCDB1st obtenidos por PCR se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8 % y luego se eluyeron y se usaron como plantilla para la PCR secundaria. La PCR secundaria se realizó usando los productos eluidos de la PCR primaria como plantillas y las combinaciones de cebadores de las SEQ ID NO: 14 y 15, 16 y 17, 18 y 19, 14 y 19 que contienen secuencias de nucleótidos de 20 pb de las regiones 5' y 3' de los productos de PCR obtenidos en la PCR primaria bajo las condiciones de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 segundos, hibridación a 55 °C durante 30 segundos y elongación a 72 °C durante 1 minuto, obteniendo de esta manera productos de PCR de aproximadamente 1,3 kb, AfhuC, AfhuD, AfhuB y AfhuCDB. Los productos de PCR obtenidos de este modo se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%, luego se eluyeron y se usaron en recombinación.

La E. coli W3110, que se transformó con un vector pKD46 de acuerdo con el procedimiento de inactivación en un paso desarrollado por Datsenko KA y col. (Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640-6645), se preparó a modo de cepa competente, y la transformación se realizó introduciendo el fragmento de gen de 1,3 kb obtenido mediante la p Cr primaria y secundaria. Las cepas se cultivaron en el medio LB suplementado con cloranfenicol y se seleccionaron los transformantes que tienen resistencia al cloranfenicol. La eliminación de alguno o de la totalidad de fhuC, fhuD y fhuB se confirmó mediante los productos de PCR de aproximadamente 4,4 kb, aproximadamente 4,3 kb, aproximadamente 3,3 kb, y aproximadamente 1,6 kb que se amplificaron por PCR utilizando genomas obtenidos de las cepas seleccionadas como plantillas y los cebadores de las SEQ ID NO: 20 y 21.

Después de la eliminación de pKD46 de las cepas recombinantes primarias que tienen resistencia al cloranfenicol obtenidas de este modo, se introdujo un vector pJW168 (Gene, (2000) 247, 255-264) en las cepas recombinantes primarias que tienen resistencia al cloranfenicol para eliminar el gen marcador de cloranfenicol de las cepas (Gene, (2000) 247, 255-264). Se realizó una PCR utilizando cebadores de las SEQ ID NO: 20 y 21 para obtener productos de PCR de aproximadamente 3,4 kb, aproximadamente 3,3 kb, aproximadamente 2,2 kb y aproximadamente 0,6 kb, manifestando que las cepas finalmente obtenidas tenían deleción de alguno o de la totalidad de los genes fhuC, fhuD y fhuB. Las cepas se designaron como E. coli W3110_AfhuC, W3110_AfhuD, W3110_AfhuB y W3110_AfhuCDB, respectivamente.

Ejemplo 2: Medición de los niveles de ATP intracelular en el derivado de E. coli de tipo salvaje con los genes fhuC, fhuD y fhuB eliminados

En este ejemplo, Los niveles intracelulares de ATP en las cepas preparadas en el ejemplo 1 se midieron de manera práctica.

Para este fin, se empleó "An Efficient Method for Quantitative determination of Cellular ATP Synthetic Activity" ("Un Procedimiento Eficaz para la determinación Cuantitativa de la Actividad Sintética de ATP Celular") desarrollado por Kiyotaka Y. Hara y col., en el que se usa la luciferasa, (J Biom Scre, (2006) Vol. 11, N.° 3, p. 310-17). En resumen, La E. coli W3110, que es una cepa no modificada utilizada en el ejemplo 1 y la E. coli W3110_AfhuCDB obtenida por deleción génica se cultivaron respectivamente durante la noche en un medio líquido LB que contiene glucosa. Después del cultivo, los sobrenadantes se retiraron por centrifugación, las células obtenidas de este modo se lavaron con Tris-Cl 100 mM (pH 7,5) y luego se trataron con tampón PB (tampón permeable: 40 % [v/v] de glucosa, 0,8% [v/v] de Triton X-100) durante 30 minutos para liberar el ATP intracelular de las células. A continuación, los sobrenadantes se retiraron mediante centrifugación y se añadió luciferina como sustrato para la luciferasa a las células. Las células se dejaron reaccionar durante 10 minutos. La producción de color por la luciferasa se midió usando un luminómetro para determinar cuantitativamente los niveles de ATP. Los resultados se proporcionan en la figura 1. Los resultados de la figura 1 se registraron como el promedio de tres experimentos repetidos.

Como se muestra en la figura 1, los niveles intracelulares de ATP se incrementaron en E. coli W3110_AfhuC, W3110_AfhuD, W3110_AfhuB y W3110_AfhuCDB preparados en el ejemplo 1, y en cualesquiera o en la totalidad de los derivados de E. coli de tipo salvaje, en los que fhuC, fhuD, y fhuB fueron eliminados, en comparación con la cepa no modificada, E. coli W3110.

Ejemplo 3: Preparación de la cepa productora de L-triptófano derivada del tipo salvaje que tiene inactivación de proteínas codificadas por los genes fhuC, fhuD, y fhuB y medición de los niveles de ATP intracelular

En este ejemplo, alguno o la totalidad los genes de fhuC, fhuD y fhuB de una cepa productora de L-triptófano derivada del tipo salvaje, E. coli W3110 trpA2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA (publicación de patente coreana N.° 10-2013-0082121) fue/fueron eliminado/eliminados mediante recombinación homóloga como en el ejemplo 1 para preparar las cepas W3110 trpA2_AfhuC/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA, W3110 trpA2_AfhuD/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA, W3110 trpA2_AfhuB/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA y W3110 trpA2_AfhuCDB/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA. En estas cepas preparadas de este modo, se midieron los niveles intracelulares de ATP de la misma manera que en el ejemplo 2 y los resultados se proporcionan en la figura 2.

Como se muestra en la figura 2, se incrementaron los niveles intracelulares de ATP en las cepas, que se prepararon mediante la eliminación de alguno o de la totalidad de los genes fhuC, fhuD y fhuB en la cepa productora de L-triptófano de tipo salvaje, en comparación con una cepa no modificada y una cepa control.

Ejemplo 4: Examen de titulación de la cepa productora de L-triptófano derivada del tipo salvaje que tiene inactivación de proteínas codificadas por los genes fhuC, fhuD y thub

Como se describe en el ejemplo 3, la cepa productora de L-triptófano derivada del tipo salvaje, W3110 trpA2/pCL-Dtrp_atttrpEDCBA y las cepas con niveles mejorados de ATP intracelular preparadas mediante la eliminación de cualquiera o de la totalidad de los genes fhuC, fhuD y fhuB se sometieron a titulación utilizando glucosa como fuente de carbono.

Cada una de las cepas se inoculó mediante un asa de platino en un medio sólido LB y se cultivó en una incubadora a 37 °C durante la noche, y luego se inoculó mediante un asa de platino en 25 ml de un medio de titulación que contenía glucosa que contenía la composición de la tabla 1. Después, Las cepas se cultivaron en una incubadora a 37 °C y a 200 rpm durante 48 horas. Los resultados se proporcionan en la tabla 2. Todos los resultados se registraron como el promedio de tres experimentos repetidos.

[Tabla 1]

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[Tabla 2]

Como se muestra en la tabla 2, se demostró que las cepas con niveles mejorados de ATP intracelular, preparadas en el ejemplo 3 mediante la eliminación de alguno o de la totalidad de los genes fhuC, fhuD, y fhuB en la cepa W3110 trpA2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA de tipo salvaje productora de L-triptófano, incrementaron la producción de L-triptófano hasta aproximadamente el 63%, en comparación con la cepa no modificada trpA2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA. En vista de los niveles intracelulares de ATP constatados en la figura 2, estos resultados indican que las capacidades de producción de L-triptófano de las cepas se incrementaron por los niveles incrementados de ATP intracelular.

Ejemplo 5: Preparación de la cepa productora de L-treonina y la cepa productora de L-triptófano que tienen inactivación de proteínas codificadas por los genes fhuC, fhuD and fhuB

En este ejemplo, los genes fhuC, fhuD, y fhuB de la cepa productora de L-triptófano KCCM10812P (patente coreana N.° 0792095) y de la cepa productora de L-treonina KCCM10541 (patente coreana N.° 0576342) se eliminaron respectivamente mediante recombinación homóloga, como en el ejemplo 1.

La cepa no modificada que tiene capacidad de producción de L-triptófano, E. coli KCCM10812P es una cepa derivada de una variante de E. coli (KFCC 10066) que tiene capacidad de producción de L-fenilalanina, y es una cepa de E. coli recombinante que tiene capacidad de producción de L-triptófano, caracterizada porque la auxotrofía cromosómica de triptófano se desensibilizó o se eliminó, los genes pheA, trpR, mtr and tnaAB se atenuaron y los genes aroG and trpE se modificaron.

Además, la cepa no modificada que tiene capacidad de producción de L-treonina, E. coli KCCM10541P, es una cepa derivada de E. coli KFCC10718 (publicación de patente coreana N.° 1992-0008365), y es una E. coli que tiene resistencia al análogo de L-metionina, un fenotipo auxotrófico para metionina, resistencia al análogo de L-treonina, un fenotipo auxotrófico para isoleucina obtenido por inactivación parcial, resistencia al análogo de L-lisina y resistencia al ácido a-aminobutírico, y capacidad de producción de L-treonina.

Los genes fhuC, fhuD y fhuB a eliminar se eliminaron de E. coli KCCM10812P y E. coli KCCM10541P respectivamente, de la misma manera que en el ejemplo 1. Como resultado, se prepararon una cepa productora de L-treonina, KCCM10541_AfhuCDB, y una cepa productora de L-triptófano, KCCM108l2P_AfhuCDB.

Ejemplo 6: Medición de los niveles de ATP en cepas productoras de L-treonina y cepas productoras de L-triptófano que tienen inactivación de proteínas codificadas por los genes fhuC, fhuD yfhub

En este ejemplo, Los niveles intracelulares de ATP en las cepas preparadas en el ejemplo 5 se midieron de manera práctica.

Los niveles intracelulares de ATP se midieron de la misma manera que en el ejemplo 2. Los resultados se proporcionan en las figuras 3 y 4. Los resultados de las figuras 3 y 4 se registraron como el promedio de tres experimentos repetidos. Como grupos control, se usaron la cepa productora de L-treonina (E. coli KCCM10541P_AysaAydaS) y la cepa productora de L-triptófano (E. coli KCCMl08l2P-AysaAydaS), delecionadas con ysa e ydaS, que se sabe que tienen niveles de ATP intracelular más altos que las cepas no modificadas, E. coli KCCM10812P y E. coli KCCM10541P usadas en el ejemplo 3 (patente coreana N.° 1327093).

Como se muestra en las figuras 3 y 4, Las cepas con eliminación de fhuC, fhuD y fhuB preparadas a partir de la cepa productora de L-treonina y de la cepa productora de L-triptófano en el ejemplo 3, mostraron niveles incrementados de ATP intracelular, en comparación con la cepa no modificada y con la cepa control.

Ejemplo 7: Examen de titulación de la cepa productora de L-treonina que tiene las proteínas inactivadas codificadas por los genes fhuC, fhuD y fhub

Como se describe en el ejemplo 5, las cepas con niveles mejorados de ATP intracelular, que se prepararon por eliminación de los genes fhuC, fhuD y fhuB en un microorganismo productor de L-treonina, E. coli KCCM10541P (patente coreana N.° 0576342), se sometieron a titulación usando glucosa como fuente de carbono. La cepa productora de L-treonina delecionada con ysa e ydaS (E. coli KCCM10541P_AysaAydaS) se usó como grupo de control para comparar los resultados de la titulación.

Cada una de las cepas se cultivó en un medio sólido LB en una incubadora a 33 °C durante la noche, y luego se inoculó mediante un asa de platino en 25 ml de un medio de titulación que contiene glucosa que contiene la composición de la tabla 3. Después, Las cepas se cultivaron en una incubadora a 33 °C y a 200 rpm durante 50 horas. Los resultados se proporcionan en la tabla 4 y la figura 5. Todos los resultados se registraron como el promedio de tres experimentos repetidos.

[Tabla 3]

_________ _________

continuación

[Tabla 4]

Como se muestra en la tabla 4, se demostró que la cepa de E. coli productora de L-treonina recombinante preparada de acuerdo con la presente solicitud mostró una actividad fisiológica similar a la de la cepa no modificada, y una producción de L-treonina incrementada hasta aproximadamente un 9%, en comparación con la cepa no modificada. En vista de los niveles intracelulares de ATP constatados en la figura 3, estos resultados indican que las capacidades de producción de L-treonina de las cepas se incrementaron por el aumento de los niveles intracelulares de ATP.

Ejemplo 8: Examen de titulación de la cepa productora de L-triptófano que tiene inactivación de proteínas codificadas por los genes fhuC, fhuD and fhuB

Como se describe en el ejemplo 5, las cepas con niveles mejorados de ATP intracelular, que se prepararon por eliminación de los genes fhuC, fhuD y fhuB en un microorganismo productor de L-triptófano, KCCM10812P (patente coreana N.° 0792095), se sometieron a titulación usando glucosa como fuente de carbono. La cepa productora de L-triptófano delecionada con ysa e ydaS (E. coli KCCM10812P_AysaAydaS) se usó como grupo control para evaluar la titulación de la misma manera que en el ejemplo 4.

Los resultados se proporcionan en las tablas 5 y 6. Todos los resultados se registraron como el promedio de tres experimentos repetidos.

[Tabla 5]

Como se muestra en la tabla 5, se demostró que la cepa recombinante de E. coli productora de L-triptófano preparada de acuerdo con la presente solicitud mostró una actividad fisiológica similar a la de la cepa no modificada, y una producción de L-triptófano incrementada hasta aproximadamente un 30%, en comparación con la cepa no modificada. En vista de los niveles intracelulares de ATP constatados en la figura 4, estos resultados indican que las capacidades de producción de L-triptófano de las cepas se incrementaron por los niveles incrementados de ATP intracelular.

La cepa recombinante de la presente solicitud, CA04-2801 (KCCM10812P_AfhuCDB) se depositó en el Korean Culture Center of Microorganisms, una autoridad depositaria internacional, el 15 de noviembre de 2013, bajo la referencia N.° KCCM11474P.

<110> CJ Cheiljedang

<120> Microorganismos con nivel de ATP intracelular mejorado y procedimiento para la producción de L-aminoácidos usando los mismos

<130> PN103858

<160> 21

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211>798

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221>gen

<222> (1)..(798)

<223> ORF de fhuC

<400> 1

atgcaggaat acacgaatca ttccgatacc acttttgcac tgcgtaatat ctcctttcgt 60 gtgcccgggc gcacgctttt gcatccgctg tcgttaacct ttcctgccgg gaaagtgacc 120 ggtctgattg gtcacaacgg ttctggtaaa tccactctgc tcaaaatgct tggccgtcat 180 cagccgccgt cggaagggga gattcttctt gatgcccaac cgctggaaag ctggagcagc 240 aaagcgtttg cccgcaaagt ggcttatttg ccgcagcagc ttcctccggc agaagggatg 300 accgtgcgtg aactggtggc gattggtcgt tacccgtggc atggcgcgct ggggcgcttt 360 ggggcggcag atcgcgaaaa agtcgaggaa gctatctcgc tggttggctt aaaaccgctg 420 gcgcatcggc tggtcgatag tctctctggc ggcgaacgtc agcgggcgtg gatcgccatg 480 ctggtggcgc aggatagccg ttgtctgttg ctcgacgaac cgacctcggc gctggatatc 540 gcccaccagg ttgatgtgct gtcgctggtg caccgtttaa gtcaggagcg tggcctgacg 600 gtcattgccg tgttgcacga tatcaatatg gcggcacgct actgtgatta tctggtcgcc 660 ctgcgcggcg gtgaaatgat tgctcaggga acgcctgcgg aaattatgcg cggcgaaacc 720 ctcgaaatga tttatggcat cccgatgggt attttgccgc atccggcggg tgctgcacct 780 gtgagttttg tttattga 798 <210>2

<211> 891

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> gen

<222> (1 )..(891)

<223> ORF de fhuD

<400> 2

atgagcggct tacctcttat ttcgcgccgt cgactgttaa cggcgatggc gctttctccg 60 ttgttatggc agatgaatac cgcccacgcg gcggctattg atcccaatcg tattgtggcg 120 ctggagtggt tgccggtgga attactgctg gcgctcggca tcgtgcctta cggcgtggcg 180 gataccatca actatcgcct gtgggtcagc gaaccaccat tgccggactc agtgatcgac 240 gtcggtttgc gcacagaacc taaccttgaa ctgctgaccg aaatgaaacc atcgtttatg 300 gtctggtcgg caggatatgg cccttcacca gaaatgctgg ctcgtattgc gccgggtcgc 360 ggatttaact tcagtgacgg caaacagccg ttggcgatgg cgcgtaaatc gctgacggaa 420 atggcagatt tacttaacct gcaaagcgca gcggaaacgc atttagcgca atatgaagac 480 tttatccgca gcatgaaacc ccgctttgtg aagcgtggtg cgcgtccgtt attgctgacg 540 acgcttatcg atccgcgcca tatgctggtc ttcggtccaa acagcttgtt ccaggaaatt 600 cttgatgagt acggcatccc aaatgcctgg caaggggaaa ccaacttctg gggcagtacc 660 gccgtcagta tcgatcgtct ggcggcgtat aaagacgttg atgtgctctg ttttgatcac 720 gacaacagca aagacatgga tgcgctaatg gcaacgccgc tgtggcaggc catgccgttt 780 gtccgcgccg gacgctttca gcgcgtacct gcagtctggt tttatggtgc gacgctctcg 840 gcaatgcact ttgtgcgcgt tctggataac gccatcggag gtaaagcgtg a 891

<210>3

<211> 1983

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> gen

<222> (1)..(1983)

<223> ORF de fhuB

<400> 3

gtgagtaaac gaattgcgct tttcccggcg ttattgctgg cgctgttagt gattgtcgct 60 acggcgctca cctggatgaa cttctcgcag gcgctgccgc gtagccagtg ggcgcaggct 120 gcctggtcgc cggatattga cgtcatcgag cagatgattt ttcactacag cttgttgccg 180 cgtctggcga tttcgctgct ggtgggcgcg ggtctggggc tggtgggcgt gctgtttcag 240 caagtgctgc gtaacccgct ggcggagccg acgacgcttg gcgttgctac aggcgcgcaa 300 ctggggatta ccgtcactac gctctgggcg atccctggtg cgatggcgag ccagtttgct 360 gcgcaggcag gggcttgtgt tgttggctta attgtctttg gcgtcgcgtg ggggaaacgg 420 ctgtcgccgg taacgctgat tctcgcgggg ttggtagtga gcctttattg cggcgcaatc 480 aatcagttac tggttatctt ccatcatgac caactgcaaa gcatgtttct gtggagcact 540 ggaacgctga cgcaaaccga ctggggcggc gttgagcgtt tatggccgca gctgctgggc 600 ggtgtgatgc tgacgttgct gctacttcgt ccgttaaccc tgatggggct tgatgatggc 660 gtggcgcgca atctcgggct ggccttgtcg cttgcgcgtc tggcagcgct gtcgctggcg 720 attgtcatca gtgcgctgct ggtgaacgct gtggggatta tcggctttat cgggttgttc 780 gcgccgctgc tggcaaaaat gctgggggcg cggcgtctgc tgccacgact gatgctggcg 840 tcgttgattg gtgcgctgat cctctggctt tccgatcaaa tcatcctctg gctgactcgc 900 gtgtggatgg aagtgtccac cggttcggtc actgcgttga tcggtgcgcc gctgctactg 960 tggctgttgc cgcgtttacg cagcattagc gcgccggata tgaaggtcaa cgatcgtgtc 1020 gcggctgaac gccaacatgt gctggcgttt gccctcgcgg gcggcgtgct gctgttgatg 1080 gctgtggtgg tggcgctgtc gtttggtcgt gatgcgcacg gctggacgtg ggcgagcggg 1140 gcgttgctcg aggatttaat gccctggcgc tggccgcgaa ttatggcggc gctgtttgcg 1200 ggcgtcatgc tggcggtggc gggctgtatt attcagcgac tgaccggaaa cccgatggca 1260 agcccggaag tgctggggat tagctccggc gcggcgtttg gcgtggtgtt gatgctgttt 1320 ctggtgccgg gtaatgcctt tggctggctg ttacctgcag gcagtctcgg cgcggcggtg 1380 acgctgttga tcattatgat cgccgccggc cgcggtggat tttccccaca ccgtatgtta 1440 ctggcgggga tggcgttaag caccgcgttc accatgcttt tgatgatgtt gcaggcaagt 1500 ggtgacccgc gaatggcgca agtgctgacc tggatttccg gttcgaccta caacgcgacc 1560 gatgcgcagg tctggcgcac cggaattgtg atggtgattt tgctggcgat taccccgctg 1620 tgccgccgct ggctgaccat tttaccgctg ggtggtgata ccgcccgagc cgtaggaatg 1680 gcgctgacgc cgacgcgaat tgcgctgctg ctgttagcgg cttgcctgac ggcgaccgcg 1740 acgatgacta ttggaccgtt gagttttgtt ggtttaatgg caccgcatat tgcgcggatg 1800 atgggctttc gacggacgat gccacacatc gtaatttcgg cgctggtggg tggtttactg 1860 ctggtgttcg ctgactggtg tgggcggatg gtgctgtttc cattccagat cccggcgggg 1920 ctgctgtcaa cctttatcgg cgcgccatat tttatctatt tgttgagaaa gcagagccgt 1980 taa 1983 <210>4

<211> 3667

<212> ADN

<213> Escherichia coli

<220>

<221> gen

<222> (1)..(3667)

<223> operón fhuCDB

<400> 4

atgcaggaat acacgaatca ttccgatacc acttttgcac tgcgtaatat ctcctttcgt 60 gtgcccgggc gcacgctttt gcatccgctg tcgttaacct ttcctgccgg gaaagtgacc 120 ggtctgattg gtcacaacgg ttctggtaaa tccactctgc tcaaaatgct tggccgtcat 180 cagccgccgt cggaagggga gattcttctt gatgcccaac cgctggaaag ctggagcagc 240 aaagcgtttg cccgcaaagt ggcttatttg ccgcagcagc ttcctccggc agaagggatg 300 accgtgcgtg aactggtggc gattggtcgt tacccgtggc atggcgcgct ggggcgcttt 360 ggggcggcag atcgcgaaaa agtcgaggaa gctatctcgc tggttggctt aaaaccgctg 420 gcgcatcggc tggtcgatag tctctctggc ggcgaacgtc agcgggcgtg gatcgccatg 480 ctggtggcgc aggatagccg ttgtctgttg ctcgacgaac cgacctcggc gctggatatc 540 gcccaccagg ttgatgtgct gtcgctggtg caccgtttaa gtcaggagcg tggcctgacg 600 gtcattgccg tgttgcacga tatcaatatg gcggcacgct actgtgatta tctggtcgcc 660 ctgcgcggcg gtgaaatgat tgctcaggga acgcctgcgg aaattatgcg cggcgaaacc 720 ctcgaaatga tttatggcat cccgatgggt attttgccgc atccggcggg tgctgcacct 780 gtgagttttg tttattgatg agcggcttac ctcttatttc gcgccgtcga ctgttaacgg 840 cgatggcgct ttctccgttg ttatggcaga tgaataccgc ccacgcggcg gctattgatc 900 ccaatcgtat tgtggcgctg gagtggttgc cggtggaatt actgctggcg ctcggcatcg 960 tgccttacgg cgtggcggat accatcaact atcgcctgtg ggtcagcgaa ccaccattgc 1020 cggactcagt gatcgacgtc ggtttgcgca cagaacctaa ccttgaactg ctgaccgaaa 1080 tgaaaccatc gtttatggtc tggtcggcag gatatggccc ttcaccagaa atgctggctc 1140 gtattgcgcc gggtcgcgga tttaacttca gtgacggcaa acagccgttg gcgatggcgc 1200 gtaaatcgct gacggaaatg gcagatttac ttaacctgca aagcgcagcg gaaacgcatt 1260 tagcgcaata tgaagacttt atccgcagca tgaaaccccg ctttgtgaag cgtggtgcgc 1320 gtccgttatt gctgacgacg cttatcgatc cgcgccatat gctggtcttc ggtccaaaca 1380 gcttgttcca ggaaattctt gatgagtacg gcatcccaaa tgcctggcaa ggggaaacca 1440 acttctgggg cagtaccgcc gtcagtatcg atcgtctggc ggcgtataaa gacgttgatg 1500 tgctctgttt tgatcacgac aacagcaaag acatggatgc gctaatggca acgccgctgt 1560 ggcaggccat gccgtttgtc cgcgccggac gctttcagcg cgtacctgca gtctggtttt 1620 atggtgcgac gctctcggca atgcactttg tgcgcgttct ggataacgcc atcggaggta 1680 aagcgtgagt aaacgaattg cgcttttccc ggcgttattg ctggcgctgt tagtgattgt 1740 cgctacggcg ctcacctgga tgaacttctc gcaggcgctg ccgcgtagcc agtgggcgca 1800 ggctgcctgg tcgccggata ttgacgtcat cgagcagatg atttttcact acagcttgtt 1860 gccgcgtctg gcgatttcgc tgctggtggg cgcgggtctg gggctggtgg gcgtgctgtt 1920 tcagcaagtg ctgcgtaacc cgctggcgga gccgacgacg cttggcgttg ctacaggcgc 1980 gcaactgggg attaccgtca ctacgctctg ggcgatccct ggtgcgatgg cgagccagtt 2040 tgctgcgcag gcaggggctt gtgttgttgg cttaattgtc tttggcgtcg cgtgggggaa 2100 acggctgtcg ccggtaacgc tgattctcgc ggggttggta gtgagccttt attgcggcgc 2160 aatcaatcag ttactggtta tcttccatca tgaccaactg caaagcatgt ttctgtggag 2220 cactggaacg ctgacgcaaa ccgactgggg cggcgttgag cgtttatggc cgcagctgct 2280 gggcggtgtg atgctgacgt tgctgctact tcgtccgtta accctgatgg ggcttgatga 2340 tggcgtggcg cgcaatctcg ggctggcctt gtcgcttgcg cgtctggcag cgctgtcgct 2400 ggcgattgtc atcagtgcgc tgctggtgaa cgctgtgggg attatcggct ttatcgggtt 2460 gttcgcgccg ctgctggcaa aaatgctggg ggcgcggcgt ctgctgccac gactgatgct 2520 ggcgtcgttg attggtgcgc tgatcctctg gctttccgat caaatcatcc tctggctgac 2580 tcgcgtgtgg atggaagtgt ccaccggttc ggtcactgcg ttgatcggtg cgccgctgct 2640 actgtggctg ttgccgcgtt tacgcagcat tagcgcgccg gatatgaagg tcaacgatcg 2700 tgtcgcggct gaacgccaac atgtgctggc gtttgccctc gcgggcggcg tgctgctgtt 2760 gatggctgtg gtggtggcgc tgtcgtttgg tcgtgatgcg cacggctgga cgtgggcgag 2820 cggggcgttg ctcgaggatt taatgccctg gcgctggccg cgaattatgg cggcgctgtt 2880 tgcgggcgtc atgctggcgg tggcgggctg tattatteag cgactgaccg gaaacccgat 2940 ggcaagcccg gaagtgctgg ggattágete cggcgcggcg tttggcgtgg tgttgatgct 3000 gtttctggtg ccgggtaatg cctttggctg gctgttacct gcaggcagtc tcggcgcggc 3060 ggtgacgctg ttgatcatta tgatcgccgc cggccgcggt ggattttccc cacaccgtat 3120 gttactggcg gggatggcgt taagcaccgc gttcaccatg cttttgatga tgttgcaggc 3180 aagtggtgac ccgcgaatgg cgcaagtgct gacctggatt tccggttcga cctacaacgc 3240 gaccgatgcg caggtctggc gcaccggaat tgtgatggtg attttgctgg cgattacccc 3300 gctgtgccgc cgctggctga ccattttacc gctgggtggt gataccgccc gagccgtagg 3360 aatggcgctg acgccgacgc gaattgcgct gctgctgtta gcggcttgcc tgacggcgac 3420 cgcgacgatg actattggac cgttgagttt tgttggttta atggcaccgc atattgcgcg 3480 gatgatgggc tttcgacgga cgatgccaca catcgtaatt tcggcgctgg tgggtggttt 3540 actgctggtg ttcgctgact ggtgtgggcg gatggtgctg tttccattcc agatcccggc 3600 ggggctgctg tcaaccttta tcggcgcgcc atattttatc tatttgttga gaaagcagag 3660 ccgttaa 3667

<210>5

<211> 265

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(265)

<223> FhuC

<400>5

Met Gln Glu Tyr Thr Asn His Ser Asp Thr Thr Phe Ala Leu Arg Asn

1 5 10 15

lie Ser Phe Arg Val Pro Gly Arg Thr Leu Leu His Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Thr Phe Pro Ala Gly Lys Val Thr Gly Leu lie Gly His Asn Gly Ser

35 40 45

Gly Lys Ser Thr Leu Leu Lys Met Leu Gly Arg His Gln Pro Pro Ser 50 55 60

Glu Gly Glu lie Leu Leu Asp Ala Gln Pro Leu Glu Ser Trp Ser Ser

65 70 75 80

Lys Ala Phe Ala Arg Lys Val Ala Tyr Leu Pro Gln Gln Leu Pro Pro 85 90 95

Ala Glu Gly Met Thr Val Arg Glu Leu Val Ala lie Gly Arg Tyr Pro

100 105 110

Trp His Gly Ala Leu Gly Arg Phe Gly Ala Ala Asp Arg Glu Lys Val

115 120 125

Glu Glu Ala lie Ser Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Ala His Arg Leu 130 135 140

Val Asp Ser Leu Ser Gly Gly Glu Arg Gln Arg Ala Trp lie Ala Met

145 150 155 160

Leu Val Ala Gln Asp Ser Arg Cys Leu Leu Leu Asp Glu Pro Thr Ser 165 170 175

Ala Leu Asp lie Ala His Gln Val Asp Val Leu Ser Leu Val His Arg

180 185 190

Leu Ser Gln Glu Arg Gly Leu Thr Val lie Ala Val Leu His Asp lie

195 200 205

Asn Met Ala Ala Arg Tyr Cys Asp Tyr Leu Val Ala Leu Arg Gly Gly 210 215 220

Glu Met lie Ala Gln Gly Thr Pro Ala Glu lie Met Arg Gly Glu Thr

225 230 235 240

Leu Glu Met lie Tyr Gly lie Pro Met Gly lie Leu Pro His Pro Ala 245 250 255

Gly Ala Ala Pro Val Ser Phe Val Tyr

260 265

<210>6

<211> 296

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<220>

<221> PÉPTIDO <222> (1)..(296) <223> FhuD <400>6 Met Ser Gly Leu Pro Leu lie Ser Arg Arg Arg Leu Leu Thr Ala Met

1 5 10 15

Ala Leu Ser Pro Leu Leu Trp Gln Met Asn Thr Ala His Ala Ala Ala

20 25 30

lie Asp Pro Asn Arg lie Val Ala Leu Glu Trp Leu Pro Val Glu Leu

35 40 45

Leu Leu Ala Leu Gly lie Val Pro Tyr Gly Val Ala Asp Thr lie Asn 50 55 60

Tyr Arg Leu Trp Val Ser Glu Pro Pro Leu Pro Asp Ser Val lie Asp

65 70 75 80

Val Gly Leu Arg Thr Glu Pro Asn Leu Glu Leu Leu Thr Glu Met Lys 85 90 95

Pro Ser Phe Met Val Trp Ser Ala Gly Tyr Gly Pro Ser Pro Glu Met

100 105 110

Leu Ala Arg lie Ala Pro Gly Arg Gly Phe Asn Phe Ser Asp Gly Lys

115 120 125

Gln Pro Leu Ala Met Ala Arg Lys Ser Leu Thr Glu Met Ala Asp Leu 130 135 140

Leu Asn Leu Gln Ser Ala Ala Glu Thr His Leu Ala Gln Tyr Glu Asp

145 150 155 160

Phe lie Arg Ser Met Lys Pro Arg Phe Val Lys Arg Gly Ala Arg Pro 165 170 175

Leu Leu Leu Thr Thr Leu lie Asp Pro Arg His Met Leu Val Phe Gly

180 185 190

Pro Asn Ser Leu Phe Gln Glu lie Leu Asp Glu Tyr Gly lie Pro Asn

195 200 205

Ala Trp Gln Gly Glu Thr Asn Phe Trp Gly Ser Thr Ala Val Ser lie 210 215 220

Asp Arg Leu Ala Ala Tyr Lys Asp Val Asp Val Leu Cys Phe Asp His

225 230 235 240

Asp Asn Ser Lys Asp Met Asp Ala Leu Met Ala Thr Pro Leu Trp Gln 245 250 255

Ala Met Pro Phe Val Arg Ala Gly Arg Phe Gln Arg Val Pro Ala Val

260 265 270

Trp Phe Tyr Gly Ala Thr Leu Ser Ala Met His Phe Val Arg Val Leu

275 280 285

Asp Asn Ala lie Gly Gly Lys Ala

290 295

<210>7

<211> 660

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(660)

<223> FhuB

<400>7

Met Ser Lys Arg lie Ala Leu Phe Pro Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Val lie Val Ala Thr Ala Leu Thr Trp Met Asn Phe Ser Gln Ala Leu

20 25 30

Pro Arg Ser Gln Trp Ala Gln Ala Ala Trp Ser Pro Asp lie Asp Val

35 40 45

lie Glu Gln Met lie Phe His Tyr Ser Leu Leu Pro Arg Leu Ala lie 50 55 60

Ser Leu Leu Val Gly Ala Gly Leu Gly Leu Val Gly Val Leu Phe Gln

65 70 75 80

Gln Val Leu Arg Asn Pro Leu Ala Glu Pro Thr Thr Leu Gly Val Ala 85 90 95

Thr Gly Ala Gln Leu Gly lie Thr Val Thr Thr Leu Trp Ala lie Pro

100 105 110

Gly Ala Met Ala Ser Gln Phe Ala Ala Gln Ala Gly Ala Cys Val Val

115 120 125

Gly Leu lie Val Phe Gly Val Ala Trp Gly Lys Arg Leu Ser Pro Val 130 135 140

Thr Leu lie Leu Ala Gly Leu Val Val Ser Leu Tyr Cys Gly Ala lie

145 150 155 160

Asn Gln Leu Leu Val lie Phe His His Asp Gln Leu Gln Ser Met Phe 165 170 175

Leu Trp Ser Thr Gly Thr Leu Thr Gln Thr Asp Trp Gly Gly Val Glu

180 185 190

Arg Leu Trp Pro Gln Leu Leu Gly Gly Val Met Leu Thr Leu Leu Leu

195 200 205

Leu Arg Pro Leu Thr Leu Met Gly Leu Asp Asp Gly Val Ala Arg Asn 210 215 220

Leu Gly Leu Ala Leu Ser Leu Ala Arg Leu Ala Ala Leu Ser Leu Ala

225 230 235 240 lie Val lie Ser Ala Leu Leu Val Asn Ala Val Gly lie lie Gly Phe 245 250 255

H e Gly Leu Phe Ala Pro Leu Leu Ala Lys Met Leu Gly Ala Arg Arg

260 265 270

Leu Leu Pro Arg Leu Met Leu Ala Ser Leu lie Gly Ala Leu lie Leu

275 280 285

Trp Leu Ser Asp Gln lie lie Leu Trp Leu Thr Arg Val Trp Met Glu 290 295 300

Val Ser Thr Gly Ser Val Thr Ala Leu lie Gly Ala Pro Leu Leu Leu 305 310 315 320 Trp Leu Leu Pro Arg Leu Arg Ser lie Ser Ala Pro Asp Met Lys Val 325 330 335

Asn Asp Arg Val Ala Ala Glu Arg Gln His Val Leu Ala Phe Ala Leu

340 345 350

Ala Gly Gly Val Leu Leu Leu Met Ala Val Val Val Ala Leu Ser Phe

355 360 365

Gly Arg Asp Ala His Gly Trp Thr Trp Ala Ser Gly Ala Leu Leu Glu 370 375 380

Asp Leu Met Pro Trp Arg Trp Pro Arg lie Met Ala Ala Leu Phe Ala 385 390 395 400 Gly Val Met Leu Ala Val Ala Gly Cys lie lie Gln Arg Leu Thr Gly 405 410 415

Asn Pro Met Ala Ser Pro Glu Val Leu Gly lie Ser Ser Gly Ala Ala

420 425 430

Phe Gly Val Val Leu Met Leu Phe Leu Val Pro Gly Asn Ala Phe Gly

435 440 445

Trp Leu Leu Pro Ala Gly Ser Leu Gly Ala Ala Val Thr Leu Leu lie 450 455 460

lie Met lie Ala Ala Gly Arg Gly Gly Phe Ser Pro His Arg Met Leu 465 470 475 480 Leu Ala Gly Met Ala Leu Ser Thr Ala Phe Thr Met Leu Leu Met Met 485 490 495

Leu Gln Ala Ser Gly Asp Pro Arg Met Ala Gln Val Leu Thr Trp lie

500 505 510

Ser Gly Ser Thr Tyr Asn Ala Thr Asp Ala Gln Val Trp Arg Thr Gly

515 520 525

lie Val Met Val lie Leu Leu Ala lie Thr Pro Leu Cys Arg Arg Trp 530 535 540

Leu Thr lie Leu Pro Leu Gly Gly Asp Thr Ala Arg Ala Val Gly Met 545 550 555 560 Ala Leu Thr Pro Thr Arg lie Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Cys Leu 565 570 575 Thr Ala Thr Ala Thr Met Thr lie Gly Pro Leu Ser Phe Val Gly Leu

580 585 590

Met Ala Pro His lie Ala Arg Met Met Gly Phe Arg Arg Thr Met Pro

595 600 605

His lie Val lie Ser Ala Leu Val Gly Gly Leu Leu Leu Val Phe Ala 610 615 620

Asp Trp Cys Gly Arg Met Val Leu Phe Pro Phe Gln lie Pro Ala Gly

625 630 635 640

Leu Leu Ser Thr Phe lie Gly Ala Pro Tyr Phe lie Tyr Leu Leu Arg 645 650 655

Lys Gln Ser Arg

660

<210>8

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 1

<400> 8

ctcctttcgt gtgcccgggc gcacgctttt gcatccgctg tcgttaacct aggtgacact 60

atagaacgcg 70

<210>9

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 2

<400> 9

caataaacaa aactcacagg tgcagcaccc gccggatgcg gcaaaatacc tagtggatct 60

gatgggtacc 70

<210> 10

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 3

<400> 10

cgactgttaa cggcgatggc gctttctccg ttgttatggc agatgaatac aggtgacact 60

atagaacgcg 70

<210> 11

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<223> Cebador 4

<400> 11

tcacgcttta cctccgatgg cgttatccag aacgcgcaca aagtgcattg tagtggatct 60

gatgggtacc 70 <210> 12

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 5

<400> 12

gtgagtaaac gaattgcgct tttcccggcg ttattgctgg cgctgttagt aggtgacact 60

atagaacgcg 70 <210> 13

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 6

<400> 13

aggttgacag cagccccgcc gggatctgga atggaaacag caccatccgc tagtggatct 60

gatgggtacc 70

<210> 14

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 7

<400> 14

atgcaggaat acacgaatca ttccgatacc acttttgcac tgcgtaatat ctcctttcgt 60

gtgcccgggc 70

<210> 15

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 8

<400> 15

gccatcgccg ttaacagtcg acggcgcgaa ataagaggta agccgctcat caataaacaa 60

aactcacagg 70

<210> 16

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<223> Cebador 9

<400> 16

cctgtgagtt ttgtttattg atgagcggct tacctcttat ttcgcgccgt cgactgttaa 60

cggcgatggc 70 <210> 17

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 10

<400> 17

aatcactaac agcgccagca ataacgccgg gaaaagcgca attcgtttac tcacgcttta 60

cctccgatgg 70

<210> 18

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 11

<400> 18

tcggcaatgc actttgtgcg cgttctggat aacgccatcg gaggtaaagc gtgagtaaac 60

gaattgcgct 70 <210> 19

<211> 70

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 12

<400> 19

ttaacggctc tgctttctca acaaatagat aaaatatggc gcgccgataa aggttgacag 60

cagccccgcc 70 <210> 20

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 13

<400> 20

gaatacgtcg ccagctgctt taacac 26

<210> 21

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador 14

<400> 21

tggtttgtcg gatgcggcgt gaac 24

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de producción de L-aminoácidos, comprendiendo el procedimiento:

cultivar un microorganismo del género Escherichia en un medio y

recuperar L-aminoácidos de los medios de cultivo o del microorganismo;

en el que el microorganismo tiene un nivel de ATP intracelular aumentado, en comparación con una cepa no modificada, en el que una o más proteínas seleccionadas de una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6 y una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7, que constituyen un sistema de absorción de hierro, están inactivadas en el microorganismo;

en el que el microorganismo del género Escherichia tiene una capacidad mejorada para producir L-aminoácido, en comparación con una cepa no modificada; y

en el que el L-aminoácido es L-treonina o L-triptófano.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que todas las proteínas que tienen secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 5, 6 y 7 están inactivadas.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el microorganismo es E. coli.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha una o más proteínas se inactivan por mutación debido a deleción, sustitución o inserción de parte o la totalidad del gen que codifica la correspondiente proteína, por modificación de una secuencia reguladora de la expresión para reducir la expresión del gen, por modificación de la secuencia del gen cromosómico para debilitar o eliminar la actividad de la proteína, o por combinaciones de las mismas.