ES2871097T3

ES2871097T3 - Expresión de polipéptidos de Klebsiella oxytoca implicados en la descarboxilación de lisina, y métodos y aplicaciones de los mismos

Info

Publication number: ES2871097T3
Application number: ES15879438T
Authority: ES
Inventors: Howard Chou; Naiqiang Li; Xiucai Liu
Original assignee: Cathay Biotech Inc; CIBT America Inc
Current assignee: Cathay Biotech Inc; CIBT America Inc
Priority date: 2015-01-30
Filing date: 2015-01-30
Publication date: 2021-10-28
Anticipated expiration: 2035-01-30
Also published as: EP3250583A1; CN107074915B; US20180371028A1; EP3250583A4; WO2016119230A1; CN107074915A; US11261217B2; US10584149B2; US20200157152A1; EP3250583B1

Abstract

Polipéptido de lisina descarboxilasa que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de Klebsiella oxytoca (K. oxytoca)), en el que el mutante de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutante de Ldc de K. oxytoca) se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 (es decir, Ldc de K. oxytoca T398S) y SEQ ID NO: 11 (es decir, Ldc de K. oxytoca F507L).

Description

DESCRIPCIÓN

Expresión de polipéptidos de Klebsiella oxytoca implicados en la descarboxilación de lisina, y métodos y aplicaciones de los mismos

Antecedentes

La cadaverina es un producto químico de plataforma implicado en la producción de diversos productos. La cadaverina puede sintetizarse mediante descarboxilación de lisina en microorganismos. Las lisina descarboxilasas son las enzimas que catalizan la producción de cadaverina eliminando el grupo carboxilo de la lisina. Por ejemplo, en Escherichia coli (E. coli), la cadaverina se biosintetiza directamente a partir de L-lisina mediante dos polipéptidos de lisina descarboxilasa, CadA y LdcC. Los enfoques actuales para mejorar la producción de lisina y la producción de productos derivados de lisina, tales como cadaverina, se centran en la sobreexpresión o atenuación de proteínas implicadas en el metabolismo celular. Sin embargo, el rendimiento obtenido hasta ahora no es satisfactorio. Por lo tanto, existe la necesidad de nuevas técnicas que den como resultado mayores rendimientos de cadaverina.

Sumario

La presente invención se define por las reivindicaciones. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polipéptido de lisina descarboxilasa que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de Klebsiella oxytoca (K. oxytoca)), en el que el mutante de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutante de Ldc de K. oxytoca) se selecciona del grupo que consiste en s Eq ID NO: 7 (es decir, Ldc de K. oxytoca T398S) y SEQ ID NO: 11 (es decir, Ldc de K. oxytoca F507L).

Un aspecto que también se proporciona en el presente documento se refiere a un polipéptido de lisina descarboxilasa que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de Klebsiella oxytoca (K. oxytoca)) y fragmentos de la misma, y fragmentos de SEQ ID NO: 2 (es decir, fragmentos de Ldc de K. oxytoca), en el que los mutantes o fragmentos tienen al menos un 95 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2. En determinadas implementaciones, el mutante de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutante de Ldc de K. oxytoca) puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una mutación en la posición de aminoácido 287 con respecto a X ¹, una mutación en la posición de aminoácido 398 con respecto a X², una mutación en la posición de aminoácido 436 con respecto a X³, una mutación en la posición de aminoácido 507 con respecto a X⁴y una mutación en la posición de aminoácido 607 con respecto a X⁵; X ¹, X², X³, X⁴y X⁵se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina; y con la condición de que X ¹no sea lisina, X²no sea treonina, X³no sea arginina, X⁴no sea fenilalanina y X⁵no sea fenilalanina. En determinadas implementaciones, el mutante de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutante de Ldc de K. oxytoca) puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 5 (es decir, Ldc de K. oxytoca K287E), SEQ ID NO: 7 (es decir, Ldc de K. oxytoca t 398S), SEQ ID NO: 9 (es decir, Ldc de K. oxytoca R436G), SEQ ID NO: 11 (es decir, Ldc de K. oxytoca F507l ) y SEQ ID NO: 13 (es decir, Ldc de K. oxytoca F607Y).

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a un polinucleótido de ADN que no se produce de manera natural que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en una o más secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa, en el que las secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa tienen al menos un 95 % de identidad de secuencia con s Eq ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, y en el que el polinucleótido codifica uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa descritos en el presente documento. En determinadas implementaciones, el polinucleótido de ADN que no se produce de manera natural puede comprender una o más secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa seleccionadas del grupo que consiste en mutantes de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de ldc de K. oxytoca) y fragmentos de la misma, y fragmentos de SEQ ID NO: 1 (es decir, fragmentos de ldc de K. oxytoca), en el que las secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa tienen al menos un 95 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, y en el que el polinucleótido codifica uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa que comprenden, que consiste en o que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 (es decir, Ldc de K. oxytoca) y fragmentos de la misma, y mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) y fragmentos de la misma. En determinadas implementaciones, el mutante de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutante de ldc de K. oxytoca) puede comprender, consistir en o consistir esencialmente en la secuencia de nucleótidos de lisina descarboxilasa de SEQ ID NO: 3 (es decir, ldcco1 de K. oxytoca) o un fragmento de la misma. En determinadas implementaciones, la secuencia de nucleótidos de lisina descarboxilasa de SEQ ID NO: 3 comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una mutación en la posición de nucleótido 859 con respecto a Z¹, una mutación en la posición de nucleótido 1193 con respecto a Z², una mutación en la posición de nucleótido 1306 con respecto a Z³, una mutación en la posición de nucleótido 1521 con respecto a Z⁴y una mutación en la posición de nucleótido 1820 con respecto a Z⁵; Z¹, Z², Z³, Z⁴y Z⁵se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T), con la condición de que Z¹no sea una A, Z²no sea una C, Z³no sea una C, Z⁴no sea una C o T y Z⁵no sea una T. En determinadas implementaciones, el mutante de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutante de Idc de K. oxytoca) comprende, consiste en o consiste esencialmente en una secuencia de nucleótidos de lisina descarboxilasa seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4 (es decir, ldc-co1 de K. oxytoca A859G), SEQ ID NO: 6 (es decir, ldc-co1 de K. oxytoca C1193G), SEQ ID NO: 8 (es decir, ldc-co1 de K. oxytoca C1306G), SEQ ID NO: 10 (es decir, Idc-co1 de K. oxytoca C1521G) y SEQ ID NO: 12 (es decir, ldc-co1 de K. oxytoca T1820A).

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a un vector de plásmido de expresión que comprende un polinucleótido de ADN tal como se describe en el presente documento, y un plásmido de cadena principal capaz de replicación autónoma en una célula huésped, en el que el vector de plásmido de expresión se usa para la producción de un producto derivado de lisina.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a un transformante que comprende uno o más vectores de plásmido de expresión tal como se describe en el presente documento en una célula huésped.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a una célula huésped mutante que comprende un polinucleótido de ADN tal como se describe en el presente documento integrado en un cromosoma de la célula huésped.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a un método para producir uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa tal como se describe en el presente documento, en el que el método comprende obtener la célula huésped mutante descrita en el presente documento y/o el transformante descrito en el presente documento, cultivar la célula huésped mutante y/o el transformante en condiciones eficaces para la expresión del uno o más polipéptidos y recoger el uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a un método para producir cadaverina (1,5-pentanodiamina) que comprende 1a) cultivar una célula huésped mutante y/o un transformante descrito en el presente documento; 1b) producir cadaverina usando el cultivo obtenido de la etapa 1a para descarboxilar lisina; y 1c) extraer y purificar cadaverina usando el cultivo obtenido de la etapa 1b.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a un método para producir cadaverina (1,5-pentanodiamina) que comprende obtener uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa tal como se describe en el presente documento y producir cadaverina usando el uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa para descarboxilar lisina.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Tabla que muestra los cebadores usados en la creación de los constructos descritos en la sección de ejemplos a continuación.

Figura 2: Tabla que muestra cepas, plásmidos, enzimas, genes, promotores y secuencias de ácido desoxirribonucleico (ADN) del sitio de unión al ribosoma (RBS) descritos en el presente documento.

Figura 3: Resultados de la fermentación discontinua. Las cepas LN20 (blanco) y CIB60 (negro) se cultivaron usando fermentación discontinua, y los cultivos se sometieron a ensayo para determinar su capacidad para convertir lisina-HCl en cadaverina. En cada punto de tiempo, se tomaron muestras para medir la DO⁶⁰⁰(cuadrado), glucosa (círculo) y actividad (triángulo).

Figura 4: Resultados de la fermentación por alimentación discontinua. La cepa LN24 se cultivó en una fermentación por alimentación discontinua, y el cultivo se sometió a ensayo para determinar su capacidad para convertir lisina-HCl en cadaverina. En cada punto de tiempo, se tomaron muestras para medir la DO⁶⁰⁰(cuadrado blanco) y actividad (rombo negro).

Figura 5: Resultados de la fermentación discontinua. Se cultivaron LN24 (negro) y LN3014 (blanco) usando fermentación discontinua, y los cultivos se sometieron a ensayo para determinar su capacidad para convertir lisina-HCl en cadaverina. En cada punto de tiempo, se tomaron muestras para medir la DO⁶⁰⁰(cuadrado), glucosa (círculo) y actividad (triángulo).

Figura 6: Resultados de la fermentación por alimentación discontinua. La cepa LN3014 se cultivó en una fermentación por alimentación discontinua, y el cultivo se sometió a ensayo para determinar su capacidad para convertir lisina-HCl en cadaverina. En cada punto de tiempo, se tomaron muestras para medir la DO⁶⁰⁰(cuadrado blanco) y actividad (triángulo blanco).

Descripción detallada

La siguiente descripción proporciona detalles específicos para una comprensión exhaustiva de, y permitir la descripción de, implementaciones de la divulgación. Sin embargo, un experto en la técnica entenderá que la divulgación puede ponerse en práctica sin estos detalles. En otros casos, no se han mostrado ni descrito estructuras y funciones bien conocidas en detalle para evitar oscurecer innecesariamente la descripción de las implementaciones de la divulgación.

Klebsiella oxytoca (K. oxytoca) es un bacteria en forma de bacilo, Gram-negativa. La secuencia del genoma de K. oxytoca E718 contiene el gen de la lisina descarboxilasa de K. oxytoca, Idc, que codifica el polipéptido de lisina descarboxilasa, Ldc de K. oxytoca. Tal como se usa en el presente documento, la secuencia de nucleótidos de Idc de K. oxytoca se denomina “Idc de K. oxytoca", “Idc", “polinucleótido de Idc de K. oxytoca” o “secuencia de nucleótidos de Idc de K. oxytoca" y tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1. Tal como se usa en el presente documento, el polipéptido de Ldc de K. Oxytoca se denomina “Ldc de K. oxytoca", “Ldc”, “polipéptido de Ldc de K. oxytoca" o “proteína de Ldc de K. oxytoca" y tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Un aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a un polipéptido de lisina descarboxilasa que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 (es decir, Ldc de K. oxytoca) y fragmentos de la misma, y mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) y fragmentos de los mismos, en el que los mutantes o fragmentos tienen al menos un 95 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

En determinadas implementaciones, los mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) o fragmentos de los mismos pueden tener al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 90 %~99,999 %, aproximadamente el 91 %~99,999 %, aproximadamente el 92 %~99,999 %, aproximadamente el 93 %~99,999 %, aproximadamente el 94 %~99,999 %, aproximadamente el 95 %~99,999 %, aproximadamente el 96 %~99,999 %, aproximadamente el 97 %~99,999 %, aproximadamente el 98 %~99,999 % o aproximadamente el 99 %~99,999 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

El término “aproximadamente” tal como se usa en el presente documento significa dentro del 5 % o el 10 % de un valor establecido o un intervalo de valores.

En determinadas implementaciones, los mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) pueden comprender, consistir en o consistir esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que comprende una o más mutaciones. Un mutante de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutante de Ldc de K. oxytoca) puede comprender una o más deleciones, sustituciones, adiciones y/o inserciones de uno o más aminoácidos dentro de SEQ ID NO: 2, en el que el mutante de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutante de Ldc de K. oxytoca) proporciona sustancialmente la misma actividad de lisina descarboxilasa que Ldc de K. oxytoca (es decir, el mutante de Ldc de K. oxytoca tiene aproximadamente el 80% o más de actividad de lisina descarboxilasa en comparación con la de Ldc de K. oxytoca; aproximadamente el 90 % o más de actividad de lisina descarboxilasa en comparación con la de Ldc de K. oxytoca; aproximadamente el 95 % o más de actividad de lisina descarboxilasa en comparación con la de Ldc de K. oxytoca; aproximadamente el 97 % o más de actividad de lisina descarboxilasa en comparación con la de Ldc de K. oxytoca; aproximadamente el 99% o más de actividad de lisina descarboxilasa en comparación con la de Ldc de K. oxytoca; o aproximadamente el 100 % o más de actividad de lisina descarboxilasa en comparación con la de Ldc de K. oxytoca).

Ejemplos de mutantes preferidos de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) incluyen, sin limitación, SEQ ID NO: 5 (es decir, Ldc de K. oxytoca K287E); SEQ ID NO: 7 (es decir, Ldc de K. oxytoca T398S); SEQ ID NO:

9 (es decir, Ldc de K. oxytoca R436G); SEQ ID NO: 11 (es decir, Ldc de K. oxytoca F507L); y SEQ ID NO: 13 (es decir, Ldc de K. oxytoca F607Y). Ejemplos adicionales de mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) incluyen, sin limitación, mutantes que comprenden, que consisten en o que consisten esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una mutación en la posición de aminoácido 287 con respecto a X¹, una mutación en la posición de aminoácido 398 con respecto a X², una mutación en la posición de aminoácido 436 con respecto a X³, una mutación en la posición de aminoácido 507 con respecto a X⁴, una mutación en la posición de aminoácido 607 con respecto a X⁵; polipéptidos homólogos de SEQ ID NO: 5 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca K287X-i); polipéptidos homólogos de SEQ ID NO: 7 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca T³⁹⁸X²); polipéptidos homólogos de SEQ ID NO: 9 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca R^{4 36}X³); polipéptidos homólogos de SEQ ID NO: 11 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca F507X4); y polipéptidos homólogos de s Eq ID NO: 13 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca F607Xs). X ¹, X², X³, X⁴y X⁵se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina, con la condición de que X ¹no sea lisina, X²no sea treonina, X³no sea arginina, X⁴no sea fenilalanina y X⁵no sea fenilalanina. Tal como se usa en el presente documento, un polipéptido homólogo puede tener al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 94 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 90 %~99,999 %, aproximadamente el 91 %~99,999 %, aproximadamente el 92 %~99,999 %, aproximadamente el 93 %~99,999 %, aproximadamente el 94 %~99,999 %, aproximadamente el 95 %~99,999 %, aproximadamente el 96 %~99,999 %, aproximadamente el 97 %~99,999 %,

aproximadamente el 98 %~99,999 % o aproximadamente el 99 %~99,999 % de homología de secuencia con una

secuencia polipeptídica especificada.

En determinadas implementaciones, un fragmento de un polipéptido tal como se usa en el presente documento

proporciona sustancialmente la misma función que el polipéptido no mutado completo del que se deriva el fragmento.

En estas implementaciones, fragmentos de Ldc de K. oxytoca o mutantes de Ldc de K. oxytoca presentan

sustancialmente la misma función que Ldc de K. oxytoca o el mutante de K. oxytoca del que se derivan (por ejemplo,

actividad de lisina descarboxilasa).

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a un polinucleótido de ADN que comprende, que

consiste en o que consiste esencialmente en una o más secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa descritas

en el presente documento. En determinadas implementaciones, un polinucleótido de ADN puede comprender una o

más secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 (es

decir, ldc de K. oxytoca) y fragmentos de las mismas, y mutantes de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de ldc de K.

oxytoca) y fragmentos de los mismos, en el que las secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa tienen al menos

un 95 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, y en el que el polinucleótido codifica uno o

más polipéptidos de lisina descarboxilasa que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en una

secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 (es decir, Ldc de K. oxytoca) y

fragmentos de las mismas, y mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) y fragmentos de

los mismos.

En determinadas implementaciones, los polipéptidos de lisina descarboxilasa, Ldc de K. oxytoca y mutantes de Ldc

de K. Oxytoca son los mismos que los descritos anteriormente. Cuando hay una pluralidad de polipéptidos, cada

polipéptido puede ser igual o diferente, y el uno o más polipéptidos pueden expresarse individualmente o como una

proteína de fusión.

Ejemplos de mutantes preferidos de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) incluyen, sin limitación,

SEQ ID NO: 5 (es decir, Ldc de K. oxytoca K287E); SEQ ID NO: 7 (es decir, Ldc de K. oxytoca T398S); SEQ ID NO:

9 (es decir, Ldc de K. oxytoca R436G); SEQ ID NO: 11 (es decir, Ldc de K. oxytoca F507L); y SEQ ID NO: 13 (es

decir, Ldc de K. oxytoca F607Y). Ejemplos adicionales de mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de

K. oxytoca) incluyen, sin limitación, mutantes que comprenden, que consisten en o que consisten esencialmente en la

secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que

consiste en una mutación en la posición de aminoácido 287 con respecto a X¹, una mutación en la posición de

aminoácido 398 con respecto a X², una mutación en la posición de aminoácido 436 con respecto a X³, una mutación

en la posición de aminoácido 507 con respecto a X⁴, una mutación en la posición de aminoácido 607 con respecto a

X⁵; polipéptidos homólogos de SEQ ID NO: 5 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca K287X-i); polipéptidos homólogos de

SEQ ID NO: 7 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca T³⁹⁸X²); polipéptidos homólogos de SEQ ID NO: 9 (por ejemplo, Ldc

de K. oxytoca R^{4 36}X³); polipéptidos homólogos de SEQ ID NO: 11 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca F507X4); y

polipéptidos homólogos de s Eq ID NO: 13 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca F607Xs). X ¹, X², X³, X⁴y X⁵se seleccionan

cada uno independientemente del grupo que consiste en alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína,

glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina,

treonina, triptófano, tirosina y valina, con la condición de que X ¹no sea lisina, X²no sea treonina, X³no sea arginina,

X⁴no sea fenilalanina y X⁵no sea fenilalanina.

En determinadas implementaciones, la secuencia de polinucleótidos de ADN puede comprender una o más

secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa seleccionadas del grupo que consiste en mutantes de SEQ ID NO:

1 (es decir, mutantes de ldc de K. oxytoca) y fragmentos de las mismas, y fragmentos de SEQ ID NO: 1 (es decir,

fragmentos de ldc de K. oxytoca). Un mutante de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutante de ldc de K. oxytoca) puede incluir

una o más deleciones, sustituciones, adiciones y/o inserciones de uno o más nucleótidos en la secuencia de

nucleótidos que comprende SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO 3, mientras que el polipéptido de lisina descarboxilasa

codificado por la secuencia de nucleótidos proporciona sustancialmente la misma función que Ldc de K. oxytoca (es

decir, el polipéptido de lisina descarboxilasa codificado por el mutante de ldc de K. oxytoca tiene aproximadamente el

80 % o más de actividad de lisina descarboxilasa en comparación con la de Ldc de K. oxytoca; aproximadam 90 % o más de actividad de lisina descarboxilasa en comparación

con la de Ldc de K. oxytoca; aproximadam 95% o más de actividad de lisina descarboxilasa en comparación

con la de Ldc de K. oxytoca; aproximadam 97 % o más de actividad de lisina descarboxilasa en comparación con la de Ldc de K. oxytoca; aproximadam 99% o más de actividad de lisina descarboxilasa en comparación con la de Ldc de K. oxytoca; o aproximadamente el

100 % o más de actividad de lisina descarboxilasa en comparación con la de Ldc de K. oxytoca).

En determinadas implementaciones, los mutantes de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de ldc de K. oxytoca) o

fragmentos de los mismos pueden tener al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91%, al

menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 94%, al menos

aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos

aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, aproximadamente el 90 %~99,999 %,

aproximadamente el 91 %~99,999 %, aproximadamente el 92 %~99,999 %, aproximadamente el 93 %~99,999 %, aproximadamente el 94 %~99,999 %, aproximadamente el 95 %~99,999 %, aproximadamente el 96 %~99,999 %, aproximadamente el 97 %~99,999 %, aproximadamente el 98 %~99,999 % o aproximadamente el 99 %~99,999 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3.

Un ejemplo de un mutante de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutante de Idc de K. oxytoca) puede incluir, sin limitación, la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 (es decir, Idc de K. oxytoca) cuyos codones se han optimizado para la expresión en E. coli (es decir, Idc-co1 de K. oxytoca, SEQ ID NO: 3) y que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (es decir, Ldc de K. oxytoca). Otros ejemplos de mutantes de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de Idc de K. oxytoca) pueden incluir, sin limitación, secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa que codifican secuencias de aminoácidos de mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca). Ejemplos de mutantes preferidos de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de ldc de K. oxytoca) que codifican una secuencia de aminoácidos de mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) incluyen, sin limitación, SEQ ID NO: 4 (es decir, Idc-co1 de K. oxytoca A859G), SEQ ID NO: 6 (es decir, Idc-co1 de K. oxytoca C1193G), SEQ ID NO: 8 (es decir, Idc-co1 de K. oxytoca C1306G), SEQ ID NO: 10 (es decir, Idc-co1 de K. oxytoca C1521G) y SEQ ID NO: 12 (es decir, Idc-co1 de K. oxytoca T1820A).

Ejemplos adicionales de mutantes de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de ldc de K. oxytoca) que codifican una secuencia de aminoácidos de mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) pueden incluir, sin limitación, secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa que comprenden, que consisten en o que consisten esencialmente en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una mutación en la posición de nucleótido 859 con respecto a Z¹, una mutación en la posición de nucleótido 1193 con respecto a Z², una mutación en la posición de nucleótido 1306 con respecto a Z³, una mutación en la posición de nucleótido 1521 con respecto a Z⁴, una mutación en la posición de nucleótido 1820 con respecto a Z⁵y/o cualquier combinación de los mismos; secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa que comprenden, que consisten en o que consisten esencialmente en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una mutación en la posición de nucleótido 859 mutada a una G (guanina), una mutación en la posición de nucleótido 1193 mutada a una G, una mutación en la posición de nucleótido 1306 mutada a una G, una mutación en la posición de nucleótido 1521 mutada a una G o una A (adenina), una mutación en la posición de nucleótido 1820 mutada a una A, y/o cualquier combinación de las mismas; secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca A859G o Idc-co1 de K. oxytoca A859G (por ejemplo, ldc de K. oxytoca A859Z1 o Idc-co1 de K. oxytoca A859z -i); secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca C1193G o ldc-co1 de K. oxytoca C1193G (por ejemplo, ldc de K. oxytoca C1193Z2 o ldc-co1 de K. oxytoca C1193Z2); secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca C1306G o ldc-co1 de K. oxytoca C1306G (por ejemplo, ldc de K. oxytoca C1306Z3 o ldc-co1 de K. oxytoca C ^{130 6}Z³); secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca C1521G o ldc-co1 de K. oxytoca C1521G (por ejemplo, ldc de K. oxytoca C1521Z4 o ldc-co1 de K. oxytoca C1521Z4); y secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca T1820A o ldc-co1 de K. oxytoca T1820A (por ejemplo, ldc de K. oxytoca T1820Z5 o ldc-co1 de K. oxytoca T1820Z5). Z¹, Z², Z³, Z⁴y Z⁵se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en A, G, C (citosina) y T (timina), con la condición de que Z¹no sea una A, Z²no sea una C, Z³no sea una C, Z⁴no sea una C o T y Z⁵no sea una T. Tal como se usa en el presente documento, una secuencia de nucleótidos homóloga puede tener al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91%, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 94%, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99%, aproximadamente el 90 %~99,999 %, aproximadamente el 91 %~99,999 %, aproximadamente el 92 %~99,999 %, aproximadamente el 93 %~99,999 %, aproximadamente el 94 %~99,999 %, aproximadamente el 95 %~99,999 %, aproximadamente el 96 %~99,999 %, aproximadamente el 97 %~99,999 %, aproximadamente el 98 %~99,999 % o aproximadamente el 99 %~99,999 % de homología con una secuencia de nucleótidos especificada.

En determinadas implementaciones, el polinucleótido de ADN puede ser un polinucleótido recombinante o que no se produce de manera natural. En determinadas implementaciones, el polinucleótido de ADN puede ser ADNc. En determinadas implementaciones, el polinucleótido de ADN puede obtenerse mediante optimización de codones para la expresión de polipéptidos óptima en un microorganismo particular (por ejemplo, E. coli, H. alvei o K. oxytoca).

Secuencias de nucleótidos, polinucleótidos y moléculas de ADN tal como se usan en el presente documento no se limitan a la región funcional, y pueden incluir al menos una de una región de supresión de la expresión, una región codificante, una secuencia líder, un exón, un intrón y un casete de expresión (véase, por ejemplo, Papadakis et al., “Promoters and Control Elements: Designing Expression Cassettes for Gene Therapy”, Current Gene Therapy (2004), 4, 89-113). Además, secuencias de nucleótidos o polinucleótidos pueden incluir ADN bicatenario o ADN monocatenario (es decir, una cadena sentido y una cadena antisentido que constituyen el ADN bicatenario), o ácido ribonucleico (ARN). Un polinucleótido que contiene secuencias de nucleótidos puede incluir fragmentos y/o mutantes de las secuencias de nucleótidos. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos significa una parte de la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que proporciona sustancialmente la misma función que el polipéptido codificado por todo el polinucleótido. Ejemplos de mutantes de una secuencia de nucleótidos incluyen mutantes alélicos naturales; mutantes artificiales; y secuencias de nucleótidos obtenidas por deleción, sustitución, adición y/o inserción de uno o más nucleótidos en la secuencia de nucleótidos. Debe entenderse que tales fragmentos y/o mutantes de una secuencia de nucleótidos codifican un polipéptido que tiene sustancialmente la misma función que el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos original. Por ejemplo, un fragmento y/o mutante de Idc de K. oxytoca codifica un polipéptido que presenta sustancialmente la misma función de Ldc de K. oxytoca (es decir, actividad de lisina descarboxilasa).

La optimización de codones es una técnica que puede usarse para maximizar la expresión de proteínas en un organismo aumentando la eficacia traduccional del gen de interés. Diferentes organismos a menudo muestran preferencias particulares para uno de los varios codones que codifican el mismo aminoácido debido a sesgos mutacionales y selección natural. Por ejemplo, en microorganismos de crecimiento rápido tales como E. coli, los codones óptimos reflejan la composición de su respectivo conjunto de ARNt genómico. Por lo tanto, los codones de baja frecuencia de un aminoácido pueden reemplazarse por codones para el mismo aminoácido pero de alta frecuencia en el microorganismo de rápido crecimiento. Por consiguiente, la expresión de la secuencia de ADN optimizada se mejora en el microorganismo de rápido crecimiento. Véase, por ejemplo, http://www.guptalab.org/shubhg/pdf/shubhra_codon.pdf para una visión general de la tecnología de optimización de codones. Tal como se proporciona en el presente documento, los codones de las secuencias de polinucleótidos pueden haberse optimizado para la expresión de polipéptidos óptima en un microorganismo particular que incluye, pero no se limita a, E. coli, H. alvei y K. oxytoca.

En determinadas implementaciones, pueden obtenerse mutantes de una secuencia de nucleótidos a partir de la optimización de codones de la secuencia de nucleótidos para disminuir el contenido de nucleótidos G y C de la misma para mejorar la expresión de proteínas. Un genoma se considera rico en GC si aproximadamente el 50 % o más de sus bases son G o C. Un alto contenido de GC en la secuencia de nucleótidos de interés puede conducir a la formación de estructura secundaria en el ARNm, lo que puede dar como resultado una traducción interrumpida y niveles más bajos de expresión. Por lo tanto, cambiar los residuos de G y C en la secuencia codificante a residuos de A y T sin cambiar los aminoácidos puede proporcionar niveles de expresión más altos.

En determinadas implementaciones, el polinucleótido de ADN descrito en el presente documento puede comprender además una o más secuencias de nucleótidos de ADN de sitios de unión al ribosoma (RBS). Tal como se usa en el presente documento, la secuencia de nucleótidos de ADN de RBS puede denominarse “ADN de RBS”, “secuencia de ADN de RBS”, “secuencia de nucleótidos de ADN de RBS” o “secuencia de polinucleótidos de ADN de RBS”. Un RBS es una secuencia de ARN encontrada en el ARN mensajero (ARNm) al que los ribosomas pueden unirse e iniciar la traducción. En procariotas, el RBS se denomina secuencia de Shine-Dalgarno y se encuentra en el sentido de 5' del codón de inicio de la secuencia de ARN que va a traducirse. Las mutaciones en la secuencia de RBS pueden reducir o aumentar la traducción en procariotas. Las secuencias de nucleótidos de ADN de RBS proporcionadas en el presente documento tienen la misma secuencia de bases de las secuencias de RBS, excepto porque el uracilo (U) en la secuencia de ARN de la secuencia de RBS se reemplaza por timina (T). Por ejemplo, si la secuencia de RBS es “GGAGAU”, la secuencia de nucleótidos de ADN de r Bs correspondiente es “GGAGAt ”. Tal como se muestra en los ejemplos a continuación, la expresión de Ldc de K. oxytoca y mutantes de la misma a partir de diversas secuencias de RBS dio como resultado diferentes niveles de actividad de producción de cadaverina (véase el ejemplo 7). Tal como se proporciona a continuación en el ejemplo 7, el plásmido pUC18-KOldc-co1-Pbad contiene la secuencia de nucleótidos de ADN de RBS “GGAGAT” (ADN-1 de RBS, SEQ ID No : 14) en el sentido de 5' de la secuencia de ldcco1 de K. oxytoca. Se preparó una biblioteca de ADN de RBS para su uso en el cribado de una secuencia de RBS óptima para la expresión de proteína Ldc de K. oxytoca que da como resultado un aumento de la producción de cadaverina. Al menos cinco plásmidos con secuencias de nucleótidos de ADN de RBS mutadas produjeron niveles más altos de cadaverina cuando se transformaron en E. coli K12 en comparación con el plásmido que contiene la secuencia de nucleótidos de ADN de RBS, ADN-1 de RBS (SEQ ID NO: 14). El plásmido (pLN637) que contiene la secuencia de nucleótidos de ADN de RBS, “TGGAGG” (ADN-5 de RBS, SEQ ID n O: 18), produjo el mayor rendimiento de cadaverina (véase el ejemplo 7).

Tal como se proporciona en el presente documento en determinadas implementaciones, el polinucleótido de ADN descrito en el presente documento puede comprender además una o más secuencias de nucleótidos de ADN de RBS seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14 (es decir, ADN-1 de RBS), SEQ ID NO: 15 (es decir, ADN-2 de RBS), SEQ ID NO: 16 (es decir, ADN-3 de RBS), SEQ ID NO: 17 (es decir, ADN-4 de RBS), SEQ ID NO: 18 (es decir, a Dn -5 de RBS) y s Eq ID NO: 19 (es decir, ADN-6 de RBS). En determinadas implementaciones preferidas, la una o más secuencias de nucleótidos de ADN de RBS pueden comprender, consistir en o consistir esencialmente en SEQ ID NO: 18 (es decir, ADN-5 DE RBS). En determinadas implementaciones, la secuencia de nucleótidos de ADN de RBS puede estar colocada en el sentido de 5' de la secuencia de nucleótidos de lisina descarboxilasa de SEQ ID NO: 1 (es decir, ldc de K. oxytoca) y fragmentos de la misma, y mutantes de SEQ ID NO: 1 (es decir, ldc de K. oxytoca) y fragmentos de los mismos.

Tal como se proporciona en el presente documento en determinadas implementaciones, el polinucleótido de ADN descrito en el presente documento puede comprender además una o más secuencias de nucleótidos promotoras seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20 (es decir, secuencia promotora de Plac), SEQ ID NO: 21 (es decir, secuencia promotora de Pbad) y SEQ ID NO: 22 (es decir, secuencia promotora de Ptac). Un promotor es una región de ADN que inicia la transcripción de ADN. El promotor está ubicado en el sentido de 5' del ADN que va a transcribirse. En determinadas implementaciones preferidas, la una o más secuencias de nucleótidos promotoras pueden comprender, consistir en o consistir esencialmente en SEQ ID NO: 21 (es decir, secuencia promotora de Pbad). En determinadas implementaciones, la secuencia de nucleótidos promotora puede estar colocada en el sentido de 5' de la secuencia de nucleótidos de lisina descarboxilasa de SEQ ID NO: 1 (es decir, Idc de K. oxytoca) o fragmentos de la misma y mutantes de SEQ ID NO: 1 (es decir, Idc de K. oxytoca) o fragmentos de los mismos. Cuando el polinucleótido de ADN comprende una o más secuencias de nucleótidos de ADN de RBS y una o más secuencias de nucleótidos promotoras, la una o más secuencias de nucleótidos promotoras pueden estar colocadas en el sentido de 5' de la secuencia de nucleótidos de lisina descarboxilasa y la secuencia de nucleótidos de ADN de RBS.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a un vector de plásmido de expresión que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en:

un polinucleótido de ADN que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en una o más secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa seleccionadas del grupo que consiste en mutantes de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de Idc de K. oxytoca) y fragmentos de las mismas, y fragmentos de SEQ ID NO: 1 (es decir, fragmentos de Idc de K. oxytoca), en el que las secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa tienen al menos un 95 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, y en el que el polinucleótido codifica uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa que comprenden, que consisten en o que consisten esencialmente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 (es decir, Ldc de K. oxytoca) y fragmentos de la misma, y mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) y fragmentos de los mismos; y

un plásmido de cadena principal capaz de replicación autónoma en una célula huésped,

en el que el vector de plásmido de expresión se usa para la producción de un producto derivado de lisina.

Los polinucleótidos de ADN; secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa; ldc de K. oxytoca, mutantes y fragmentos de los mismos; polipéptidos de lisina descarboxilasa; Ldc de K. oxytoca, mutantes y fragmentos de los mismos son los mismos que los descritos anteriormente. Cuando hay una pluralidad de polipéptidos, cada polipéptido puede ser igual o diferente, y el uno o más polipéptidos pueden expresarse individualmente o como una proteína de fusión.

Un ejemplo de un mutante de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutante de ldc de K. oxytoca) puede incluir, sin limitación, la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 (es decir, ldc de K. oxytoca) cuyos codones se han optimizado para la expresión en E. coli (es decir, Idc-co1 de K. oxytoca, SEQ ID NO: 3) y que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (es decir, Ldc de K. oxytoca). Otros ejemplos de mutantes de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de ldc de K. oxytoca) pueden incluir, sin limitación, secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa que codifican secuencias de aminoácidos de mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca). Ejemplos de mutantes preferidos de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de ldc de K. oxytoca) que codifican una secuencia de aminoácidos de mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) incluyen, sin limitación, SEQ ID NO: 4 (es decir, ldc-co1 de K. oxytoca A859G), SEQ ID NO: 6 (es decir, ldc-co1 de K. oxytoca C1193G), SEQ ID NO: 8 (es decir, ldc-co1 de K. oxytoca C1306G), SEQ ID NO: 10 (es decir, ldc-co1 de K. oxytoca C1521G) y SEQ ID NO: 12 (es decir, ldc-co1 de K. oxytoca T1820A).

Ejemplos adicionales de mutantes de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de ldc de K. oxytoca) que codifican una secuencia de aminoácidos de mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) pueden incluir, sin limitación, secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa que comprenden, que consisten en o que consisten esencialmente en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una mutación en la posición de nucleótido 859 con respecto a Z¹, una mutación en la posición de nucleótido 1193 con respecto a Z², una mutación en la posición de nucleótido 1306 con respecto a Z³, una mutación en la posición de nucleótido 1521 con respecto a Z⁴, una mutación en la posición de nucleótido 1820 con respecto a Z⁵, y/o cualquier combinación de las mismas; secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa que comprenden, que consisten en o que consisten esencialmente en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una mutación en la posición de nucleótido 859 mutada a una G (guanina), una mutación en la posición de nucleótido 1193 mutada a una G, una mutación en la posición de nucleótido 1306 mutada a una G, una mutación en la posición de nucleótido 1521 mutada a una G o una A (adenina), una mutación en la posición de nucleótido 1820 mutada a una A, y/o cualquier combinación de las mismas; secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca A859G o ldc-co1 de K. oxytoca A859G (por ejemplo, ldc de K. oxytoca A859Z1 o ldc-co1 de K. oxytoca A859z -i); secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca C1193G o ldc-co1 de K. oxytoca C1193G (por ejemplo, ldc de K. oxytoca C1193Z2 o ldc-co1 de K. oxytoca C1193Z2); secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca C1306G o ldc-co1 de K. oxytoca C1306G (por ejemplo, ldc de K. oxytoca C1306Z3 o ldc-co1 de K. oxytoca C ^{130 6}Z³); secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca C1521G o ldc-co1 de K. oxytoca C1521G (por ejemplo, ldc de K. oxytoca C1521Z4 o ldc-co1 de K. oxytoca C1521Z4); y secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca T1820A o ldc-co1 de K. oxytoca T1820A (por ejemplo, ldc de K. oxytoca T1820Z5 o ldc-co1 de K. oxytoca T1820Z5). Z¹, Z², Z³, Z⁴y Z⁵se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en A, G, C (citosina) y T (timina), con la condición de que Z¹no sea una A, Z²no sea una C, Z³no sea una C, Z⁴no sea una C o T y Z⁵no sea una T.

Ejemplos de mutantes preferidos de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) incluyen, sin limitación, SEQ ID NO: 5 (es decir, Ldc de K. oxytoca K287E); SEQ ID NO: 7 (es decir, Ldc de K. oxytoca T398S); SEQ ID NO: 9 (es decir, Ldc de K. oxytoca R436G); SEQ ID NO: 11 (es decir, Ldc de K. oxytoca F507L); y SEQ ID NO: 13 (es decir, Ldc de K. oxytoca F607Y). Ejemplos adicionales de mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) incluyen, sin limitación, mutantes que comprenden, que consisten en o que consisten esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una mutación en la posición de aminoácido 287 con respecto a X¹, una mutación en la posición de aminoácido 398 con respecto a X², una mutación en la posición de aminoácido 436 con respecto a X³, una mutación en la posición de aminoácido 507 con respecto a X⁴, una mutación en la posición de aminoácido 607 con respecto a X⁵; polipéptidos homólogos de SEQ ID NO: 5 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca K287X1); polipéptidos homólogos de SEQ ID NO: 7 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca T³⁹⁸X²); polipéptidos homólogos de SEQ ID NO: 9 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca R^{4 36}X³); polipéptidos homólogos de SEQ ID NO: 11 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca F507X4); y polipéptidos homólogos de s Eq ID NO: 13 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca F607X5). X ¹, X², X³, X⁴y X⁵se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina, con la condición de que X ¹no sea lisina, X²no sea treonina, X³no sea arginina, X⁴no sea fenilalanina y X⁵no sea fenilalanina.

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula huésped” se refiere a una célula de microorganismo que puede ser cualquier célula que pueda transformarse con un vector de plásmido de expresión (por ejemplo, Escherichia (por ejemplo, E. coli), Klebsiella (por ejemplo, K. oxytoca), Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa), Corynebacterium (por ejemplo, Corynebacterium glutamicum), Bacilli, Hafnia (por ejemplo, Hafnia alvei), Brevibacterium, Lactobacillus (por ejemplo, Lactobacillus pentosus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus saerimneri), Lactococcus (por ejemplo, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. lactis) y Streptococcus (por ejemplo, Streptococcus thermophilus)).

Una célula de E. coli puede ser cualquiera de las cepas de E. coli derivadas de E. coli K12 (por ejemplo, MG1655, W3110, DH10b, DH1, BW2952 y cepas derivadas de las mismas) o E. coli B, o cepas derivadas de la misma.

Un producto derivado de lisina tal como se usa en el presente documento puede ser cadaverina. Por ejemplo, el vector de plásmido de expresión descrito en el presente documento puede usarse para la producción de cadaverina.

En determinadas implementaciones, la célula huésped puede contener uno o más plásmidos endógenos. En determinadas implementaciones, la célula huésped no contiene plásmidos endógenos. El término “curar”, tal como se usa en el presente documento, significa eliminar uno o más plásmidos endógenos de una célula huésped. En determinadas implementaciones, una célula huésped puede “curarse” de todos los plásmidos endógenos eliminando todos los plásmidos endógenos de la célula huésped. En determinadas implementaciones, una célula huésped puede “curarse” de uno o más plásmidos endógenos eliminando solo uno o más plásmidos endógenos que se seleccionan como diana para la eliminación de la célula.

En determinadas implementaciones, la célula huésped puede ser una célula procariota (por ejemplo, H. alvei) que contiene plásmidos endógenos que codifican pares de genes de toxina/antitoxina específicos. Tales pares de genes de toxina/antitoxina desempeñan un papel en el mantenimiento de la información genética y la respuesta al estrés. (Véase, Wertz et al. “Chimeric nature of two plasmids of Hafnia alvei encoding the bacteriocins alveicins A and B”. Journal of Bacteriology, (2004) 186: 1598-1605.) Siempre que la célula tenga uno o más plásmidos que comprendan un gen de antitoxina, la toxina se neutraliza por la antitoxina que se expresa de manera continua por el uno o más plásmidos para mantener las células vivas. En ciertos procariotas, la proteína de antitoxina se degrada más rápido que la proteína de toxina. Si el plásmido que comprende el gen de antitoxina se pierde de la célula, la proteína de toxina existirá más tiempo que la proteína de antitoxina en la célula y destruirá o inhibirá el crecimiento de la célula. Por lo tanto, los plásmidos que comprenden la antitoxina o el gen de toxina/antitoxina se mantienen preferiblemente para mantener la célula huésped viva.

Tal como se usa en el presente documento, un par de genes de toxina/antitoxina tiene dos genes, uno es un gen de toxina que expresa un polipéptido tóxico para una célula huésped, y el otro es un gen de antitoxina que neutraliza el polipéptido tóxico en la célula huésped. Ejemplos del par de genes de toxina/antitoxina incluyen, sin limitación, par de genes abt/abi y par de genes aat/aai, fragmentos de los mismos y mutantes de los mismos. En algunas implementaciones, la secuencia de polinucleótidos de toxina comprende, consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 25, fragmentos de la misma o mutantes de la misma. En algunas implementaciones, la secuencia de polinucleótidos de antitoxina comprende, consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 26, fragmentos de la misma o mutantes de la misma.

En determinadas implementaciones, la célula huésped puede ser cualquier cepa de H. alvei, por ejemplo, cepas de H. alvei libres de plásmidos endógenos o cepas de H. alvei que contienen plásmidos endógenos. Por ejemplo, la célula huésped puede ser una cepa de H. alvei que contiene uno o más plásmidos pAlvA o las cepas curadas de la misma (cepas pAlvA), o una cepa de H. alvei que contiene uno o más plásmidos pAlvB y las cepas curadas de la misma (cepas pAlvB).

En determinadas implementaciones, el vector de plásmido de expresión dado a conocer en el presente documento (por ejemplo, el vector de plásmido de expresión) puede comprender además uno o más genes de antitoxina seleccionados del grupo que consiste en el gen abi, gen aai, mutaciones y fragmentos de los mismos, y/o uno o más pares de genes de toxina/antitoxina seleccionados del grupo que consiste en un par de genes abt/abi y un par de genes aat/aai, y mutaciones y fragmentos de los mismos. Por ejemplo, en determinadas implementaciones, un vector de plásmido de expresión (por ejemplo, el vector de plásmido de expresión) puede comprender además un polinucleótido de antitoxina que contrarresta un polipéptido de toxina que es perjudicial para la célula huésped, y una secuencia de polinucleótidos de toxina que codifica el polipéptido de toxina.

En determinadas implementaciones, la célula huésped puede ser una cepa industrial adecuada para usarse en la producción a escala industrial o a gran escala. Por ejemplo, las cepas industriales pueden cultivarse en un fermentador. La escala de cultivo puede variar de cientos de litros a millones de litros. Por otro lado, una cepa de laboratorio generalmente se cultiva en unos pocos litros o menos. En determinadas implementaciones, una cepa industrial puede crecer en un medio más simple o más económico que las cepas de laboratorio.

Un plásmido de cadena principal capaz de replicación autónoma en una célula huésped puede ser cualquier plásmido que pueda replicarse en la célula huésped. En una implementación, un vector de plásmido de expresión comprende un plásmido de cadena principal que puede replicarse en E. coli. En otra implementación, un vector de plásmido de expresión comprende un plásmido de cadena principal que puede replicarse en H. alvei. Ejemplos de los plásmidos de cadena principal incluyen, sin limitación, plásmidos de cadena principal que pueden replicarse en cepas de E. coli, por ejemplo, plásmidos pUC (por ejemplo, plásmidos pUC18 y pUC19), pBR322, pSC101, pET, p15a y pACYC, y plásmidos derivados de los mismos.

En determinadas implementaciones, el vector de plásmido de expresión puede usarse para la producción de un producto derivado de lisina tal como se describe en el presente documento. En determinadas implementaciones, un producto derivado de lisina puede ser cadaverina tal como se describe en el presente documento.

Tal como se ha proporcionado anteriormente, en determinadas implementaciones, el polinucleótido de ADN descrito en el presente documento puede comprender además una o más secuencias de nucleótidos de ADN de RBS seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14 (es decir, ADN-1 de RBS), SEQ ID NO: 15 (es decir, ADN-2 de RBS), SEQ ID NO: 16 (es decir, ADN-3 de RBS), SEQ ID NO: 17 (es decir, ADN-4 de RBS), SEQ ID NO: 18 (es decir, a Dn -5 de RBS) y s Eq ID NO: 19 (es decir, ADN-6 de RBS). En determinadas implementaciones preferidas, la una o más secuencias de nucleótidos de ADN de RBS pueden comprender, consistir en o consistir esencialmente en SEQ ID NO: 18 (es decir, ADN-5 DE RBS).

Tal como se ha proporcionado anteriormente, en determinadas implementaciones, el polinucleótido de ADN descrito en el presente documento puede comprender además una o más secuencias de nucleótidos promotoras seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20 (es decir, secuencia promotora de Plac), SEQ ID NO: 21 (es decir, secuencia promotora de Pbad) y SEQ ID NO: 22 (es decir, secuencia promotora de Ptac). En determinadas implementaciones preferidas, la una o más secuencias de nucleótidos promotoras pueden comprender, consistir en o consistir esencialmente en SEQ ID NO: 21 (es decir, secuencia promotora de Pbad).

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a un transformante que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en uno o más vectores de plásmido de expresión en una célula huésped, los vectores de plásmido de expresión comprendiendo, consistiendo en o consistiendo esencialmente en:

Los vectores de plásmido de expresión; célula huésped; plásmido de cadena principal; polinucleótidos de ADN; secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa; ldc de K. oxytoca, mutantes y fragmentos de los mismos; polipéptidos de lisina descarboxilasa; Ldc de K. oxytoca, mutantes y fragmentos de los mismos son los mismos que los descritos anteriormente.

Un ejemplo de un mutante de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutante de Idc de K. oxytoca) puede incluir, sin limitación, la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 (es decir, Idc de K. oxytoca) cuyos codones se han optimizado para la expresión en E. coli (es decir, Idc-co1 de K. oxytoca , SEQ ID NO: 3) y que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (es decir, Ldc de K. oxytoca). Otros ejemplos de mutantes de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de Idc de K. oxytoca) pueden incluir, sin limitación, secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa que codifican secuencias de aminoácidos de mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca). Ejemplos de mutantes preferidos de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de ldc de K. oxytoca) que codifican una secuencia de aminoácidos de mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) incluyen, sin limitación, SEQ ID NO: 4 (es decir, Idc-co1 de K. oxytoca A859G), SEQ ID NO: 6 (es decir, Idc-co1 de K. oxytoca C1193G), SEQ ID NO: 8 (es decir, Idc-co1 de K. oxytoca C1306G), SEQ ID NO: 10 (es decir, Idc-co1 de K. oxytoca C1521G) y SEQ ID NO: 12 (es decir, Idc-co1 de K. oxytoca T1820A).

Ejemplos adicionales de mutantes de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de ldc de K. oxytoca) que codifican una secuencia de aminoácidos de mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) pueden incluir, sin limitación, secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa que comprenden, que consisten en o que consisten esencialmente en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una mutación en la posición de nucleótido 859 con respecto a Z¹, una mutación en la posición de nucleótido 1193 con respecto a Z², una mutación en la posición de nucleótido 1306 con respecto a Z³, una mutación en la posición de nucleótido 1521 con respecto a Z⁴, una mutación en la posición de nucleótido 1820 con respecto a Z⁵y/o cualquier combinación de las mismas; secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa que comprenden, que consisten en o que consisten esencialmente en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una mutación en la posición de nucleótido 859 mutada a una G (guanina), una mutación en la posición de nucleótido 1193 mutada a una G, una mutación en la posición de nucleótido 1306 mutada a una G, una mutación en la posición de nucleótido 1521 mutada a una G o una A (adenina), una mutación en la posición de nucleótido 1820 mutada a una A, y/o cualquier combinación de las mismas; secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca A859G o Idc-co1 de K. oxytoca A859G (por ejemplo, ldc de K. oxytoca A859Z1 o Idc-co1 de K. oxytoca A859z -i); secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca C1193G o ldc-co1 de K. oxytoca C1193G (por ejemplo, ldc de K. oxytoca C1193Z2 o ldc-co1 de K. oxytoca C1193Z2); secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca C1306G o ldc-co1 de K. oxytoca C1306G (por ejemplo, ldc de K. oxytoca C1306Z3 o ldc-co1 de K. oxytoca C ^{130 6}Z³); secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca C1521G o ldc-co1 de K. oxytoca C1521G (por ejemplo, ldc de K. oxytoca C1521Z4 o ldc-co1 de K. oxytoca C1521Z4); y secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca T1820A o ldc-co1 de K. oxytoca T1820A (por ejemplo, ldc de K. oxytoca T1820Z5 o ldc-co1 de K. oxytoca T1820Z5). Z¹, Z², Z³, Z⁴y Z⁵se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en A, G, C (citosina) y T (timina), con la condición de que Z¹no sea una A, Z²no sea una C, Z³no sea una C, Z⁴no sea una C o T y Z⁵no sea una T.

Ejemplos de mutantes preferidos de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) incluyen, sin limitación, SEQ ID NO: 5 (es decir, Ldc de K. oxytoca K287E); SEQ ID NO: 7 (es decir, Ldc de K. oxytoca T398S); SEQ ID NO: 9 (es decir, Ldc de K. oxytoca R436G); SEQ ID NO: 11 (es decir, Ldc de K. oxytoca F507L); y SEQ ID NO: 13 (es decir, Ldc de K. oxytoca F607Y). Ejemplos adicionales de mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) incluyen, sin limitación, mutantes que comprenden, que consisten en o que consisten esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una mutación en la posición de aminoácido 287 con respecto a X¹, una mutación en la posición de aminoácido 398 con respecto a X², una mutación en la posición de aminoácido 436 con respecto a X³, una mutación en la posición de aminoácido 507 con respecto a X⁴, una mutación en la posición de aminoácido 607 con respecto a X⁵; polipéptidos homólogos de SEQ ID NO: 5 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca K287X-i); polipéptidos homólogos de SEQ ID NO: 7 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca T³⁹⁸X²); polipéptidos homólogos de SEQ ID NO: 9 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca R^{4 36}X³); polipéptidos homólogos de SEQ ID NO: 11 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca F507X4); y polipéptidos homólogos de s Eq ID NO: 13 (por ejemplo, Ldc de K. oxytoca F607Xs). X ¹, X², X³, X⁴y X⁵se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina, con la condición de que X ¹no sea lisina, X²no sea treonina, X³no sea arginina, X⁴no sea fenilalanina y X⁵no sea fenilalanina.

Tal como se usa en el presente documento, un transformante puede ser una célula huésped que se ha alterado mediante la introducción de uno o más vectores de plásmido de expresión en la célula huésped. En determinadas implementaciones, el transformante puede obtenerse introduciendo un vector de plásmido de expresión a través de transformación en una célula huésped que muestra competencia en el vector de plásmido.

En determinadas implementaciones, el transformante puede usarse para la producción de un producto derivado de lisina tal como se describe en el presente documento. En determinadas implementaciones, un producto derivado de lisina puede ser cadaverina tal como se describe en el presente documento.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a una célula huésped mutante que comprende, que consiste en, que consiste esencialmente en:

un polinucleótido de ADN que comprende una o más secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa seleccionadas del grupo que consiste en mutantes de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de Idc de K. oxytoca) y fragmentos de las mismas, y fragmentos de SEQ ID NO: 1 (es decir, fragmentos de Idc de K. oxytoca), en el que las secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa tienen al menos un 95 % de identidad de secuencia con s Eq ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, y en el que el polinucleótido codifica uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 (es decir, Ldc de K. oxytoca) y fragmentos de la misma, y mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) y fragmentos de los mismos.

La célula huésped; polinucleótidos de ADN; secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa; ldc de K. oxytoca, fragmentos y mutantes de los mismos; polipéptidos de lisina descarboxilasa; Ldc de K. oxytoca, fragmentos y mutantes de los mismos son iguales que los descritos anteriormente.

Ejemplos adicionales de mutantes de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de ldc de K. oxytoca) que codifican una secuencia de aminoácidos de mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) pueden incluir, sin limitación, secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa que comprenden, que consisten en o que consisten esencialmente en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una mutación en la posición de nucleótido 859 con respecto a Z¹, una mutación en la posición de nucleótido 1193 con respecto a Z², una mutación en la posición de nucleótido 1306 con respecto a Z³, una mutación en la posición de nucleótido 1521 con respecto a Z⁴, una mutación en la posición de nucleótido 1820 con respecto a Z⁵, y/o cualquier combinación de las mismas; secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa que comprenden, que consisten en o que consisten esencialmente en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 que comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una mutación en la posición de nucleótido 859 mutada a una G (guanina), una mutación en la posición de nucleótido 1193 mutada a una G, una mutación en la posición de nucleótido 1306 mutada a una G, una mutación en la posición de nucleótido 1521 mutada a una G o una A (adenina), una mutación en la posición de nucleótido 1820 mutada a una A, y/o cualquier combinación de las mismas; secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca A859G o ldc-co1 de K. oxytoca A859G (por ejemplo, ldc de K. oxytoca A859Z1 o ldc-co1 de K. oxytoca A859z -i); secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca C1193G o ldc-co1 de K. oxytoca C1193G (por ejemplo, ldc de K. oxytoca C1193Z2 o ldc-co1 de K. oxytoca C1193Z2); secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca C1306G o Idc-co1 de K. oxytoca C1306G (por ejemplo, ldc de K. oxytoca C1306Z3 o ldc-co1 de K. oxytoca C ^{130 6}Z³); secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca C1521G o ldc-co1 de K. oxytoca C1521G (por ejemplo, ldc de K. oxytoca C1521Z4 o ldc-co1 de K. oxytoca C1521Z4); y secuencias de nucleótidos homólogas de ldc de K. oxytoca T1820A o ldc-co1 de K. oxytoca T1820A (por ejemplo, ldc de K. oxytoca T1820Z5 o ldc-co1 de K. oxytoca T1820Z5). Z¹, Z², Z³, Z⁴y Z⁵se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en A, G, C (citosina) y T (timina), con la condición de que Z¹no sea una A, Z²no sea una C, Z³no sea una C, Z⁴no sea una C o T y Z⁵no sea una T.

Tal como se ha proporcionado anteriormente, en determinadas implementaciones, el polinucleótido de ADN descrito en el presente documento puede comprender además una o más secuencias de nucleótidos de ADN de RBS seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14 (es decir, ADN-1 de RBS), SEQ ID NO: 15 (es decir, ADN-2 de RBS), SEQ ID NO: 16 (es decir, ADN-3 de RBS), SEQ ID NO: 17 (es decir, ADN-4 de RBS), SEQ ID NO: 18 (es decir, ADN-5 de RBS) y SEQ ID NO: 19 (es decir, ADN-6 de RBS).

Tal como se ha proporcionado anteriormente, en determinadas implementaciones, el polinucleótido de ADN descrito en el presente documento puede comprender además, consistir en o consistir esencialmente en una o más secuencias de nucleótidos promotoras seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20 (es decir, secuencia promotora de Plac), SEQ ID NO: 21 (es decir, secuencia promotora de Pbad) y SEQ ID NO: 22 (es decir, secuencia promotora de Ptac). En determinadas implementaciones preferidas, la una o más secuencias de nucleótidos promotoras pueden comprender, consistir en o consistir esencialmente en SEQ ID NO: 21 (es decir, secuencia promotora de Pbad).

En determinadas implementaciones, la célula huésped mutante puede usarse para la producción de un producto derivado de lisina tal como se describe en el presente documento. En determinadas implementaciones, un producto derivado de lisina puede ser cadaverina tal como se describe en el presente documento.

En determinadas implementaciones, el polinucleótido de ADN puede integrarse en el cromosoma de la célula huésped de acuerdo con el método de reemplazo de genes mediado por PCR (véase, por ejemplo, Datsenko, 2000 para una visión general del método de reemplazo de genes mediado por PCR). También pueden producirse cromosomas integrados por otros métodos adecuados.

Otro aspecto de la divulgación se refiere a un método para producir uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa descritos en el presente documento que comprende:

obtener una célula huésped mutante y/o el transformante tal como se describe en el presente documento;

cultivar la célula huésped mutante y/o el transformante en condiciones eficaces para la expresión de uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa; y

recoger el uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa.

Los polipéptidos de lisina descarboxilasa; Ldc de K. oxytoca, mutaciones y fragmentos de los mismos; célula huésped mutante y/o transformantes son iguales que los descritos anteriormente.

En determinadas implementaciones, la célula huésped transformante y/o mutante puede ser cualquiera de las descritas en el presente documento. Por ejemplo, el transformante usado para producir uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa puede obtenerse transformando uno o más vectores de plásmido de expresión tal como se da a conocer en el presente documento en una célula huésped.

La célula huésped transformante y/o mutante puede cultivarse usando un medio que contiene fuentes de carbono y fuentes de nutrientes distintas de carbono. Ejemplos de fuentes de carbono incluyen, sin limitación, azúcar (por ejemplo, hidratos de carbono tales como glucosa y fructosa), aceite y/o grasa, ácido graso, y/o derivados de los mismos. El aceite y la grasa pueden contener ácidos grasos saturados y/o insaturados que tienen 10 o más átomos de carbono, por ejemplo, aceite de coco, aceite de palma, aceite de palmiste, y similares. El ácido graso puede ser un ácido graso saturado y/o insaturado, por ejemplo, ácido hexanoico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido láurico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido mirístico, y similares. Ejemplos de derivados de un ácido graso incluyen, sin limitación, ésteres y sales de los mismos. Ejemplos de fuentes distintas de carbono incluyen, sin limitación, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas y otras fuentes de nutrientes orgánicos.

Por ejemplo, un medio puede contener una fuente de carbono asimilable por la célula huésped transformante y/o mutante, opcionalmente con una o más de otras fuentes seleccionadas del grupo que consiste en una fuente de nitrógeno, una sal inorgánica y otra fuente de nutrientes orgánicos. En determinadas implementaciones, el porcentaje en peso de la fuente de nitrógeno es de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 0,1 % del medio. Ejemplos de la fuente de nitrógeno pueden comprender amoniaco, sales de amonio (por ejemplo, cloruro de amonio, sulfato de amonio y fosfato de amonio), peptona, extracto de carne, extracto de levadura, y similares. Ejemplos de las sales inorgánicas incluyen, sin limitación, dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro de sodio, y similares. Ejemplos de la otra fuente de nutrientes orgánicos incluyen, sin limitación, aminoácidos (por ejemplo, glicina, alanina, serina, treonina y prolina), vitaminas (por ejemplo, vitamina B1, vitamina B12 y vitamina C), y similares.

El cultivo puede llevarse a cabo a cualquier temperatura siempre que las células puedan crecer, y preferiblemente a de aproximadamente 20°C a aproximadamente 40°C, o aproximadamente 35°C. El período de cultivo puede ser de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9 o aproximadamente 10 días.

En una implementación, la célula huésped transformante y/o mutante se cultiva en un medio que contiene péptidos, peptonas, vitaminas (por ejemplo, vitaminas B), oligoelementos (por ejemplo, nitrógeno, azufre, magnesio) y minerales. Ejemplos de tal medio incluyen, sin limitación, medios de caldo de lisogenia (LB) comúnmente conocidos que comprenden triptona, extracto de levadura y NaCl suspendido en agua (por ejemplo, destilada o desionizada).

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a un método para producir cadaverina (1,5-pentanodiamina) que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en:

la ) cultivar una célula huésped transformante y/o mutante tal como se da a conocer en el presente documento,

lb ) producir cadaverina usando el cultivo obtenido de la etapa 1a para descarboxilar lisina, y

lc ) extraer y purificar cadaverina usando el cultivo obtenido de la etapa 1b.

En determinadas implementaciones, la célula huésped transformante y/o mutante puede ser cualquiera de las descritas en el presente documento.

Cultivar la célula huésped transformante y/o mutante puede comprender las etapas de cultivar el transformante tal como se describió anteriormente.

Por ejemplo, la célula huésped transformante y/o mutante puede cultivarse usando un medio que contiene fuentes de carbono y fuentes de nutrientes distintas de carbono. Ejemplos de fuentes de carbono incluyen, sin limitación, azúcar (por ejemplo, hidratos de carbono tales como glucosa y fructosa), aceite y/o grasa, ácido graso, y/o derivados de los mismos. El aceite y la grasa pueden contener ácidos grasos saturados y/o insaturados que tienen 10 o más átomos de carbono, por ejemplo, aceite de coco, aceite de palma, aceite palmiste, y similares. El ácido graso puede ser un ácido graso saturado y/o insaturado, por ejemplo, ácido hexanoico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido láurico, ácido oleico, ácido palmítico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido mirístico, y similares. Ejemplos de derivados de un ácido graso incluyen, sin limitación, ésteres y sales de los mismos. Ejemplos de fuentes distintas de carbono incluyen, sin limitación, fuentes de nitrógeno, sales inorgánicas y otras fuentes de nutrientes orgánicos.

En una implementación, la célula huésped transformante y/o mutante se cultiva en un medio que contiene péptidos, peptonas, vitaminas (por ejemplo, vitaminas B), oligoelementos (por ejemplo, nitrógeno, azufre, magnesio) y minerales. Ejemplos de tal medio incluyen, sin limitación, medios de caldo de lisogenia (LB) comúnmente conocidos que comprenden triptona, extracto de levadura y NaCI suspendido en agua (por ejemplo destilada o desionizada).

Tal como se usa en el presente documento, “usar el cultivo obtenido de la etapa 1a” puede comprender procesos adicionales del cultivo obtenido de la etapa 1a. Por ejemplo, usar una disolución tampón para diluir el cultivo; centrifugar el cultivo para recoger las células; resuspender las células en una disolución tampón; o lisar las células para dar un lisado celular; y/o purificar lisina descarboxilasa del lisado celular.

En otra implementación, la etapa 1c del método comprende además las siguientes etapas:

ld ) separar los componentes sólidos y líquidos de la reacción obtenida de la etapa 1b;

le ) ajustar el pH del componente líquido obtenido de la etapa 1d a aproximadamente 14 o superior;

lf) retirar agua del componente líquido obtenido de la etapa 1e; y

lg ) recuperar cadaverina.

En la etapa 1d, la separación de los componentes sólidos y líquidos de la reacción de la etapa 1b puede lograrse mediante centrifugación y/o filtración convencional.

En la etapa 1e, el pH del componente líquido de la etapa 1d puede ajustarse añadiendo una base, por ejemplo, NaOH. Puede añadirse NaOH como un sólido y/o una disolución (por ejemplo, una disolución acuosa).

En la etapa 1f, el agua puede retirarse por destilación a presión ambiental o a vacío.

En la etapa 1g, puede recuperarse cadaverina por destilación a presión ambiental o al vacío.

2a) obtener uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 2 (es decir, Ldc de K. oxytoca) y fragmentos de la misma, y mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca) y fragmentos de los mismos; y

2b) producir cadaverina usando el uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa obtenidos en la etapa 2a para descarboxilar lisina.

Los polipéptidos de lisina descarboxilasa; Ldc de K. oxytoca, mutaciones y fragmentos de los mismos son iguales que los descritos anteriormente.

En determinadas implementaciones, el método para producir cadaverina puede incluir además la etapa de 2c que comprende extraer y purificar la cadaverina producida en la etapa 2b. En otra implementación, la etapa 2c del método comprende además las siguientes etapas:

2d) separar los componentes sólidos y líquidos de la reacción obtenida de la etapa 2b;

2e) ajustar el pH del componente líquido obtenido de la etapa 2d a aproximadamente 14 o superior;

2f) retirar agua del componente líquido obtenido de la etapa 2e; y

2g) recuperar cadaverina.

En la etapa 2d, la separación de los componentes sólidos y líquidos de la reacción de la etapa 2b puede lograrse mediante centrifugación y/o filtración convencional.

En la etapa 2e, el pH del componente líquido de la etapa 2d puede ajustarse añadiendo una base, por ejemplo, NaOH. Puede añadirse NaOH como un sólido y/o una disolución (por ejemplo, una disolución acuosa).

En la etapa 2f, el agua puede retirarse por destilación a presión ambiental o a vacío.

En la etapa 2g, puede recuperarse cadaverina por destilación a presión ambiental o a vacío.

En determinadas implementaciones, el uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa usados para producir cadaverina pueden estar inmovilizados. En determinadas implementaciones, el uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa pueden estar confinados a una matriz. En determinadas implementaciones, el uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa pueden inmovilizarse usando cualquier método adecuado conocido por un experto en la técnica. Ejemplos de técnicas de inmovilización incluyen, sin limitación, adsorción (por ejemplo, a partir de interacciones iónicas o hidrófobas), unión covalente, inmovilización por afinidad (por ejemplo, la matriz se acopla a un ligando de afinidad para el uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa, o el uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa se conjugan con una molécula que tiene afinidad por la matriz) y atrapamiento (es decir, confinamiento de uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa por interacciones covalentes o no covalentes con la matriz). Ejemplos de materiales que pueden usarse como matriz incluyen, sin limitación, alginato, quitosano, quitina, colágeno, carragenina, gelatina, celulosa, almidón, pectina, Sepharose, zeolitas, cerámicas, celite, sílice, vidrio, carbono activado y carbón.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a cadaverina de base biológica preparada de acuerdo con el método dado a conocer en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, un compuesto “de base biológica” significa que el compuesto se considera de base biológica según la norma ASTM D6866.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a una poliamida que tiene una estructura de estructura 1:

incluyendo estereoisómeros de la misma, en la que:

m = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22;

n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22;

j = aproximadamente 100 ~ aproximadamente 1.000.000; y

la poliamida se prepara a partir de una o más diaminas que tienen números de carbonos de m y uno o más ácidos dicarboxílicos que tienen números de carbonos de n, al menos una de las diaminas y ácidos dicarboxílicos comprende carbono de base biológica según la norma ASTM D6866, y el m o n de cada diamina o ácido dicarboxílico puede ser igual o diferente.

En una implementación, la diamina es cadaverina de base biológica, más preferiblemente cadaverina de base biológica preparada de acuerdo con el método dado a conocer en el presente documento. Ejemplos de los ácidos dicarboxílicos incluyen, sin limitación, ácido dicarboxílico C¹⁰, ácido dicarboxílico C¹¹, ácido dicarboxílico C¹², ácido dicarboxílico C¹³, ácido dicarboxílico C¹⁴, ácido dicarboxílico C¹⁶, ácido dicarboxílico C¹⁸y cualquier combinación de los mismos. En determinadas implementaciones, todos o parte de los ácidos dicarboxílicos Cn son de base biológica.

En otras implementaciones, la poliamida tiene una estructura descrita anteriormente, en la que:

la poliamida se forma haciendo reaccionar cadaverina de base biológica con uno o más ácidos dicarboxílicos, más preferiblemente, la cadaverina de base biológica se prepara de acuerdo con el método dado a conocer en el presente documento;

n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22;

j = aproximadamente 100 ~ aproximadamente 1.000.000, aproximadamente 1000 ~ aproximadamente 100.000 o aproximadamente 1000 ~ aproximadamente 10.000; y

los ácidos dicarboxílicos comprenden carbono de base biológica según la norma ASTM D6866.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a un método de preparación de las poliamidas dadas a conocer en el presente documento que comprende preparar cadaverina de base biológica como la diamina Cm de acuerdo con el método dado a conocer en el presente documento.

En una implementación, el método comprende además preparar uno o más ácidos dicarboxílicos Cn de base biológica.

En otra implementación, el método comprende además preparar la poliamida haciendo reaccionar cadaverina de base biológica con uno o más ácidos dicarboxílicos Cn de base biológica.

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a una composición que comprende una o más poliamidas dadas a conocer en el presente documento.

En una implementación, la diamina es cadaverina de base biológica, más preferiblemente cadaverina de base biológica preparada de acuerdo con el método dado a conocer en la presente memoria. Ejemplos de los ácidos dicarboxílicos incluyen, sin limitación, ácido dicarboxílico C¹⁰, ácido dicarboxílico C¹¹, ácido dicarboxílico C¹², ácido dicarboxílico C¹³, ácido dicarboxílico C¹⁴, ácido dicarboxílico C¹⁶, ácido dicarboxílico C¹⁸, y cualquier combinación de los mismos. En determinadas implementaciones, todos o parte de los ácidos dicarboxílicos Cn son de base biológica.

En otra implementación, la poliamida tiene una estructura descrita anteriormente, en la que:

n = 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22;

Otro aspecto proporcionado en el presente documento se refiere a un método de preparación de 1,5-diisocianatopentano que comprende:

3a) preparar cadaverina de base biológica tal como se da a conocer en el presente documento; y

3b) convertir cadaverina de base biológica obtenida de la etapa 3a en 1,5-diisocianatopentano.

La etapa 3b puede comprender usar cualquier método conocido para convertir diamina en isocianato. Un ejemplo de dicho método es el método tradicional de fosgeno, que incluye un método de fosgeno a alta temperatura de una etapa (es decir, mezclar fosgeno con diamina a alta temperatura para obtener isocianato), el método mejorado de fosgeno de dos etapas y el método de trifosgeno en el que se usa trifosgeno en lugar de fosgeno. También hay otros métodos que no usan fosgeno como materia prima. Un ejemplo de dicho método es la carbonilación de hexanodiamina que usa CO²en lugar de fosgeno: se añade CO²a una disolución de una amina primaria y una base orgánica, después se añade una cantidad adecuada de reactivos electrófilos de fósforo a la disolución de reacción para comenzar una reacción de deshidratación exotérmica para obtener isocianato. Otro ejemplo es el método de descomposición térmica de carbamato en el que una amina primaria se convierte en un carbamato, y luego el carbamato se calienta para que se descomponga y generar isocianato.

Las abreviaturas usadas para los aminoácidos, polipéptidos, secuencias de bases y ácidos nucleicos se basan en las abreviaturas especificadas en la Comunicación de la IUPAC-IUB sobre Nomenclatura Bioquímica, Eur. J. Biochem.y138:9 (1984), “Guideline for Preparing Specifications Including Base Sequences and Amino Acid Sequences” (Oficina de Patentes y Marcas de los Estados Unidos), y las usadas comúnmente en este campo técnico.

A menos que el contexto requiera claramente lo contrario, a lo largo de la descripción y las reivindicaciones, las palabras “comprenden”, “que comprende” y similares deben interpretarse en un sentido inclusivo (es decir, por ejemplo, en el sentido de “que incluye, pero sin limitarse a”), en oposición a un sentido exclusivo o exhaustivo. Las palabras “en el presente documento”, “anteriormente”, “a continuación”, “citado anteriormente” y palabras de importancia similar; cuando se usan en esta solicitud, se refieren a esta solicitud en su conjunto y no a ninguna parte particular de esta solicitud. Cuando el contexto lo permita, las palabras en la descripción detallada anterior que usan el número singular o plural también pueden incluir el número plural o singular respectivamente. Las palabras “o” e “y/o” en referencia a una lista de dos o más elementos, cubren todas las siguientes interpretaciones de la palabra: cualquiera de los elementos de la lista, todos los elementos de la lista y cualquier combinación de los elementos de la lista.

Los siguientes ejemplos se pretende que ilustren diversas realizaciones de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Sobreexpresión de lisina descarboxilasa de K. oxytoca en E. coli.

Se adquirió ADN genómico de K. Oxytoca de DSMZ (DSM 6673). El ADN genómico se usó como molde en una reacción PCR con los cebadores KOldc-F y KOldc-R (véase la figura 1). Los cebadores se diseñaron basándose en el registro de GenBank CP003683.1, que es la porción del genoma de K. oxytoca E718 que contiene el gen de lisina descarboxilasa (Idc) de tipo silvestre. La secuencia de nucleótidos de Idc de K. oxytoca (SEQ ID NO: 1) codifica la proteína lisina descarboxilasa, Ldc de K. oxytoca (SEQ ID NO: 2). El producto de PCR amplificado se clonó en el plásmido pUC18 usando las enzimas de restricción Sacl y Xbal para crear pUC18-KOldc. Después de que se verificase la secuencia de lisina descarboxilasa, se transformó pUC18-KOldc en E. coli MG1655 K12 (DSM 18039) (K12) para crear la cepa LN18 (véase la figura 2). Se optimizaron los codones de la secuencia de ldc de K. oxytoca para la expresión en E. coli (ldc-co1 de K. oxytoca; s Eq ID NO: 3). El gen con codones optimizados (ldc-co1 de K. oxytoca) se clonó en pUC18 tal como se describió anteriormente para crear el plásmido pUC18-KOldc-co1, y el plásmido se transformó en E. coli K12 para producir la cepa LN20 (véase la figura 2). Se construyó un vector de plásmido que contiene cadA de E. coli, que codifica el polipéptido de lisina descarboxilasa CadA, clonando cadA de E coli de tipo silvestre en pUC18 para generar el control positivo, pCIB60. Se transformó pCIB60 en E. coli K12 para generar la cepa CIB60 (véase la figura 2).

Se cultivaron tres colonias de cada cepa durante la noche en medio LB con ampicilina en un cultivo de 3 ml a 37°C. Al día siguiente, se inocularon 40 pl de cada cultivo durante la noche en 3 ml de medio LB nuevo con ampicilina hasta una DO⁶⁰⁰final ~ 0,05, se cultivaron durante 3 horas hasta una DO⁶⁰⁰~ 0,4, y se añadió p-D-1-tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) 0,5 mM. Cada cultivo se incubó a 37°C durante 8 horas adicionales. Para someter a prueba la actividad, se mezclaron 0,9 ml de cultivo con lisina-HCl (15 mg) y piridoxal 5-fosfato (PLP) (concentración final de 0,1 mM) para dar un volumen de reacción final de 1 ml. Se permitió que cada reacción continuara a 37°C durante 2 horas. Se detuvo la reacción sometiendo a ebullición la muestra durante 5 minutos. Las muestras se procesaron inmediatamente usando RMN.

Tabla 1: Producción de cadaverina usando la cepa CIB60 (cepa de E. coli que comprende cadA de E. coli), la cepa LN18 (cepa de E. coli que comprende ldc de K. oxytoca) y la cepa LN20 (cepa de E. coli que comprende ldc-co1 de K. oxytoca).

Tal como se muestra en la tabla 1, las células que expresan la proteína Ldc de K. oxytoca codificada por ADN de ldcco1 de K. oxytoca produjeron el mayor rendimiento de cadaverina (6,63 g/kg) en comparación con células que expresan la proteína Ldc de K. oxytoca codificada por ADN de ldc de K. Oxytoca de tipo silvestre. (4,41 g/kg) o células que expresan la proteína CadA de E. coli (5,69 g/kg).

Ejemplo 2: Producción de cadaverina usando la cepa LN20 que comprende lcd-co1 de K. oxytoca y un prom otor Plac.

Se cultivaron tres colonias de la cepa LN20 que comprende ldc-co1 de K. oxytoca y un promotor Plac (véase la figura 2) durante la noche en medio LB con ampicilina en un cultivo de 3 ml a 37°C. Al día siguiente, se inocularon 160 pl de cada cultivo durante la noche en 12 ml de medio LB nuevo con ampicilina hasta una DO⁶⁰⁰final ~ 0,05, y se cultivaron durante 3 horas hasta una DO⁶⁰⁰-0,4. A una DO⁶⁰⁰~0,4, cada cultivo de 12 ml se dividió en cuatro cultivos separados de 3 ml, y se añadió IPTG a cada cultivo a las siguientes concentraciones finales: 0, 0,1, 0,2 y 0,5 mM. Cada cultivo se incubó a 37°C durante 8 horas adicionales. Se usó el mismo protocolo que se describió en el ejemplo 1 para someter a prueba la producción de cadaverina.

Tabla 2: Producción de cadaverina usando la cepa LN20 (cepa de E. coli que comprende ldc-co1 de K. oxytoca y un promotor Plac)

Tal como se muestra en la tabla 2, el rendimiento más alto de cadaverina se produjo cuando las células LN20 (cepa de E. coli que comprende ldc-co1 de K. oxytoca y un promotor Plac) se indujeron a una concentración de IPTG de 0,5 mM.

Ejemplo 3: Producción de cadaverina usando la cepa LN22 que comprende ldc-co1 de K. oxytoca y un prom otor Pbad.

A continuación, se creó una cepa que comprendía ldc-co1 de K. oxytoca y un promotor Pbad (cepa LN22, véase la figura 2). Se insertó un sitio de restricción Xhol 27 pares de bases en el sentido de 5' del inicio del promotor lac en el plásmido pUC18-KOldc-co1 usando los cebadores Xhol-F y Xhol-R (véase la figura 1). Se realizó PCR QuickChange usando pUC18-KOldc-co1, el plásmido que contiene el gen de ldc-co1 de K. oxytoca, como ADN molde. El plásmido resultante que contenía la secuencia de Xhol insertada se denominó pUC18-KOldc-co1-Xhol. El promotor Pbad y el gen araC en el sentido de 5' se amplificaron a partir de un plásmido de expresión pKD46 usando los cebadores Pbad-F y Pbad-R (véase la figura 1), y se clonaron en pUC18-KOldc-co1-Xhol usando las enzimas de restricción Xhol y Sacl para crear el plásmido pUC18-KOldc-co1-Pbad. El plásmido pUC18-KOldc-co1-Pbad se transformó en la cepa de E. coli K12 para crear la cepa LN22 (véase la figura 2). La producción de cadaverina y los experimentos de análisis se realizaron de la misma manera que se describió en el ejemplo 2, excepto porque se añadió arabinosa en lugar de IPTG a las siguientes concentraciones finales: 0, 2,5, 5,0 y 10,0 mM.

Tabla 3: Producción de cadaverina usando la cepa LN22 (cepa de E. coli que comprende ldc-co1 de K. oxytoca y un promotor Pbad).

Tal como se muestra en la tabla 3, el rendimiento más alto de cadaverina se produjo cuando las células LN22 (cepa de E. coli que comprende ldc-co1 de K. oxytoca y un promotor Pbad) se indujeron a una concentración de arabinosa de 10 mM.

Ejemplo 4: Producción de cadaverina usando la cepa LN24 (cepa de E. coli que comprende ldc-co1 de K. oxytoca y un promotor Ptac).

A continuación, se creó una cepa que comprendía ldc-co1 de K. oxytoca y un promotor Ptac (cepa LN24, véase la figura 2). De manera similar, el promotor Ptac y el gen laclq en el sentido de 5' se amplificaron a partir de pGEXT43 usando los cebadores Ptac-F y Ptac-R (véase la figura 1), y se clonaron en pUC18-KOldc-co1-Xhol para crear el plásmido, pUC18-KOldc-co1-Ptac. Se transformó pUC18-KOldc-co1-Ptac en k 12 para crear la cepa LN24 (véase la figura 2). La producción de cadaverina y los experimentos de análisis se realizaron de la misma manera que se describió en el ejemplo 2.

Tabla 4: Producción de cadaverina usando la cepa LN24 (cepa de E. coli que comprende ldc-co1 de K. oxytoca y un promotor Ptac).

Tal como se muestra en la tabla 4, se produjo el mayor rendimiento de cadaverina cuando las células LN24 (cepa de E. coli que comprende ldc-co1 de K. oxytoca y un promotor Ptac) se indujeron a una concentración de IPTG de 0,1 o 0,2 mM.

Ejemplo 5: Producción de cadaverina comparando cepas que expresan Ldc de K. oxytoca o CadA de E. coli durante fermentación discontinua.

Se realizó fermentación discontinua usando células que expresan la proteína Ldc de K. oxytoca (cepa LN20, células de E. coli que comprenden ldc-co1 de K. oxytoca y un promotor Plac, véase la figura 2) y células que expresan la proteína CadA de E. coli (cepa CIB60, o células de E. coli que comprenden cadA de E. coli y un promotor Plac, véase la figura 2). Se llevaron a cabo cultivos discontinuos a 37°C en un fermentador en frasco de 10 l que contenía 7 l de medio de fermentación que consistía en 20 g l-1 de glucosa, 30 g l-1 de licor de maíz fermentado, 10 g l-1 de extracto de levadura, 5 g l-1 de sulfato de amonio, 10 g l-1 de MgSO⁴, 0,05 g l-1 de FeSO⁴, 0,05 g l-1 de MnSO⁴, 5 g l-1 de CaCl²y 0,1 g l-1 de ampicilina. Se inoculó una colonia en 50 ml de medio LB, y se cultivó durante 24 horas a 100 rpm y 37°C en una incubadora de agitación. El fermentador se inoculó con 50 ml del cultivo de siembra, y el pH se controló a -7,0 añadiendo NaOH al 20 % (p/v). La aireación se mantuvo a 3,5 l min-1 con una velocidad de agitación de 400 rpm y una presión de 0,05 MPa. Se añadió IPTG 0,2 mM en fase exponencial. El tiempo total de fermentación fue de 18 h. Se tomaron muestras periódicamente para medir la concentración de biomasa y la capacidad de conversión de lisina en cadaverina. Los datos se muestran en la figura 3.

En condiciones de fermentación discontinua, células que expresan CadA de E. coli (cepa CIB60) alcanzaron una DO⁶⁰⁰final de 15,02 después de 18 horas (véase la figura 3, cuadrados negros). Células que expresan Ldc de K. oxytoca (cepa LN20) lograron una DO⁶⁰⁰inferior de 14,26 (véase la figura 3, cuadrados blancos). La tasa de utilización de glucosa es similar entre las dos cepas (véase la figura 3: LN20, círculos blancos; CIB60, círculos negros). Sin embargo, las células que expresan Ldc de K. oxytoca (cepa LN20) fueron capaces de convertir lisina-HCl en cadaverina a una tasa del 0,43 % min'1, que es un 24 % mayor en comparación con las células que expresan CadA de E. coli (cepa CIB60), que tenían una actividad del 0,37 % min'1 (véase la figura 3, triángulos blancos y triángulos negros, respectivamente).

Ejemplo 6: Producción de cadaverina usando la cepa que expresa Ldc de K. oxytoca durante la fermentación por alimentación discontinua.

Se realizó fermentación por alimentación discontinua usando células que expresan la proteína Ldc de K. oxytoca (cepa LN24, células de E. coli que comprenden ldc-co1 de K. oxytoca y un promotor Ptac, véase la figura 2). El cultivo de alimentación discontinua se llevó a cabo a 37°C en un fermentador de frasco de 10 l que contenía 5 l de medio de fermentación que consistía en 8 g l-1 de glucosa, 30 g l-1 de licor de maíz fermentado, 10 g l-1 de extracto de levadura, 5 g l-1 de sulfato de amonio, 10 g l-1 de MgSO⁴, 0,05 g l-1 de FeSO⁴, 0,05 g l-1 de MnSO⁴, 5 g l-1 de CaCh y 0,1 g l-1 de ampicilina. La disolución de alimentación contenía el 50% de glucosa en agua para mantener la concentración de glucosa en el caldo de fermentación a 5-8 g l-1. Se añadió una disolución de amoniaco al 25 % para mantener el pH en ~7,0. La aireación se mantuvo a 3,5 l min-1 con una velocidad de agitación de 400 rpm y una presión de 0,05 Mpa. Se añadió IPTG 0,1 mM cada 10 horas durante la fase exponencial. El tiempo total de fermentación fue de 58 horas. Se tomaron muestras periódicamente durante las 58 horas para medir la concentración de biomasa y la capacidad de conversión de lisina en cadaverina. Los datos se muestran en la figura 4.

En condiciones de fermentación por alimentación discontinua, células que expresan la proteína Ldc de K. oxytoca (cepa LN24) alcanzaron una DO⁶⁰⁰de ~80 después de 58 horas (véase la figura 4, cuadrados blancos), y se observó una actividad máxima del 1,33 % min-1 para la muestra de 10 g sometida a ensayo (0,133 % min-1 g-1) (véase la figura 4, rombos negros).

Ejemplo 7: Cribado de una biblioteca de sitios de unión al ribosoma para aumentar la producción de cadaverina.

Se preparó una biblioteca de ADN de sitios de unión al ribosoma (RBS) para su uso para el cribado de una secuencia de RBS óptima para la expresión de la proteína Ldc de K. oxytoca que da como resultado una mayor producción de cadaverina. Se usaron los cebadores RBS-F y RBS-R (véase la figura 1) para modificar los nucleótidos en la región de ADN de RBS de ldc-co1 de K. oxytoca (SEQ ID NO: 3) en pUC18-KOldc-co1-Ptac. Se diseñó RBS-F para permitir que se generaran secuencias de nucleótidos aleatorias en las posiciones de nucleótidos -7 a -12 en relación con el primer nucleótido de ldc-co1 de K. oxytoca. Se agruparon cinco reacciones de PCR, se trataron con la enzima de restricción Dpnl para eliminar cualquier ADN molde y se realizó la limpieza por PCR. Se transformó un |ig de ADN purificado en E. coli MG1655 K12, y la transformación se sembró en placas para permitir que se cribaran colonias individuales. Se cribaron mil colonias y se marcaron como LN100-1099. La producción de cadaverina usando las cepas LN100-1099 se comparó con la de l N24 (cepa de E. coli que comprende ldc-co1 de K. oxytoca y Ptac, véase la figura 2).

Cinco cepas obtenidas de la biblioteca de cribado (LN140, LN301, LN499, LN637 y LN770) demostraron la mayor producción de cadaverina de las mil cepas cribadas. Los plásmidos de estas cepas se purificaron y se marcaron como pLN140, pLN301, pLN499, pLN637 y pLN770. Los plásmidos se secuenciaron usando el cebador RBS-out-F (véase la figura 1) para determinar las secuencias de ADN de RBS novedosas en la región de ADN de RBS de ldc-co1 de K. oxytoca. Los cinco plásmidos de los cinco principales productores se transformaron en E. coli MG1655 K12 para producir las cepas LN1100, LN1101, LN1102, LN1103 y LN1104 (véase la figura 2). La producción de cadaverina usando las cepas con secuencias de ADN de RBS mutadas (LN1100, LN1101, LN1102, LN1103 y LN1104) se comparó con la producción de cadaverina usando la cepa con la secuencia de ADN de RBS de tipo silvestre (cepa LN24, cepa de E. coli que comprende ldc-co1 de K. oxytoca y un promotor Ptac, figura 2). La producción y el análisis de cadaverina se realizaron tal como se describió en el ejemplo 1, excepto porque se usó IPTg 0,1 mM y 25 mg de lisina-HCl.

Tabla 5: Producción de cadaverina usando la cepa LN24 y cepas obtenidas de la biblioteca de cribado de ADN de RBS.

Tal como se muestra en la tabla 5, los plásmidos con las secuencias de ADN de RBS mutadas, cuando se transformaron en E. coli K12 (LN1100, LN1101, LN1102, LN1103 y LN1104), produjeron mayores rendimientos de cadaverina en comparación con la cepa con la secuencia de a Dn de RBS de tipo silvestre (LN24). El mayor rendimiento de cadaverina se produjo a partir de la cepa LN1103 (es decir, 10,0 0,6 g/kg), que tenía la secuencia de ADN-5 de RBS (es decir, TGGAGG; SEQ ID NO: 18).

Ejemplo 8: Cribado de la biblioteca de epPCR para aumentar la producción de cadaverina

El plásmido de la cepa que produjo el mayor rendimiento de cadaverina en el ejemplo 7 (plásmido pLN637, cepa LN1103) se usó para introducir mutaciones aleatorias en la secuencia de polinucleótidos de ldc-co1 de K. oxytoca (SEQ ID NO: 3) usando PCR propensa a errores (epPCR). Basándose en el resultado de secuenciación de pLN637, se diseñó el cebador epPCR-F (véase la figura 1) para amplificar la región en el sentido de 5' de ldc-co1 de K. oxytoca. Los cebadores epPCR-F y epPCR-R (figura 1) se usaron para amplificar la secuencia de ldc-co1 de K. oxytoca a partir de pLN637 usando epPCR. La epPCR se realizó con el kit de mutagénesis aleatoria GeneMorph II siguiendo las instrucciones del fabricante. Se agruparon cinco reacciones PCR, se trataron con la enzima de restricción Dpnl para eliminar cualquier ADN molde y se purificaron. El producto amplificado se clonó en pUC18-KOldc-co1-Ptac para reemplazar la secuencia de polinucleótidos de ldc-co1 de K. oxytoca usando las enzimas de restricción Sacl y Xbal. El a Dn purificado se transformó en E. coli MG1655 K12, y la transformación se sembró en placas para permitir que se cribaran colonias individuales para aumentar la producción de cadaverina. Se cribaron mil colonias individuales a partir de la transformación para identificar cepas con la capacidad aumentada de convertir lisina-HCl en cadaverina en comparación con LN1103. Estos mil mutantes generados a partir de la epPCR se marcaron como LN2000-2999.

Cinco cepas obtenidas a partir de la epPCR (es decir, LN2377, LN2453, LN2768, LN2888 y LN2964) demostraron la mayor producción de cadaverina de los mil mutantes generados por la epPCR que se cribaron. Los plásmidos de estas cepas se purificaron, y se marcaron como pLN2377, pLN2453, pLN2768, pLN2888 y pLN2964. El gen de lisina descarboxilasa en cada uno de estos plásmidos se secuenció usando los cebadores Idc-out-F y Idc-out-R (figura 1). Los cinco plásmidos se transformaron en E. coli MG1655 K12 para producir las cepas LN3010, LN3011, LN3012, LN3013 y LN3014 (figura 2). La producción y el análisis de cadaverina se realizó tal como se describió en el ejemplo 7.

Tabla 6: Producción de cadaverina usando la cepa LN1103 y cepas obtenidas de la biblioteca de cribado de epPCR.

Tal como se muestra en la tabla 6, E. coli K12 transformada con los plásmidos que tienen mutaciones en la secuencia de ldc-co1 de K. oxytoca (es decir, cepa LN3010, LN3011, LN3012, LN3013 y LN3014) condujo a mayores rendimientos de cadaverina en comparación con la cepa sin mutaciones en la secuencia de ldc-co1 de K. oxytoca (es decir, cepa LN24). El mayor rendimiento de cadaverina se produjo a partir de la cepa LN3014, la cepa que expresa la proteína Ldc de K. oxytoca F507L mutante (SEQ ID NO: 11), lo que dio como resultado un rendimiento de 11,2 ± 1,0 g/kg de cadaverina.

Ejemplo 9: Producción de cadaverina comparando cepas que expresan Ldc de K. oxytoca o Ldc de K. oxytoca F507L durante fermentación discontinua.

Se realizó fermentación discontinua de células que expresan o bien Ldc de K. oxytoca (cepa LN24, figura 2) o bien células que expresan Ldc de K. oxytoca F507L (cepa LN3014, figura 2) de la misma manera que se describió en el ejemplo 5. Los datos se muestran en la figura 5. En condiciones de fermentación discontinua, células que expresan Ldc de K. oxytoca (cepa LN24) y células que expresan Ldc de K. oxytoca F507L (cepa LN3014) alcanzaron una DO⁶⁰⁰final similar de alrededor de 13,6 ± 0,1 después de 18 horas (véase la figura 5, cuadrados negros y cuadrados blancos, respectivamente). La tasa de utilización de glucosa es ligeramente mayor en células que expresan Ldc de K. oxytoca (cepa LN24) en comparación con células que expresan Ldc de K. oxytoca F507L (cepa LN3014) (véase la figura 5, círculos negros y círculos blancos, respectivamente). Sin embargo, las células que expresan Ldc de K. oxytoca F507L (cepa LN3014) tuvieron una tasa un 25 % mayor de conversión de lisina-HCl en cadaverina en comparación con células que expresan Ldc de K. oxytoca (cepa LN24) (véase la figura 5, triángulos blancos y triángulos negros, respectivamente). Células que expresan Ldc de K. Oxytoca (cepa LN24) lograron una actividad del 0,58 % min-1, mientras que células expresan Ldc de K. oxytoca F507L (cepa LN3014) lograron una actividad del 0,72 % min-1 (véase la figura 5 en el punto de tiempo de 18 horas, triángulos negros y triángulos blancos, respectivamente).

Ejemplo 10: Producción de cadaverina de la cepa que expresa Ldc de K. oxytoca F507L durante la fermentación por alimentación discontinua.

Se realizó fermentación por alimentación discontinua de células que expresan Ldc de K. oxytoca F507L (cepa LN3014, figura 2) de la misma manera que se proporciona en el ejemplo 6. Los datos se muestran en la figura 6. Se sometieron a prueba células que expresan Ldc de K. oxytoca F507L (cepa LN3014) en fermentación por alimentación discontinua durante 58 horas. La DO⁶⁰⁰alcanzó ~82 después de 58 horas, y se observó una actividad máxima del 1,56 % min-1 para la muestra de 10 g sometida a ensayo (0,156 % min-1 g-1) (véase la figura 6, cuadrado y triángulo, respectivamente, en el punto de tiempo de 58 horas).

Bibliografía

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2. Datsenko KA & Wanner BL. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. PNAS, (2000) 6640-6645.

3. Papadakis et al. Promoters and Control Elements: Designing Expression Cassettes for Gene Therapy. Current Gene Therapy, (2004) 4: 89-113.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Polipéptido de lisina descarboxilasa que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de Klebsiella oxytoca (K. oxytoca)),

en el que el mutante de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutante de Ldc de K. oxytoca) se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 (es decir, Ldc de K. oxytoca T398S) y SEQ ID No : 11 (es decir, Ldc de K. oxytoca F507L).

2. Polinucleótido de ADN que comprende una o más secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa, en el que el polinucleótido codifica uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa según la reivindicación ¹.

3. Polinucleótido de ADN que comprende una o más secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa seleccionadas del grupo que consiste en mutantes de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de ldc de K. oxytoca) y fragmentos de las mismas, en el que las secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa tienen al menos un 95 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, y en el que el polinucleótido codifica uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca),

en el que el mutante de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutante de Ldc de K. oxytoca) se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 (es decir, Ldc de K. oxytoca T398S) y SEQ ID No : 11 (es decir, Ldc de K. oxytoca F507L).

4. Polinucleótido de ADN según la reivindicación 3, en el que la secuencia de nucleótidos de lisina descarboxilasa de SEQ ID NO: 3 comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una mutación en la posición de nucleótido 1193 con respecto a Z², y una mutación en la posición de nucleótido 1521 con respecto a Z⁴; en el que Z²y Z⁴se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T), con la condición de que Z²no sea una C y Z⁴no sea una C o T.

5. Polinucleótido de ADN según la reivindicación 3, en el que el mutante de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutante de ldc de K. oxytoca) se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: ⁶(ldc-co1 de K. oxytoca C1193G), y SEQ ID NO: 10 (es decir, Idc-co1 de K. oxytoca C1521G).

⁶. Polinucleótido de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, que comprende además

(a) una o más secuencias de nucleótidos de ADN de sitios de unión al ribosoma (RBS) seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14 (es decir, ADN-1 de RBS), SEQ ID NO: 15 (es decir, ADN-2 de RBS), SEQ ID NO: 16 (es decir, ADN-3 de RBS), SEQ ID NO: 17 (es decir, ADN-4 de RBS), SEQ ID NO: 18 (es decir, ADN-5 de RBS) y SEQ ID NO: 19 (es decir, ADN^{- 6}de RBS), y/o

(b) una o más secuencias de nucleótidos promotoras seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20 (es decir, secuencia promotora de Plac), SEQ ID NO: 21 (es decir, secuencia promotora de Pbad) y SEQ ID NO: 22 (es decir, secuencia promotora de Ptac).

7. Polinucleótido de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 2 a ⁶, en el que los codones de secuencia de polinucleótidos se han optimizado para la expresión de polipéptidos óptima en una célula de E. coli.

8. Vector de plásmido de expresión que comprende:

un polinucleótido de ADN que comprende una o más secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa seleccionadas del grupo que consiste en mutantes de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutantes de ldc de K. oxytoca) y fragmentos de las mismas, en el que las secuencias de nucleótidos de lisina descarboxilasa tienen al menos un 95 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, y en el que el polinucleótido codifica uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en mutantes de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutantes de Ldc de K. oxytoca); y

un plásmido de cadena principal capaz de replicación autónoma en una célula huésped,

en el que el vector de plásmido de expresión se usa para la producción de un producto derivado de lisina,

en el que el mutante de SEQ ID NO: 2 (es decir, mutante de Ldc de K. oxytoca) se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7 (es decir, Ldc de K. oxytoca T398S) y SEQ ID No : 11 (es decir, Ldc de K. oxytoca F507L).

9. Vector de plásmido de expresión según la reivindicación 8, en el que el mutante de SEQ ID NO: 1 (es decir, mutante de Idc de K. oxytoca) comprende la secuencia de nucleótidos de lisina descarboxilasa de SEQ ID NO: 3 (es decir, ldc-co1 de K. oxytoca) o un fragmento de la misma,

en el que la secuencia de nucleótidos de lisina descarboxilasa de SEQ ID NO: 3 comprende una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una mutación en la posición de nucleótido 1193 con respecto a Z²y una mutación en la posición de nucleótido 1521 con respecto a Z⁴; en el que Z²y Z⁴se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T), con la condición de que Z²no sea una C y Z⁴no sea una C o T.

10. Vector de plásmido de expresión según la reivindicación 8, en el que el mutante de SEQ ID NO:1 (es decir, mutante de Idc de K. oxytoca) se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 6 (es decir, ldc-co1 de K. oxytoca C1193G) y Se Q ID No : 10 (es decir, Idc-co1 de K. oxytoca C1521G).

11. Vector de plásmido de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la célula huésped es una célula de E. coli.

12. Vector de plásmido de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que los codones de la secuencia de polinucleótidos de ADN se han optimizado para la expresión de polipéptidos óptima en la célula de E. coli, en el que opcionalmente el plásmido de cadena principal es un vector de plásmido de expresión de E. coli, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en pUC18, pUC19, pBR322, pACYC, pET, pSC101, y cualquier plásmido derivado de los mismos.

13. Vector de plásmido de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que el polinucleótido de ADN comprende además

(a) una o más secuencias de nucleótidos de ADN de RBS seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14 (es decir, ADN-1 de RBS), SEQ ID NO: 15 (es decir, ADN-2 de RBS), SEQ ID NO: 16 (es decir, ADN-3 de RBS), SEQ ID NO: 17 (es decir, ADN-4 de RBS), SEQ ID NO: 18 (es decir, ADN-5 de RBS) y SEQ ID NO: 19 (es decir, ADN-6 de RBS), y/o

(b) una o más secuencias de nucleótidos promotoras seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20 (es decir, secuencia promotora de Plac), SEQ ID NO: 21 (es decir, secuencia promotora de Pbad) y SEQ ID NO: 22 (es decir, secuencia promotora de Ptac).

14. Transformante que comprende uno o más vectores de plásmido de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 en una célula huésped.

15. Célula huésped mutante que comprende el polinucleótido de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 integrado en un cromosoma de la célula huésped, en el que preferiblemente la célula huésped es una célula de E. coli.

16. Método para producir uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa que comprende:

obtener la célula huésped mutante según la reivindicación 15 y/o el transformante según la reivindicación 14; cultivar la célula huésped mutante y/o el transformante en condiciones eficaces para la expresión de uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa; y

recoger el uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa.

17. Método para producir cadaverina (1,5-pentanodiamina) que comprende:

(a) cultivar la célula huésped mutante según la reivindicación 15 y/o el transformante según la reivindicación 14;

(b) producir cadaverina usando el cultivo obtenido de la etapa (a) para descarboxilar lisina; y

(c) extraer y purificar cadaverina usando el cultivo obtenido de la etapa (b).

18. Método para producir cadaverina (1,5-pentanodiamina) que comprende:

(a) obtener uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa según la reivindicación 1; y

(b) producir cadaverina usando el uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa obtenidos en la etapa (a) para descarboxilar lisina, en el que opcionalmente el uno o más polipéptidos de lisina descarboxilasa están inmovilizados sobre una superficie,

en el que opcionalmente el método comprende además:

(c) extraer y purificar la cadaverina producida en la etapa (b).