WO2018160103A1 - Способ получения l-аспарагиновой кислоты - Google Patents

Способ получения l-аспарагиновой кислоты Download PDF

Info

Publication number
WO2018160103A1
WO2018160103A1 PCT/RU2018/050006 RU2018050006W WO2018160103A1 WO 2018160103 A1 WO2018160103 A1 WO 2018160103A1 RU 2018050006 W RU2018050006 W RU 2018050006W WO 2018160103 A1 WO2018160103 A1 WO 2018160103A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
coli
strain
cells
biocatalyst
aspartase
Prior art date
Application number
PCT/RU2018/050006
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Максим Константинович СИНОЛИЦКИЙ
Стэлла Владимировна СИНОЛИЦКАЯ
Сергей Петрович ВОРОНИН
Владимир Георгиевич ДЕБАБОВ
Андрей Дмитриевич НОВИКОВ
Александр Степанович ЯНЕНКО
Original Assignee
Акционерное Общество "Биоамид"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Акционерное Общество "Биоамид" filed Critical Акционерное Общество "Биоамид"
Priority to EP18761555.4A priority Critical patent/EP3591034A4/en
Publication of WO2018160103A1 publication Critical patent/WO2018160103A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/08—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C12N11/089—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier the carrier being a synthetic polymer obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds
    • C12N11/091—Phenol resins; Amino resins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/20—Aspartic acid; Asparagine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y403/00—Carbon-nitrogen lyases (4.3)
    • C12Y403/01—Ammonia-lyases (4.3.1)
    • C12Y403/01001—Aspartate ammonia-lyase (4.3.1.1), i.e. aspartase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli

Definitions

  • the invention relates to biotechnology and relates to a method for producing L-aspartic acid, which finds application in the pharmaceutical, food, microbiological industry and in feed production.
  • Natural (wild), mutant and recombinant strains of aspartase producers belonging to different genera are used, for example, the genus Escherichia (SU65961 1).
  • the main disadvantage of this method is the low activity of aspartase.
  • the main disadvantages of this method is the high level of side activity of fumarate hydratase and the low activity of aspartase.
  • a recombinant strain was obtained by the genus Serratia (EP01 11293).
  • the main disadvantages of this method are the lack of a breeding factor during the cultivation of the strain and the rapid loss of the plasmid.
  • the genera of Pseudomonas, Bacillus, Brevibacterium and others (EP0752476), the main disadvantages of the method are the complexity, multi-stage and low target activity.
  • a known method of producing aspartic acid described in patent US4692409. It describes a recombinant strain of Escherichia coli TA-5004, with high aspartase activity and a biocatalyst based on the biomass of cells of this strain included in the polysaccharide gel, kappa-carrageenan.
  • the main disadvantages of this method are the lack of a breeding factor during the cultivation of the strain, the rapid loss of the plasmid, and the diffusion restriction of the carrageenan gel matrix with an increase in the specific aspartase activity of cells, it is not possible to significantly increase the specific activity of the biocatalyst.
  • a known method of producing aspartic acid which uses a biocatalyst based on cells with aspartase activity, immobilized on vermiculite particles using crosslinking agents, including glutaraldehyde in the presence of polyethyleneimine (US4504582).
  • the disadvantage of this method is the low efficiency of the resulting biocatalyst.
  • a biocatalyst based on cells of a recombinant strain of Escherichia coli was used.
  • the strain contains the plasmid pUC19 with the aspartase gene insert under the lactose promoter.
  • the method involves passing a solution of ammonium fumarate through a column filled with biocatalyst particles, followed by the isolation of L-aspartic acid from the reaction solution.
  • a biocatalyst is obtained by immobilizing bacterial cells on an ion exchange resin using polymers that alter the solubility depending on the pH of the medium.
  • the disadvantage of this method is the high cost of the components of the environment, in particular the need for the addition of an expensive inducer of the lactose operon, isopropyl-1-thio ⁇ -0-galactoside (IPTG), which induces the expression of aspartase.
  • IPTG isopropyl-1-thio ⁇ -0-galactoside
  • This compound is widely used to induce expression of recombinant genes in expression vectors constructed based on the lac operon promoter.
  • the need to add this expensive substance reduces the economic efficiency of the process of culturing E. coli cells, obtaining a biocatalyst and, as a result, the entire process for producing L-aspartic acid.
  • the disadvantage of this method is the inaccessibility of polymers and the use of sophisticated equipment for immobilization.
  • the objective of the present invention is to increase the efficiency of the process for producing L-aspartic acid by reducing the complexity and cost of the process associated with the use of a more effective biocatalyst.
  • the problem is solved by obtaining a recombinant strain deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms under the number E. coli VKPM B-1 1745;
  • the problem is solved by developing a method for producing L-aspartic acid using free or immobilized cells of E. coli strain as a biocatalyst;
  • the problem is solved by developing a method for immobilizing cells of E. coli strain in a polyethyleneimine matrix covalently linked with glutaraldehyde.
  • the problem is solved by developing a method for immobilizing cells of a strain of E. coli characterized in that the weight ratio of polyethyleneimine and glutaraldehyde is from 1: 1 to 3: 1.
  • the problem is solved by developing a method for immobilizing cells of a strain of E. coli characterized in that the weight ratio of the components of polyethyleneimine and glutaraldehyde to the biomass of E. coli is from 0.25: 1 to 3: 1.
  • E. coli including E. coli strain VKPM B-1 1745, with high aspartase activity;
  • IPTG expensive inducer
  • Amp is the ampicillin resistance gene
  • rep pMB1
  • f1 IG
  • IG DNA fragment of prophage f1
  • Asp is the L-aspartate ammonium lyase gene
  • prom is the promoter region of LacUV5.
  • the present invention is aimed at improving the efficiency of the process of obtaining L-aspartic acid by reducing the complexity and cost of the process associated with the use of a more efficient biocatalyst based on a new recombinant strain of E.coH immobilized with polyethyleneimine crosslinked with glutaraldehyde.
  • the claimed method is to provide high aspartase activity of a biocatalyst based on cells of a new recombinant E.coH strain without using an expensive IPTG inducer in the process of cultivation and obtaining a highly effective biocatalyst based on cells of a E.coH strain.
  • the proposed method for the production of L-aspartic acid by biotransformation of ammonium fumarate into ammonium asparaginate using a biocatalyst based on E. coli microbial cells, followed by isolation of the target product involves the use of a highly active biocatalyst based on a new recombinant E.coHN strain grown on a nutrient environment without the addition of an IPTG inductor.
  • the strain can be used both in free form and immobilized using techniques known in the art, for example, in polyacrylamide gel, carrageenan and others by methods, in particular, the strain can be immobilized into a polyethyleneimine matrix covalently crosslinked by glutaraldehyde.
  • Polyethyleneimine and glutaraldehyde are accessible and well-studied compounds widely used for immobilizing enzymes (see, e.g., R. Bahulekar et.al., Polyethyleneimine in immobilization of biocatalysts // Enzyme and Microb. Technol., 1991. - V.13 (1 1) - P.858-868 .; US4504582).
  • Schiff bases formed during the joint crosslinking of the amino groups of bacterial cells and polyethyleneimine are considered not very strong compounds.
  • this type of compound is quite stable.
  • the formed polymer matrix has sufficiently wide pores so as not to exert significant diffusion restrictions when the particle size is from 0.5 to 1.0 mm.
  • the method is as follows.
  • a recombinant strain is being constructed.
  • a recombinant strain is understood to mean a line of microorganisms of Escherichia coli derivatives VKPM B-1 1745 preserving major mutations and genetic engineering modifications providing high production of the aspartase enzyme.
  • the recombinant E. coli strain VKPM B-1 1745 is constructed by transforming the E. coli strain VKPM B-7188 with plasmid pAsp 1 16-5.
  • the choice of a strain of E. coli VKPM B-7188 as a recipient when designing the inventive strain is due to the fact that, despite the low level of aspartase production, it meets most of the requirements for recipients for expression, i.e. genetically labeled, it allows to obtain high efficiency during transformation and does not produce toxic metabolites.
  • the strain Escherichia coli VKPM B-7188 is obtained from the wild strain by treatment with a mutagen (nitrosoguanidine), followed by selection of mutants on the glucose analog alpha-methyl-O-glucopyranoside (RU2174558).
  • Plasmid pAsp 1 16-5 is obtained on the basis of the pUC19 vector and contains the L-aspartate-ammonium lyase gene from E. coli B-7188 under the lacUV5 lactose promoter and the penicillin antibiotic resistance gene.
  • the plasmid scheme is shown in FIG. 1, where: Amp is the ampicillin resistance gene, rep (pMB1) is replicon, f1 (IG) is the DNA fragment of prophage f1, Asp is the gene of ammonium lyase L-aspartate, prom is the promoter region of LacUV5.
  • Strain E. coli VKPM B-1 1745 is characterized by all the features common to E. coli, including, inter alia, cultural and morphological characters.
  • the culture is represented by gram-negative, optionally anaerobic rod-shaped cells, with slightly rounded ends, measuring 0.4-0.8 x 1-3 microns. Cells are good grow on simple rich nutrient media. The colonies on meat-peptone agar (MPA) and Luria-Bertani (LB) medium are whitish shiny, 2-3 mm in size, the edges are even, do not form spores.
  • MPA meat-peptone agar
  • LB Luria-Bertani
  • the obtained strain of E. coli 7188 (pAsp1 16-5) was deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms and has a registration number VKPM B-1 1745.
  • This strain when grown on a fermentation medium in a fermenter, is capable of producing at least 40,000 L-aspartate-ammonium lyase. u / ml
  • the specific aspartase activity of the cells was determined as follows. To 4.5 ml of a 1, 5 M solution of ammonium fumarate, 0.5 ml of a suspension of previously activated microbial cells with an optical density of 5 units was added. and the mixture was incubated with stirring for one hour at 30 ° C. The amount of aspartic acid formed was determined by high performance liquid chromatography (HPLC). The unit of activity is the formation of one micromole of aspartic acid in one hour. The optical density of the cell suspension was determined at a wavelength of 540 nm and an optical path of 5 mm.
  • the preparation of immobilized cells was carried out by mixing the cell suspension with a solution of polyethyleneimine homopolymer (Polymin-P, BASF), after which a solution of glutaraldehyde was added, mixed and left to complete the crosslinking processes.
  • the amount of polyethyleneimine homopolymer solution was chosen so that the final concentration of polyethyleneimine was from 10 to 50% per 100% substance.
  • the amount of glutaraldehyde solution was chosen in such a way so that the final concentration of glutaraldehyde is from 5 to 30% per 100% substance.
  • the amount of biomass of E. coli cells was selected so that the final concentration of cell biomass was 25 to 65% based on dry weight.
  • the ratio of polyethyleneimine and glutaraldehyde is from 1: 1 to 3: 1. And the weight ratio of the components of polyethyleneimine and glutaraldehyde to E. coli biomass is from 0.25: 1 to 3: 1. Where is polyethyleneimine and glutaraldehyde per 100% substance, and biomass per dry weight.
  • the method of immobilization provides immobilized cells with specific aspartase activity from 90,000 to 210,000 units / h per gram of wet biocatalyst.
  • This biocatalyst placed in a flow reactor provides biotransformation of a solution of ammonium fumarate at a concentration of 200 g / l (according to fumaric acid) at 25 ° C at a rate of 3 to 5 volumes / hour of the biocatalyst located in the reactor with an efficiency of 99%.
  • the preparation and cultivation of the strain Escherichia coli VKPM B-11745, the preparation of immobilized cells of the E. coli strain VKPM B-1 1745, the biotransformation of ammonium fumarate and the production of L-aspartic acid using the immobilized cells of the E. coli VKPM B-11745 strain are confirmed by the following specific examples execution.
  • Example 1 Obtaining plasmids pAsp 116-5.
  • the AspA gene sequence from Escherichia coli was used, which is the L-aspartate-ammonium lyase gene without a regulatory promoter region.
  • the aspA sequence was obtained by PCR using genomic DNA isolated from E. coli strain VKPM B-7188 as a template.
  • Genomic DNA was isolated using a Genomic DNA Isolation Kit according to the manufacturer's recommendations (Genomic DNA Purification Kit, # K0512, Thermo Fisher Scientific Biosciences Inc.).
  • PCR product was obtained using the following pair of primers: ttt gta taa gaa aat gag agg g (SEQ ID NO: 1) and aaa gga tec tgt acg att act gtt cgc ttt cat cag tat age (SEQ ID NO: 2)
  • DNA fragments were obtained using Pfu polymerase.
  • the amplified DNA fragment after electrophoresis on a 1% agarose gel was purified by extraction using a gel DNA isolation kit according to the manufacturer's recommendations (GeneJET Gel Extraction Kit, # K0691, Thermo Fisher Scientific Biosciences Inc.).
  • 0.5 ⁇ g purified DNA fragment was ligated with 0.2 ⁇ g pUC19 plasmid DNA digested with Smal restriction enzyme. Ligation was performed using reagents Thermo Fisher Scientific Biosciences Inc. according to manufacturer's recommendations. The resulting plasmid was transformed into E. coli XL1-Blue by electroporation according to the procedure described in the source (Sambrook et al., Molecular Cloning, second edition Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y., 1989). Clones containing the desired DNA insert were selected on plates with agarized LB medium with ampicillin and a standard test for the absence of ⁇ -galactosidase activity, as described in the above source.
  • Plasmid DNA isolated from the selected clones was checked by PCR for insert using the above primers. Clones with confirmed insertion were checked for aspartase activity. In clones with confirmed aspartase activity, the nucleotide sequence of the gene was checked by sequencing.
  • Example 2 Obtaining a strain of E. coli VKPM B-11745.
  • the Escherichia coli strain VKPM B-7188 for transformation was used to prepare an electrocompetent culture as described in the source (Sambrook et al., Molecular Cloning, second edition Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y., 1989).
  • plasmid DNA pAsp 1 16-5 was used, obtained as described in Example 1.
  • transformants The selection of transformants was performed on agar medium LB with ampicillin. Selected transformants were checked for aspartase activity. The phenotype of the transformants was maintained by sieving on the same medium. Ten clones showing the highest aspartase activity were tested for the presence of L-aspartate-ammonium lyase activity in an acetate fermentation medium, as described below in Example 3.
  • the selected clone with the highest aspartase activity which is a transformant of E. coli VKPM B-7188 (pAsp 1 16-5) and, when cultured in vitro, allows the production of L-aspartate-ammonium lyase activity of at least 10,000 units / ml, was designated below as E. coli VKPM B-1 1745.
  • Example 3 Cultivation of E. coli strain VKPM B-11745 in flasks.
  • the strain was pre-grown at 37 ° C. overnight on LB agar medium with 100 mg / L ampicillin.
  • Fresh culture was seeded from the plates with a bacteriological loop into tubes with 10 ml of LB medium with ampicillin and cultured on a thermostatic shaker at 37 ° C, 300 rpm, for at least 15 hours.
  • the resulting seed was subcultured in test tubes with 10 ml of LB liquid medium with ampicillin, diluting 100 times (100 ⁇ l of culture per 10 ml of medium). Cultivated on a thermostatic shaker at 37 ° C, 300 rpm, for at least 2 hours to an OD of 600 ⁇ 0.6 - 0.8.
  • the resulting seed was seeded into flasks with 100 ml of liquid fermentation medium of the following composition (g / l):
  • Example 4 The cultivation of E. coli strain VKPM B-11745 in a laboratory fermenter.
  • the strain was pre-grown at 37 ° C. overnight on LB agar medium with 100 mg / L ampicillin.
  • Fresh culture was seeded from the plates with a bacteriological loop into two flasks with 50 ml of LB liquid medium with ampicillin and cultivated on a thermostatic shaker at 37 ° C, 300 rpm for at least 15 hours.
  • the resulting seed was transferred to a 3-liter fermenter containing 2 l of nutrient fermentation medium of the following composition (g / l): KH 2 P0 4 - 2.0; CH 3 COONa - 13.8; Yeast extract - 50; MgSCy7H 2 0 - 0.25; pH - 6.8-7.2, ampicillin - 100 mg / l.
  • Cultivation conditions temperature 30 ° C, aeration - 2 l / min, stirring - 600 rpm, pH 7.8.
  • the automatic pH maintenance system doses the solution of acetic acid.
  • the cultivation time is 15-18 hours.
  • the total aspartase activity is 72000 units / ml.
  • Cells were separated by centrifugation and washed with saline.
  • the number of collected wet cells in the form of a paste was 171 g.
  • Example 5 Obtaining immobilized cells.
  • the biomass of cells of strain E. coli B-1 1745 of Example 4 in an amount of 10 g was placed in a glass beaker into which 11 g of a 1% sodium chloride solution were previously added and mixed. Then, while continuing to mix, 5 g of a 20% solution of polyethyleneimine homopolymer (Polymin-P, BASF), preliminarily neutralized with hydrochloric acid to pH 7.5, was added, and further, 3 g of a 25% solution of glutaraldehyde (Rapgeas) was added while continuing stirring. The mixture began to cure quickly. It was left for 30 minutes to complete the ongoing reactions, after which it was crushed and dried to a residual moisture content of 65-75%. The obtained immobilized cells were sieved through a sieve, leaving a 0.5-1.5 mm fraction, which was placed in a 20% solution of ammonium acetate and left for at least 24 hours at a temperature of 5 ° C.
  • Polymin-P polyethyleneimine homopolymer
  • the resulting biocatalyst had a specific activity of 180,900 units / g of wet biocatalyst.
  • Example 6 Continuous biotransformation of ammonium fumarate by immobilized cells.
  • the biocatalyst obtained in Example 5 in an amount of 5 g (wet weight) filled a glass column with a jacket (1X12.7 cm, 10 ml). A coolant with a temperature of 25 ° C was fed into the shirt. Ammonium fumarate solution was pumped through a biocatalyst layer through a peristaltic pump, with a concentration of 200 g / l (for fumaric acid), pH 8.5 and with the addition of 1 mM MgS0 4 . The flow rate of the solution is 50 ml / hour. The solution exiting the column contained less than 1.5 g / l ammonium fumarate (calculated as fumaric acid), which corresponds to a conversion of more than 99%. The degree of conversion remained more than 99% during the continuous process of biotransformation of ammonium fumarate for three months or more.
  • Example 7 Obtaining L-aspartic acid from reaction solutions after biotransformation.
  • the proposed method provides a more efficient production of L-aspartic acid due to the cost reduction and simplification of the process. This eliminates the need to use expensive nutrient media, large volumes of cultivation and inaccessible components for immobilization of cells.
  • the proposed method for producing L-aspartic acid allows to provide high aspartase activity of the biocatalyst, significantly reduce the complexity and cost of the process.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии и касается способа получения L- аспарагиновой кислоты. Для этого сконструирован рекомбинантный штамм Escherichia coli, продуцент аспартазы, путем введения в штамм Е. coli ВКПМ 7188 рекомбинантной плазмиды, содержащей ген aspA под контролем лактозного промотора lacUV5. Получение L-аспарагиновой кислоты заключается в биотрансформации фумарата аммония с помощью биокатализатора, полученного на основе клеток рекомбинантного штамма Е. coli, и выделении целевого продукта известными способами. В качестве биокатализатора используют свободные или иммобилизованные клетки штамма Е. coli. Рекомбинантный штамм Е. coli позволяет получать высокий уровень аспартазной активности без использования изопропилтиогалактозида в качестве индуктора в составе питательной среды.

Description

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ
Область техники
Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения L- аспарагиновой кислоты, которая находит применение в фармацевтической, пищевой, микробиологической промышленности и в кормопроизводстве.
Уровень техники
Известны способы получения L-аспарагиновой кислоты биокаталитической трансформацией фумарата аммония в L-аспарагинат аммония с использованием микроорганизмов, синтезирующих фермент аспартат-аммоний лиазу (аспартазу). Наиболее перспективным и технически легко осуществимым в процессе биотрансформации фумарата аммония в L-аспарагинат является использование иммобилизованных бактериальных клеток. Иммобилизованными клетками заполняется проточный реактор, и раствор фумарата аммония насосом прокачивают через слой биокатализатора, на выходе из реактора образуется раствор моноаммонийной соли аспарагиновой кислоты.
Используются природные (дикие), мутантные и рекомбинантные штаммы продуценты аспартазы, относящиеся к различным родам, например, роду Escherichia (SU65961 1). В указанном изобретении использован природный штамм. Основной недостаток данного способа - низкая активность аспартазы. В изобретении по патенту ЕР0110422 использованы мутантные штаммы. Основные недостатки данного способа - это высокий уровень побочной активности фумаратгидратазы и невысокая активность аспартазы. По роду Serratia (ЕР01 11293) был получен рекомбинантный штамм. Основные недостатки данного способа - отсутствие селектирующего фактора при культивировании штамма и быстрая утеря плазмиды. Родов Pseudomonas, Bacillus, Brevibacterium и др. (ЕР0752476), основные недостатки способа - трудоемкость, многостадийность и невысокая целевая активность.
Известен способ получения L-аспарагиновой кислоты с использованием природного штамма Escherichia coli (ВКПМ В-7188) (RU2174558). Однако данный способ является недостаточно эффективным из-за низкой аспартазной активности штамма.
Известен способ получения аспарагиновой кислоты, описанный в патенте US4692409. В нем описан рекомбинантный штамм Escherichia coli ТА-5004, с высокой аспартазной активностью и биокатализатор на основе биомассы клеток этого штамма включенных в гель полисахарида, каппа-каррагинана. Основные недостатки указанного способа - это отсутствие селектирующего фактора при культивировании штамма, быстрая утеря плазмиды, а также диффузионные ограничение матрицы геля каррагинана, которые при увеличении удельной аспартазной активности клеток не позволяют существенно увеличить удельную активность биокатализатора.
Также известен способ получения аспарагиновой кислоты с использованием иммобилизованных клеток, обладающих аспартазной активностью на поверхности частиц ионообменных смол или неорганических материалов с помощью полиазетидина (US4436813). Известен способ получения аспарагиновой кислоты, в котором используют биокатализатор на основе клеток, обладающих аспартазной активностью, иммобилизованных на частицах вермикулита с помощью сшивающих агентов, в том числе глутарового альдегида в присутствии полиэтиленимина (US4504582). Недостатком данного способа является низкая эффективность получаемого биокатализатора.
Наиболее близким к заявленному способу является способ получения L- аспарагиновой кислоты, описанный в патенте US6214589. В данном способе использовали биокатализатор на основе клеток рекомбинантного штамма Escherichia coli. Штамм содержит плазмиду pUC19 с вставкой гена аспартазы под лактозным промотором. Способ предусматривает пропускание раствора фумарата аммония через колонку, заполненную частицами биокатализатора, с последующим выделением L-аспарагиновой кислоты из реакционного раствора. Биокатализатор получают иммобилизацией бактериальных клеток на ионообменной смоле с использованием полимеров, изменяющих растворимость в зависимости от величины рН среды.
Недостатком способа является высокая стоимость компонентов среды, в частности необходимость добавки дорогостоящего индуктора лактозного оперона, изопропил-1 -тио^-0-галактозида (ИПТГ), который индуцирует экспрессию аспартазы. Это соединение широко используется для индукции экспрессии рекомбинантных генов в экспрессионных векторах, сконструированных на основе промотора lac-оперона. Необходимость добавки этого дорогостоящего вещества снижает экономическую эффективность процесса культивирования клеток Е. coli, получения биокатализатора и, как следствие, всего процесса получения L-аспарагиновой кислоты. Кроме того, недостатком данного способа является труднодоступность полимеров и использование сложного оборудования для иммобилизации.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности процесса получения L-аспарагиновой кислоты за счет снижения трудоёмкости и удешевления процесса, связанного с применением более эффективного биокатализатора. Задача решается путем:
- конструирования рекомбинантного штамма Escherichia coli, продуцента аспартазы, путем введения в штамм Е. coli ВКПМ 7188 рекомбинантной плазмиды, содержащей ген aspA под контролем лактозного промотора lacUV5;
- в некоторых вариантах изобретения задача решается путем получения рекомбинантного штамма, депонированного во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером Е. coli ВКПМ В-1 1745;
разработки способа получения L-аспарагиновой кислоты путем биотрансформации фумарата аммония с помощью биокатализатора на основе клеток рекомбинантного штамма Е. coli;
- в некоторых вариантах изобретения задача решается путем разработки способа получения L-аспарагиновой кислоты с использованием в качестве биокатализатора свободных или иммобилизованных клеток штамма Е. coli;
- в некоторых частных вариантах изобретения задача решается путем разработки способа иммобилизации клеток штамма Е. coli в матрице полиэтиленимина, ковалентно сшитой глутаровым альдегидом.
- в некоторых частных вариантах изобретения задача решается путем разработки способа иммобилизации клеток штамма Е. coli отличающегося тем, что весовое соотношение полиэтиленимина и глутарового альдегида составляет от 1 : 1 до 3: 1.
- в некоторых частных вариантах изобретения задача решается путем разработки способа иммобилизации клеток штамма Е. coli отличающегося тем, что, весовое соотношение компонентов полиэтиленимина и глутарового альдегида к биомассе Е. coli составляет от 0,25: 1 до 3: 1.
В результате осуществления изобретения достигаются следующие технические результаты:
получена рекомбинантная плазмида pAsp 1 16-5 для создания высокопродуктивных штаммов Е.соЧ;
- получены рекомбинантные штаммы Е. coli, в том числе штамм Е. coli ВКПМ В- 1 1745, обладающие высокой аспартазной активностью;
- снижение трудоемкости, упрощение и удешевление процесса получения L- аспарагиновой кислоты;
- увеличение аспартазной активности биокатализатора на основе рекомбинантного штамма Е.соЧ;
- повышение ферментативной активности биокатализатора без внесения в среду дорогостоящего индуктора (ИПТГ); - исключение необходимости использования дорогостоящих питательных сред, больших объемов культивирования и малодоступных компонентов для иммобилизации клеток;
- разработан способ иммобилизации клеток рекомбинантного штамма Е. coli;
разработан способ получения L-аспарагиновой кислоты с помощью биокатализатора на основе свободных и иммобилизованных клеток Е. coli;
- разработан способ иммобилизации Е.соН в матрице полиэтиленимина, ковалентно сшитой глутаровым альдегидом;
- разработан способ непрерывной биотрансформации фумарата аммония иммобилизованными клетками.
Описание рисунков
Фиг 1. Схема плазмиды pAsp 1 16-5.
На рисунке: Amp - ген устойчивости к ампициллину, rep (рМВ1 ) - репликон, f1 (IG) - фрагмент ДНК профага f1 , Asp - ген L-аспартат аммоний лиазы, prom - промоторная область LacUV5.
Подробное описание изобретения
Предлагаемое изобретение направлено на повышение эффективности процесса получения L-аспарагиновой кислоты за счет снижения трудоемкости и удешевления процесса, связанного с применением более эффективного биокатализатора на основе нового рекомбинантного штамма Е.соН, иммобилизованного с помощью полиэтиленимина сшитого глутаровым диальдегидом.
Заявленный способ заключается в обеспечении высокой аспартазной активности биокатализатора на основе клеток нового рекомбинантного штамма Е.соН без использования дорогостоящего индуктора ИПТГ в процессе его культивирования и получении высокоэффективного биокатализатора на основе клеток штамма Е.соН.
Предлагаемый способ получения L-аспарагиновой кислоты путем биотрансформации фумарата аммония в аспарагинат аммония с помощью биокатализатора на основе микробных клеток Е. coli, с последующим выделением целевого продукта, предусматривает использование в процессе биотрансформации высокоактивного биокатализатора на основе нового рекомбинантного штамма Е.соН, выращенного на питательной среде без добавления индуктора ИПТГ.
При осуществлении изобретения штамм может быть в использован как в свободном виде, так и иммобилизованном с использованием приемов, известных в данной области, например, в полиакриламидном геле, в каррагинане и другими способами, в частности штамм может быть иммобилизован в ковалентно сшитую глутаровым альдегидом матрицу полиэтиленимина.
Полиэтиленимин и глутаровый альдегид являются доступными и хорошо изученными соединениями, широко применяемыми для иммобилизации ферментов (см., например, R. Bahulekar et.al., Polyethyleneimine in immobilization of biocatalysts // Enzyme and Microb. Technol., 1991 . - V.13(1 1 ) - P.858-868.; US4504582). Шиффовы основания, образуемые в процессе совместной сшивки аминогрупп бактериальных клеток и полиэтиленимина считаются не очень прочными соединениями. Однако в щелочных условиях функционирования аспартазы, а также в водных растворах с концентрацией солей выше 20%, данный тип соединений достаточно устойчив. Кроме того, образуемая полимерная матрица имеет достаточно широкие поры, чтобы не оказывать существенных диффузионных ограничений при размере частиц от 0,5 до 1 ,0 мм.
Способ осуществляют следующим образом.
Производится конструирование рекомбинантного штамма.
В одном из вариантов осуществления изобретения под рекомбинантным штаммом понимается линия микроорганизмов производных Escherichia coli ВКПМ В-1 1745, сохраняющих основные мутации и генно-инженерные модификации, обеспечивающие высокую продукцию фермента аспартазы. Рекомбинантный штамм E.coli ВКПМ В-1 1745 конструируется путем трансформации штамма E.coli ВКПМ В-7188 плазмидой pAsp 1 16-5. Выбор в качестве реципиента при конструировании заявляемого штамма именно штамма E.coli ВКПМ В-7188 связан с тем, что, несмотря на низкий уровень продукции аспартазы, он соответствует большинству требований, предъявляемых реципиентам для экспрессии, т.е. генетически маркирован, позволяет получить высокую эффективность при трансформации и не продуцирует токсичных метаболитов.
Штамм Escherichia coli ВКПМ В-7188 получается из дикого штамма посредством обработки мутагеном (нитрозогуанидином), с последующим отбором мутантов на аналоге глюкозы альфа-метил-О-глюкопиранозид (RU2174558).
Плазмида pAsp 1 16-5 получается на основе вектора pUC19 и содержит ген L- аспартат-аммоний лиазы из Е. coli В-7188 под лактозным промотором lacUV5 и ген устойчивости к антибиотикам пенициллинового ряда. Схема плазмиды представлена на Фиг. 1 , где: Amp - ген устойчивости к ампициллину, rep (рМВ1 ) - репликон, f1 (IG) - фрагмент ДНК профага f1 , Asp - ген L-аспартат аммоний лиазы, prom - промоторная область LacUV5.
Штамм E.coli ВКПМ В-1 1745 характеризуется всеми признаками, обычными для E.coli, включая, в том числе, культурально-морфологические признаки. Культура представлена грамотрицательными, факультативно анаэробными палочковидными клетками, со слегка закруглёнными концами, размером 0,4-0,8 х 1-3 мкм. Клетки хорошо растут на простых богатых питательных средах. Колонии на мясо-пептонном агаре (МПА) и среде Лурия-Бертани (LB) - беловатые блестящие, размером 2-3 мм, края ровные, спор не образуют.
После трансформации клеток штамма Е. coli ВКПМ В-7188 - ДНК pAsp 1 16-5, в процессе выделения штаммов-трансформантов был получен спонтанный мутант, поддерживающий высокий уровень синтеза аспартазы в отсутствие индуктора ИПТГ. В таблице 1 представлено влияние добавления индуктора ИПТГ в количестве 1 мМ в ферментационную среду.
Таблица 1. Влияние индуктора ИПТГ на аспартазную активность.
Figure imgf000007_0001
Полученный штамм Е. coli 7188 (pAsp1 16-5) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В- 1 1745. Данный штамм при выращивании на ферментационной среде в ферментере способен продуцировать L-аспартат-аммоний лиазу в количестве не менее 40000 ед/мл.
Удельную аспартазную активность клеток определяли следующим образом. К 4,5 мл 1 ,5 М раствора фумарата аммония добавляли 0,5 мл суспензии предварительно активированных микробных клеток с оптической плотностью 5 ед. и инкубировали смесь при перемешивании один час при 30°С. Количество образовавшейся аспарагиновой кислоты определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). За единицу активности принято образование одного микромоля аспарагиновой кислоты за один час. Оптическую плотность клеточной суспензии определяли при длине волны 540 нм и оптическом пути 5 мм.
Получение иммобилизованных клеток осуществляли, смешивая суспензию клеток с раствором гомополимера полиэтиленимина (Polymin-P, BASF), после чего добавляли раствор глутарового альдегида, перемешивали и оставляли для завершения процессов сшивки. Количество раствора гомополимера полиэтиленимина выбирали таким образом, чтобы конечная концентрация полиэтиленимина составляла от 10 до 50% в расчете на 100% вещество. Количество раствора глутарового альдегида выбирали таким образом, чтобы конечная концентрация глутарового альдегида составляла от 5 до 30% в расчете на 100% вещество. Количество биомассы клеток E.coli выбирали таким образом, чтобы конечная концентрация биомассы клеток составляла от 25 до 65% в расчете сухой вес. Соотношение полиэтиленимина и глутарового альдегида составляет от 1 : 1 до 3: 1. А весовое соотношение компонентов полиэтиленимина и глутарового альдегида к биомассе Е. coli составляет от 0,25: 1 до 3: 1. Где полиэтиленимин и глутаровый альдегид в расчете на 100% вещество, а биомасса в расчете на сухой вес.
Затем полученную массу измельчали, подсушивали до остаточной влажности от 65 до 75%, отсеивали фракции менее 0,5 мм и более 1 ,5 мм, выдерживали в растворе ацетата аммония с концентрацией от 200 до 250 г/л не менее 24 часов.
Способ иммобилизации обеспечивает получение иммобилизованных клеток с удельной аспартазной активностью от 90000 до 210000 ед./ч на грамм влажного биокатализатора. Данный биокатализатор, помещенный в проточный реактор, обеспечивает при 25 °С биотрансформацию раствора фумарата аммония с концентрацией 200 г/л (по фумаровой кислоте) со скоростью от 3 до 5 объемов/час биокатализатора, находящегося в реакторе с эффективностью 99%.
Получение и культивирование штамма Escherichia coli ВКПМ В-11745, получение иммобилизованных клеток штамма Е. coli ВКПМ В-1 1745, проведение биотрансформации фумарата аммония и получение L-аспарагиновой кислоты с использованием иммобилизованных клеток штамма E.coli ВКПМ В-11745 подтверждены следующими примерами конкретного исполнения.
Следует понимать, что эти и все приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.
Пример 1. Получение плазмиды pAsp 116-5.
Для получения плазмиды pAsp 116-5 использовали последовательность гена AspA из Escherichia coli, представляющую собой ген L-аспартат-аммоний лиазы без регуляторной промоторной области.
Последовательность aspA получали методом ПЦР, используя в качестве матрицы геномную ДНК, выделенную из штамма E.coli ВКПМ В-7188.
Геномную ДНК выделяли с помощью Набора для выделения геномной ДНК согласно рекомендациям изготовителя (Genomic DNA Purification Kit, # К0512, Thermo Fisher Scientific Biosciences Inc.).
ПЦР продукт получали с помощью следующей пары праймеров: ttt gta taa gaa aat gag agg g (SEQ ID NO: 1 ) и aaa gga tec tgt acg att act gtt cgc ttt cat cag tat age (SEQ ID NO: 2)
Фрагменты ДНК получали с использованием Pfu полимеразы.
В работе использовали праймеры-олигонуклеотиды, синтезированные ЦКП ФГУП ТосН И И генетика" и ферменты Thermo Fisher Scientific Biosciences Inc.
Для реакции амплификации использовали приблизительно 100 нмолей каждого праймера. Фрагмент амплифицированной ДНК после электрофореза в 1 % агарозном геле очищали методом экстракции с помощью набора для выделения ДНК из геля согласно рекомендациям изготовителя (GeneJET Gel Extraction Kit, # K0691 , Thermo Fisher Scientific Biosciences Inc.).
Очищенный фрагмент ДНК в количестве 0,5 мкг лигировали с 0,2 мкг ДНК плазмиды pUC19, расщепленной рестриктазой Smal. Лигирование производили с помощью реактивов Thermo Fisher Scientific Biosciences Inc. согласно рекомендациям изготовителя. Полученную плазмиду трансформировали в E.coli XL1 -Blue методом электропорации согласно методике, описанной в источнике (Sambrook et al., Molecular Cloning, second edition Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y. ,1989). Клоны, содержащие искомую вставку ДНК, отбирали на чашках с агаризованной средой LB с ампициллином и стандартному тесту на отсутствие активности β-галактозидазы, как описано в вышеуказанном источнике. Плазмидную ДНК, выделенную из отобранных клонов, проверяли методом ПЦР на наличие вставки, с использованием указанных выше праймеров. Клоны с подтвержденной вставкой проверяли на наличие аспартазной активности. В клонах с подтвержденной аспартазной активностью проверяли нуклеотидную последовательность гена методом секвенирования.
Плазмидную ДНК, выделенную из отобранных клонов, подтвержденного размера, подтвержденной нуклеотидной последовательности, обеспечивающую экспрессию L- аспартат-аммоний лиазы в штамме E.co// XL1 -Blue обозначали далее как pAsp 1 16-5.
Пример 2. Получение штамма E.coli ВКПМ В-11745.
Штамм Escherichia coli ВКПМ В-7188 для трансформации использовали для приготовления электрокомпетентной культуры как описано в источнике (Sambrook et al., Molecular Cloning, second edition Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y.,1989).
В качестве ДНК для трансформации штамма Escherichia coli ВКПМ В-7188 использовали плазмидную ДНК pAsp 1 16-5, полученную в соответствии с описанием в примере 1.
Селекцию трансформантов проводили на агаризованной среде LB с ампициллином. Отобранные трансформанты проверяли на наличие аспартазной активности. Фенотип трансформантов поддерживали рассевом на той же среде. Десять клонов, показавших наибольшую аспартазную активность, проверяли на наличие L-аспартат-аммоний лиазной активности в ацетатной ферментационной среде, как описано далее в примере 3.
По результатам культивирования отбирали наиболее активный клон. Отобранный клон, обладающий наибольшей аспартазной активностью, являющийся трансформантом E.coli ВКПМ В-7188 (pAsp 1 16-5) и при культивировании в пробирках позволяющий получать активность L-аспартат-аммоний лиазы не менее 10000 ед/мл, обозначали далее как E.coli ВКПМ В-1 1745.
Пример 3. Культивирование штамма E.coli ВКПМ В-11745 в колбах.
Штамм предварительно выращивали при 37°С в течение ночи на агаризованной среде LB с 100 мг/л ампициллина.
Свежую культуру пересевали с чашек бактериологической петлей в пробирки с 10мл жидкой среды LB с ампициллином и культивировали на термостатируемом шейкере при 37°С, 300 об/мин, в течение не менее 15 часов.
Полученный посевной материал пересевали в пробирки с 10 мл жидкой среды LB с ампициллином, разбавляя в 100 раз (100 мкл культуры на 10 мл среды). Культивировали на термостатируемом шейкере при 37°С, 300 об/мин, в течение не менее 2 часов до ОП600 ~ 0,6 - 0,8. Полученный посевной материал пересевали в колбы со 100 мл жидкой ферментационной среды следующего состава (г/л):
Na2HPCy 12H20 - 15,0; КН2Р04 - 2,0; CH3COONa - 7; Дрожжевой экстракт - 20; MgSCy7H20 - 0,25; рН - 6,5-7,0 с ампициллином - 100 мг/л и культивировали на термостатируемом шейкере при 37°С, 300 об/мин, в течение не менее 2 часов до ОП600 ~ 0,6 - 0,8. После этого снижали температуру культивирования до 30 °С и культивировали еще не менее 7 часов до достижения максимальной активности культуры. При культивировании штамма E.coli ВКПМ В-1 1745 продукция аспартазы составляла не менее 10000 ед/мл.
Пример 4. Культивирование штамма E.coli ВКПМ В-11745 в лабораторном ферментере.
Штамм предварительно выращивали при 37°С в течение ночи на агаризованной среде LB с 100 мг/л ампициллина.
Свежую культуру пересевали с чашек бактериологической петлей в две колбы с 50 мл жидкой среды LB с ампициллином и культивировали на термостатируемом шейкере при 37°С, 300 об/мин в течение не менее 15 часов.
Полученный посевной материал переносили в 3-х литровый ферментер, содержащий 2 л питательной ферментационной среды следующего состава (г/л): KH2P04 - 2,0; CH3COONa - 13,8; Дрожжевой экстракт - 50; MgSCy7H20 - 0,25; рН - 6,8-7,2, ампициллин - 100 мг/л. Условия культивирования: температура 30°С, аэрация - 2л/мин, перемешивание - 600 об/мин, рН 7.8. Система автоматического поддержания рН осуществляет дозировку раствора уксусной кислоты. Время культивирования 15-18 часов. Оптическая плотность культуральной жидкости на сливе 30,0 ед. ОП. Удельная аспартазная активность 2400 Ед.акт./ед. ОП. Общая аспартазная активность - 72000 Ед.акт./мл. Клетки отделяли центрифугированием и промывали физиологическим раствором. Количество собранных влажных клеток в виде пасты составило 171 г. Пример 5. Получение иммобилизованных клеток.
Биомассу клеток штамма E.coli В-1 1745 из примера 4 в количестве 10 г помещали в стеклянный стакан, в который предварительно вносили 11 г 1 % раствора хлористого натрия и перемешивали. Затем, продолжая перемешивание, добавляли 5 г 20%-ного раствора гомополимера полиэтиленимина (Polymin-P, BASF), предварительно нейтрализованного соляной кислотой до рН 7,5 и далее, продолжая перемешивание, добавляли 3 г 25% раствора глутарового альдегида (Рапгеас). Смесь начинала быстро отверждаться. Ее оставляли на 30 минут для завершения протекающих реакций, после чего измельчали и подсушивали до остаточной влажности 65-75%. Полученные иммобилизованные клетки просеивали через сито, оставляя фракцию 0,5-1 ,5 мм, которую помещали в 20%-ный раствор ацетата аммония и оставляли не менее, чем на 24 часа при температуре 5°С.
Полученный биокатализатор имел удельную активность 180900 ед./ г влажного биокатализатора. Пример 6. Непрерывная биотрансформация фумарата аммония иммобилизованными клетками.
Биокатализатором, полученным по примеру 5, в количестве 5 г (по влажному весу) заполняли стеклянную колонку с рубашкой (1X12,7 см, 10 мл). В рубашку подавали теплоноситель с температурой 25°С. Перистальтическим насосом прокачивали через слой биокатализатора раствор фумарат аммония, с концентрацией 200 г/л (по фумаровой кислоте), рН 8,5 и с добавлением 1 мМ MgS04. Скорость подачи раствора 50 мл/час. Раствор, выходящий из колонки, содержал менее 1 ,5 г/л фумарата аммония (в расчете на фумаровую кислоту), что соответствует конверсии более 99%. Степень конверсии оставалась более 99% в продолжение непрерывного процесса биотрансформации фумарата аммония в течение трех месяцев и более. Пример 7. Получение L-аспарагиновой кислоты из реакционных растворов после биотрансформации.
В 2-х литровую колбу с обратным холодильником вносили 1600 мл реакционного раствора после биотрансформации по примеру 6. Колбу помещали на магнитную мешалку с нагревом и раствор нагревали при перемешивании до 90-98°С. Не прекращая перемешивание, в колбу вносили 150 г кристаллической фумаровой кислоты. Нагрев и поддержание температуры в пределах 90-95 °С продолжали еще 30 минут. Затем отключали нагрев и продолжали перемешивать суспензию выпадающих кристаллов аспарагиновой кислоты. Раствор охлаждали до 25°С, выдерживали при этой температуре 30 минут и кристаллы отделяли фильтрацией. Кристаллы промывали на фильтре обессоленной водой и сушили при 80°С. Было получено 269,8 г кристаллической L- аспарагиновой кислоты. Удельный угол вращения в 5 н HCI: [a]D20=+24,9. Примесь фумаровой кислоты 0,34%. Маточник и промывные воды упаривали под вакуумом до объема 1 ,3 л. К полученному концентрату добавляли 90 г фумаровой кислоты, 25%-ный водный аммиак до значения рН раствора 8,5 и обессоленную воду до объема 1 ,6 л. Полученный раствор вновь направляли на биотрансформацию.
Предлагаемый способ обеспечивает более эффективное получение L- аспарагиновой кислоты за счет удешевления и упрощения процесса. При этом исключается необходимость использования дорогостоящих питательных сред, больших объемов культивирования и малодоступных компонентов для иммобилизации клеток.
Таким образом, предлагаемой способ получения L-аспарагиновой кислоты позволяет обеспечить высокую аспартазную активность биокатализатора, существенно снизить трудоёмкость и стоимость технологического процесса.
Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1 . Рекомбинантный штамм Escherichia coli, продуцент аспартазы, полученный путем введения в штамм Е. coli В КПМ 7188 рекомбинантной плазмиды, содержащей ген aspA под контролем лактозного промотора lacUV5.
2. Штамм по п.1 , депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером ВКПМ В-1 1745.
3. Способ получения L-аспарагиновой кислоты путем биотрансформации фумарата аммония с помощью биокатализатора на основе клеток Е. coli, отличающийся тем, что в качестве биокатализатора используют штамм Е. coli по любому из пп.1 или 2.
4. Способ по п.З, отличающийся тем, что в качестве биокатализатора используют свободные или иммобилизованные клетки штамма Е. coli.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что иммобилизацию клеток штамма Е. coli осуществляют в матрице полиэтиленимина, ковалентно сшитой глутаровым альдегидом.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что весовое соотношение полиэтиленимина и глутарового альдегида составляет от 1 : 1 до 3: 1.
7. Способ по п.5, отличающийся тем, что весовое соотношение компонентов полиэтиленимина и глутарового альдегида к биомассе Е. coli составляет от 0,25: 1 до 3: 1.
PCT/RU2018/050006 2017-02-28 2018-02-02 Способ получения l-аспарагиновой кислоты WO2018160103A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18761555.4A EP3591034A4 (en) 2017-02-28 2018-02-02 ASPARTIC ACID MANUFACTURING PROCESS

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA201700163A EA035353B1 (ru) 2017-02-28 2017-02-28 Способ получения l-аспарагиновой кислоты и рекомбинантный штамм-продуцент аспартазы escherichia coli
EA201700163 2017-02-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018160103A1 true WO2018160103A1 (ru) 2018-09-07

Family

ID=63287021

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2018/050006 WO2018160103A1 (ru) 2017-02-28 2018-02-02 Способ получения l-аспарагиновой кислоты

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP3591034A4 (ru)
EA (1) EA035353B1 (ru)
WO (1) WO2018160103A1 (ru)

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU659611A1 (ru) 1977-02-09 1979-04-30 Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова Способ получени -аспарагиновой кислоты
US4355105A (en) * 1981-03-30 1982-10-19 Miles Laboratories, Inc. Glutaraldehyde/polyethylenimine immobilization of whole microbial cells
US4436813A (en) 1982-03-16 1984-03-13 Purification Engineering, Inc. Immobilized microbial cell composition for making L-aspartic acid
EP0110422A2 (en) 1982-12-03 1984-06-13 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Process for producing L-aspartic acid
EP0111293A2 (en) 1982-12-08 1984-06-20 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Microorganism of the genus Serratia, method of producing the same and method for producing L-aspartic acid
US4504582A (en) 1982-07-20 1985-03-12 Genex Corporation Vermiculite as a carrier support for immobilized biological materials
US4692409A (en) 1983-06-15 1987-09-08 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Method for producing L-aspartic acid
EP0752476A1 (en) 1994-12-09 1997-01-08 Mitsubishi Chemical Corporation Process for the production of l-aspartic acid
US6214589B1 (en) 1998-02-13 2001-04-10 Nippon Shokubai Co., Ltd. Method for producing L-aspartic acid
RU2174558C1 (ru) 2000-12-07 2001-10-10 Закрытое акционерное общество "Биоамид" Способ получения l-аспарагиновой кислоты
RU2546239C1 (ru) * 2013-12-12 2015-04-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика" РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli, ОБЛАДАЮЩИЙ КОНСТИТУТИВНОЙ АСПАРТАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И СПОСОБ СИНТЕЗА L-АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО ШТАММА В КАЧЕСТВЕ БИОКАТАЛИЗАТОРА

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2108047B1 (en) * 2007-01-31 2012-10-24 Pfenex Inc. Bacterial leader sequences for increased expression

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU659611A1 (ru) 1977-02-09 1979-04-30 Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова Способ получени -аспарагиновой кислоты
US4355105A (en) * 1981-03-30 1982-10-19 Miles Laboratories, Inc. Glutaraldehyde/polyethylenimine immobilization of whole microbial cells
US4436813A (en) 1982-03-16 1984-03-13 Purification Engineering, Inc. Immobilized microbial cell composition for making L-aspartic acid
US4504582A (en) 1982-07-20 1985-03-12 Genex Corporation Vermiculite as a carrier support for immobilized biological materials
EP0110422A2 (en) 1982-12-03 1984-06-13 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Process for producing L-aspartic acid
EP0111293A2 (en) 1982-12-08 1984-06-20 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Microorganism of the genus Serratia, method of producing the same and method for producing L-aspartic acid
US4692409A (en) 1983-06-15 1987-09-08 Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Method for producing L-aspartic acid
EP0752476A1 (en) 1994-12-09 1997-01-08 Mitsubishi Chemical Corporation Process for the production of l-aspartic acid
US6214589B1 (en) 1998-02-13 2001-04-10 Nippon Shokubai Co., Ltd. Method for producing L-aspartic acid
RU2174558C1 (ru) 2000-12-07 2001-10-10 Закрытое акционерное общество "Биоамид" Способ получения l-аспарагиновой кислоты
RU2546239C1 (ru) * 2013-12-12 2015-04-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика" РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli, ОБЛАДАЮЩИЙ КОНСТИТУТИВНОЙ АСПАРТАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И СПОСОБ СИНТЕЗА L-АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО ШТАММА В КАЧЕСТВЕ БИОКАТАЛИЗАТОРА

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FULLER F ET AL.: "A family of cloning vectors containing the lacUV5 promoter", GENE, vol. 19, no. 1, July 1982 (1982-07-01), pages 43 - 54, XP023538546, Retrieved from the Internet <URL:https://doi.org/10.1016/0378-1119(82)90187-1> *
R. BAHULEKAR: "Polyethyleneimine in immobilization of biocatalysts", ENZYME AND MICROB. TECHNOL., vol. 13, no. 11, 1991, pages 858 - 868, XP023791170, DOI: doi:10.1016/0141-0229(91)90101-F
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY
See also references of EP3591034A4

Also Published As

Publication number Publication date
EP3591034A4 (en) 2020-12-16
EA201700163A1 (ru) 2018-08-31
EA035353B1 (ru) 2020-06-01
EP3591034A1 (en) 2020-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11261217B2 (en) Expression of Klebsiella oxytoca polypeptides involved in lysine decarboxylation, and methods and applications thereof
TWI308594B (en) Method for producing l-amino acid
CN110468092B (zh) 一株高产l-缬氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用
JP4108766B2 (ja) 改良されたトランスアミナーゼ生物学的変換方法
CN102770550A (zh) 尸胺的制备方法
CN110885803A (zh) 重组草铵膦脱氢酶、基因工程菌及其在制备l-草铵膦中的应用
CN101463358B (zh) 一种腈水合酶基因簇及其应用
MXPA03009345A (es) El microoganismo del cual el gen fadr tuvo expresion bloqueada en el cromosoma y un procedimiento para producir l-treonina mediante fermentacion con el mismo mutante.
WO2011138966A1 (ja) 微生物触媒を用いたアクリルアミドの製造方法
CN113151133B (zh) 一种产唾液酸乳糖的重组宿主菌及其构建方法和应用
RU2546239C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli, ОБЛАДАЮЩИЙ КОНСТИТУТИВНОЙ АСПАРТАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ И СПОСОБ СИНТЕЗА L-АСПАРАГИНОВОЙ КИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭТОГО ШТАММА В КАЧЕСТВЕ БИОКАТАЛИЗАТОРА
CN107287144B (zh) 一种代谢改造的枯草芽孢杆菌生物转化细胞及其制备方法与应用
CN100406553C (zh) 生产D-N-氨基甲酰基-α-氨基酸的方法
CN114854659B (zh) 一种麦角硫因生产工艺及其应用
WO2018160103A1 (ru) Способ получения l-аспарагиновой кислоты
CN112779233B (zh) 重组草铵膦脱氢酶、基因工程菌及其在制备l-草铵膦中的应用
RU2174558C1 (ru) Способ получения l-аспарагиновой кислоты
RU2339699C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pT7ΔpckA::loxpcat ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ L-ТРЕОНИНА В КЛЕТКАХ Escherichia coli, И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli FTR2717 (KCCM-10475) - ПРОДУЦЕНТ L-ТРЕОНИНА
KR19990072677A (ko) Ｌ-아스파라긴산의제조방법
RU2143002C1 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ γ-АМИНОМАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ
CN114921432B (zh) 一种转氨酶突变体及其工程菌与应用
CN117363552B (zh) 生产纳他霉素的褐黄孢链霉菌基因工程菌株及其构建方法
CN110331121B (zh) 一种高产脂肽的重组菌及其应用
CN116904379A (zh) 一种高产四氢嘧啶的基因重组菌株及其构建方法和应用
CN101892228A (zh) 一种高丙烯酰胺和丙烯腈耐受性产腈水合酶工程菌及应用

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18761555

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018761555

Country of ref document: EP

Effective date: 20190930