KR19990072677A

KR19990072677A - Ｌ-아스파라긴산의제조방법

Info

Publication number: KR19990072677A
Application number: KR1019990005196A
Authority: KR
Inventors: 무코우야마마사하루; 고마쓰자키사토미
Original assignee: 아이다 겐지; 가부시끼가이샤 니뽕 쇼꾸바이
Priority date: 1998-02-13
Filing date: 1999-02-13
Publication date: 1999-09-27
Also published as: EP0945513A2; EP0945513B1; US6214589B1; DE69927315T2; CN1229142A; DE69927315D1; KR100591080B1; CN1084389C; EP0945513A3

Abstract

아스파타제를 함유한 균체를 고정화하여 작제한 고정화 아스파타제를 충진한 반응기에 푸마르산암모니움을 통과시켜 L-아스파라긴산을 제조하는 방법에 있어서, 250U 이상의 활성을 가지는 고정화 아스파타제를 사용하고, 반응기로의 푸마르산암모니움 용액의 통액속도를 LHSV=2 내지 35로 하는 것을 특징으로 하는 L-아스파라긴산의 제조방법.

Description

Ｌ-아스파라긴산의 제조방법{Process for Preparing L-Aspartic Acid}

본 발명은 고 아스파타제 활성을 가진 미생물을 이용한 L-아스파라긴산의 제조방법에 관한 것이다.

대장균이 아스파타제 활성을 가지고 있고, 이 미생물을 이용하여 푸마르산암모니움으로부터 L-아스파라긴산을 효소적으로 제조하는 방법이 알려져 있다. 일본 특허공개 (소) 55-35110호에는 이온교환수지 듀오라이트 A-7에 대장균 아스파타제를 고정화하여 이용하는 방법이 개시되어 있다. 또한, [Applied Biochemistry and Biotechnology, vol.13, pp231-240(1986)]에는 k-카라기난으로 대장균 균체를 포괄 고정화하여 반응기에 충진하고, 연속적으로 L-아스파라긴산을 생산하는 방법이 기재되어있다. 그러나, 이러한 방법으로는 고정화 아스파타제의 활성이 낮거나 또는 포괄 고정화에 의해 확산율속이 발생하기 때문에, 그 생산성은 공업적으로 만족할 수 있는 것은 아니었다.

또한, 종래의 고정화 아스파타제로는 그 활성이 높지 않기 때문에, 반응온도를 30℃ 이상으로 하지 않으면 안되므로 냉각을 필요로 하게 된다. 아스파타제는 열에 의해 불활성화되는데, 특히 40 ℃를 넘는 온도 범위에서는 활성이 현저히 저하되기 때문에(Applied Microbiology, vol.27, No.5, p878-885(1974); Applied Microbiology, vol.27, No.5, p886-889(1974)), 반응열에 의한 반응기 내의 온도상승을 막기 위한 목적으로 반응기 내부에 냉각관을 장치하기도 하고 재킷 등의 냉각장치를 설치하는 등, 장치가 복잡해지는 문제가 있었다. 또한, 종래 고정화 아스파타제로는 그의 효소활성이 높지 않기 때문에, 반응온도를 30 ℃ 이상으로 하지 않으면 안되므로 냉각을 필요로 하게 되고, 높은 LHSV하에서 반응을 수행할 수 없었다. 또한, 겔에서의 포괄 고정화 아스파타제를 이용한 방법에서는 확산저항이 커지기 때문에, 고 LHSV하에서 반응을 수행할 수 없었다.

생산성을 높이기 위해서는 고 LHSV 하에서 반응을 수행하는 일이 필수적이고 이것을 실현하기 위해서는 저온에서도 반응할 수 있는 고활성이고, 또한 확산저항이나 압력손실이 적은 고정화 아스파타제가 필요하다. 이 점에 대하여, 본 발명자들은 예의 검토한 결과, 고정화 아스파타제의 활성이 안정한 온도범위에서 유지되기 위해서는 발열반응에 의한 온도상승 분 이상 낮아진 기질액을 통액시킴으로써, 실질적으로 열의 제거가 불필요한 반응형식이 가능하고, 또한, 고 LHSV하에서의 반응이 가능하게 된다는데 기초하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 아스파타제를 함유한 균체를 고정화시켜 작제한 고정화 아스파타제를 충진한 반응기에 푸마르산암모니움을 통액시켜 L-아스파라긴산을 제조하는 방법에 있어서, 250U 이상의 활성을 가지는 고정화 아스파타제를 사용하고, 반응기로의 푸마르산암모니움 용액의 통액 속도를 LHSV=2 내지 35로 하는 것을 특징으로 하는 L-아스파라긴산의 제조방법에 관한 것이다. 이 때, 1U는 1μmole L-아스파라긴산 생성/min/㎖ 고정화 효소를 의미하고, LHSV(공탑속도)는 통액용량(㎖)/촉매충진용량(㎖)/1시간을 의미한다.

또한, 상기 고정화 아스파타제로서는, 예를 들어 아스파타제 유전자를 재조합 DNA에 의해 도입한 재조합체 균체를 고정화한 것을 이용한다. 아울러, 상기 고정화 아스파타제는 구상담체에 상기 아스파타제를 함유하는 균체를 고분자로 피복함으로써 고정화한 것이고, 또한 구 모양의 스티렌디비닐벤젠(styrene divinylbenzene) 공중합체 이온교환수지담체에 다음의 일반식에 표시된 고분자와 상기 아스파타제를 함유하는 균체를 혼합한 것을 피복함으로 고정화된다:

상기 식에서,

Y는 직접 결합하거나,또는로

표시되는 2가 기이고;

R₁및 R₂는 상호 독립적으로 수소원자 또는 유기잔기이며;

X는 음이온을 표시하고; 및,

n 은 100 내지 5000 의 수이다.

상기 R₁또는 R₂의 유기잔기로서는 탄소수 열 개 이하의 알킬기, 예를 들어 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, ter-부틸기 등이며, 특히 메틸기가 바람직하다. 또한, 할로겐과 히드록실기로 치환한 유기잔기도 사용할 수 있는데, 4-클로로-2-디메틸펜틸기, 3-에틸-2,5-디클로로헵틸기, 2-히드록시-3,5-디메틸노닐기 등을 들 수 있고, 특히 3-클로로-2-히드록시프로필기가 바람직하다.

상기의 음이온(X-)으로서는, 할로겐이온, 예를 들어, F-, Cl-, Br-, I-을 들수 있으나, 특히 Cl-가 바람직하며, 또한 다른 1가의 음이온, 예를 들어 NO₃- 등을 사용할 수도 있다.

상기의 아스파타제 유전자 재조합체 균체를 상기의 고정화 방법에 의해 고정화한 고정화 아스파타제는 활성이 아주 높으며, 압력손실, 확산저항도 적기 때문에, 종래의 고정화 아스파타제로는 실시할 수 없었던 고 LHSV에서의 반응이 가능하다.

또한, 저온의 푸마르산암모니움용액을 통액시켜 반응을 수행할 수 있기 때문에, 아스파타제의 수명도 보다 길게 할 수 있었다.

본 발명에서 사용할 수 있는 아스파타제를 함유하는 미생물 균체는 아스파타제 활성이 높은 것으로 알려져 있다. 대장균 (Escherichia coli)나 슈도모나스ㆍ 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens), 브레비박테리움(Brevibacterium)속 세균 등이 적절히 이용된다. 특히, 재조합 DNA에 의해 아스파타제 유전자를 도입한 재조합체 균체가 바람직하다.

본 발명에 사용할 수 있는 아스파타제 유전자는 대장균 (Escherichia coli)나 슈도모나스ㆍ플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens), 엔테로박터(Enterobacter)속, 시트로박터(Citrobacter)속의 미생물 등 대장균과 자연계에서 유전자가 교잡되는 것이 확인된 미생물로 아스파타제 활성을 가지고 있는 미생물이 바람직하고, 아스파타제 활성을 가진 미생물이라면 어느 것이나 적절히 사용할 수 있다.

예를 들어, 대장균 K-12(IFO3301)의 염색체 DNA 또는 슈도모나스 플루오레슨스(IFO3081)의 염색체 DNA로부터 공지된 아스파타제 유전자 배열을 기초로 하여 작제한 프라이머와 주형으로서의 대장균의 염색체 DNA 또는 슈도모나스 플루오레슨스 염색체 DNA를 이용하여 PCR법에 의해 아스파타제 유전자를 증폭시킴으로써 아스파타제 유전자를 수득할 수 있다. 또한, 염색체 DNA를 제한효소처리하여 단편화한 것을 전기영동한 다음, 아스파타제 유전자를 포함한 단편을 회수하는 방법 등 통상의 방법에 의해서도 얻을 수 있다.

이 아스파타제 유전자를 조합하기 위한 플라스미드는 대장균의 균체 내에서 복제된 플라스미드라면 어느 것이라도 좋으며, 특별히 한정되는 것이 아니고, 예를 들어 pUC18(닛폰진사 제품), pKK223-3(파마시아사 제품) 등을 사용할 수 있다.

또한, 아스파타제 유전자를 조합한 플라스미드를 도입하는 숙주 미생물로서는 대장균 K-12 주(스트라타진사 제품) 등이 적절히 이용된다.

아스파타제를 함유하는 균체의 고정화 방법으로는, 강도가 충분하고 통액할 때의 압력손실이나 확산율속이 일어나기 어려운 방법이 바람직하다.

균체의 고정화 방법으로서는 구상의 담체표면에 균체를 고분자와 함께 코팅하는 방법이 바람직하고, 스티렌디비닐벤젠 공중합체계의 이온교환수지표면에 폴리알릴아민(polyallylamine)계 고분자와 균체의 혼합물을 코팅하는 방법이 보다 바람직하다. 스틸렌디비닐벤젠 공중합체계의 이온교환수지로서는 특히 앰벌라이트(Amberilte) IRA-96SB 등이 바람직하고, 또한 폴리알릴아민계 고분자로서는 PAS-880(일동방적 제품) 등이 특히 바람직하다.

이러한 방법이라면 아스파타제를 포함하는 균체를 그대로 고정화하기 위해서, 균체에 포함되어 있는 아스파타제를 거의 대부분 고정화할 수 있기 때문에, 아주 활성이 높은 고정화 아스파타제를 얻을 수 있다.

균체의 고정화는 수득한 균체를 pH 7.0으로 조절한 PAS-880과 혼합하고, 나스형 플라스크에 넣은 테플론볼과 앰벌라이트 IRA-96SB에 가하여, 회전식 증발장치에서 회전시키면서 감압 하에서 건조시켜 코팅함으로써 수행할 수 있다.

이 방법에 의해 고정화물은 구 모양의 것이 수득되기 때문에, 그 압력손실이 LHSV=20 일때에 2.0 ㎏/㎠/1 m 고정화 아스파타제 층 길이(물, 20℃)이하이고, 고 LHSV에서의 반응이 가능해 진다. 또한, 확산층이 얇기 때문에 효소활성이 충분히 발휘될 수 있기 때문에 바람직하다. 고정화 효소의 압력손실은 LHSV=20일 때에 2 ㎏/㎠/1 m 고정화 아스파타제 층 길이가 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 1㎏/㎠/1 m 고정화 아스파타제층 길이 이하의 범위이다. 본 발명의 방법에서 이용하는 반응기의 형상은 특별히 제한되지 않지만, 통상 원통형의 반응기를 이용한다. 반응기의 길이는 아주 길면 압력손실의 원인이 되기 때문에, 10 M 이내가 바람직하다. 반응기에는 특별히 냉각을 위한 장치가 필요하지는 않지만, 반응기가 보온되도록 하면 더욱 바람직하다.

반응기 앞에 온도조절이 가능한 원료저장조 또는 열교환기를 설치함으로써, 반응기에 통액하는 푸마르산암모니움용액의 온도를 일정하게 유지할 수 있도록 할 필요가 있다.

상온균의 효소는 일반적으로 40℃를 넘는 범위에서는 안정성이 악화되고, 열에 의한 불활성이 커진다. 대장균의 아스파타제 경우도 40℃를 넘는 온도 하에서 급격히 안정성이 악화되고, 열에 의해 불활성화되며(Applied Microbiology vol.27, No.5, pp878-885(1974); Applied Microbiology, vol.27, No.5, pp886-889(1974)), 이 열에 의해 불활성은 고정화 효소 수명의 단축을 초래하게 된다.

반응기에 통액하는 푸마르산암모니움용액의 온도조절은 아스파타제의 열에 의한 불활성화를 막기 위하여, 반응기 출구의 반응액 온도를 40℃를 넘지 않도록 하는 것이 중요하다.

이 온도 범위라면 아스파타제의 안정성도 양호하다. 대장균의 경우, 이 온도 범위는 40 ℃ 이하이고, 이 온도 범위로부터 될 수 있는 한 낮게 하면 안정성이 높아지기 때문에 바람직하다. 또한, 40℃ 이상에서 적절 온도를 가지는 고온이고, 안정한 아스파타제에 있어서도 마찬가지로 그 반응성이 악화되는 온도로부터 반응열로 상승하는 온도 폭 이상으로 낮게 조절한 원료액을 통액시킴으로써, 동일한 효과를 얻을 수 있다. 종래의 고정화효소에는 이와 동일한 범위에서 반응을 수행하기에는 그 활성이 충분하지 않았다. 또한,「아스파타제의 안정성이 악화되는 온도」라는 것은 상술한 바와 같이, 대장균 유래의 아스파타제의 경우는 40 ℃ 전후, 프레비박테리움ㆍ플라본 유래의 아스파타제의 경우는 48 ℃ 전후(일본농예화학회지 vol.59, No.1, p31∼37(1985)), 바실러스ㆍ아미노게네스유래의 아스파타제의 경우는 50 ℃ 전후(일본 특허공개 (평)3-48795호)이다. 즉, 통액한 푸마르산암모니움용액은 평형이 될 때까지 L-아스파라긴산으로 변환된 경우, 반응열에 의해 온도가 상승하지만, 통액하는 푸마르산암모니움 용액의 온도를 40℃에서 반응열로 상승하는 온도 폭 이상을 낮추어 조절하면, 반응액 온도를 40℃를 넘지 않는 범위로 유지할 수 있다. 이 범위에서 될 수 있는 한 온도를 낮게 하면 안정성이 높아져서 바람직하지만, 너무 온도가 낮으면 푸마르산암모니움의 결정이 석출될 우려가 있기 때문에, 통액하는 푸마르산암모니움용액의 반응기 입구에서의 온도는 10℃를 하한으로 하고, 33 ℃까지의 범위가 바람직하나, 보다 바람직하게는 15 내지 28℃의 범위가 좋다.

대장균 이외 미생물 아스파타제의 경우도 마찬가지다.

구체적으로는 고정화 아스파타제의 반응성 등의 면에서 푸마르산암모니움 용용액의 농도가 푸마르산으로 환산하여 10%인 경우에는 반응열에 의한 온도상승이 7 ℃정도이기 때문에, 10 내지 33℃, 바람직하게는 15 내지 28℃의 푸마르산암모니움용액을 통액하는 것이 바람직하다.

또한, 푸마르산암모니움 용액의 농도가 푸마르산 환산으로 20 % 인 경우에는 반응열에 의한 온도 상승이 14 ℃ 정도이기 때문에, 10 내지 26℃, 바람직하게는 15 내지 24℃의 푸마르산암모니움 용액을 통액하는 것이 바람직하다. 이 반응형식이라면, 반응기 출구에서의 반응액 온도가 40 ℃를 넘지 않고, 아스파타제의 안정성도 양호하다. 또한, 실질적으로 반응기에서의 냉각이 불필요하기 때문에, 반응기의 제조도 간단히 할 수 있다.

반응기에 통액하는 푸마르산암모니움 용액의 속도는 생산성의 면에서 큰 편이 바람직하며, 푸마르산암모니움 용액농도와 고정화 아스파타제의 활성, 고정화 아스파타제의 충진층 길이에 따라 임의의 값을 설정할 수 있고, LHSV=2 내지 35의 범위가 바람직하며, LHSV=6 내지 30가 보다 바람직하고, LHSV=7 내지 25의 범위가 가장 바람직하다.

이 범위보다 크면, 푸마르산암모니움으로부터 L-아스파라긴산으로의 전화율이 낮아질 우려가 있기 때문에 바람직하지 않다. 또한, 이 범위 보다 적으면, 생산성이 낮아지기 때문에 바람직하지 않다.

반응기 출구에서의 푸마르산암모니움의 L-아스파라긴산으로의 전화율은 90 % 이상이 바람직하며, 95 % 이상이 보다 바람직하다. 너무 낮으면, 미반응하는 푸마르산이 늘어나고, 원가가 올라가기 때문에 바람직하지 않다.

고정화 아스파타제는 바람직하게는 250U 이상, 보다 바람직하게는 500U 이상의 활성을 가진다.

고정화 아스파타제의 활성이 250U 의 경우에는, 20 % 푸마르산암모니움 용액을 반응기 입구 온도 20 ℃, LHSV=2 에서 통액할 경우 99 % 이상의 전화율을 얻을 수 있고, 또한 고정화 아스파타제의 활성이 1000 U의 경우에는, 20 % 푸마르산암모니움 용액을 반응기 입구 온도 20 ℃, LHVS=2 로 통액한 경우 전화율은 80 %로 저하된다. 또한, 고정화 아스파타제의 활성이 1000 U의 경우에는, 20 % 푸마르산암모니움 용액을 반응기 입구 온도 23 ℃, LHSV=10으로 통액한 경우 99 % 이상의 전화율을 얻을 수 있다.

이와 같이 고활성 고정화 아스파타제를 이용함으로써, 고 LHSV의 반응이 가능하게 된다.

이하에서는, 유전공학적 방법에 의해 대장균 또는 슈도모나스ㆍ플루오레슨스 유래아스파타제의 제조방법을 설명한다.

(1) 대장균(Escherichia coli)아스파타제 재조합체의 작제

재단법인 발효연구소로부터 입수한 대장균(Escherichia coli) IFO3301주를 표 1에 표시한 LB 배지에 접종하고, 37℃에서 8시간 배양하였다. 이 배양액 1㎖로부터 균체를 회수하고 증류수 1㎖에 현탁하였다. 이 균체 현탁액 1㎕를 아스파타제 유전자를 증폭하기 위한 주형 DNA로서 이용하였다.

LB 배지^＊의 조성

성 분	함 량
폴리펩톤(polypeptone)효모추출물NaCl증류수	10 g5 g10 g1 L

＊: 121℃, 15분 가압멸균(autoclave)

(2) PCR에 의한 아스파타제 유전자의 증폭과 삽입 단편의 작제

공지의 대장균(Escherichia coli) K-12주의 아스파타제 유전자 (그 유전자의 염기 배열을 '배열 번호 1', 또는 그 염기 배열에 의해 코드된 아미노산 배열을 '배열번호 2'로 한다)(Biochem. J., 237(2), 547-557)를 기초로 대장균(Escherichia coli)의 아스파타제 유전자를 증폭하기 위하여, 다음의 두가지 프라이머를 작제하였다:

프라이머F1 GGATAATCGTCGGTCGAAAA (배열번호 3)

프라이머R1 CGTCATCTGACGTGCCTTT (배열번호 4)

KOD DNA 중합효소(TOYOBO)를 이용하여 하기 조성 반응액을 조제하고, PCR방법으로 아스파타제 유전자를 증폭시켰다.

성 분	함 량
10 X 완충용액dNTPs 혼합물MgCl₂주형 DNAKOD DNA 중합효소프라이머 F1(25 pmol)프라이머 R1(25 pmol)멸균수	5 ㎕5 ㎕2 ㎕1 ㎕1 ㎕1 ㎕1 ㎕34 ㎕
합계	50 ㎕

PCR 조건:

① 98℃ 5 분

② 98℃ 30 초

③ 53 ℃ 30 초

④ 68 ℃ 1 분 ② 에서 ④의 사이클을 30회 반복한다.

PCR반응 완료후, 증폭된 DNA 단편을 1% 아가로스겔로 전기 영동, 에티디움브로마이드 염색한 결과, 예상된 약 1600bp의 단편이 증폭되었음을 확인하였다.

이 단편을 아가로스겔(agarose gel)로부터 잘라내어, Prep-A-Gene(BioRad)에서 DNA를 회수하였다.

(3) 벡터로의 삽입단편의 결합

pCR- Script Amp SK(+) 클로닝벡터에 제한효소 Srf와 DNA 리가제(ligase)의 존재하에서 앞서 회수한 DNA 단편을 결합시켰다.

이 삽입 DNA 단편을 삽입한 형질전환체의 한가지를 'PUaspE1주'로 명명하였다.

이 PUaspE1주를 앰피실린 100 ppm을 첨가한 LB 배지 3 ㎖에 접종하고, 37℃에서 하룻밤 진탕배양한 다음, 그 배양액 1.5 ㎖로부터 균체를 회수하였다. 이 균체로부터 알칼리 SDS법에 의해 플라스미드를 회수하였다. 이 플라스미드를 'pUaspE1'이라고 명명하였다.

이 플라스미드의 삽입 단편의 배열을 해석(解析)한 바, 벡터의 프로모터에 대해 역방향으로 아스파타제 유전자가 삽입되어 있는 것을 알게 되었다.

프로모터에 대하여 순방향으로 다시 연결하기 위하여, 플라스미드 pUaspE1으로부터 제한효소 Sacl과 BamHI에서 삽입단편을 잘라내어, pUC19에 도입되도록 하였다. 플라스미드 pUaspE1을 제한효소 BamHI에서 절단한 후, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수한 다음, 제한효소 SacI에서 절단하였다. 절단한 DNA 단편을 1 % 아가로스겔로 전기영동함으로써 분리하고, 겔로부터 잘라낸 prep-A-Gene(BioRad)에서 DNA를 회수하였다.

(4) 벡터의 작제

플라스미드 pUC19(닛폰진 제품) 1 ㎍을 제한효소 BamHI에서 절단한 후, 에탄올 침전에 의해 DNA를 회수하여 제한효소 SacI로 절단하였다. 절단한 DNA 단편을 1 % 아가로스겔로 전기영동함으로써 분리하고, 겔로부터 잘라내어 prep-A-Gene(BioRad)에서 DNA를 회수하여 벡터로 사용하였다.

(5) 벡터로의 삽입단편의 결합

제한효소에서 절단한 벡터와 삽입단편을 라이게이션 하이(TOYOBO)를 이용하여, 16℃에서, 30분간 결합시켰다.

(6) 대장균의 형질전환

벡터와 삽입단편을 결합시킨 반응액 2 ㎕를 대장균 컴피텐트셀(XL 2-Blue MRF Ultracompetent cells STRATAGENE사 제품) 200 ㎕에 넣어 대장균을 형질전환하였다. 형질전환시킨 대장균을 앰피실린 100 ppm을 함유하는 LB 한천배지에 도말하고, 37℃의 온도조건에서, 하룻밤 배양하였다.

대조군으로서 삽입단편을 삽입하지 않은 플라스미드 pUC18에서 형질전환하고, 동일한 방법으로 앰피실린 100 ppm을 함유하는 LB 한천배지에 도말하고, 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다.

나타난 콜로니 20개를 앰피실린 100 ppm을 함유하는 LB 배지에 접종하고 37 ℃에서 진탕배양하였다. 8시간 후 IPTG(이소프로필티오(isopropylthio)-β-D-갈락토시드(galactoside))를 1 mM의 농도에 첨가하여, 하룻밤 30℃에서 진탕배양하고 배양액 1㎖로부터 균체를 회수하였다. 동일한 방법으로 삽입 단편을 갖지 않는 대조군의 형질전환체 1주를 배양하고 균체를 회수하였다. 회수한 균체에 하기 표 2에 표시한 푸마르산암모니움 기질액 1 ㎖를 첨가하여 균체를 현탁시키고, 30 ℃에서 1시간동안 반응시켰다.

20 % 푸마르산암모니움 기질액의 조성

성 분	함 량 ＊
푸마르산25 % 암모니아수황산 마그네슘 7수염이온교환수	200 g200 g2.5 g500 g

＊: 25 % 암모니아수로 pH 8.3으로 조정한 다음, 이온교환수를 가하여 1 L 로 조제하였다.

반응액을 분석한 결과, 삽입단편을 삽입한 대장균 형질전환체는 L-아스파라긴산으로의 전화율이 99.5 % 로 밝혀졌다. 한편, 삽입단편을 삽입하지 않은 대조군의 형질전환체는 전화율이 5 % 이었다. 이 삽입단편을 삽입한 형질전환체의 한가지를 'PUaspE2'로 명명하였다. PUaspE2를 앰피실린 100 ppm을 첨가한 LB 배지 3 ㎖에 접종하고, 37℃에서 8시간 배양하였다. 이 배양액 1.5 ㎖로부터 알칼리 SDS법에 의해 플라스미드를 회수하고, 이 플라스미드를 'pUaspE2'라고 명명하였다. 플라스미드 pUaspE2를 제한효소 SmaI와, 이어서 제한효소 HindIII로 절단한 후, 1 % 아가로스겔 전기영동에 의해 DNA 단편의 크기를 계산하였는 바, 약 2960 bp와 1600 bp의 2개의 단편이 존재하였다. PUaspE2주를 앰피실린 100 ppm을 첨가한 LB배지 3 ㎖에 접종하고 37 ℃에서 진탕배양하여, 8시간 후에 IPTG(이소프로필-β-D-갈락토시드)를 1 mM의 농도로 첨가하고 하룻밤 30 ℃로 진탕배양하였다. 이 배양액 1 ㎖로부터 균체를 회수함과 동시에 균체농도 OD 660 nm을 측정하였는 바, 8.0 으로 확인되었다. 이 균체를 20 % 푸마르산암모니움 기질액 10 ㎖에 현탁하고, 30 ℃에서 1시간 반응시킨 후 반응액을 HPLC 분석하였다. 생성된 L-아스파라긴산과 균체 농도로부터, 아스파타제 활성을 계산하였는 바, 2000,000 μM-L-아스파라긴산 생성/hr/OD 660nm 균체 농도로 확인되었다.

동일한 방법으로 삽입단편을 갖지 않은 대조군의 형질전환체 1주를 배양하고, 균체를 회수함과 동시에 균체농도 OD 660nm를 측정하였는 바, 8.5 로 확인되었다. 이 균체를 20 % 푸마르산암모니움 기질액 10 ㎖에 현탁하고, 30 ℃에서 1시간 반응시킨 후 반응액을 HPLC 분석하였다. 생성된 L-아스파라긴산과 균체농도로부터 아스파타제 활성을 계산하였는 바, 10,000 μM-L-아스파라긴산 생성/hr/OD 660nm 균체 농도로 밝혀졌다. 이와 같이 수득한 PUaspE2주는 삽입 아스파타제 유전자를 갖지 않는 주의 200 배의 아스파타제 활성을 가지고 있었다.

(7) 재조합체의 배양

대장균(Escherichia coli)의 아스파타제의 재조합 대장균 PUaspE2주를 상기표 1에 표시된 배지에 앰피실린 100 ppm을 함유한 배지 3 ㎖를 넣은 시험관 10개에 접종하여 37℃에서 8시간 배양한 후, 동 조성의 배지에 IPTG를 1 mM을 첨가한 배지 100 ㎖를 넣은 사카쿠치 플라스크 10개에 각각 1개 씩 접종하고 30 ℃에서 하룻밤 진탕배양한 다음, 균체를 원심분리함으로써 회수하였다. 이 균체의 아스파타제 활성을 측정하였는 바, 1.05 moles L-아스파라긴산 생성/hr/g 균체로 확인되었다.

(8) 슈도모나스ㆍ플루오레슨스의 아스파타제 재조합체의 작제

재단법인 발효연구소로부터 입수한 슈도모나스ㆍ플루오레슨스 IFO3081주를 상기 표 1에 표시한 LB 배지에 접종하고, 30℃에서 8시간 배양하였다. 이 배양액 1㎖로부터 균체를 회수하고 증류수 1㎖에 현탁하였다. 이 균체 현탁액 1㎕를 아스파타제 유전자를 증폭하기 위한 주형 DNA로서 이용하였다.

(9) PCR에서의 아스파타제 유전자의 증폭과 삽입 단편의 작제

공지의 슈도모나스ㆍ플루오레슨스 IFO3081주의 아스파타제 유전자의 염기 배열 번호(J. Biochem., 100, 697-705(1986))를 기초로 슈도모나스ㆍ플루오레슨스의 아스파타제 유전자를 증폭하기 위하여 이하 두가지 프라이머를 작제하였다:

프라이머 F2

GGGCATATGATCTCCGTCATGTCCTCTGCTGCATCTTTCCG (배열번호 5)

프라이머 R2

CCCGGATCCTTAGGCCTTCAGCGGACCAAGCGTGGGG (배열번호 6)

KOD DNA 중합효소(TOYOBO)를 이용하여, 하기 조성 반응액을 조제하고 PCR에서의 아스파타제 유전자를 증폭시켰다.

성 분	함 량
10 X 완충용액dNTPs 혼합물MgCl₂주형 DNAKOD DNA 중합효소프라이머 F2(25 pmol)프라이머 R2(25 pmol)멸균수	5 ㎕5 ㎕2 ㎕1 ㎕1 ㎕1 ㎕1 ㎕34 ㎕
합계	50 ㎕

PCR 조건:

① 98℃ 5 분

② 98℃ 30 초

③ 55 ℃ 30 초

④ 68 ℃ 1 분, ② 에서 ④의 사이클을 30회 반복한다.

PCR반응 완료후, 증폭된 DNA 단편을 1% 아가로스겔로 전기 영동, 에티디움브로마이드 염색한 결과, 예상된 약 1500bp의 단편이 증폭되었음을 확인하였다.

이 단편을 아가로스겔로부터 잘라내어, Prep-A-Gene(BioRad)에서 DNA를 회수하였다. 회수한 DNA를 제한효소 Ndel과 BamHI로 동시에 절단한 후, 1 % 아가로스겔로 전기영동함으로써 분리하고, 먼저와 동일한 방법으로 잘라낸 Prep-A-Gene(BioRad)로 DNA 단편을 회수하였다.

(10) 벡터의 작제

플라스미드 pUC18의 β-갈락토시디아제(galactosidase)의 구조 유전자의 개시 코돈(codon) 위치에서, NdeI 제한효소 사이트를 종시 코돈위치에서 BamHI 제한효소 사이트를 가진 벡터 DNA 단편을 PCR법으로 조제하기 때문에, 두가지 프라이머를 작제하였다:

프라이머 F3 CCCCATATGTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACA

ATTCCACACAATATACGAGCC (배열번호 7)

프라이머 R3 CCCGGATCCTTAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACC (배열번호 8)

KOD DNA 중합효소(TOYOBO)를 이용하여, 하기 조성의 반응액을 조제하고 PCR에서 벡터 DNA 단편을 증폭하였다. 주형 DNA 로서는 플라스미드 pUC18을 이용하였다.

성 분	함 량
10 X 완충용액dNTPs 혼합물MgCl₂주형 DNAKOD DNA 중합효소프라이머 F3(25 pmol)프라이머 R3(25 pmol)멸균수	5 ㎕5 ㎕2 ㎕1 ㎕1 ㎕1 ㎕1 ㎕34 ㎕
합계	50 ㎕

PCR 조건:

① 98℃ 5 분

② 98℃ 30 초

③ 55 ℃ 30 초

④ 68 ℃ 1 분, ② 에서 ④의 사이클을 30회 반복한다.

PCR반응 완료후, 증폭된 DNA 단편을 1% 아가로스겔에서 전기영동시켜, 에티디움브로마이드 염색한 결과, 예상된 약 2400bp의 단편이 증폭되었음을 확인하였다.

이 단편을 아가로스겔로부터 잘라내어, Prep-A-Gene(BioRad)에서 DNA를 회수하였다. 회수한 DNA를 제한효소 Ndel과 BamHI로 동시에 절단한 후, 1 % 아가로스겔로 전기영동함으로써 분리하고, 먼저와 동일한 방법으로 잘라낸 Prep-A-Gene(BioRad)로 DNA 단편을 회수하여 벡터 DNA로 사용하였다.

(11) 벡터로의 삽입단편의 결합

(12) 대장균의 형질전환

벡터와 삽입단편을 결합시킨 반응액 2 ㎕를 대장균 컴피텐트셀(XL 2-Blue MRF Ultracompetent cells STRATAGENE사 제품) 200 ㎕에 넣어 대장균을 형질전환시켰다. 형질전환시킨 대장균을 앰피실린 100 ppm을 함유하는 LB 한천배지에 도말하고, 37 ℃의 온도조건에서, 하룻밤 배양하였다.

대조군으로서 삽입단편을 삽입하지 않은 플라스미드 pUC18로 형질전환하고, 동일한 방법으로 앰피실린 100 ppm을 함유하는 LB 한천배지에 도말하고, 37℃에서 하룻밤 배양하였다.

나타난 콜로니 20개를 앰피실린 100 ppm을 함유하는 LB 배지에 접종하고 37℃에서 진탕배양하였다. 8시간 후 IPTG(이소프로필티오(isopropylthio)-β-D-갈락토시드(galactoside))를 1 mM의 농도에 첨가하여 하룻밤 30℃에서 진탕배양하고 배양액 1㎖로부터 균체를 회수하였다. 동일한 방법으로 삽입 단편을 갖지 않는 대조군의 형질전환체 1주를 배양하고 균체를 회수하였다. 회수한 균체에 상기 표 2에 표시한 푸마르산암모니움 기질액 1 ㎖을 첨가하여 균체를 현탁시켜, 30 ℃에서 1시간 반응시켰다.

반응액을 분석한 결과, 삽입 단편을 삽입한 대장균 형질전환체는 L-아스파라긴산으로의 전화율이 99.5 % 로 밝혀졌다. 한편, 삽입단편을 넣지 않은 대조군의 형질전환체는 전화율이 5 % 로 밝혀졌다. 이 삽입단편을 삽입한 형질전환체의 한가지를 'PUaspP1'주로 명명하였다. PUaspP1 주를 앰피실린 100 ppm을 첨가한 LB 배지 3 ㎖에 접종하고, 37℃에서 8시간 배양하였다. 이 배양액 1.5 ㎖로부터 알칼리 SDS법에 의해 플라스미드를 회수하고, 이 플라스미드를 'pUaspP1' 이라고 명명하였다. 이 플라스미드를 제한효소 NdeI와 BamHI로 절단한 후, 1 % 아가로스겔 전기영동에 의해 DNA 단편의 크기를 계산하였는 바, 약 2400 bp와 1500 bp의 2개의 단편이 존재하였다. PUaspP1주를 앰피실린 100 ppm을 첨가한 LB배지 3 ㎖에 접종하고 37℃에서 진탕배양하여 8시간 후에 IPTG(이소프로필-β-D-갈락토시드)를 1 mM의 농도로 첨가하여, 하룻밤 30℃로 진탕배양하였다. 이 배양액 1 ㎖로부터 균체를 회수함과 동시에 균체농도 OD 660 nm을 측정하였는 바, 8.0 으로 확인되었다. 이 균체를 20 % 푸마르산암모니움기질액 10 ㎖에 현탁하고, 30 ℃에서 1시간 반응시킨 후, 반응액을 HPLC 분석하였다. 생성된 L-아스파라긴산과 균체 농도에서, 아스파타제 활성을 계산하였는 바, 2500,000 μM-L-아스파라긴산 생성/hr/OD660nm 균체 농도로 확인되었다.

동일한 방법으로 삽입단편을 갖지 않은 대조군의 형질전환체 1주를 배양하고, 균체를 회수함과 동시에 균체농도 OD660nm를 측정하였는 바, 7.0 으로 확인되었다. 이 균체를 20 % 푸마르산암모니움 기질액 10 ㎖에 현탁하고, 30 ℃에서 1시간 반응시킨 후 반응액을 HPLC 분석하였다. 생성된 L-아스파라긴산과 균체농도로부터 아스파타제 활성을 계산하였는 바, 10,000 μM-L-아스파라긴산 생성/hr/OD660nm 균체 농도로 밝혀졌다. 이와 같이 수득한 PUaspP1주는 삽입 아스파타제 유전자를 갖지 않는 주의 200 배의 아스파타제 활성을 가지고 있었다.

(13) 재조합체의 배양

슈도모나스ㆍ플루오레슨스 아스파타제의 재조합 대장균 PUaspP1주를 상기 표 1에 표시된 배지에 앰피실린 100 ppm을 함유하는 배지 3 ㎖를 넣은 시험관 10개에 접종하여, 37℃에서 8시간 배양한 후, 동 조성의 배지에 IPTG(이소프로필-β-D갈락토시드)를 1 mM을 첨가한 배지 100 ㎖를 넣은 사카쿠치 플라스크 10개에 각각 1개 씩 접종하고, 30 ℃에서 하룻밤 진탕배양한 다음, 균체를 원심분리함으로써 회수하였다. 이 균체의 아스파타제 활성을 측정하였는 바, 0.85 moles L-아스파라긴산 생성/hr/g 균체로 확인되었다.

이하, 본 발명을 실시예를 들어 구체적으로 설명하고자 하나, 본 발명은 이들 실시예에 그 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1:

슈도모나스ㆍ플루오레슨스 아스파타제의 재조합 대장균 PUaspP1주를 상기 표 1에 표시된 배지에 앰피실린 100 ppm을 함유하는 배지 3 ㎖를 넣은 시험관 10개에 접종하여 37℃에서 8시간 배양한 후, 표 3의 배지에 IPTG 1 mM와 앰피실린 100 ppm 을 첨가한 배지 100 ㎖를 넣은 사카쿠치 플라스크 10개에 각각 1개 씩 접종하고 30 ℃에서 하룻밤 진탕배양한 다음, 균체를 원심분리함으로써 회수하였다. 이 균체의 아스파타제 활성을 측정하였는 바, 0.19 moles L-아스파라긴산 생성/hr/g 균체로 확인되었다.

배지조성^＊

성 분	함 량
푸마르산황산 암모니움KH₂PO₄K₂HPO₄MgSO₄ㆍ7H₂ONaOH효모 추출물	10 g5 g1 g3 g0.5 g6.5 g pH 6.320 g

＊: 121 ℃, 15 분 가압멸균(autoclave)

PAS-880 (일동방적 제품)을 알칼리로 pH 7.0 부근으로 조정한 것 70 g 및 탈이온수 230 g 을 잘 혼합하여, 앞서 회수한 균체를 균일하게 분산시킨다. 6 L 용의 나스형 플라스크에 이온 교환수지(Amberlite IRA-96SBC 1형 오르가노사 제품, 평균 입자 지름 0.5 mm) 300 ㎖ 와 0.5 인치의 테플론 구 200개를 넣어, 여기에 먼저 수득한 균체 분산액의 1/6을 넣어, 30 ℃에서 회전하면서 증발장치에서 1시간 건조하고, 균체를 이온 교환수지에 피복시켰다. 이 조작을 6회 수행한 다음, 테플론구을 제거하여, 비드 모양의 고정화 아스파타제를 수득하였다. 이 고정화 아스파타제의 활성은 354 U 이었다.

전술한 바와 같이, 조제한 고정화 아스파타제를 20 % 푸마르산암모니움 용액(pH 8.3)에 4 ℃에서 하룻밤 침지(浸漬)한 다음, 그 50 ㎖를 직경 1 ㎝ 칼럼에 충진하였다. 고정화 아스파타제의 충진층 길이는 약 64 ㎝ 이었다. 이 칼럼의 외부를 발포 폴리스티렌 보온재로 보온함으로써 반응기를 단열하였다. 이 칼럼에 20 ℃의 항온수조에서 보온한 20 ℃의 기질액 (1 L 중에 200 g의 푸마르산, 200 g의 25 % 암모니아수, 0.25 g 의 MgSO₄ㆍ7H₂O 및 암모니아로 pH 8.3으로 조제)을 단열재를 감싼 테플론튜브를 통하여 매시간 100 ㎖의 속도(LHVS=2.0)으로 통액시켜 연속반응액을 수행하였다.

반응개시 후 3시간째에 반응액을 분석하였는데, 반응생성물로서 소비된 푸마르산과 거의 동일한 몰의 L-아스파라긴산이 생성되고, 그 반응 전환율은 99.77 % 이었는데, 이 때 용출액의 온도는 33 ℃이었다. 또한, 반응개시후 7일째, 1개월 후의 변환율도 99.7 %를 유지하였다. 이 칼럼에 20 ℃의 물을 통액시켜 고정화 아스파타제의 압력손실을 측정하였는 바, LHVS=20(1L/hr)일 때 0.8 ㎏/㎠/1 m 고정화 아스파타제층 길이로 확인되었다.

실시예 2:

슈도모나스ㆍ플루오레슨스 아스파타제의 재조합 대장균 PUaspP1주를 상기 표 1에 표시된 배지에 앰피실린 100 ppm을 함유하는 배지 3 ㎖를 넣은 시험관 10개에 접종하여 37℃에서 8시간 배양한 후, 상기 표 3의 배지에 앰피실린 100 ppm와 IPTG를 1 mM의 농도로 첨가한 배지 100 ㎖를 넣은 사카쿠치 플라스크 10개에 각각 1개 씩 접종하고 30 ℃에서 하룻밤 진탕배양한 다음, 균체를 원심분리함으로써 회수하였다. 이 균체의 아스파타제 활성을 측정하였는 바, 0.85 moles L-아스파라긴산 생성/hr/g 균체로 확인되었다.

실시예 1과 동일한 방법으로 균체를 고정화하여 고정화 아스파타제를 수득하였다. 이 고정화 아스파타제의 활성은 2800 U로 확인되었다. 조제한 고정화 아스파타제를 20 % 푸마르산암모니움 용액(pH 8.3)에 4 ℃에서 하룻밤 침지(浸漬)한 다음, 그 10 ㎖를 직경 1 ㎝ 칼럼에 충진하였다. 고정화 아스파타제의 충진층 길이는 약 13 ㎝ 이었다. 이 칼럼을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 연속반응을 수행하였는데, 기질액의 온도는 20 ℃이고, 또한 그 통액속도는 매시간 100 ㎖(LHVS=10.0)으로 수행하였다. 반응개시 후 3시간 째에 반응액을 분석하였는데++++++, 반응생성물로서 소비된 푸마르산과 거의 동일한 몰의 L-아스파라긴산이 생성되고, 그 반응 전환율은 99.6 % 이었는데, 이 때 용출액의 온도는 33 ℃이었다. 또한, 반응개시후 7일째, 1개월 후의 변환율도 99.5 %를 유지하였다.

실시예 3:

슈도모나스ㆍ플루오레슨스 아스파타제의 재조합 대장균 PUaspP1주를 상기 표 1에 표시된 배지에 앰피실린 100 ppm을 함유하는 배지 3 ㎖를 넣은 시험관 10개에 접종하여 37℃에서 8시간 배양한 후, 상기 표 3의 배지에 앰피실린 100 ppm와 IPTG를 1 mM의 농도로 첨가한 배지 100 ㎖를 넣은 사카쿠치 플라스크 10개에 각각 1개 씩 접종하고 30 ℃에서 하룻밤 진탕배양한 다음, 균체를 원심분리함으로써 회수하였다.

이 균체의 아스파타제 활성을 측정하였는 바, 0.85 moles L-아스파라긴산 생성/hr/g 균체로 확인되었다. 고정화에 사용한 균체량을 이등분하는 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 균체를 고정화하여, 고정화 아스파타제를 수득하였다. 이 고정화 아스파타제의 활성은 560 U이었다. 조제한 고정화 아스파타제를 20 % 푸마르산암모니움 용액(pH 8.3)에 4 ℃에서 하룻밤 침지(浸漬)한 다음, 그 10 ㎖를 직경 1 ㎝ 칼럼에 충진하고 23 ℃의 항온수조에서 보온한 23 ℃의 기질액을 이용하는 것 이외에는, 실시예 2와 동일한 방법으로 연속반응을 수행하였다. 기질액의 통액속도는 매시간 100 ㎖(LHVS=10.0)으로 수행하였다.

반응개시 후 3시간 째에 반응액을 분석하였는데, 반응생성물로서 소비된 푸마르산과 거의 동일한 몰의 L-아스파라긴산이 생성되고, 그 반응 전환율은 99.6 % 이었는데, 이 때 용출액의 온도는 36 ℃이었다. 또한, 반응개시후 7일째, 1개월 후의 변환율도 99.5 %를 유지하였다.

실시예 4:

대장균 아스파타제의 재조합 대장균 PUaspE2주를 상기 표 1에 표시된 배지에 앰피실린 100 ppm을 함유하는 배지 3 ㎖를 넣은 시험관 10개에 접종하여 37℃에서 8시간 배양한 후, 표 3의 배지에 앰피실린 100 ppm와 IPTG를 1 mM를 첨가한 배지 100 ㎖를 넣은 사카쿠치 플라스크 10개에 각각 1개 씩 접종하고 30 ℃에서 하룻밤 진탕배양한 다음, 균체를 원심분리함으로써 회수하였다. 이 균체의 아스파타제 활성을 측정하였는 바, 1.27 moles L-아스파라긴산 생성/hr/g 균체로 확인되었다.

실시예 1과 동일한 방법으로 균체를 고정화하여, 고정화 아스파타제를 수득하였다. 이 고정화 아스파타제의 활성은 3200 U로 확인되었다. 조제한 고정화 아스파타제를 20 % 푸마르산암모니움 용액(pH 8.3)에 4 ℃에서 하룻밤 침지(浸漬)한 다음, 그 10 ㎖를 직경 1 ㎝ 칼럼에 충진하고 실시예 1과 동일한 방법으로 연속반응을 수행하였다. 기질액의 온도는 20 ℃이고, 또한 그 통액속도는 매시간 100 ㎖ (LHVS=10.0)으로 수행하였다. 반응개시 후 3시간 째에 반응액을 분석하였는데, 반응생성물로서 소비된 푸마르산과 거의 동일한 몰의 L-아스파라긴산이 생성되고, 그 반응 전환율은 99.6 % 을 유지하였는데, 이 때 유출액의 온도는 33 ℃이었다.

또한, 반응개시후 7일 후, 1 개월 후의 변환율도 99.6 % 이었다. 이 고정화 아스파타제에 20 ℃의 물을 통액시켜 고정화 아스파타제의 압력손실을 측정하였는 바, LHSV=20(1L/hr)일 때 0.7 ㎏/㎠/1m 고정화 아스파타제 층 길이 이었다.

실시예 5:

실시예 4와 동일한 방법으로, 대장균 아스파타제 재조합 대장균 PUaspE2주를 배양하고, 균체를 회수하였다. 이 균체의 아스파타제 활성을 측정하였는 바, 1.00 moles L-아스파라긴산 생성/hr/g 균체로 확인되었다. 수득한 균체의 1/10 을 이용하는 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 고정화 아스파타제를 수득하였다. 이 아스파타제 활성은 265 U 이었다.

조제한 고정화 아스파타제를 20 % 푸마르산암모니움 용액(pH 8.3)에 4 ℃에서 하룻밤 침지(浸漬)한 다음, 그 10 ㎖를 직경 1 ㎝ 칼럼에 충진하고 실시예 1과 동일한 방법으로 연속반응을 수행하였는데, 기질액의 온도는 20 ℃이고, 또한 그 통액속도는 매시간 20 ㎖(LHVS=2.0)으로 수행하였다. 반응개시 후 3시간 째에 반응액을 분석하였는데, 반응생성물로서 소비된 푸마르산과 거의 동일한 몰의 L-아스파라긴산이 생성되고, 그 반응 전환율은 99.2 % 이었는데, 이 때 유출액의 온도는 31 ℃이었다. 또한, 반응개시후 7일째, 1개월 후의 변환율도 99.2 %를 유지하였다.

실시예 6:

실시예 4와 동일한 방법으로, 대장균 아스파타제 재조합 대장균 PUaspE2주를 배양하고, 균체를 회수하였다. 이 균체의 아스파타제 활성을 측정하였는 바, 1.20 moles L-아스파라긴산 생성/hr/g 균체로 확인되었다. 수득한 균체를 이용한 실시예 1과 동일한 방법으로 고정화 아스파타제를 수득하였다. 이 고정화 아스파타제 활성은 3600 U 이었다. 조제한 고정화 아스파타제를 20 % 푸마르산암모니움 용액(pH 8.3)에 4 ℃에서 하룻밤 침지(浸漬)한 다음, 그 10 ㎖를 직경 1 ㎝ 칼럼에 충진하고 실시예 1과 동일한 방법으로 연속반응을 수행하였는데, 기질액의 온도는 20 ℃이고, 또한 그 통액속도는 매시간 200 ㎖(LHVS=20.0)으로 수행하였다. 반응개시 후 3시간 째에 반응액을 분석하였는데, 반응생성물로서 소비된 푸마르산과 거의 동일한 몰의 L-아스파라긴산이 생성되고, 그 반응 전환율은 97.0 % 이었는데, 이 때 유출액의 온도는 33 ℃이었다. 또한, 반응개시후 7일째, 1개월 후의 변환율도 97.0 %를 유지하였다.

실시예 7:

실시예 4와 동일한 방법으로, 대장균 아스파타제 재조합 대장균 PUaspE2주를 배양하여 균체를 회수하였다. 이 균체의 아스파타제 활성을 측정하였는 바, 1.20 moles L-아스파라긴산 생성/hr/g 균체로 획인되었다. 수득한 균체를 이용하는 실시예 1과 동일한 방법으로 고정화 아스파타제를 수득하였다. 이 고정화 아스파타제 활성은 3600 U 이었다. 조제한 고정화 아스파타제를 20 % 푸마르산암모니움 용액(pH 8.3)에 4 ℃에서 하룻밤 침지(浸漬)한 다음, 그 10 ㎖를 직경 1 ㎝ 칼럼에 충진하고 실시예 1과 동일한 방법으로 연속반응을 수행하였는데, 기질액의 온도는 20 ℃이고, 또한 그 통액속도는 매시간 250 ㎖(LHVS=25.0)으로 수행하였다. 반응개시 후 3시간 째에 반응액을 분석하였는데, 반응생성물로서 소비된 푸마르산과 거의 동일한 몰의 L-아스파라긴산이 생성되고, 그 반응 전환율은 90.0 % 이었는데, 이 때 용출액의 온도는 31 ℃이었다. 또한, 반응개시후 7일째, 1개월 후의 변환율도 90.0 %를 유지하였다.

실시예 8:

실시예 4와 동일한 방법으로, 대장균 아스파타제 재조합 대장균 PUaspE2주를 배양하고, 고정화하는 조작을 2회 수행하고 고정화 아스파타제 약 600 ㎖를 조제하였다. 이 고정화 아스파타제 활성은 3000 U 이었다. 이 고정화 아스파타제를 20 % 푸마르산암모니움 용액(pH 8.3)에 1시간 담근 후 직경 1 인치의 칼럼에 충진하였다. 충진한 고정화 아스파타제는 500 ㎖ 이고, 충진층 길이는 80 ㎝이었다. 이 칼럼을 사용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 연속반응을 수행하였다. 기질액의 온도는 24 ℃이고, 또한 그 통액속도는 매시간 5 L(LHVS=10)으로 수행하였다. 반응개시 후 2시간 째에 반응액을 분석하였는데, 반응생성물로서 소비된 푸마르산과 거의 동일한 몰의 L-아스파라긴산이 생성되고, 그 반응 전환율은 99.4 % 이었다. 반응 개시 3시간 째에 통액속도를 매시간 10 L(LHSV=2.0)으로 변경하였다. 반응개시 4시간 째에 반응액을 분석하였는데, 반응생성물로서 소비된 푸마르산과 거의 동일한 몰의 L-아스파라긴산이 생성되고, 그 변환율은 98.2 % 이었다. 반응 개시 5시간 째에 유통속도를 매시간 12.5 L(LHSV=25)로 변경되었다. 반응개시 후 6시간째에 반응액을 분석하였는데, 반응생성물로서 소비된 푸마르산과 거의 동일한 몰의 L-아스파라긴산이 생성되고, 그 변환율은 96.3 %이었다. 반응개시 7일 째에 유통속도를 매시간 15L(LHSV=30)으로 변경하였다. 반응 개시 8시간 째에 반응액을 분석하였는데, 반응생성물로서 소비된 푸마르산과 거의 동일한 몰의 L-아스파라긴산이 생성되고, 그 변환율은 93.8 %이었다. 반응개시 9일 째에 유통속도를 매시간 17.5L(LHSV=35)로 변경하였다. 반응개시 10시간 째에 반응액을 분석하였는데, 반응생성물로서, 소비된 푸마르산과 거의 동일한 몰의 L-아스파라긴산이 생성되고, 그 변환율은 90.3 %이었다. 반응개시 11 시간 째에 반응액을 분석하였는데, 반응생성물로서 소비된 푸마르산과 거의 동일한 몰의 L-아스파라긴산이 생성되고, 그 변환율은 85.8 % 이었다.

비교예 1:

대장균 K-12 주(IFO3301)을 상기 표 3에 표시한 배지 3 ㎖를 넣은 실험관 10개에 접종하여, 37 ℃에서 8시간 배양한 다음, 상기 표 3의 배지 100 ㎖를 넣은 사카구치 플라스크 10 개에 각각 1개씩 접종하고, 30 ℃에서 하룻밤 진탕배양한 다음, 균체를 원심분리함으로써 회수하였다. 이 균체의 아스파타제 활성을 측정하였는 바, 0.063 moles L-아스파라긴산 생성/hr/g 균체로 확인되었다. 수득한 균체를 이용한 실시예 1과 동일한 방법으로, 고정화 아스파타제를 수득하였다. 이 고정화 아스파타제 활성은 126 U 이었다. 조제한 고정화 아스파타제를 20 % 푸마르산암모니움 용액(pH 8.3)에 4℃에서 하룻밤 침지한 다음, 그 10 ㎖를 직경 1 ㎝의 칼럼에 충진하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 연속반응을 실행하였는데, 기질액의 온도는 20 ℃이고, 또한 그 유통속도는 매시간 20 ㎖(LHSV=2.0)으로 수행하였다. 반응개시 후 3시간 째에 반응액을 분석하였는데, 반응생성물로서 소비된 푸마르산과 거의 동일한 몰의 L-아스파라긴산이 생성되고, 그 변환율은 86.4 % 이었는데, 이 때 유출액의 온도는 31 ℃이었다. 또한, 반응개시 후 7일 째의 변환율은 86.8%, 1개월 후의 변환율은 86.2 %이었다.

비교예 2:

실시예 5와 동일한 방법으로 수행하여, 대장균 아스파타제 재조합 대장균 PUasp E1 주를 배양하고, 고정화 아스파타제를 조제하였다. 이 고정화 아스파타제의 활성은 263 U 이었다.

항온수조의 온도를 30 ℃로 하는 것 이외에는, 실시예 1과 동일한 방법으로 항온한 30 ℃의 기질액(1L 중에 200 g의 푸마르산, 200 g의 25 %암모니아수, 0.25 g의 MgSO₄ㆍ7H₂O 및 암모니아로 pH 8.3으로 조제)을 단열재로 감싼 테플론튜브를 통해서 매시간 20 ㎖(LHVS=2.0)의 속도로 통액시켜 연속반응을 수행하였다. 반응개시 후 3시간 째에 반응액을 분석하였는데, 반응생성물로서 소비된 푸마르산과 거의 동일한 몰의 L-아스파라긴산이 생성되고, 그 반응변환율은 99.7 %이었는데, 이 때 용출액의 온도는 43 ℃이었다. 반응개시 후 7일 째의 변환율은 95.4 %, 1개월후의 변환율은 77.6 %이었다.

비교예 3:

실시예 4와 동일한 방법으로, 대장균 아스파타제 재조합 대장균 PUaspE2 주를 배양한 다음, 균체를 회수하였다. 이 균체의 아스타파제 활성을 측정하였는 바 1.20 moles L-아스파라긴산 생성/hr/g 균체로 확인되었다. 수득한 균체를 이용한 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 고정화 아스파타제를 수득하였다. 이 고정화 아스파타제 활성은 3500 U 이었다. 조제한 고정화 아스파타제를 20 % 푸마르산암모니움 용액(pH 8.3)에 4℃에서 하룻밤 침지한 다음, 그 10 ㎖를 직경 1 ㎝의 칼럼에 충진하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 실행하여 연속반응을 수행하였다. 기질액의 온도는 20 ℃이고, 또한 그 유통속도는 매시간 300 ㎖(LHVS=30.0)으로 수행하였다. 반응개시후 3시간째에 반응액을 분석하였는데, 반응생성물로서 소비된 푸마르산과 거의 동일한 몰의 L-아스파라긴산이 생성되고 그 변환율은 75.0 % 이었다. 이 때 유출액의 온도는 31 ℃이었다. 또한, 반응개시후 7일 째, 1개월 후도 변환율 75.0 %를 유지하였다.

본 발명의 방법에 의하면, 고 아스파타제 활성을 가지는 미생물을 이용함으로써 L-아스파라긴산을 고수율로 수득할 수 있다.

Claims

아스파타제를 함유한 균체를 고정화하여 작제한 고정화 아스파타제를 충진한 반응기에 푸마르산암모니움을 통과시켜 L-아스파라긴산을 제조하는 방법에 있어서, 250U 이상의 활성을 가지는 고정화 아스파타제를 사용하고, 반응기로의 푸마르산암모니움 용액의 통액속도를 LHSV=2 내지 35로 하는 것을 특징으로 하는 L-아스파라긴산의 제조방법.
제 1항에 있어서,

반응기에 도입하는 푸마르산암모니움 용액의 온도를 다음 식으로 나타내어지는 온도 이하로 하는 것을 특징으로 하는 L-아스파라긴산의 제조방법:

(아스파타제의 안정성이 악화되는 온도)-(그 아스파타제와 푸마르산암모니움과의 반응열에 의한 푸마르산암모니움 용액의 상승온도).
제 1항에 있어서,

반응기에 도입하는 푸마르산암모니움용액의 온도를 10 내지 33℃로 하는 것을 특징으로 하는 L-아스파라긴산의 제조방법.
제 1항에 있어서,

아스파타제를 함유하는 균체가 아스파타제유전자를 재조합한 DNA에 의해 도입한 재조합체 균체인 것을 특징으로 하는 L-아스파라긴산의 제조방법.
제 1항 내지 제 4항에 있어서,

고정화 아스파타제가 구상담체에 제 1항 또는 제 4항의 아스파타제를 함유하는 균체를 고분자로 피복함으로써 고정화하게 되는 것을 특징으로 하는 L-아스파라긴산의 제조방법.
제 1항 내지 제 5항에 있어서,

고정화 아스파타제가 구상의 스틸렌디비닐벤젠 공중합체 이온 교환수지담체에 다음 일반식(Ⅰ)로 나타내는 고분자와 제 1항 또는 제 4항의 아스파타제를 함유하는 균체를 혼합한 것을 피복함으로써 고정화하게 되는 것을 특징을 하는 L-아스파라긴산의 제조방법:

상기 식에서,

Y는 직접 결합하거나,또는로

표시되는 2가기이고;

R1 및 R2는 상호 독립적으로 수소원자 또는 유기잔기이며;

X는 음이온을 나타내고; 및,

n 은 100 내지 5000의 수이다.
제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 있어서,

고정화 아스파타제의 압력 손실이 LHSV=20일 때에 2.0㎏/㎠/m 고정화 아스파타제층 길이(물, 20℃)이하인 고정화 아스파타제를 이용하는 것을 특징으로 하는 L-아스파라긴산의 제조방법.