JP3179058B2 - 固定化生体触媒 - Google Patents
固定化生体触媒Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規固定化生体触
媒及びその使用に関する。
媒及びその使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】固定化生体触媒としては、固体担体の表
面に物理的吸着、イオン結合又は共有結合により酵素又
は微生物を結合したもの、菌体等の酵素含有物を相互に
架橋したもの、酵素や酵素含有物を格子やマイクロカプ
セルに包括したもの、等が知られている。また、これら
とは異るタイプの固定化触媒として、特開平５−３４４
８９８号公報には、固体担体表面上でポリアゼチジンプ
レポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリウレタ
ンヒドロゲルプレポリマー又はポリメチレンイソシアネ
ートを硬化せしめることにより微生物細胞を該固体表面
上に固定する方法が記載されている。しかしながら、こ
の方法においては固定化時における酵素の失活が大きい
などの問題点がある。
面に物理的吸着、イオン結合又は共有結合により酵素又
は微生物を結合したもの、菌体等の酵素含有物を相互に
架橋したもの、酵素や酵素含有物を格子やマイクロカプ
セルに包括したもの、等が知られている。また、これら
とは異るタイプの固定化触媒として、特開平５−３４４
８９８号公報には、固体担体表面上でポリアゼチジンプ
レポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリウレタ
ンヒドロゲルプレポリマー又はポリメチレンイソシアネ
ートを硬化せしめることにより微生物細胞を該固体表面
上に固定する方法が記載されている。しかしながら、こ
の方法においては固定化時における酵素の失活が大きい
などの問題点がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明は、上記
の欠点を解消した新規な固定化生体触媒を提供しようと
するものである。
の欠点を解消した新規な固定化生体触媒を提供しようと
するものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の特許
を解決すべき種々検討した結果、酸性において水溶性で
ありアルカリ性において不溶性となるポリアリルアミン
系ポリマーにより酵素含有細胞を固体担体に結合させる
ことにより、上記の欠点を有さず、且つ酵素活性を長時
間にわたって安定に維持することができる固定化生体触
媒が得られることを見出し、本発明を完成した。従って
本発明は、水不溶性固体担体上に、次の一般式：
を解決すべき種々検討した結果、酸性において水溶性で
ありアルカリ性において不溶性となるポリアリルアミン
系ポリマーにより酵素含有細胞を固体担体に結合させる
ことにより、上記の欠点を有さず、且つ酵素活性を長時
間にわたって安定に維持することができる固定化生体触
媒が得られることを見出し、本発明を完成した。従って
本発明は、水不溶性固体担体上に、次の一般式：
【０００５】
【化４】 （式中、Ｙは直接結合であるか、又は次の式：
【０００６】
【化５】 により表わされる２価基であり、Ｒ1 及びＲ2 は相互に
独立に水素原子又は有機残基であり、
独立に水素原子又は有機残基であり、
【０００７】
【化６】 は陰イオンであり、そしてｎは１００〜５０００の数で
ある）により表わされるポリマーにより、酵素を含有す
る細胞を固定化して成る固定化生体触媒を提供する。
ある）により表わされるポリマーにより、酵素を含有す
る細胞を固定化して成る固定化生体触媒を提供する。
【０００８】本発明はまた、上記の細胞としてアスパル
ターゼもしくはアスパルターゼとマレイン酸イソメラー
ゼの両者を含有する細胞、あるいはアスパルターゼを含
有する細胞とマレイン酸イソメラーゼを含有する細胞と
の組合せを用いる固定化生体触媒に、フマル酸とアンモ
ニアもしくはフマル酸アンモニウム又はマレイン酸とア
ンモニアもしくはマレイン酸アンモニウムを接触せしめ
ることを特徴とする、Ｌ−アスパラギン酸の製造方法を
提供する。
ターゼもしくはアスパルターゼとマレイン酸イソメラー
ゼの両者を含有する細胞、あるいはアスパルターゼを含
有する細胞とマレイン酸イソメラーゼを含有する細胞と
の組合せを用いる固定化生体触媒に、フマル酸とアンモ
ニアもしくはフマル酸アンモニウム又はマレイン酸とア
ンモニアもしくはマレイン酸アンモニウムを接触せしめ
ることを特徴とする、Ｌ−アスパラギン酸の製造方法を
提供する。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明の固定化生体触媒において
使用する担体としては、粒状物又はシート状物のいずれ
でもよく、例えば、粒状物としてはイオン交換樹脂、例
えばアニオン交換樹脂である（オルガノ（株）製）アン
バーライトＩＲＡ−９０４，ＩＲＡ−９４Ｓ、アンバー
リストＡ−２６，Ａ−２７、カチオン交換樹脂である
（オルガノ（株）製）アンバーライト２００Ｃ，２０１
Ｂ，ＩＲＣ−５０，ＩＲＣ−７６等が使用される；無機
担体、例えばモレキュラーシーブ、アルミナ、シリカ、
シリカゲル等が使用される。粒状物の粒径は、０．１mm
〜１０mmが好ましく、さらに好ましくは０．３mm〜３mm
である。またシート状物としてはイオン交換膜やアルミ
ナやシリカのシート等が使用される。シート状物の厚さ
は、０．０１mm〜１０mmが好ましくさらに好ましくは
０．１mm〜５mmである。本発明において細胞を固定化す
るために使用する樹脂としては、次の一般式：
使用する担体としては、粒状物又はシート状物のいずれ
でもよく、例えば、粒状物としてはイオン交換樹脂、例
えばアニオン交換樹脂である（オルガノ（株）製）アン
バーライトＩＲＡ−９０４，ＩＲＡ−９４Ｓ、アンバー
リストＡ−２６，Ａ−２７、カチオン交換樹脂である
（オルガノ（株）製）アンバーライト２００Ｃ，２０１
Ｂ，ＩＲＣ−５０，ＩＲＣ−７６等が使用される；無機
担体、例えばモレキュラーシーブ、アルミナ、シリカ、
シリカゲル等が使用される。粒状物の粒径は、０．１mm
〜１０mmが好ましく、さらに好ましくは０．３mm〜３mm
である。またシート状物としてはイオン交換膜やアルミ
ナやシリカのシート等が使用される。シート状物の厚さ
は、０．０１mm〜１０mmが好ましくさらに好ましくは
０．１mm〜５mmである。本発明において細胞を固定化す
るために使用する樹脂としては、次の一般式：
【００１０】
【化７】 （式中、Ｙは直接結合であるか、又は次の式：
【００１１】
【化８】 により表わされる２価基であり、Ｒ1 及びＲ2 は相互に
独立に水素又は有機残基であり、
独立に水素又は有機残基であり、
【００１２】
【化９】 は陰イオンを表わし、そしてｎは１００〜５０００の数
である）により表わされるポリマーが使用される。
である）により表わされるポリマーが使用される。
【００１３】式中、Ｒ1 及びＲ2 の有機残基としては、
炭素数１０個以下のアルキル基が挙げられ、メチル基、
エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチ
ル基、イソブチル基、ｔｅｒ−ブチル基等であり、メチ
ル基が特に好ましい。さらに、ハロゲンやヒドロキシル
の置換した有機残基を使用することができ４−クロロ−
２−ジメチルペンチル基、３−エチル−２，５−ジクロ
ロヘプチル基、２−ヒドロキシ−３，５−ジメチルノニ
ル基などであり、特に、３−クロロ−２−ヒドロキシプ
ロピル基が好ましい。
炭素数１０個以下のアルキル基が挙げられ、メチル基、
エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチ
ル基、イソブチル基、ｔｅｒ−ブチル基等であり、メチ
ル基が特に好ましい。さらに、ハロゲンやヒドロキシル
の置換した有機残基を使用することができ４−クロロ−
２−ジメチルペンチル基、３−エチル−２，５−ジクロ
ロヘプチル基、２−ヒドロキシ−３，５−ジメチルノニ
ル基などであり、特に、３−クロロ−２−ヒドロキシプ
ロピル基が好ましい。
【００１４】Ｘ- としてはハロゲンイオン、例えば
Ｆ- 、Ｃｌ- 、Ｂｒ- 、Ｉ- が挙げられ特にＣｌ- が好
ましい。さらに、他の一価の陰イオン、例えばＮＯ3 -
などを使用することもできる。ｎは好ましくは１００〜
５０００である。具体的なポリマーとしては、次の構造
式により示されるものが挙げられる。
Ｆ- 、Ｃｌ- 、Ｂｒ- 、Ｉ- が挙げられ特にＣｌ- が好
ましい。さらに、他の一価の陰イオン、例えばＮＯ3 -
などを使用することもできる。ｎは好ましくは１００〜
５０００である。具体的なポリマーとしては、次の構造
式により示されるものが挙げられる。
【００１５】
【化１０】
【００１６】式（Ａ）のポリマーは、例えば商品名ＰＡ
Ｓ４１０として、式（Ｃ）のポリマーは例えば商品名Ｐ
ＡＳ−Ｍ−１として、式（Ｄ）のポリマーは例えば商品
名ＰＡＳ−８８０として、式（Ｅ）のポリマーは例えば
商品名ＰＡＳ−Ｈ−５Ｌとして、日東紡績株式会社から
入手することができる。また、例えば式（Ａ）のポリマ
ーは、ジアリルアミン塩（例えば塩酸塩）とマレイン酸
の１：１共重合により製造することができ、式（Ｃ）の
ポリマーはジアリルモノアルキルアミンの共重合又はラ
ジカル重合により、製造することができる。
Ｓ４１０として、式（Ｃ）のポリマーは例えば商品名Ｐ
ＡＳ−Ｍ−１として、式（Ｄ）のポリマーは例えば商品
名ＰＡＳ−８８０として、式（Ｅ）のポリマーは例えば
商品名ＰＡＳ−Ｈ−５Ｌとして、日東紡績株式会社から
入手することができる。また、例えば式（Ａ）のポリマ
ーは、ジアリルアミン塩（例えば塩酸塩）とマレイン酸
の１：１共重合により製造することができ、式（Ｃ）の
ポリマーはジアリルモノアルキルアミンの共重合又はラ
ジカル重合により、製造することができる。
【００１７】本発明で使用する細胞としては、所望の酵
素を含有する任意の細胞を使用することができ、例えば
細菌、酵母、藻類、糸状菌等の微生物細胞、植物細胞等
が使用できる。酵素としては、特に限定されないが、例
えばフマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギン酸に転換
するアスパルターゼ、マレイン酸をフマル酸に転換する
マレイン酸イソメラーゼ、フマル酸をＬ−リンゴ酸に転
換するフマラーゼ、マレイン酸をＤ−リンゴ酸に転換す
るマレアーゼ、シスエポキシコハク酸をＬ−酒石酸に転
換するヒドラターゼ等、種々の酵素が挙げられる。より
具体的な細胞の例として、アスパルターゼを含有する細
菌細胞、マレイン酸イソメラーゼを含有する細菌細胞、
アスパルターゼとマレイン酸イソメラーゼの両方を含有
する細菌細胞等が使用される。さらに、具体的には、例
えば次のような微生物の細胞を使用することができる。
素を含有する任意の細胞を使用することができ、例えば
細菌、酵母、藻類、糸状菌等の微生物細胞、植物細胞等
が使用できる。酵素としては、特に限定されないが、例
えばフマル酸アンモニウムをＬ−アスパラギン酸に転換
するアスパルターゼ、マレイン酸をフマル酸に転換する
マレイン酸イソメラーゼ、フマル酸をＬ−リンゴ酸に転
換するフマラーゼ、マレイン酸をＤ−リンゴ酸に転換す
るマレアーゼ、シスエポキシコハク酸をＬ−酒石酸に転
換するヒドラターゼ等、種々の酵素が挙げられる。より
具体的な細胞の例として、アスパルターゼを含有する細
菌細胞、マレイン酸イソメラーゼを含有する細菌細胞、
アスパルターゼとマレイン酸イソメラーゼの両方を含有
する細菌細胞等が使用される。さらに、具体的には、例
えば次のような微生物の細胞を使用することができる。
【００１８】
【表１】
【００１９】これら微生物の細胞を培養した培養液に先
の一般式（化４）で示されるポリマーを低濃度で添加す
ると、培養菌体を凝縮沈降させることができ、大量の培
養液を遠心分離にかける必要がなくなるため操作が簡易
となる。具体的には、固定化する微生物を培養した培養
液に、先の一般式（化４）で示されるポリマーを固型分
濃度として１０〜１００００ppm になるように、好まし
くは１００〜１０００ppm になるように添加し、静置す
ると微生物菌体が凝集し、沈降する。この時、あらかじ
め培養液を冷却しておけば、目的の酵素活性の低下を防
ぐのに有効である。
の一般式（化４）で示されるポリマーを低濃度で添加す
ると、培養菌体を凝縮沈降させることができ、大量の培
養液を遠心分離にかける必要がなくなるため操作が簡易
となる。具体的には、固定化する微生物を培養した培養
液に、先の一般式（化４）で示されるポリマーを固型分
濃度として１０〜１００００ppm になるように、好まし
くは１００〜１０００ppm になるように添加し、静置す
ると微生物菌体が凝集し、沈降する。この時、あらかじ
め培養液を冷却しておけば、目的の酵素活性の低下を防
ぐのに有効である。
【００２０】このようにして、微生物菌体を沈降させた
後、上澄みを抜き出すことによって液量を数分の１に減
らすことが出来る。例えば、１Ｌの培養液にＰＡＳ−８
８０を５００ppm 添加して、３０分静置すると、約８０
０mlが上澄みとして分離される。残りの菌体凝集液を３
０００rpm の低速遠心分離器にかけると、菌体をケーキ
として回収することが出来る。このように凝集した菌体
は低速遠心機でも十分に遠心分離できるため、簡易な装
置で菌体が回収出来るようになる。回収した菌体はその
まま、あるいは水を追加して、pH調節したポリマーと混
合することによって固定化の材料として使用することが
出来る。
後、上澄みを抜き出すことによって液量を数分の１に減
らすことが出来る。例えば、１Ｌの培養液にＰＡＳ−８
８０を５００ppm 添加して、３０分静置すると、約８０
０mlが上澄みとして分離される。残りの菌体凝集液を３
０００rpm の低速遠心分離器にかけると、菌体をケーキ
として回収することが出来る。このように凝集した菌体
は低速遠心機でも十分に遠心分離できるため、簡易な装
置で菌体が回収出来るようになる。回収した菌体はその
まま、あるいは水を追加して、pH調節したポリマーと混
合することによって固定化の材料として使用することが
出来る。
【００２１】細胞の固定に当っては１種類の細胞を固定
することもでき、又は複数種類の細胞を固定することも
できる。例えば、マレイン酸イソメラーゼを含有する細
菌細胞とアスパルターゼを含有する細菌細胞とを組合せ
て固定することができる。細胞の固定にあたっては、弱
酸性にした液状のポリマーに細胞を水と共に混合した
後、この混合物pHを中性〜塩基性にし、固体担体にまぶ
して乾燥すればよい。乾燥はロータリーエバポレータ
ー、流動床乾燥器、スプレードライヤー等、細胞中の酵
素が不活性化しない程度で操作できる常用の粒体乾燥機
を用いることができる。
することもでき、又は複数種類の細胞を固定することも
できる。例えば、マレイン酸イソメラーゼを含有する細
菌細胞とアスパルターゼを含有する細菌細胞とを組合せ
て固定することができる。細胞の固定にあたっては、弱
酸性にした液状のポリマーに細胞を水と共に混合した
後、この混合物pHを中性〜塩基性にし、固体担体にまぶ
して乾燥すればよい。乾燥はロータリーエバポレータ
ー、流動床乾燥器、スプレードライヤー等、細胞中の酵
素が不活性化しない程度で操作できる常用の粒体乾燥機
を用いることができる。
【００２２】１回の操作により固定化される細胞の量が
少ない場合には、固体担体にポリマー／細胞混合物をま
ぶす操作と乾燥操作を複数回、例えば２〜５回反復する
こともできる。固定化すべき細胞とポリマーとの比率は
細胞（乾物重量として）１kgに対してポリマー４kg〜２
００kg、好ましくは１０kg〜５０kgである。ポリマーと
細胞との混合物を調製する場合に添加する水の量は細胞
１kg当り５kg〜４００kg、好ましくは２０kg〜１００kg
である。固定化した後の細胞を含むポリマー層の厚さは
０．０１〜０．３mm、好ましくは０．１〜０．２mmであ
る。
少ない場合には、固体担体にポリマー／細胞混合物をま
ぶす操作と乾燥操作を複数回、例えば２〜５回反復する
こともできる。固定化すべき細胞とポリマーとの比率は
細胞（乾物重量として）１kgに対してポリマー４kg〜２
００kg、好ましくは１０kg〜５０kgである。ポリマーと
細胞との混合物を調製する場合に添加する水の量は細胞
１kg当り５kg〜４００kg、好ましくは２０kg〜１００kg
である。固定化した後の細胞を含むポリマー層の厚さは
０．０１〜０．３mm、好ましくは０．１〜０．２mmであ
る。
【００２３】固定化触媒を膜状にする場合は、前記のご
ときシート状担体に、上記の細胞／ポリマー混合物を塗
布した後乾燥すればよい。固定化された細胞の密度は、
塗布量、又は塗布−乾燥の反復回数の調整により調節す
ることができる。本発明の固定化生体触媒の応用例の１
つとしてＬ−アスパラギン酸の生産がある。この場合、
アスパルターゼを有する細胞、特に細菌細胞を固定化し
た固定化生体触媒をカラムに詰め、これにフマル酸とア
ンモニアとの水溶液、又はフマル酸アンモニウムの水溶
液を通過させればよい。
ときシート状担体に、上記の細胞／ポリマー混合物を塗
布した後乾燥すればよい。固定化された細胞の密度は、
塗布量、又は塗布−乾燥の反復回数の調整により調節す
ることができる。本発明の固定化生体触媒の応用例の１
つとしてＬ−アスパラギン酸の生産がある。この場合、
アスパルターゼを有する細胞、特に細菌細胞を固定化し
た固定化生体触媒をカラムに詰め、これにフマル酸とア
ンモニアとの水溶液、又はフマル酸アンモニウムの水溶
液を通過させればよい。
【００２４】また、アスパルターゼとマレイン酸イソメ
ラーゼとを有する細胞（例えば細菌細胞）を固定化した
固定化生体触媒、又はアスパルターゼを有する細胞とマ
レイン酸イソメラーゼを有する細胞の両者を１つの固定
化担体に固定化した固定化生体触媒をカラムに詰め、こ
れにマレイン酸とアンモニアとの水溶液又はマレイン酸
アンモニウムの水溶液を通過させることによりマレイン
酸から１段階の操作でＬ−アスパラギン酸を生成せしめ
ることができる。
ラーゼとを有する細胞（例えば細菌細胞）を固定化した
固定化生体触媒、又はアスパルターゼを有する細胞とマ
レイン酸イソメラーゼを有する細胞の両者を１つの固定
化担体に固定化した固定化生体触媒をカラムに詰め、こ
れにマレイン酸とアンモニアとの水溶液又はマレイン酸
アンモニウムの水溶液を通過させることによりマレイン
酸から１段階の操作でＬ−アスパラギン酸を生成せしめ
ることができる。
【００２５】また、マレイン酸イソメラーゼを有する細
胞を固定化した固定化生体触媒と、アスパルターゼを有
する細胞を固定化した固定化生体触媒の両者を混合しカ
ラムに詰め、これにマレイン酸とアンモニアとの水溶
液、又はマレイン酸アンモニウムの水溶液を通過させる
ことによりマレイン酸から１段階の操作でＬ−アスパラ
ギン酸を生成せしめることができる。
胞を固定化した固定化生体触媒と、アスパルターゼを有
する細胞を固定化した固定化生体触媒の両者を混合しカ
ラムに詰め、これにマレイン酸とアンモニアとの水溶
液、又はマレイン酸アンモニウムの水溶液を通過させる
ことによりマレイン酸から１段階の操作でＬ−アスパラ
ギン酸を生成せしめることができる。
【００２６】さらに、マレイン酸イソメラーゼを有する
細胞を固定化した固定化生体触媒と、アスパルターゼを
有する細胞を固定化した固定化生体触媒とを別々のカラ
ムに詰め、マレイン酸とアンモニアの水溶液、又はマレ
イン酸アンモニウムの水溶液を、まずマレイン酸イソメ
ラーゼを固定化した固定化生体触媒を通してマレイン酸
をフマル酸に転換した後、アスパルターゼを固定化した
固定化生体触媒のカラムを通してフマル酸アンモニウム
をＬ−アスパラギン酸に転換することができる。
細胞を固定化した固定化生体触媒と、アスパルターゼを
有する細胞を固定化した固定化生体触媒とを別々のカラ
ムに詰め、マレイン酸とアンモニアの水溶液、又はマレ
イン酸アンモニウムの水溶液を、まずマレイン酸イソメ
ラーゼを固定化した固定化生体触媒を通してマレイン酸
をフマル酸に転換した後、アスパルターゼを固定化した
固定化生体触媒のカラムを通してフマル酸アンモニウム
をＬ−アスパラギン酸に転換することができる。
【００２７】
【実施例】以下に本発明を実施例により詳細に説明する
が、本発明はこれに限定されるものではない。なお、反
応生成物は、液体クロマトブラフィーにより分析した。実施例１． 蒸留水１Ｌあたり１０ｇのフマル酸、５ｇの
（ＮＨ4)2 ＳＯ4 、１ｇのＫＨ2ＰＯ4 、３ｇのＫ2 Ｈ
ＰＯ4 、０．５ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、５．５ｇの
ＮａＯＨ及び２０ｇの酵母エキスの組成からなる培地
（pH６．３）３Ｌを５Ｌジャーファーメンターに仕込
み、エッシェリシア・コリ（Escherichia coli) ＡＴＣ
Ｃ１１３０３株を接種し、３７℃で通気攪拌培養を行っ
た。培養２０時間目に培養を終了し、菌体を遠心分離に
よって集めた。
が、本発明はこれに限定されるものではない。なお、反
応生成物は、液体クロマトブラフィーにより分析した。実施例１． 蒸留水１Ｌあたり１０ｇのフマル酸、５ｇの
（ＮＨ4)2 ＳＯ4 、１ｇのＫＨ2ＰＯ4 、３ｇのＫ2 Ｈ
ＰＯ4 、０．５ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、５．５ｇの
ＮａＯＨ及び２０ｇの酵母エキスの組成からなる培地
（pH６．３）３Ｌを５Ｌジャーファーメンターに仕込
み、エッシェリシア・コリ（Escherichia coli) ＡＴＣ
Ｃ１１３０３株を接種し、３７℃で通気攪拌培養を行っ
た。培養２０時間目に培養を終了し、菌体を遠心分離に
よって集めた。
【００２８】ＰＡＳ−８８０（日東紡績株式会社製）を
アルカリでpHを７付近にしたもの７０ｇ及び脱イオン水
２３０ｇをよく混合し、前記の菌体を均一に分散させ
た。６Ｌ容のナス型フラスコにイオン交換樹脂（アンバ
ーライトＩＲＡ−９４Ｓ Ｃｌ型オルガノ社製、平均粒
径０．５mm）３００mlと０．５インチのテフロン球２０
０個を入れ、ここに先に得た菌体分散液の１／６を入
れ、３０℃で回転させながらエバポレーターで１時間減
圧乾燥し、菌体をイオン交換樹脂に被覆させた。この操
作を６回行った後、テフロン球を除去してビーズ状の固
定化生体触媒を得た。
アルカリでpHを７付近にしたもの７０ｇ及び脱イオン水
２３０ｇをよく混合し、前記の菌体を均一に分散させ
た。６Ｌ容のナス型フラスコにイオン交換樹脂（アンバ
ーライトＩＲＡ−９４Ｓ Ｃｌ型オルガノ社製、平均粒
径０．５mm）３００mlと０．５インチのテフロン球２０
０個を入れ、ここに先に得た菌体分散液の１／６を入
れ、３０℃で回転させながらエバポレーターで１時間減
圧乾燥し、菌体をイオン交換樹脂に被覆させた。この操
作を６回行った後、テフロン球を除去してビーズ状の固
定化生体触媒を得た。
【００２９】前記において調製した固定化生体触媒を、
２０％フマル酸アンモニウム溶液（pH８．５）に４℃で
一晩浸したのち、その５０mlをジャケット付きカラムに
充填し、ジャケットに３０℃の温水を循環させて、反応
器の温度を３０℃に設定した。ふた付きビンに入れた基
質液（１Ｌ中に２００ｇのフマル酸、２００ｇの２５％
アンモニア水、０．２５ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ及び
１ｇの亜硫酸ナトリウム、アンモニアでpH８．３に調
製）をテフロンチューブを通して、毎時２５mlの速度で
カラムに流通させ連続反応を行った。
２０％フマル酸アンモニウム溶液（pH８．５）に４℃で
一晩浸したのち、その５０mlをジャケット付きカラムに
充填し、ジャケットに３０℃の温水を循環させて、反応
器の温度を３０℃に設定した。ふた付きビンに入れた基
質液（１Ｌ中に２００ｇのフマル酸、２００ｇの２５％
アンモニア水、０．２５ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ及び
１ｇの亜硫酸ナトリウム、アンモニアでpH８．３に調
製）をテフロンチューブを通して、毎時２５mlの速度で
カラムに流通させ連続反応を行った。
【００３０】反応開始後６時間目に反応液の分析を行っ
たところ、反応生成物として、消費フマル酸とほぼ等モ
ルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９
９．７％であった。また、反応開始後７日目、１ケ月目
及び４ケ月目の変換率も９９．７％を維持していた。な
お、固定化生体触媒の形状にも変化はなかった。
たところ、反応生成物として、消費フマル酸とほぼ等モ
ルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９
９．７％であった。また、反応開始後７日目、１ケ月目
及び４ケ月目の変換率も９９．７％を維持していた。な
お、固定化生体触媒の形状にも変化はなかった。
【００３１】実施例２〜４．実施例１と同様に操作した
が、固定化用ポリマーとしてＰＡＳ−８８０の代りに、
ＰＡＳ−Ｍ−１（実施例２）、ＰＡＳ−４１０（実施例
３）及びＰＡＳ−Ｈ−５Ｌ（実施例４）、を用いた。こ
れらの結果をまとめて表２に示す。
が、固定化用ポリマーとしてＰＡＳ−８８０の代りに、
ＰＡＳ−Ｍ−１（実施例２）、ＰＡＳ−４１０（実施例
３）及びＰＡＳ−Ｈ−５Ｌ（実施例４）、を用いた。こ
れらの結果をまとめて表２に示す。
【００３２】
【表２】 ７日間使用した後も、フマル酸からＬ−アスパラギン酸
への変換率は低下しなかった。
への変換率は低下しなかった。
【００３３】実施例５．実施例１と同様にエッシェリシ
アコリ（Escherichia coli) ＡＴＣＣ１１３０３株を培
養し、３７℃で通気攪拌培養を行った。培養２０時間目
に培地を１０℃に冷却し、ＰＡＳ−８８０ ３ｇを添加
して５分攪拌後、攪拌を止めて静置した。３０分後、菌
体が凝集して沈降したので、上澄み液約２．５Ｌを抜き
出した。残りの液を菌体とともに抜き出し、低速遠心分
離機によって湿菌体１２０ｇを回収した。ＰＡＳ−８８
０（日東紡績株式会社製）をアルカリでpH７付近にした
もの７０ｇ及び脱イオン水１７０ｇをよく混合し、前記
の菌体を均一に分散させた。６Ｌ容のナス型フラスコに
イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−９４Ｓ Ｃｌ
型オルガノ社製、平均粒径０．５mm）３００mlと０．５
インチのテフロン球２００個を入れ、ここに先に得た菌
体分散液の１／６を入れ、３０℃で回転させながらエバ
ポレーターで１時間減圧乾燥し、菌体をイオン交換樹脂
に被覆させた。この操作を６回行った後、テフロン球を
除去してビーズ状の固定化生体触媒を得た。
アコリ（Escherichia coli) ＡＴＣＣ１１３０３株を培
養し、３７℃で通気攪拌培養を行った。培養２０時間目
に培地を１０℃に冷却し、ＰＡＳ−８８０ ３ｇを添加
して５分攪拌後、攪拌を止めて静置した。３０分後、菌
体が凝集して沈降したので、上澄み液約２．５Ｌを抜き
出した。残りの液を菌体とともに抜き出し、低速遠心分
離機によって湿菌体１２０ｇを回収した。ＰＡＳ−８８
０（日東紡績株式会社製）をアルカリでpH７付近にした
もの７０ｇ及び脱イオン水１７０ｇをよく混合し、前記
の菌体を均一に分散させた。６Ｌ容のナス型フラスコに
イオン交換樹脂（アンバーライトＩＲＡ−９４Ｓ Ｃｌ
型オルガノ社製、平均粒径０．５mm）３００mlと０．５
インチのテフロン球２００個を入れ、ここに先に得た菌
体分散液の１／６を入れ、３０℃で回転させながらエバ
ポレーターで１時間減圧乾燥し、菌体をイオン交換樹脂
に被覆させた。この操作を６回行った後、テフロン球を
除去してビーズ状の固定化生体触媒を得た。
【００３４】前記において調製した固定化生体触媒を、
２０％フマル酸アンモニウム溶液（pH８．５）に４℃で
一晩浸したのち、その５０mlをジャケット付きカラムに
充填し、ジャケットに３０℃の温水を循環させて、反応
器の温度を３０℃に設定した。ふた付きビンに入れた基
質液（１Ｌ中に２００ｇのフマル酸、２００ｇの２５％
アンモニア水、０．２５ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ及び
１ｇの亜硫酸ナトリウム、アンモニアでpH８．３に調
製）をテフロンチューブを通して、毎時２５mlの速度で
カラムに流通させ連続反応を行った。
２０％フマル酸アンモニウム溶液（pH８．５）に４℃で
一晩浸したのち、その５０mlをジャケット付きカラムに
充填し、ジャケットに３０℃の温水を循環させて、反応
器の温度を３０℃に設定した。ふた付きビンに入れた基
質液（１Ｌ中に２００ｇのフマル酸、２００ｇの２５％
アンモニア水、０．２５ｇのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ及び
１ｇの亜硫酸ナトリウム、アンモニアでpH８．３に調
製）をテフロンチューブを通して、毎時２５mlの速度で
カラムに流通させ連続反応を行った。
【００３５】反応開始後６時間目に反応液の分析を行っ
たところ、反応生成物として、消費フマル酸とほぼ等モ
ルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９
９．７％であった。また、反応開始後７日目、１ケ月目
及び４ケ月目の変換率も９９．７％を維持していた。な
お、固定化生体触媒の形状にも変化はなかった。
たところ、反応生成物として、消費フマル酸とほぼ等モ
ルのＬ−アスパラギン酸が生成し、その反応変換率は９
９．７％であった。また、反応開始後７日目、１ケ月目
及び４ケ月目の変換率も９９．７％を維持していた。な
お、固定化生体触媒の形状にも変化はなかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 7/46 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 7/46 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 7/46 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/20 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/20 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 13/20 Ｃ１２Ｒ 1:06） (56)参考文献 特開 平５−344898（ＪＰ，Ａ) 特公 昭43−5891（ＪＰ，Ｂ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 11/00 - 11/18 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (5)
- 【請求項１】 水不溶性固体担体上に、次の一般式： 【化１】 （式中、Ｙは直接結合であるか、又は次の式： 【化２】 により表わされる２価基であり、Ｒ1 及びＲ2 は相互に
独立に水素原子又は有機残基であり、 【化３】 は陰イオンを表わし、そしてｎは１００〜５０００の数
である） により表わされるポリマーにより、酵素を含有する細胞
を固定して成る固定化生体触媒。 - 【請求項２】 前記担体がイオン交換樹脂又は無機担体
である、請求項１又は２に記載の固定化生体触媒。 - 【請求項３】 前記担体が粒状物、又はシートである、
請求項１〜２のいずれか１項に記載の固定化生体触媒。 - 【請求項４】 前記細胞が、アスパルターゼおよび／ま
たはマレイン酸イソメラーゼを含有する細菌細胞、並び
に該細菌細胞の組合せである請求項１〜３のいずれか１
項に記載の固定化生体触媒。 - 【請求項５】 フマル酸とアンモニアもしくはフマル酸
アンモニウム、又はマレイン酸とアンモニアもしくはマ
レイン酸アンモニウムあるいはマレイン酸を請求項４に
記載の固定化生体触媒上で反応せしめることを特徴とす
るＬ−アスパラギン酸あるいはフマル酸の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1580998A JP3179058B2 (ja) | 1997-02-14 | 1998-01-28 | 固定化生体触媒 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9-30647 | 1997-02-14 | ||
| JP3064797 | 1997-02-14 | ||
| JP1580998A JP3179058B2 (ja) | 1997-02-14 | 1998-01-28 | 固定化生体触媒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10286087A JPH10286087A (ja) | 1998-10-27 |
| JP3179058B2 true JP3179058B2 (ja) | 2001-06-25 |
Family
ID=26352025
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1580998A Expired - Fee Related JP3179058B2 (ja) | 1997-02-14 | 1998-01-28 | 固定化生体触媒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3179058B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69927315T2 (de) | 1998-02-13 | 2006-07-06 | Nippon Shokubai Co. Ltd. | Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure |
| WO2005095626A1 (ja) * | 2004-03-31 | 2005-10-13 | Nippon Soda Co., Ltd. | 固定化生体触媒およびそれを用いた有機酸塩の製造方法 |
| CN112195171A (zh) * | 2019-07-08 | 2021-01-08 | 秦皇岛华恒生物工程有限公司 | 一种利用固定化酶制备β-丙氨酸的方法 |
-
1998
- 1998-01-28 JP JP1580998A patent/JP3179058B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH10286087A (ja) | 1998-10-27 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |