DE69927315T2

DE69927315T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure

Info

Publication number: DE69927315T2
Application number: DE69927315T
Authority: DE
Inventors: Masaharu Tsukuba-gun Mukouyama; Satomi Nishiibaraki-gun Komatsuzaki
Original assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Current assignee: Nippon Shokubai Co Ltd
Priority date: 1998-02-13
Filing date: 1999-02-11
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2019-02-12
Also published as: EP0945513B1; CN1084389C; US6214589B1; EP0945513A2; KR19990072677A; EP0945513A3; KR100591080B1; DE69927315D1; CN1229142A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure unter Verwendung eines Mikroorganismus mit hoher Aspartaseaktivität.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von L-Asparaginsäure aus Ammoniumfumarat unter Verwendung eines Mikroorganismus mit Aspartaseaktivität, Escherichia coli, bekannt. Das japanische Patent mit der Veröffentlichungsnummer 55-35110 (d.h. JP-B-55-35110) beschreibt ein Verfahren, bei dem E. coli-Aspartase auf einem Ionenaustauscher-Harz Duolite A-7 immobilisiert wird. Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 13, S. 231–240 (1986) beschreibt ein Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung von L-Asparaginsäure, wobei ein Reaktor mit E. coli-Zellen beschickt wird, die in κ-Carrageenan durch Geleinschluß immobilisiert sind. Diese Verfahren sind jedoch im Hinblick auf die Produktivität im industriellen Maßstab unbefriedigend, da die immobilisierte Aspartase eine niedrige Aktivität aufweist oder weil die Geleinschlußimmobilisierung zu einer Diffusionsbarriere führt oder zu einer eingeschränkten Diffusionsrate.
Da die herkömmlich immobilisierten Aspartasen keine hinreichend hohe Aktivität aufweisen, muß die Reaktion bei 30°C oder höher durchgeführt werden, wobei es in diesem Fall erforderlich ist, zu kühlen, da die Aspartase durch die Reaktionswärme ihre Aktivität verliert. Die Aktivität wird insbesondere bei einer Temperatur, die 40°C überschreitet, merklich reduziert (Applied Microbiology Vol. 27, Nr. 5, S. 878–885 (1974); Applied Microbiology Vol. 27, Nr. 5, S. 886–889 (1974)). Um die Erhöhung der Temperatur in einem Reaktor durch die Reaktionswärme zu vermeiden, muß der Reaktor mit einem internen Kühlrohr oder einer Kühlvorrichtung, wie z. B. einer Ummantelung, ausgestattet sein, was den Reaktor komplizierter werden läßt. Des weiteren können immobilisierte Aspartasen aus dem Stand der Technik aufgrund ihrer niedrigen Aktivitäten nicht verwendet werden, um enzymatische Reaktionen bei einer hohen LHSV durchzuführen. Bei Verfahren, die Aspartasen einsetzen, die durch Geleinschluß immobilisiert sind, ist es ebenfalls nicht möglich, eine enzymatische Reaktion bei einer hohen LHSV (stündliche Flüssigkeitsraumgeschwindigkeit) durchzuführen, da die Diffusionsbarriere größer wird.
Die Reaktion bei einer hohen LHSV ist erforderlich, um die verbesserte Produktivität von L-Asparaginsäure durch die enzymatische Reaktion unter Verwendung von immobilisierten Aspartasen zu erreichen. Eine solche Reaktion kann realisiert werden mit einer immobilisierten Aspartase, die eine genügend hohe Aktivität aufweist, um bei einer niedrigen Temperatur zu reagieren, und die zu einer geringen Diffusionsbarriere und einem geringen Druckverlust führt. Unglücklicherweise wurde auf diesem Gebiet eine solche immobilisierte Aspartase bisher nicht hergestellt. Ausgehend von dieser Situation haben die Erfinder jetzt eine immobilisierte Aspartase mit den obigen bevorzugten Eigenschaften hergestellt, und haben nun herausgefunden, daß die Reaktion bei einer hohen LHSV im wesentlichen ohne das Abführen von Wärme erreicht wird, indem eine Ammoniumfumarat lösung in einen Reaktor eingebracht wird, wobei die Temperatur der Ammoniumfumaratlösung so gesteuert wird, daß sie gleich wie oder geringer als die Temperatur ist, die man erhält, wenn man den Temperaturanstieg der Ammoniumfumaratlösung, der während der Umsetzung zwischen Ammoniumfumarat und Aspartase auftritt, von der Temperatur, bei welcher die Stabilität der Aspartase beeinträchtigt wird, subtrahiert.
Die US-A-4,732,851 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure unter Verwendung von immobilisierten mikrobiellen Zellen, namentlich E. coli- (Escherichia coli-) Zellen, die L-Aspartaseaktivität enthalten. Ein Beispiel in der US-A-4,732,851 beschreibt die kontinuierliche Produktion von L-Asparaginsäure (als Ammonium-L-Aspartat), wobei immobilisierte E. coli-Zellen in eine Säule eingebracht werden, und Ammoniumfumarat kontinuierlich durch die Säule nach oben geleitet wird.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure bereit, mit den Stufen, in denen man:
mikrobielle Zellen, die Aspartase enthalten, immobilisiert, um eine immobilisierte Aspartase zu erzeugen,
eine Ammoniumfumaratlösung in einen mit der immobilisierten Aspartase gefüllten Reaktor einführt, und
die erzeugte L-Asparaginsäure aus dem Reaktionsgemisch gewinnt,
wobei:

i) die immobilisierte Aspartase eine Aktivität von 250 U (μmol/min/ml immobilisierte Aspartase) oder mehr hat,
ii) die Ammoniumfumaratlösung in den Reaktor mit einer Beschickungsgeschwindigkeit LHSV (stündliche Flüssigkeitsraumgeschwindigkeit, gemessen als Volumen an eingespeister Ammoniumfumaratlösung (in ml) je Volumen immobilisierte Aspartase (in ml) je Stunde) von 2 bis 35 eingespeist wird, und
iii) die Temperatur der in den Reaktor einzuführenden Ammoniumfumaratlösung derart gesteuert wird, daß sie gleich wie oder geringer als die Temperatur ist, die man durch Subtrahieren des Temperaturanstiegs der Ammoniumfumaratlösung, der während der Umsetzung zwischen Ammoniumfumarat und Aspartase auftritt, von der Temperatur, bei welcher die Stabilität der Aspartase beeinträchtigt wird, erhält.

"1U" bedeutet hierin 1 μmol an pro Minute pro ml an immobilisiertem Enzym erhaltene L-Asparaginsäure, und "LHSV" steht für "stündliche Flüssigkeitsraumgeschwindigkeit" und bezieht sich auf ein Volumen an Beschickungssubstrat (in ml) pro Volumen an eingefülltem Katalysator (in ml) pro Stunde.
Die immobilisierte Aspartase, die bei dieser Erfindung verwendbar ist, ist z. B. eine immobilisierte mikrobielle Zelle mit einem Aspartasegen, das durch rekombinante DNA-Techniken eingeführt wurde.
Die immobilisierte Aspartase kann erhalten werden, indem man einen kugelförmigen Träger mit der zuvor genannten Aspartase enthaltenden mikrobiellen Zelle in Kombination mit einem Polymer beschichtet. Insbesondere kann die immobilisierte Aspartase erhalten werden, indem man einen kugelförmigen Ionenaustauschharzträger vom Styrol-Divinylbenzol-Copolymer-Typ mit den zuvor genannten Aspartase enthaltenden mikrobiellen Zellen vermischt mit einem Polymer, welches durch die allgemeine Formel
wiedergegeben wird, beschichtet, wobei Y entweder eine direkte Bindung oder eine bifunktionelle Gruppe der Formel
bedeutet, R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein organischer Rest sind, X^⊖ ein Anion ist und n eine ganze Zahl zwischen 100 und 5000 bedeutet.
Die Beispiele für organische Reste umfassen Alkylgruppen mit nicht mehr als 10 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, Isobutyl- und ter-Butyl-Gruppen, wobei die Methylgruppe bevorzugt ist.
Die organischen Reste können als einen Substituenten wenigstens ein Halogen oder eine Hydroxylgruppe umfassen, und Beispiele hierfür sind die 4-Chlor-2-dimethylpentyl-Gruppe, die 3-Ethyl-2,5-dichlorheptyl-Gruppe und die 2-Hydroxy-3,5-dimethylnonyl-Gruppe, vorzugsweise die 3-Chlor-2-hydroxypropyl-Gruppe.
Die Beispiele für X^⊖ umfassen Halogenionen, wie z. B. F^–, Cl^–, Br^– und I^–, vorzugsweise Cl^–. Es können auch andere monovalente Anionen, wie z. B. NO₃ ^– als X^⊖ verwendet werden.
Die immobilisierte Aspartase, die gemäß dieser Erfindung verwendet werden kann, und die erhalten wird, indem die zuvor genannte ein Aspartasegen enthaltende Zelle nach dem zuvor genannten Immobilisierungsverfahren immobilisiert wird, hat eine äußerst hohe Aktivität und führt zu einem geringen Druckverlust sowie zu einer niedrigen Diffusionsbarriere. Als ein Ergebnis wird es, anders als mit der herkömmlichen immobilisierten Aspartase, möglich, eine enzymatische Reaktion bei einer hohen LHSV durchzuführen, indem man eine solche immobilisierte Aspartase verwendet.
Da eine Ammoniumfumaratlösung bei einer niedrigen Temperatur für die Reaktion eingespeist werden kann, kann die Lebensdauer der Aspartase verlängert werden.
Der Druckverlust der immobilisierten Aspartase kann beispielsweise 2,0 kg/cm² oder weniger je Meter einer Länge der immobilisierten Aspartaseschicht (in Wasser, bei 20°C) sein, wenn die LHSV 20 beträgt.
Diese und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden beim Lesen und Verstehen der folgenden ausführlichen Beschreibung für den Fachmann offensichtlich werden.
Diese Patentschrift umfaßt vollständig oder teilweise den Inhalt, der in der Patentschrift der japanischen Patentanmeldung Nr. 10-31809, die ein Prioritätsdokument der vorliegenden Anmeldung ist, offenbart ist.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Ein Aspartase enthaltender Mikroorganismus, der für die vorliegende Erfindung verwendet werden kann, ist vorzugsweise Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, die Gattung Brevibacterium oder dergleichen, die dafür bekannt sind, daß sie eine hohe Aspartaseaktivität aufweisen. Insbesondere ist eine mikrobielle Zelle bevorzugt, die ein Aspartasegen aufweist, das durch rekombinante DNA-Techniken eingeführt wurde.
Vorzugsweise kann das Aspartasegen, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet wird, aus E. coli erhalten werden und aus einem Mikroorganismus, der eine Aspartaseaktivität aufweist und dessen Gen dafür bekannt ist, daß es sich natürlich mit einem E. coli-Gen kreuzt, wie z. B. Pseudomonas fluorescens, die Gattung Enterobacter oder die Gattung Citrobacter. Allerdings kann auch ein Aspartasegen aus jeglichem Mikroorganismus mit Aspartaseaktivität entsprechend verwendet werden.
Zum Beispiel können Aspartasegene durch PCR amplifiziert werden, indem man die chromosomale DNA von E. coli K-12 (IFO3301) oder von Pseudomonas fluorescens (IFO3081) als eine Matrize verwendet und Primer, die auf der Grundlage der bekannten Aspartasegensequenz hergestellt wurden. Alternativ können die Aspartasegene auch durch andere übliche Verfahren erhalten werden, wie z. B. das Verfahren, bei dem aus chromosomaler DNA erhaltene Restriktionsfragmente elektroforiert werden, um ein Fragment zu gewinnen, das ein Aspartasegen enthält.
Ein Plasmid zur Aufnahme des auf diese Weise erhaltenen Aspartasegens kann jedes Plasmid sein, das in der Lage ist, sich in der Zelle von E. coli zu replizieren. Die Beispiele für solche Plasmide umfassen, jedoch nicht ausschließlich, pUC18 (Nippon Gene Co., Ltd.) und pKK223-3 (Pharmacia).
Als ein Wirtsorganismus zum Einbringen des Plasmids, in welches das Aspartasegen inkorporiert worden ist, kann der E. coli-Stamm K-12 (Stratagene) oder dergleichen geeignet verwendet werden.
Die Aspartase enthaltende mikrobielle Zelle wird vorzugsweise durch ein Verfahren immobilisiert, das dem immobilisierten Produkt eine genügende Beanspruchbarkeit verleiht, und das weniger wahrscheinlich Druckverlust oder eine Diffusionsbarriere beim Einspeisen einer Substratlösung verursacht.
Vorzugsweise wird die mikrobielle Zelle durch die Beschichtung der Oberfläche eines kugelförmigen Trägers mit der Zelle und einem Polymer immobilisiert. Besonders bevorzugt wird die Oberfläche eines Ionenaustauscherharzes vom Styrol-Divinylbenzol-Copolymer-Typ mit einem Gemisch der Zelle und eines Polyallylaminpolymers beschichtet. Als das Ionenaustauschharz vom Styrol-Divinylbenzol-Copolymer-Typ und als das Polyallylaminpolymer werden jeweils Amberlite IRA96SB (Organo) und PAS-880 (Nitto Boseki Co., Ltd.) bevorzugt.
Da die Aspartase enthaltenden mikrobiellen Zellen per se unmittelbar auf einem Träger immobilisiert werden können, wird die in den Zellen enthaltene Aspartase gemäß dem zuvor genannten Verfahren nahezu vollständig immobilisiert, wodurch man eine immobilisierte Aspartase mit sehr hoher Aktivität erhält.
Die mikrobiellen Zellen können immobilisiert werden, indem die Zellen vermischt mit PAS-880 (mit einem pH-Wert, der auf 7,0 eingestellt ist) zu einer auberginenförmigen Flasche, die Teflonkugeln und Amberlite IRA-96SB enthält, zugegeben werden, und indem das Gemisch in einem Rotationsverdampfer unter vermindertem Druck unter Rotation getrocknet wird, wodurch die Oberfläche von Amberlite IRA-96SB mit den Zellen und mit PAS-880 beschichtet wird.
Gemäß dem oben beschriebenen Verfahren werden kugelförmige immobilisierte Produkte erhalten, deren Druckverlust je Meter einer Länge einer immobilisierten Aspartaseschicht (in Wasser, bei 20°C) 2,0 kg/cm² oder weniger beträgt, wenn die LHSV 20 ist. Hierdurch wird eine Reaktion bei einer hohen LHSV möglich. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens ist, daß die Diffusionsschicht dünn genug ist, um eine hinreichende Enzymaktivität zu zeigen. Der Druckverlust des immobilisierten Enzyms ist vorzugsweise 2 kg/cm² oder weniger, insbesondere bevorzugt 1 kg/cm² oder weniger je Meter einer Länge der immobilisierten Aspartaseschicht, wenn die LHSV 20 ist. Die Form eines für die vorliegende Erfindung verwendeten Reaktors ist üblicherweise ein zylindrischer Reaktor, jedoch nicht hierauf beschränkt. Die Länge des Reaktors ist vorzugsweise 10 m oder weniger, weil ein übermäßig langer Reaktor verantwortlich für Druckverlust ist. Es ist nicht notwendig, den Reaktor mit einer Kühlvorrichtung auszustatten. Besonders bevorzugt ist der Reaktor isoliert.
Es ist notwendig, vor dem Reaktor einen Speichertank, dessen Temperatur regelbar ist, oder einen Wärmeaustauscher einzurichten, um die Ammoniumfumaratlösung, die in den Reaktor eingespeist werden soll, bei einer konstanten Temperatur zu halten.
Bei einer Temperatur, die 40°C übersteigt, ist ein Enzym eines Mesophilen im allgemeinen instabil und seine Inaktivierung wird durch Wärme beschleunigt. Die Aspartase von E. coli zeigt bei einer Temperatur, die 40°C übersteigt, ebenfalls eine drastische Instabilität auf und verliert ihre Akti vität durch Wärme (Applied Microbiology Vol. 27, Nr. 5, S. 878–885 (1974)); Applied Microbiology Vol. 27, Nr. 5, S. 886–889 (1974)). Diese Inaktivierung durch Wärme führt zu einer Verkürzung der Lebensdauer des immobilisierten Enzyms.
Um die Inaktivierung von Aspartase durch Wärme zu verhindern, ist es wichtig, die Temperatur der Ammoniumfumaratlösung, die in einen Reaktor eingespeist werden soll, so zu regeln, daß die Temperatur des Reaktionsgemischs am Ausgang des Reaktors 40°C nicht übersteigt.
Innerhalb eines solchen Temperaturbereichs wird eine gute Stabilität der Aspartase erhalten. Im Falle von E. coli ist der Bereich 40°C oder weniger, und die Stabilität ist bei einer niedrigeren Temperatur höher. Um bei einem Aspartaseenzym, das mit einer Optimumstemperatur bei 40°C oder höher bei einer erhöhten Temperatur stabil ist, einen ähnlichen Effekt zu erreichen, wird die Temperatur einer Ammoniumfumaratlösung, die eingespeist werden soll, so geregelt, daß sie gleich wie oder niedriger als die Temperatur ist, die man erhält, wenn man von der Temperatur, bei welcher die Stabilität der Aspartase beeinträchtigt wird, die Temperaturerhöhung der Ammoniumfumaratlösung, die während der Reaktion zwischen dem Ammoniumfumarat und der Aspartase auftritt, subtrahiert. Die Reaktion bei einer Temperatur innerhalb des oben beschriebenen Bereichs kann nicht mit herkömmlichen immobilisierten Enzymen realisiert werden, weil ihre Aktivitäten unzureichend sind. "Die Temperatur, bei welcher die Stabilität der Aspartase beeinträchtigt wird", liegt im Falle der Aspartase von E. coli bei um 40°C, im Falle der Aspartase von Brevibacterium flavum bei um 48°C (Journal of Japan Society for Bioscience, Biotechnology, and Agrochemistry, Vol. 59, Nr. 1, S. 31–37, 1985) und im Falle der Aspartase von Bacillus aminogenes bei um 50°C (Japanese Patent Publication Nr. 3-48795).
Noch einmal, wenn eine Ammoniumfumaratlösung in einen Reaktor eingespeist wird und in L-Asparaginsäure in einem Gleichgewichtsstadium umgewandelt wird, so wird die Temperatur der Ammoniumfumaratlösung höher werden. In diesem Fall kann die Temperatur des Reaktionsgemischs bei 40°C oder weniger gehalten werden, indem man die Temperatur einer Ammoniumfumaratlösung so kontrolliert, daß sie gleich oder niedriger als die Temperatur ist, die man erhält, wenn man die Temperaturerhöhung der Ammoniumfumaratlösung, die während der Reaktion zwischen dem Ammoniumfumarat und der Aspartase auftritt, von 40°C subtrahiert.
Die Temperatur wird innerhalb des obigen Bereichs vorzugsweise so niedrig wie möglich eingestellt, so daß die Stabilität verbessert wird. Allerdings kann eine übermäßig niedrige Temperatur zur Ausfällung des kristallisierten Ammoniumfumarats führen, und folglich ist die Temperatur der Ammoniumfumaratlösung am Einlaß des Reaktors vorzugsweise in dem Bereich von 10°C im niedrigsten Fall bis 33°C, noch bevorzugter von 15°C bis 28°C.
Aspartasen aus anderen Mikroorganismen als E. coli können Bedingungen ausgesetzt werden, die den obigen ähnlich sind.
Etwas spezieller, wenn die Konzentration der Ammoniumfumaratlösung 10% beträgt (berechnet als Fumarsäure), so erhöht sich die Temperatur um etwa 7°C infolge der Reaktionswärme. Berücksichtigt man die Reaktivität der immobilisierten Aspartase, so wird die Ammoniumfumaratlö sung vorzugsweise in einen Reaktor bei einer Temperatur von 10°C bis 33°C, noch bevorzugter von 15°C bis 28°C, eingespeist.
Wenn die Konzentration der Ammoniumfumaratlösung 20% beträgt (berechnet als Fumarsäure), so erhöht sich die Temperatur um etwa 14°C infolge der Reaktionswärme, und so wird die Ammoniumfumaratlösung geeignet bei einer Temperatur von 10°C bis 26°C, noch bevorzugter von 15°C bis 24°C, in einen Reaktor eingespeist. Auf diese Weise wird die Temperatur des Reaktionsgemischs 40°C am Auslaß des Reaktors nicht übersteigen, und die Aspartase bleibt stabil. Darüber hinaus kann der Aufbau des Reaktors selbst vereinfacht werden, da es keinen Bedarf der Kühlung in dem Reaktor gibt.
Die Geschwindigkeit der in einen Reaktor eingespeisten Ammoniumfumaratlösung ist im Hinblick auf die Produktivität vorzugsweise so hoch wie möglich, sie kann aber in Abhängigkeit einer Konzentration der Ammoniumfumaratlösung, einer Aktivität der immobilisierten Aspartase und einer Länge der immobilisierten Aspartaseschicht variiert werden. Die LHSV ist in dem Bereich von 2 bis 35, insbesondere von 6 bis 30, noch bevorzugter von 7 bis 25.
Eine LHSV jenseits des zuvor genannten Bereichs ist ungünstig, weil die Umsetzungsrate des Ammoniumfumarats in L-Asparaginsäure niedriger werden kann. Auf der anderen Seite ist auch eine LHSV unterhalb der zuvor genannten Bereiche ungünstig, weil sie zu einer niedrigen Produktivität führt.
Die Umsetzungsrate des Ammoniumfumarats in L-Asparaginsäure am Auslaß eines Reaktors ist vorzugsweise 90% oder höher, noch bevorzugter 95% oder höher. Eine ungewöhnlich niedrige Umsetzungsrate ist ungünstig, da sie die Menge an nicht umgesetzter Fumarsäure erhöht und eine Kostenerhöhung verursacht.
Vorzugsweise hat die immobilisierte Aspartase eine Aktivität von 250 U, noch bevorzugter von 500 U.
Wenn die Aktivität der immobilisierten Aspartase 250 U beträgt, so ist die Umwandlungsrate 99% oder mehr unter den Bedingungen, bei denen 20%-ige Ammoniumfumaratlösung in den Reaktor bei einer LHSV von 2 eingespeist wird, und bei denen die Temperatur am Einlaß 20°C beträgt. Wenn die Aktivität der immobilisierten Aspartase 100 U beträgt und die anderen Bedingungen die gleichen wie die obigen sind, so fällt die Umwandlungsrate jedoch auf 80%. Wenn die Aktivität der immobilisierten Aspartase 1000 U beträgt, so ist die Umwandlungsrate 99% oder mehr unter den Bedingungen, bei denen 20%-ige Ammoniumfumaratlösung in den Reaktor bei einer LHSV = 10 eingespeist wird, und bei denen die Temperatur am Einlaß 23°C beträgt.
Wie zuvor beschrieben, ermöglicht die immobilisierte Aspartase mit einer höheren Aktivität die Reaktion bei einer höheren LHSV.
Im folgenden wird ein Verfahren zur Herstellung einer Aspartase aus E. coli oder Pseudomonas fluorescens durch gentechnische Verfahren beschrieben werden.
(1) Herstellung einer rekombinanten Aspartase aus E. coli
Der E. coli-Stamm IFO3301, der vom Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO) bezogen wurde, wurde auf ein LB-Medium, das in Tabelle 1 dargestellt ist, inokuliert und bei 37°C für 8 Stunden kultiviert wurde. Aus 1 ml der Kultur wurden die E. coli-Zellen gesammelt und in 1 ml an destilliertem Wasser suspendiert. Ein μl der Zellsuspension wurde als eine DNA-Matrize zur Amplifizierung eines Aspartasegens verwendet. Tabelle 1 Zusammensetzung des LB-Mediums

Polypepton 10 g

Hefeextrakt 5 g

NaCl 10 g

Destilliertes Wasser 1 l (sterilisiert in einem Autoklaven für 15 Min. bei 121°C)
(2) Amplifizierung eines Aspartasegens durch PCR und Herstellung eines Insertionsfragments
Zum Amplifizieren eines Aspartasegens aus E. coli wurden die folgenden zwei Primer:
Primer F1: GGATAATCGTCGGTCGAAAA (SEQ ID NO:3) und
Primer R1: CGTCATCTGACGTGCCTTT (SEQ ID NO:4)
hergestellt auf der Grundlage des Aspartasegens aus dem bekannten E. coli-Stamm K-12 (dessen Nukleotidsequenz durch die SEQ ID NO:1 und die hierdurch codierte Aminosäuresequenz durch SEQ ID NO:2 repräsentiert ist) (Biochem. J. 237(2), 547–557).
Eine Reaktionslösung, die die folgende Zusammensetzung aufweist, wurde unter Verwendung der DNA-Polymerase KOD (Toyobo Co., Ltd.) hergestellt, um das Aspartasegen durch PCR unter den folgenden Bedingungen zu amplifizieren: Zusammensetzung:
PCR-Bedingungen (wobei ii. bis iv. in 30 Zyklen wiederholt werden):

i. 98°C, 5 Min.

ii. 98°C, 30 Sek.

iii. 53°C, 30 Sek.

iv. 68°C, 1 Min.
Am Ende der PCR-Reaktion wurden die amplifizierten DNA-Fragment auf einem 1%-igen Agarosegel elektroforiert und mit Ethidiumbromid gefärbt. Das vorhergesagte Fragment von etwa 1600 bp wurde amplifiziert.
Das Fragment wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten, um die DNA mit Prep-A-Gene^® (Bio-Rad Laboratories, Inc.) zu gewinnen.
(3) Ligation des Insertionsfragments in den Vektor
Das gewonnene DNA-Fragment wurde in Anwesenheit eines Restriktionsenzyms Srf und einer DNA-Ligase in den Klonierungsvektor pCR-Script Amp SK (+) ligiert.
Ein Transformand mit dem Insertionsfragment wurde der Stamm PUaspE1 genannt. Der Stamm PUaspE1 wurde zu 3 ml an LB-Medium, das 100 ppm Ampicillin enthielt, inokuliert und über Nacht bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Aus 1,5 ml der Kultur wurden die Zellen gesammelt und das Plasmid wiederum wurde aus den Zellen durch das basische SDS-Verfahren gewonnen. Das Plasmid wurde pUaspE1 genannt.
Die Sequenzierung des Insertionsfragments in dem Plasmid ergab, daß das Aspartasegen in Bezug auf den Promotor des Vektors in einer entgegengesetzten Richtung inseriert war.
Um das Aspartasegen in Bezug auf den Promotor korrekt in einer Vorwärtsrichtung zu ligieren, wurde das Insertionsfragment aus dem Plasmid pUaspE1 mit den Restriktionsenzymen SacI und BamHI ausgeschnitten, um in pUC19 (Nippon Gene Co., Ltd.) eingeführt zu werden. Etwas genauer wurde das Plasmid pUaspE1 zunächst mit BamHI geschnitten und vor einer weiteren Spaltung mit SacI wurde die DNA durch Ethanolfällung gesammelt. Die geschnittenen DNA-Fragmente wurden durch Elektroforese auf einem 1%-igen Agarosegel getrennt und aus dem Gel geschnitten, um das DNA-Insert mit Prep-A-Gene^® (Bio-Rad Laboratories, Inc.) zu gewinnen.
(4) Herstellung des Vektors
Ein μg des Plasmids pUC19 (Nippon Gene Co., Ltd.) wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI geschnitten, und anschließend wurde die hieraus hervorgehende DNA durch Ethanolfällung gewonnen und mit SacI geschnitten. Die geschnittenen DNA-Fragmente wurden durch Elektroforese auf einem 1%-igen Agarosegel getrennt und unter Verwendung von Prep-A-Gene^® (Bio-Rad Laboratories, Inc.) aus dem Gel ausgeschnitten, um die Ziel-DNA als einen Vektor zu gewinnen.
(5) Ligation des Insertionsfragments in den Vektor
Das Insertionsfragment und der Vektor, die beide mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten worden waren, wurden unter Einsatz von Ligation high^® (Toyobo Co., Ltd.) für 30 Minuten bei 16°C ligiert.
(6) Transformation von E. coli
Um E. coli zu transformieren, wurden 2 μl des Reaktionsgemischs, das den mit dem Insertionsfragment ligierten Vektor enthielt, zu 200 μl an kompetenten E. coli-Zellen (XL2-Blue MRF'-ultrakompetente Zellen, die von Stratagene hergestellt wurden) zugegeben. Der E. coli-Transformand wurde auf ein LB-Agarmedium verteilt, das 100 ppm an Ampicillin enthielt, und wurde über Nacht bei 37°C kultiviert.
Als eine Kontrolle wurde E. coli, das mit Plasmid pUC18 ohne Insertionsfragment transformiert worden war, auf ein LB-Agarmedium verteilt, das 100 ppm an Ampicillin enthielt, und wurde über Nacht bei 37°C kultiviert.
Zwanzig der aufgewiesenen Kolonien wurden aufgenommen und auf ein LB-Medium inokuliert, das 100 ppm Ampicillin enthielt, und wurden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Nach 8 Stunden wurde zu der Kultur IPTG (Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid) zu einer Konzentration von 1 mM zugegeben und die Schüttelkultur wurde über Nacht bei 30°C weiter fortgesetzt. Aus 1 ml der Kultur wurden die Zellen gewonnen.
Gleichsam wurde ein Kontrolltransformand ohne Insertionsfragment kultiviert, um die Zellen zu gewinnen. Die gewonnenen Zellen wurden durch Zugabe von 1 ml einer Ammoniumfumaratsubstratlösung, die in Tabelle 2 dargestellt ist, suspendiert und für 1 Stunde bei 30°C reagieren gelassen. Tabelle 2 Zusammensetzung von 20%-iger Ammoniumfumaratsubstratlösung

Fumarsäure 200 g

25%-iger wäßriger Ammoniak 200 g

Magnesiumsulfat 2,5 g

Ionenaustauscherwasser 500 g
Nachdem der pH-Wert des Reaktionsgemischs mit 25%-igem wäßrigem Ammoniak auf 8,3 eingestellt worden war, wurde das Ionenaustauscherwasser zu insgesamt 1 l zugegeben. Als das Reaktionsgemisch analysiert wurde, betrug die Umsetzung in % in L-Asparaginsäure bei dem E. coli-Transformand mit dem Insertionsfragment 99,5%, während die Umsetzung in % bei dem Kontrolltransformanden ohne Insertionsfragment 5% betrug.
Ein Transformand mit dem Insertionsfragment wurde PUaspE2 genannt. Der Stamm PUaspE2 wurde zu 3 ml LB-Medium, das 100 ppm Ampicillin enthielt, inokuliert und für 8 Stunden bei 37°C kultiviert. Aus 1,5 ml der Kultur wurde das Plasmid durch das alkalische SDS-Verfahren gewonnen, welches dann pUaspE2 genannt wurde. Das Plasmid pUaspE2 wurde mit dem Restriktionsenzym SmaI geschnitten, anschließend mit dem Restriktionsenzym HindIII, und wurde einer Elektroforese mit 1%-igem Agarosegel unterworfen, um die Größe der DNA-Fragmente zu bestimmen. Es lagen zwei Fragmente mit Größen von etwa 2960 bp und etwa 1600 bp vor.
Der Stamm PUaspE2 wurde zu 3 ml LB-Medium, das 100 ppm Ampicillin enthielt, inokuliert und bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Nach 8 Stunden wurde IPTG zu der Kultur zu einer Konzentration von 1 mM zugegeben und die Schüttelkultur wurde über Nacht bei 30°C weiter fortgesetzt. Aus 1 ml der Kultur wurden die Zellen gewonnen und die Dichte davon betrug 8,0, wie anhand der OD bei 660 nm bestimmt wurde. Die Zellen wurden in 10 ml an 20%-iger Ammoniumfumaratsubstratlösung suspendiert und für 1 Stunde bei 30°C reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde durch HPLC analysiert. Die Aspartaseaktivität wurde anhand des L-Asparaginsäuregehalts und der Zelldichte berechnet, welche, wie sich herausstellte, 2.000.000 μM L-Asparaginsäuregehalt/Std./Zelldichte bei OD 660 nm betrug.
Gleichermaßen wurde ein Kontrolltransformand ohne Insertionsfragment kultiviert und gewonnen. Die Dichte davon betrug 8,5 wie anhand der OD bei 660 nm bestimmt wurde. Die Zellen wurden in 10 ml an 20%-iger Ammoniumfumaratsubstratlösung suspendiert und für 1 Stunde bei 30°C reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde durch HPLC analysiert. Die Aspartaseaktivität wurde anhand des L-Asparaginsäuregehalts und der Zelldichte berechnet, und betrug, wie sich herausstellte, 10.000 μM L-Asparaginsäuregehalt/Std./Zelldichte bei OD bei 660 nm.
Die Aspartaseaktivität des Stamms PUaspE2 war 200-mal größer als die des Stamms ohne Aspartasegeninsert.
(7) Kultivierung des rekombinanten E. coli
Der rekombinante E. coli-Stamm PUaspE2, der in der Lage war, E. coli-Aspartase zu exprimieren, wurde zu 10 Probenröhrchen inokuliert, wobei jedes 3 ml eines Mediums enthielt, das hergestellt wurde, indem 100 ppm Ampicillin zu dem Medium, das in Tabelle 1 dargestellt ist, zugegeben wurden, und wurde bei 37°C kultiviert. Nach 8 Stunden wurden die Kulturen in den Probenröhrchen jeweils zu 10 Sakaguchi-Flaschen inokuliert, die jeweils 100 ml eines Mediums enthielten, das aus der gleichen Zusammensetzung bestand wie das obige Medium, ergänzt mit 1 mM IPTG, und wurden dann über Nacht bei 30°C unter Schütteln kultiviert.
Aus diesen Kulturen wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Die gemessene Aspartaseaktivität der Zellen betrug 1,05 mol L-Asparaginsäuregehalt/Std. pro Gramm an Zellen.
(8) Herstellung einer rekombinanten Pseudomonas fluorescens-Aspartase
Der Pseudomonas fluorescens-Stamm IFO3081, der vom Institute for Fermentation, Osaka (IFO) bezogen worden war, wurde zu dem LB-Medium, das in Tabelle 1 dargestellt ist, inokuliert und bei 30°C für 8 Stunden kultiviert. Aus 1 ml der Kultur wurden die Zellen gesammelt und in 1 ml an destilliertem Wasser suspendiert. Ein μl der Zellsuspension wurde als eine DNA-Matrize für die Amplifizierung eines Aspartasegens verwendet.
(9) Amplifizierung des Aspartasegens durch PCR und Herstellung eines Insertionsfragments
Um ein Aspartasegen aus Pseudomonas fluorescens zu amplifizieren, wurden die folgenden zwei Primer:
Primer F2: GGGCATATGATCTCCGTCATGTCCTCTGCTGCATCTTTCCG (SEQ ID NO:5) und
Primer R2: CCCGGATCCTTAGGCCTTCAGCGGACCAAGCGTGGGG (SEQ ID NO:6)
auf der Grundlage der Nukleotidsequenz des Aspartasegens des bekannten Pseudomonas fluorescens-Stamm IFO3081 (J. Biochem. 100, 697–705 (1986)) hergestellt.
Eine Reaktionslösung, die die folgende Zusammensetzung aufwies, wurde unter Verwendung der DNA-Polymerase KOD (Toyobo Co., Ltd.) hergestellt, um das Aspartasegen durch PCR unter den folgenden Bedingungen zu amplifizieren: Zusammensetzung:
PCR-Bedingungen (wobei ii. bis iv. in 30 Zyklen wiederholt werden):

i. 98°C, 5 Min.

ii. 98°C, 30 Sek.

iii. 55°C, 30 Sek.

iv. 68°C, 1 Min.
Am Ende der PCR-Reaktion wurden die amplifizierten DNA-Fragmente auf einem 1%-igen Agarosegel elektroforiert und mit Ethidiumbromid gefärbt. Das vorhergesagte Fragment von etwa 1500 bp wurde amplifiziert.
Das Zielfragment wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten, um die DNA mit Prep-A-Gene^® (Bio-Rad Laboratories Inc.) zu gewinnen. Die gewonnene DNA wurde gleichzeitig mit den Restriktionsenzymen NdeI und BamHI geschnitten, und das hieraus hervorgehende NdeI-BamHI-Fragment wurde durch Elektroforese auf einem 1%-igen Agarosegel aufgetrennt und aus dem Gel unter Verwendung von Prep-A-Gene^® (Bio-Rad Laboratories Inc.) ausgeschnitten, um die DNA zu gewinnen, wie es oben beschrieben wurde.
(10) Herstellung des Vektors
Um über PCR ein Vektor-DNA-Fragment herzustellen, das jeweils in den Positionen der Start- und Stopcodons Restriktionsenzymbereiche für NdeI und BamHI aufweist, wurden aus dem Strukturgen für β-Galactosidase des Plasmids pUC18 die folgenden zwei Primer hergestellt:
Primer F3: CCCCATATGTGTTTCCTGTGTGAAATTGTCCGCTCACA ATTCCACACAATATACGAGCC (SEQ ID NO:7), und
Primer R3: CCCGGATCCTTAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACC (SEQ ID NO:8)
Eine Reaktionslösung, die die folgende Zusammensetzung aufwies, wurde unter Verwendung der DNA-Polymerase KOD (Toyobo Co., Ltd.) hergestellt, um das Aspartasegen durch PCR zu amplifizieren und als eine DNA-Matrize wurde das Plasmid pUC18 verwendet: Zusammensetzung:
PCR-Bedingungen (wobei ii. bis iv. in 30 Zyklen wiederholt werden):

i. 98°C, 5 Min.

ii. 98°C, 30 Sek.

iii. 55°C, 30 Sek.

iv. 68°C, 1 Min.
Am Ende der PCR-Reaktion wurden die amplifizierten DNA-Fragmente auf einem 1%-igen Agarosegel elektroforiert und mit Ethidiumbromid gefärbt. Das vorhergesagte Fragment von etwa 2400 bp wurde amplifiziert.
Das Zielfragment wurde aus dem Agarosegel ausgeschnitten, um die DNA mit Prep-A-Gene^® (Bio-Rad Laboratories Inc.) zu gewinnen. Die gewonnene DNA wurde gleichzeitig mit den Restriktionsenzymen NdeI und BamHI geschnitten, und das hieraus hervorgehende NdeI-BamHI-Fragment wurde durch Elektroforese auf einem 1%-igen Agarosegel aufgetrennt und aus dem Gel unter Verwendung von Prep-A-Gene^® (Bio-Rad Laboratories Inc.) ausgeschnitten, um die DNA zu gewinnen, wie es oben beschrieben wurde.
(11) Ligation des Insertionsfragments in den Vektor
Der Vektor und das Insertionsfragment, die mit den gleichen Restriktionsenzymen geschnitten worden waren, wurden unter Verwendung von Ligation high^® (Toyobo Co., Ltd.) für 30 Minuten bei 16°C ligiert.
(12) Transformation von E. coli
Um E. coli zu transformieren, wurden 2 μl des Reaktionsgemischs, das den mit Insertionsfragment ligierten Vektor enthielt, zu 200 μl an kompetenten E. coli-Zellen (XL2-Blue MRF'-ultrakompetente Zellen, die von Stratagene hergestellt wurden) zugegeben. Der E. coli-Transformand wurde auf ein LB-Agarmedium verteilt, das 100 ppm an Ampicillin enthielt, und über Nacht bei 37°C kultiviert.
Als eine Kontrolle wurde mit Plasmid pUC18 transformiertes E. coli ohne Insertionsfragment über das gleiche LB-Agarmedium, das 100 ppm an Ampicillin enthielt, verteilt und über Nacht bei 37°C kultiviert.
Zwanzig der vorliegenden Kolonien wurden aufgenommen und zu einem LB-Medium, das 100 ppm Ampicillin enthielt, inokuliert und bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Nach 8 Stunden wurde zu der Kultur IPTG zu einer Konzentration von 1 mM zugegeben und die Schüttelkultur wurde über Nacht bei 30°C weiter fortgesetzt. Aus 1 ml der Kultur wurden die Zellen gewonnen.
Gleichermaßen wurde ein Kontrolltransformand ohne Insertionsfragment kultiviert, um die Zellen zu gewinnen.
Die gewonnenen Zellen wurden in 1 ml der Ammoniumfumaratsubstratlösung, die in Tabelle 2 dargestellt ist, suspendiert und für 1 Stunde bei 30°C reagieren gelassen.
Das Reaktionsgemisch wurde analysiert. Als ein Ergebnis betrug die Umsetzung in L-Asparaginsäure in dem E. coli-Transformand mit dem Insertionsfragment 99,5%, während die Umsetzung in % bei dem Kontrolltransformanden ohne Insertionsfragment 5% betrug.
Ein Transformand mit dem Insertionsfragment wurde PUaspP1 genannt. Der Stamm PUaspP1 wurde zu 3 ml LB-Medium, das 100 ppm Ampicillin enthielt, inokuliert und für 8 Stunden bei 37°C kultiviert. Aus 1,5 ml der Kultur wurde das Plasmid durch das alkalische SDS-Verfahren gewonnen, welches pUaspP1 genannt wurde. Das Plasmid wurde mit den Restriktionsenzymen NdeI und BamHI geschnitten und dann einer Elektroforese mit einem 1%-igen Agarosegel unterworfen, um die Größe der DNA Fragmente zu bestimmen. Es lagen zwei Fragmente mit Größen von etwa 2400 bp und etwa 1500 bp vor.
Der Stamm PUaspP1 wurde zu 3 ml LB-Medium, das 100 ppm Ampicillin enthielt, inokuliert und unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Nach 8 Stunden wurde IPTG zu der Kultur zu einer Konzentration von 1 mM zugegeben und die Schüttelkultur wurde über Nacht bei 30°C weiter fortgesetzt. Aus 1 ml der Kultur wurden die Zellen gesammelt und die Dichte davon betrug 8,0, wie anhand der OD bei 660 nm bestimmt wurde. Die Zellen wurden in 10 ml an 20%-iger Ammoniumfumaratsubstratlösung suspendiert und für 1 Stunde bei 30°C reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde durch HPLC analysiert. Die Aspartaseaktivität wurde auf der Grundlage des L-Asparaginsäuregehalts und der Zelldichte berechnet, welche, wie sich herausstellte, 2.500.000 μM L-Asparaginsäuregehalt/Std./Zelldichte bei OD bei 660 nm betrug.
Gleichermaßen wurde der Kontrolltransformand ohne Insertionsfragment kultiviert und gewonnen. Die Dichte davon betrug 7,0, wie bei OD 660 nm bestimmt wurde. Die Zellen wurden in 10 ml an 20%-iger Ammoniumfumaratsubstratlösung suspendiert und für 1 Stunde bei 30°C reagieren gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde durch HPLC analysiert. Die Aspartaseaktivität wurde auf der Grundlage des L-Asparaginsäuregehalts und der Zelldichte berechnet, welche, wie sich herausstellte, 10.000 μM L-Asparaginsäuregehalt/Std./Zelldichte bei OD 660 nm betrug.
Die Aspartaseaktivität des Stammes pUaspP1 war 250-mal größer als die des Stammes ohne Aspartasegeninsert.
(13) Kultivierung von rekombinantem E. coli
Der rekombinante E. coli-Stamm pUaspP1, der in der Lage war, die Pseudomonas fluorescens-Aspartase zu exprimieren, wurde zu 10 Teströhren inokuliert, die jeweils 3 ml eines Mediums enthielten, das durch Zugabe von 100 ppm Ampicillin zu dem Medium, das in Tabelle 1 dargestellt ist, hergestellt wurde, und wurde bei 37°C kultiviert. Nach 8 Stunden wurden die Kulturen in den Probenröhrchen jeweils zu 10 Sakaguchi-Flaschen inokuliert, die jeweils 100 ml eines Mediums enthielten, das aus der gleichen Zusammensetzung bestand wie das obige Medium, ergänzt mit 1 mM IPTG, und wurden dann über Nacht bei 30°C unter Schütteln kultiviert.
Aus diesen Kulturen wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Die Aspartaseaktivität, die für diese Zellen gemessen wurde, betrug 0,85 mol L-Asparaginsäuregehalt/Std. pro Gramm der Zellen.
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand der folgenden Beispiele etwas ausführlicher beschrieben. Der technische Umfang der vorliegenden Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
Der rekombinante E. coli-Stamm pUaspP1, der in der Lage ist, Pseudomonas fluorescens-Aspartase zu exprimieren, wurde zu 10 Probenröhren inokuliert, die jeweils 3 ml eines Mediums enthielten, das hergestellt wurde, indem 100 ppm Ampicillin zu dem Medium, das in Tabelle 1 dargestellt ist, zugegeben wurden, und wurde bei 37°C kultiviert. Nach 8 Stunden wurden die Kulturen in den Probenröhrchen jeweils zu 10 Sakaguchi-Flaschen inokuliert, die jede 100 ml eines Mediums enthielten, das hergestellt wurde, indem man 1 mM IPTG und 100 ppm Ampicillin zu dem Medium, das in Tabelle 3 dargestellt ist, zugibt, und wurden über Nacht bei 30°C kultiviert. Aus diesen Kulturen wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Die Aspartaseaktivität betrug 0,19 mol L-Asparaginsäuregehalt/Std. pro Gramm der Zellen. Tabelle 3 Zusammensetzung des Mediums

Fumarsäure 10 g

Ammoniumsulfat 5 g

KH₂PO₄ 1 g

K₂HPO₄ 3 g

MgSO₄·7H₂O 0,5 g

NaOH 6,5 g, pH 6,3

Hefeextrakt 20 g

(sterilisiert in einem Autoklauen für 15 Minuten bei 121°C)
70 g an PAS-880 (Nitto Boseki Co., Ltd.) (mit einem pH-Wert von um 7,0, eingestellt mit Alkali) und 230 g deionisiertes Wasser wurden gründlich gemischt, worin die gesammelten Zellen homogen dispergiert wurden. 300 ml eines Ionenaustauscherharzes (Amberlite IRA-96SB Typ C1, hergestellt von Organo, Japan, durchschnittliche Partikelgröße 0,5 mm) und 200 Teflonkugeln (0,5 Inch jeweils) wurden in eine auberginenförmige 6 I-Flasche eingebracht, wozu ein Sechstel der oben genannten Zelldispersion zugegeben wurde. Das Gemisch wurde für 1 Stunde in einem Verdampfer unter Rotation bei 30°C getrocknet, wodurch das Ionenaustauscherharz mit den Zellen beschichtet wurde. Nachdem dieser Schritt 6-mal wiederholt worden war, wurden die Teflonkugeln entnommen, um eine perlenartige immobilisierte Aspartase zu erhalten. Die immobilisierte Aspartase wies eine Aktivität von 354 U auf.
Die wie oben beschrieben zubereitete immobilisierte Aspartase wurde in 20%-iger Ammoniumfumaratlösung (pH 8,3) bei 4°C über Nacht eingetaucht, wovon 50 ml verwendet wurden, um einen säulenförmigen Reaktor (1 cm Durchmesser) zu füllen. Die Länge der beladenen immobilisierten Aspartaseschicht betrug etwa 64 cm. Um den Reaktor gegen Wärme zu isolieren, wurde die Säule mit einem thermisch isolierenden Material, d.h. mit Polystyrolschaum, umhüllt. Eine Substratlösung (200 g Fumarsäure, 200 g 25%-iger wäßriger Ammoniak, 0,25 g MgSO₄·7H₂O in 1 l mit einem pH-Wert von 8,3, eingestellt mit wäßrigem Ammoniak) wurde über einen Teflonschlauch, der mit einem thermisch isolierenden Material eingehüllt war, mit einer Flußrate von 100 ml/Std. (LHSV = 2,0) in die Säule eingespeist, um eine kontinuierliche Reaktion durchzuführen.
Drei Stunden nach dem Reaktionsstart wurde das Reaktionsgemisch analysiert. Die Mole des erhaltenen Reaktionsprodukts, d.h. L-Asparaginsäure, waren im wesentlichen gleich zu den Molen der konsumierten Fumarsäure. Die Umsetzungsrate der Reaktion betrug 99,77%. Die Temperatur des Ausflusses betrug 33°C. Die Umsetzungsrate blieb bei 99,7% über sieben Tage und sogar einen Monat nach dem Reaktionsstart.
Um einen Druckverlust der immobilisierte Aspartase zu messen, wurde Wasser (20°C) durch die Säule fließen gelassen. Als ein Ergebnis betrug der Druckverlust 0,8 kg/cm² pro Meter der Länge einer immobilisierten Aspartaseschicht, wenn die LHSV 20 ist (1 l/Std.).
Beispiel 2
Der rekombinante E. coli-Stamm PUaspP1, der in der Lage ist, Pseudomonas fluorescens-Aspartase zu exprimieren, wurde zu 10 Probenröhren inokuliert, die jeweils 3 ml eines Mediums enthielten, das hergestellt wurde, indem 100 ppm Ampicillin zu dem Medium, das in Tabelle 1 dargestellt ist, zugegeben wurden, und wurde bei 37°C kultiviert. Nach 8 Stunden wurden die Kulturen in den Probenröhrchen jeweils zu 10 Sakaguchi-Flaschen inokuliert, die jede 100 ml eines Mediums enthielten, das hergestellt wurde, indem man 1 mM IPTG und 100 ppm Ampicillin zu dem Medium, das in Tabelle 3 dargestellt ist, zugibt, und wurden über Nacht bei 30°C kultiviert. Aus diesen Kulturen wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Die Aspartaseaktivität betrug 0,85 mol L-Asparaginsäuregehalt/Std. pro Gramm der Zellen.
Die Zellen wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel immobilisiert, um eine immobilisierte Aspartase zu erhalten. Die Aktivität der immobilisierten Aspartase betrug 2800 U.
Die so hergestellte immobilisierte Aspartase wurde in 20%-iger Ammoniumfumaratlösung (pH 8,3) bei 4°C über Nacht eingetaucht, wovon 10 ml verwendet wurden, um einen säulenförmigen Reaktor (1 cm Durchmesser) zu füllen, um eine kontinuierliche Reaktion durchzuführen, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde. Die Länge der geladenen immobilisierten Aspartaseschicht betrug etwa 13 cm. Eine Substratlösung (20°C) wurde mit einer Flußrate von 100 ml/Std. (LHSV = 10,0) eingespeist.
Drei Stunden nach dem Reaktionsbeginn wurde das Reaktionsgemisch analysiert. Die Mole des erhaltenen Reaktionsprodukts, d.h. der L-Asparaginsäure, waren im wesentlichen gleich zu den Molen der verbrauchten Fumarsäure. Die Umsetzungsrate der Reaktion betrug 99,6%. Die Temperatur des Ausflusses betrug 33°C. Die Umsetzungsrate blieb bei 99,5% über sieben Tage und sogar einen Monat nach dem Reaktionsbeginn.
Beispiel 3
Der rekombinante E. coli-Stamm PUaspP1, der in der Lage ist, Pseudomonas fluorescens-Aspartase zu exprimieren, wurde zu 10 Probenröhren inokuliert, die jeweils 3 ml eines Mediums enthielten, das hergestellt wurde, indem 100 ppm Ampicillin zu dem Medium, das in Tabelle 1 dargestellt ist, zugegeben wurden, und wurde bei 37°C kultiviert. Nach 8 Stunden wurden die Kulturen in den Probenröhrchen jeweils zu 10 Sakaguchi-Flaschen inokuliert, die jede 100 ml eines Mediums enthielten, das hergestellt wurde, indem man 1 mM IPTG und 100 ppm Ampicillin zu dem Medium, das in Tabelle 3 dargestellt ist, zugibt, und wurden über Nacht bei 30°C kultiviert. Aus diesen Kulturen wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Die Aspartaseaktivität betrug 0,85 mol L-Asparaginsäuregehalt/Std. pro Gramm der Zellen.
Die Zellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben immobilisiert, um eine immobilisierte Aspartase zu erhalten mit dem Unterschied, daß nur die Hälfte der Zellen für die Immobilisierung verwendet wurde. Die Aktivität der immobilisierten Aspartase betrug 560 U.
Die so hergestellte immobilisierte Aspartase wurde in 20%-iger Ammoniumfumaratlösung (pH 8,3) bei 4°C über Nacht eingetaucht, wovon 10 ml verwendet wurden, um einen säulenförmigen Reaktor (1 cm Durchmesser) zu füllen, um eine kontinuierliche Reaktion, wie sie in Beispiel 2 beschrieben wurde, durchzuführen, außer daß die Substratlösung in einem Thermostat bei 23°C gehalten wurde. Die Substratlösung wurde mit einer Flußrate von 100 ml/Std. (LHSV = 10,0) eingespeist.
Drei Stunden nach dem Reaktionsbeginn wurde das Reaktionsgemisch analysiert. Die Mole des erhaltenen Reaktionsprodukts, d.h. der L-Asparaginsäure, waren im wesentlichen gleich zu den Molen der verbrauchten Fumarsäure. Die Umsetzungsrate der Reaktion betrug 99,6%. Die Temperatur des Ausflusses betrug 36°C. Die Umsetzungsrate blieb bei 99,5% über sieben Tage und sogar einen Monat nach Reaktionsbeginn.
Beispiel 4
Der rekombinante E. coli-Stamm PUaspE2, der in der Lage ist, E. coli-Aspartase zu exprimieren, wurde zu 10 Probenröhren inokuliert, die jeweils 3 ml eines Mediums enthielten, das hergestellt wurde, indem 100 ppm Ampicillin zu dem Medium, das in Tabelle 1 dargestellt ist, zugegeben wurden, und wurde bei 37°C kultiviert. Nach 8 Stunden wurden die Kulturen in den Probenröhrchen jeweils zu 10 Sakaguchi-Flaschen inokuliert, die jede 100 ml eines Mediums enthielten, das hergestellt wurde, indem man 1 mM IPTG und 100 ppm Ampicillin zu dem Medium, das in Tabelle 3 dargestellt ist, zugibt, und wurden über Nacht bei 30°C kultiviert. Aus diesen Kulturen wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Die Aspartaseaktivität betrug 1,27 mol L-Asparaginsäuregehalt/Std. pro Gramm der Zellen.
Die Zellen wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 immobilisiert, um eine immobilisierte Aspartase zu erhalten. Die Aktivität der immobilisierten Aspartase betrug 3200 U.
Die so hergestellte immobilisierte Aspartase wurde in 20%-iger Ammoniumfumaratlösung (pH 8,3) bei 4°C über Nacht eingetaucht, wovon 10 ml verwendet wurden, um einen säulenförmigen Reaktor (1 cm Durchmesser) zu füllen, um eine kontinuierliche Reaktion, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde, durchzuführen. Eine Substratlösung (20°C) wurde mit einer Flußrate von 100 ml/Std. (LHSV = 10,0) eingespeist.
Drei Stunden nach dem Reaktionsbeginn wurde das Reaktionsgemisch analysiert. Die Mole des erhaltenen Reaktionsprodukts, d.h. der L-Asparaginsäure, waren im wesentlichen gleich zu den Molen der verbrauchten Fumarsäure. Die Umsetzungsrate der Reaktion betrug 99,6%. Die Temperatur des Ausflusses betrug 33°C. Die Umsetzungsrate blieb bei 99,6% über sieben Tage und sogar einen Monat nach Reaktionsbeginn.
Um einen Druckverlust der immobilisierte Aspartase zu messen, wurde Wasser (20°C) durch die Säule fließen gelassen. Als ein Ergebnis betrug der Druckverlust 0,7 kg/cm² pro Meter der Länge einer immobilisierten Aspartaseschicht, wenn die LHSV 20 ist (1 l/Std.).
Beispiel 5
Der rekombinante E. coli-Stamm PUaspE2, der in der Lage ist, E. coli-Aspartase zu exprimieren, wurde, wie in Beispiel 4 beschrieben, kultiviert, um Zellen zu sammeln. Die Aspartaseaktivität betrug 1,00 mol L-Asparaginsäuregehalt/Std. pro Gramm an Zellen. Die immobilisierte Aspartase wurde wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten, außer daß nur ein Zehntel der erhaltenen Zellen verwendet wurde. Die Aktivität der immobilisierten Aspartase betrug 265 U.
Die so hergestellte immobilisierte Aspartase wurde in 20%-iger Ammoniumfumaratlösung (pH 8,3) bei 4°C über Nacht eingetaucht, wovon 10 ml verwendet wurden, um einen säulenförmigen Reaktor (1 cm Durchmesser) zu füllen, um eine kontinuierliche Reaktion, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde, durchzuführen. Eine Substratlösung (20°C) wurde mit einer Flußrate von 20 ml/Std. (LHSV = 2,0) eingespeist. Drei Stunden nach dem Reaktionsbeginn wurde das Reaktionsgemisch analysiert. Die Mole des erhaltenen Reaktionsprodukts, d.h. der L-Asparaginsäure, waren im wesentlichen gleich zu den Molen der verbrauchten Fumarsäure. Die Umsetzungsrate der Reaktion betrug 99,2%. Die Temperatur des Ausflusses betrug 31°C. Die Umsetzungsrate blieb bei 99,2% über sieben Tage und sogar einen Monat nach Reaktionsbeginn.
Beispiel 6
Der rekombinante E. coli-Stamm PUaspE2, der in der Lage war, E. coli-Aspartase zu exprimieren, wurde kultiviert, um die Zellen zu sammeln, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Aspartaseaktivität betrug 1,20 mol L-Asparaginsäuregehalt/Std. pro Gramm der Zellen. Aus den Zellen wurde eine immobilisierte Aspartase hergestellt, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde. Die immobilisierte Aspartase wies eine Aspartaseaktivität von 3600 U auf.
Die so hergestellte immobilisierte Aspartase wurde in 20%-iger Ammoniumfumaratlösung (pH 8,3) bei 4°C über Nacht eingetaucht, wovon 10 ml verwendet wurden, um einen säulenförmigen Reaktor (1 cm Durchmesser) zu füllen, um eine kontinuierliche Reaktion, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde, durchzuführen. Eine Substratlösung (20°C) wurde mit einer Flußrate von 200 ml/Std. (LHSV = 20,0) eingespeist.
Drei Stunden nach dem Reaktionsbeginn wurde das Reaktionsgemisch analysiert. Die Mole des erhaltenen Reaktionsprodukts, d.h. der L-Asparaginsäure, waren im wesentlichen gleich zu den Molen der verbrauchten Fumarsäure. Die Umsetzungsrate der Reaktion betrug 97,0%. Die Temperatur des Ausflusses betrug 33°C. Die Umsetzungsrate blieb bei 97,0% über sieben Tage und sogar einen Monat nach Reaktionsbeginn.
Beispiel 7
Der rekombinante E. coli-Stamm PUaspE2, der in der Lage war, E. coli-Aspartase zu exprimieren, wurde kultiviert, um die Zellen zu sammeln, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Aspartaseaktivität betrug 1,20 mol L-Asparaginsäuregehalt/Std. pro Gramm der Zellen. Aus den Zellen wurde eine immobilisierte Aspartase hergestellt, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde. Die immobilisierte Aspartase wies eine Aspartaseaktivität von 3600 U auf.
Die so hergestellte immobilisierte Aspartase wurde in 20%-iger Ammoniumfumaratlösung (pH 8,3) bei 4°C über Nacht eingetaucht, wovon 10 ml verwendet wurden, um einen säulenförmigen Reaktor (1 cm Durchmesser) zu füllen, um eine kontinuierliche Reaktion, wie sie in Beispiel 1 be schrieben wurde, durchzuführen. Eine Substratlösung (20°C) wurde mit einer Flußrate von 250 ml/Std. (LHSV = 25,0) eingespeist.
Drei Stunden nach dem Reaktionsbeginn wurde das Reaktionsgemisch analysiert. Die Mole des erhaltenen Reaktionsprodukts, d.h. der L-Asparaginsäure, waren im wesentlichen gleich zu den Molen der verbrauchten Fumarsäure. Die Umsetzungsrate der Reaktion betrug 90%. Die Temperatur des Ausflusses betrug 31°C. Die Umsetzungsrate blieb bei 90% über sieben Tage und sogar einen Monat nach Reaktionsbeginn.
Beispiel 8
Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde der rekombinante E. coli-Stamm PUaspE2, der in der Lage war, E. coli-Aspartase zu exprimieren, zweimal kultiviert und der Immobilisierungsprozedur unterworfen, um etwa 600 ml einer immobilisierten Aspartase herzustellen. Die immobilisierte Aspartase wies eine Aspartaseaktivität von 3000 U auf. Die so hergestellte immobilisierte Aspartase wurde in 20%-iger Ammoniumfumaratlösung (pH 8,3) für 1 Woche eingetaucht, wovon 500 ml verwendet wurden, um einen säulenförmigen Reaktor (1 Inch/2,54 cm Durchmesser) zu füllen, um eine kontinuierliche Reaktion, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchzuführen. Die Länge der immobilisierten Aspartaseschicht betrug 80 cm.
Die Reaktion wurde durchgeführt unter den Bedingungen, bei denen die Temperatur der Substratlösung 24°C betrug und die Flußrate 5 l/Std. (LHSV = 10) betrug. Zwei Stunden nach Reaktionsbeginn wurde das Reaktionsgemisch analysiert. Die Mole des erhaltenen Reaktionsprodukts, d.h. der L-Asparaginsäure, waren im wesentlichen gleich zu den Molen der verbrauchten Fumarsäure. Die Umsetzungsrate der Reaktion betrug 99,4%.
Drei Stunden nach dem Reaktionsbeginn wurde die Flußrate in 10 l/Std. (LHSV = 20) geändert. Eine Stunde später wurde das Reaktionsgemisch analysiert. Die Mole des erhaltenen Reaktionsprodukts, d.h. der L-Asparaginsäure, waren im wesentlichen gleich zu den Molen der verbrauchten Fumarsäure. Die Umsetzungsrate der Reaktion betrug 98,2%.
Fünf Stunden nach Reaktionsbeginn wurde die Flußrate in 12,5 l/Std. (LHSV = 25) geändert. Eine Stunde später wurde das Reaktionsgemisch analysiert. Die Mole des erhaltenen Reaktionsprodukts, d.h. der L-Asparaginsäure, waren im wesentlichen gleich zu den Molen der verbrauchten Fumarsäure. Die Umsetzungsrate der Reaktion betrug 96,3%.
Sieben Stunden nach dem Reaktionsbeginn wurde die Flußrate in 15 l/Std. (LHSV = 30) geändert. Eine Stunde später wurde das Reaktionsgemisch analysiert. Die Mole des erhaltenen Reaktionsprodukts, d.h. der L-Asparaginsäure, waren im wesentlichen gleich zu den Molen der verbrauchten Fumarsäure. Die Umsetzungsrate der Reaktion betrug 93,8%.
Neun Stunden nach dem Reaktionsbeginn wurde die Flußrate in 17,5 l/Std. (LHSV = 35) geändert. Eine Stunde später wurde das Reaktionsgemisch analysiert. Die Mole des erhaltenen Reaktionsprodukts, d.h. der L-Asparaginsäure, waren im wesentlichen gleich zu den Molen der verbrauchten Fumarsäure. Die Umsetzungsrate der Reaktion betrug 90,3%.
Elf Stunden nach dem Reaktionsbeginn wurde die Flußrate in 20 l/Std. (LHSV = 40) geändert. Eine Stunde später wurde das Reaktionsgemisch analysiert. Die Mole des erhaltenen Reaktionsprodukts, d.h. der L-Asparaginsäure, waren im wesentlichen gleich zu den Molen der verbrauchten Fumarsäure. Die Umsetzungsrate der Reaktion betrug 85,8%.
Vergleichsbeispiel 1
Der E. coli-Stamm K-12 (IFO3301) wurde zu 10 Probenröhrchen inokuliert, wovon jedes 3 ml des in Tabelle 3 gezeigten Mediums enthielt, und bei 37°C kultiviert. Nach 8 Stunden wurden die Kulturen in den Probenröhrchen jeweils zu 10 Sakaguchi-Flaschen inokuliert, die jeweils 100 ml des in Tabelle 3 gezeigten Mediums enthielten, und über Nacht bei 30°C unter Schütteln kultiviert. Von diesen Kulturen wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt. Die Aspartaseaktivität betrug 0,063 mol L-Asparaginsäuregehalt/Std. pro Gramm der Zellen. Von den erhaltenen Zellen wurde eine immobilisierte Aspartase hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die immobilisierte Aspartase wies eine Aktivität von 126 U auf.
Die so hergestellte immobilisierte Aspartase wurde in 20%-iger Ammoniumfumaratlösung (pH 8,3) bei 4°C über Nacht eingetaucht, wovon 10 ml verwendet wurden, um einen säulenförmigen Reaktor (1 cm Durchmesser) zu füllen, um eine kontinuierliche Reaktion, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde, durchzuführen. Eine Substratlösung (20°C) wurde mit einer Flußrate von 20 ml/Std. (LHSV = 2,0) eingespeist.
Drei Stunden nach dem Reaktionsbeginn wurde das Reaktionsgemisch analysiert. Die Mole des erhaltenen Reaktionsprodukts, d.h. der L-Asparaginsäure, waren im wesentlichen gleich zu den Molen der verbrauchten Fumarsäure. Die Umsetzungsrate der Reaktion betrug 86,4%. Die Temperatur des Ausflusses betrug 31°C. Die Umsetzungsraten betrugen sieben Tage und einen Monat nach Reaktionsbeginn jeweils 86,8% und 86,2%.
Vergleichsbeispiel 2
Der rekombinante E. coli-Stamm PUaspE1, der in der Lage war, E. coli-Aspartase zu exprimieren, wurde kultiviert, um eine immobilisierte Aspartase herzustellen, wie in Beispiel 5 beschrieben. Die Aktivität der immobilisierten Aspartase betrug 263 U.
Eine Substratlösung (200 g Fumarsäure, 200 g 25%-iger wäßriger Ammoniak, 0,25 g MgSO₄·7H₂O in 1 l; pH 8,3, eingestellt mit wäßrigem Ammoniak), die bei 30°C in einem Thermostat gehalten wurde, wurde in einen Reaktor mit einer Flußrate von 20 ml/Std. (LHSV = 2,0) über einen mit einem thermisch isolierenden Material eingehüllten Teflonschlauch eingespeist, um eine kontinuierliche Reaktion durchzuführen, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Drei Stunden nach dem Reaktionsbeginn wurde das Reaktionsgemisch analysiert. Die Mole des erhaltenen Reaktionsprodukts, d.h. der L-Asparaginsäure, waren im wesentlichen gleich zu den Molen der verbrauchten Fumarsäure. Die Umsetzungsrate der Reaktion betrug 99,7%. Die Temperatur des Ausflusses betrug 43°C. Die Umsetzungsraten betrugen sieben Tage und einen Monat nach Reaktionsbeginn jeweils 94,5% und 77,6%.
Vergleichsbeispiel 3
Der rekombinante E. coli-Stamm PuaspE2, der in der Lage war, E. coli-Aspartase zu exprimieren, wurde kultiviert, um Zellen zu sammeln, wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Aspartaseaktivität betrug 1,20 mol L-Asparaginsäuregehalt/Std. pro Gramm der Zellen. Aus den erhaltenen Zellen wurde eine immobilisierte Aspartase hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die immobilisierte Aspartase wies eine Aktivität von 3500 U auf.
Die so hergestellte immobilisierte Aspartase wurde in 20%-iger Ammoniumfumaratlösung (pH 8,3) bei 4°C über Nacht eingetaucht, wovon 10 ml verwendet wurden, um einen säulenförmigen Reaktor (1 cm Durchmesser) zu füllen, um eine kontinuierliche Reaktion, wie sie in Beispiel 1 beschrieben wurde, durchzuführen. Eine Substratlösung (20°C) wurde mit einer Flußrate von 300 ml/Std. (LHSV = 30,0) eingespeist.
Drei Stunden nach dem Reaktionsbeginn wurde das Reaktionsgemisch analysiert. Die Mole des erhaltenen Reaktionsprodukts, d.h. der L-Asparaginsäure, waren im wesentlichen gleich zu den Molen der verbrauchten Fumarsäure. Die Umsetzungsrate der Reaktion betrug 75%. Die Temperatur des Ausflusses betrug 31°C. Die Umsetzungsrate blieb bei 75% sieben Tage und sogar einen Monat nach Reaktionsbeginn.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann L-Asparaginsäure durch Verwendung eines Mikroorganismus mit hoher Aspartaseaktivität in einer hohen Ausbeute erhalten werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginsäure mit den Stufen, in denen man: mikrobielle Zellen, die Aspartase enthalten, immobilisiert, um eine immobilisierte Aspartase zu erzeugen, eine Ammoniumfumaratlösung in einen mit der immobilisierten Aspartase gefüllten Reaktor einführt und die erzeugte L-Asparaginsäure aus dem Reaktionsgemisch gewinnt, wobei i) die immobilisierte Aspartase eine Aktivität von 250 U (μmol/min/ml immobilisierte Aspartase) oder mehr hat, ii) die Ammoniumfumaratlösung in den Reaktor mit einer Beschickungsgeschwindigkeit LHSV (stündliche Flüssigkeitsraumgeschwindigkeit, gemessen als Volumen an eingespeister Ammoniumfumaratlösung (in ml) je Volumen immobilisierter Aspartase (in ml) je Stunde) von 2 bis 35 eingespeist wird, und iii) die Temperatur der in den Reaktor einzuführenden Ammoniumfumaratlösung derart gesteuert wird, daß sie gleich wie oder geringer als die Temperatur ist, die man durch Subtrahieren des Temperaturanstiegs der Ammoniumfumaratlösung, der während der Umsetzung zwischen Ammoniumfumarat und Aspartase auftritt, von der Temperatur, bei welcher die Stabilität der Aspartase beeinträchtigt wird, erhält.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Temperatur der in den Reaktor einzuführenden Ammoniumfumaratlösung im Bereich von 10 bis 33°C liegt.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Aspartase enthaltende mikrobielle Zelle eine mikrobielle Zelle mit einem Aspartasegen, das durch eine Technik mit rekombinanter DNA eingeführt wurde, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die immobilisierte Aspartase durch Beschichten eines kugelförmigen Trägers mit den Aspartase enthaltenden mikrobiellen Zellen in Kombination mit einem Polymer erhalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem man die immobilisierte Aspartase durch Beschichten eines kugelförmigen Ionenaustauschharzträgers vom Styrol-Divinylbenzol-Copolymer-Typ mit den aspartasehaltigen mikrobiellen Zellen vermischt mit einem Polymer erhalten hat, welches durch die allgemeine Formel
wiedergegeben wird, worin Y entweder eine direkte Bindung oder eine bifunktionelle Gruppe der Formel
bedeutet, R₁ und R₂ jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder ein organischer Rest sind, X^⊖ ein Anion ist und n eine ganze Zahl zwischen 100 und 5000 bedeutet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin der Druckverlust der immobilisierten Aspartase 2,0 kg/cm² oder weniger je Meter einer Länge der immobilisierten Aspartaseschicht (in Wasser bei 20°C) ist, wenn LHSV 2,0 ist.