WO2005028659A2 - Verfahren zur herstellung eines d-pantothensäure und/oder deren salze enthaltendes tierfuttersupplement - Google Patents

Verfahren zur herstellung eines d-pantothensäure und/oder deren salze enthaltendes tierfuttersupplement Download PDF

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WO2005028659A2
WO2005028659A2 PCT/EP2004/052308 EP2004052308W WO2005028659A2 WO 2005028659 A2 WO2005028659 A2 WO 2005028659A2 EP 2004052308 W EP2004052308 W EP 2004052308W WO 2005028659 A2 WO2005028659 A2 WO 2005028659A2
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pantothenic acid
salts
fermentation
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Christine Beck
Stefan Bitterlich
Hans-Peter Harz
Daniela Klein
Markus Lohscheidt
Edzard Scholten
Erich Schubert
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Basf Aktiengesellschaft
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/174—Vitamins

Definitions

  • the present invention relates to an improved process for the production of an animal feed supplement containing D-pantothenic acid and / or salts thereof, a genetically modified microorganism for use in the production process and an animal feed supplement containing D-pantothenic acid and / or its salts.
  • D-pantothenate As a starting product in the biosynthesis of coenzyme A, D-pantothenate is widely used in plants and animals. In contrast to humans, who ingest sufficient amounts of pantothenic acid through food, deficiency symptoms for D-pantothenate are frequently described for both plants and animals. The availability of D-pantothenate is therefore of great economic interest, especially in the animal feed industry.
  • D-pantothenate can be prepared by chemical synthesis from D-pantolactone and calcium- ⁇ -alaninate (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6 edition, 1999, electronic release, chapter "Vitamins”).
  • D-Pantolactone requires an elaborate, classic resolution of racemates via diastereomeric salts, and the sales product resulting from chemical synthesis is usually the calcium salt of D-pantothenic acid, calcium D-pantothenate.
  • EP 1 006 189 and EP 1 001 027 describe processes for producing pantothenate in which a content of at most 1 g / l of D-pantothenic acid is achieved in the fermentation solution.
  • Such low pantothenic acid contents in the fermentation solution ie less than 10% by weight based on the solids content, are, however, not very suitable for the economical production of animal feed supplements containing D-pantothenic acid.
  • the previously described methods for isolating the product from the fermentation medium require numerous complex work-up steps.
  • the published patent application DE 100 16 321 describes a fermentation process for producing an animal feed supplement containing D-pantothenic acid.
  • this process like the fermentative processes mentioned above, absolutely requires that the pantothenic acid precursor ⁇ -alanine is added to the microorganism via the fermentation medium in order to achieve economic yields of the desired product at all.
  • EP 0 590 857 describes a fermentation processor producing D-pantothenic acid, in which the cultivation of a microorganism absolutely requires the addition of ⁇ -alanine.
  • the fermentation solution is filtered to remove the insoluble constituents, then passed through a cation exchanger and then through an anion exchanger, then neutralized with calcium hydroxide, evaporated, mixed with activated carbon, filtered again and crystallized with the addition of methanol and calcium chloride.
  • the resulting calcium pantothenate-containing product contains, in addition to D-pantothenic acid in the form of the calcium salt, calcium chloride in a molar ratio of 1: 1. Electrodialysis followed by spray drying is required to reduce the calcium chloride content. Because of the large number of complex process steps and the use of organic solvents, this process is neither economical nor ecological.
  • the object of the present invention is to provide an animal feed supplement containing D-pantothenic acid and / or salts thereof and an improved process for its production which is independent of the addition of ⁇ -alanine as a cost-intensive precursor, in which the product is worked up more gently and product is lost are negligible.
  • the present invention relates to a process for producing an animal feed supplement containing D-pantothenic acid and / or salts thereof, wherein a) at least one organism producing D-pantothenic acid is used, the pantothenic acid (pan) and isoleucine valine (ilv) Biosynthesis is deregulated and lacks the ability to form thermostable spores, b) reproductive material is killed in the fermentation solution containing D-pantothenate, c) insoluble constituents are separated from the fermentation solution containing D-pantothenate and d) this solution is subjected to drying and / or formulation.
  • the expression “produce” means that the organism can synthesize larger amounts of D-pantothenic acid and / or its salts than are required for its own metabolic needs.
  • the amount of D-pantothenic acid and / or their salts do not pre-exist internally in the cell, but are ideally completely released from the organism into the culture medium. This discharge can take place actively or passively according to mechanisms known per se, such as specific membrane transport proteins, pores or by diffusion.
  • microorganisms are used as the organisms producing D-pantothenic acid.
  • these include fungi, yeasts and / or bacteria.
  • fungi such as, for example, Mucor or yeasts, such as.
  • coryneform bacteria or Bacillaceae are advantageously used.
  • According to the invention are preferably z. B.
  • Corynebacterium glutamicum Brevibacterium breve or Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. lentimorbus, B. lentus, B. firmus, B.pantothenticus, B. circulans, B. coagulans, B. megaterium, B. pumilus, B. thuringiensis, B. brevis, B. stearothermophilus and other Bacillus species of group 1, which are characterized by their 16sRNA or other strains of the group of Actinomycetales. This list is for the purpose of explanation and is in no way limitative of the present invention.
  • the present invention includes in particular the use of genetically modified organisms for the production according to the invention of an animal feed supplement containing free D-pantothenic acid and / or salts thereof.
  • genetically modified organisms can be isolated, for example, by chemical mutagenesis and subsequent selection using a suitable “screening method”
  • So-called "production strains” are also included, which are suitable for the manufacture of the product in the sense of the present invention and have genetic changes with regard to the metabolic flow in the direction of D-pantothenic acid, with changes in the discharge of D-pantothenic acid and / or its salts via the Cell membrane are included.
  • This can e.g. B. can be achieved by changing key positions in relevant metabolism biosynthetic pathways of the organism used.
  • transgenic organisms which result from the transfer of homologous and / or heterologous nucleotide sequences which are necessary or can be beneficial for the synthesis of the desired product.
  • Such transgenic organisms can advantageously contain additional copies and / or genetically modified genes selected from the group of panB, panC, panD, panE and / or their combinations and / or even organizational units, such as the panBCD operon and how for example in WO 01/021772, WO 02/057474, WO 02/057476 or WO 02/061108.
  • other metabolic pathways such as the isoleucine-valine biosynthetic pathway in the organisms, can advantageously be manipulated, as described, for example, in EP 1 006 189, EP 1 006 192, EP 1 006 193 or EP 1 001 027.
  • branched-chain precursors of pantothenic acid biosynthesis are increasingly being made available.
  • genes for this biosynthetic pathway ie ilvB, ilvN, ilvC and / or ilvD, are advantageously overexpressed, as described, for example, in WO 01/021772, WO 02/057474, WO 02/057476 or WO 02/061108.
  • panD aspartate ⁇ -decarboxylase
  • WO 01/021772 WO 02/057474, WO 02/057476 or WO 02/061108.
  • At least one gene that codes for an enzyme in a biosynthetic pathway so that the activity of the enzyme in the microorganism is changed or modified. It is preferred that at least one gene which codes for an enzyme of a biosynthetic metabolic pathway is changed in such a way that the gene product is produced more intensely or has an increased activity.
  • the term "deregulated metabolic pathway” also includes a biosynthetic pathway in which more than one gene encoding more than one enzyme is altered or modified so that the activities of more than one enzyme are altered or modified.
  • Changes or modifications may include, but are not limited to: removing the endogenous promoter or more regulatory Elements; Inserting strong promoters, inducible promoters, or multiple promoters simultaneously; Removing regulatory sequences so that the expression of the gene product is changed; Change in the chromosomal location of the gene; Alteration of the DNA sequence in the vicinity of the gene or within the gene such as e.g. B. the ribosomal binding site (RBS); Increasing the number of copies of the gene in the genome or by introducing plasmids of different numbers of copies; Modification of proteins (eg regulatory proteins, suppressors, enhancers, transcriptional activators, and the like) that play a role in the transcription of the gene and / or in the translation to the gene product. This also includes all other possibilities for deregulating the expression of genes which are state of the art, such as, for. B. the use of antisense oligonucleotides, or the blocking of repressor proteins.
  • RBS ribosomal binding
  • Deregulation can also involve changes in the coding region of genes, e.g. B. lead to cancellation of feedback regulation in the gene product or to a greater or lesser specific activity of the gene product.
  • enzymes are advantageous according to the invention which influence the outflow of precursors of pantothenic acid and / or the flow of pantothenic acid to coenzyme A.
  • enzyme-coding genes are: alsD, avtA, ilvE, ansB, coaA, coaX and others. This list is for the purpose of illustration and is in no way limiting for the present invention.
  • ß-alanine is thus already present in the cells in increased concentrations compared to correspondingly non-genetically modified organisms. That is to say that free ß-alanine or ß-alanine salts do not have to be the precursor Culture medium can be added.
  • Animal feed supplements therefore do not require the addition of precursors of D-pantothenic acid.
  • the addition of free ⁇ -alanine and / or ⁇ -alanine salt is not necessary.
  • pantothenic acid pan
  • isoleucine-valine ilv
  • aspartic ⁇ -decarboxylase panD
  • panE ketopanthoat reductase
  • coaA gene which is required for the synthesis of coenzyme A is reduced or if it is completely switched off (for example in Bacillus species).
  • the activity of this gene coaX or of the corresponding enzyme can also be changed, preferably reduced, or even deleted, provided that coaA itself still has sufficient, albeit reduced, enzyme activity, ie the enzyme activity of coaA has not been completely lost.
  • the present invention also relates to a genetically modified microorganism whose pantothenic acid (pan) and isoleucine / valine (ilv) biosynthesis is deregulated and which lacks the ability to form thermostable spores.
  • This microorganism according to the invention is further characterized in that, without the addition of free ⁇ -alanine and / or ⁇ -alanine salt, it forms at least 35% by weight of D-pantothenic acid and / or its salts.
  • pantothenic acid pan
  • isoleucine valine aspartic ⁇ -decarboxylase
  • panE ketopanthoat reductase
  • Another variant of advantageous microorganisms according to the invention are those whose pantothenic acid (pan) and isoleucine valine (ilv) biosynthesis and aspartic ⁇ -decarboxylase (panD) are deregulated and whose ketopanthoate reductase (panE) is overexpressed and which also have the ability to form thermostable spores is missing.
  • the genetically modified microorganism of the present invention is 100% non-viable after heating at temperatures in the range of 50 ° C to 140 ° C for a period of about 1 to 30 minutes. Temperatures of> 60 ° C. and holding times of approximately 20-30 minutes are preferred, particularly preferably approximately 70-90 ° C.
  • heating at about 140 ° C. and a holding time of are also advantageous about 3 minutes.
  • the microorganisms genetically modified according to the invention are preferably those of the genus Bacillus. Particularly preferred are the species Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. lentimorbus, B. lentus, B. firmus, B. pantothenticus, B. circulans, B. coagulans, B. megaterium, B. pumilus , B. thuringiensis, B. brevis, B. stearothermophilus and other Group 1 Bacillus species which are characterized by their 16sRNA. In particular, it concerns the species B. subtilis, B. licheniformis or B. amyloliquefaciens.
  • the present invention also relates to the use of the genetically modified microorganism for producing a D-pantothenate and / or animal feed supplement containing the salts thereof.
  • the bacterial strains described in WO 01/21772 such as PA 221, PA 303 and PA 327 and / or derivatives thereof.
  • the microorganism Bacillus subtilis PA 766 is used in the method according to the invention.
  • This strain Bacillus subtilis PA 766 was produced as follows:
  • the strain PY79 was generated by transducing the Trp + marker (from the Bacillus subtilis wild type W23).
  • classical genetic engineering methods e.g. in Harwood, CR and Cutting, SM (editors), Molecular Biological Methods for Bacillu $ 1990) John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, England
  • ⁇ panB and ⁇ panEI mutations introduced.
  • the resulting strain was transformed with Bacillus subtilis genomic DNA strain PA221 (genotype P 2 6panBCPtrpC2 (Trp-)) and genomic DNA from Bacillus subtilis strain PA303 (genotype P ⁇ panEI).
  • the resulting strain PA327 has the genotype P ⁇ panBCJP ⁇ panEI and is tryptophan auxotroph (Trp-).
  • Bacillus subtilis strain PA221 (genotype Pi ⁇ pan BCJ3rpC2 (Trp)) is described in the following section: Using classical genetic engineering methods, the sequence information of the pa nBCKDperon from E. coli (see Merkel et al., FEMS Microbiol. Lett., 143, 1996: 247-252) starting from a Bacillus subtilis GP275 plasmid library and cloning the panBCDOperon from Bacillus. For cloning, the E. coli strain BM4062 (bir te ) and the information that the Bacillus operon is close to the birA gene was used. The panBCDOperon was introduced into a plasmid replicable in E.
  • This plasmid was transformed into the Bacillus subtili strain RL-1 (derivatives of Bacillus subtilia68 obtained by classical mutagenesis (Marburg strain ATCC 6051), genotype trpC2 (Trp-)) and the native panBCB peron was replaced by the p 2 6panBCD operon by homologous recombination.
  • the resulting strain is called PA221 and has the genotype P26panBCP trpC2 (Trp-).
  • the preparation of the Bacillus subtilis strain PA303 (genotype P ⁇ pa ⁇ EI) is described in the following section:
  • the BacilluspanE sequence was cloned analogously using the E. coli panE gene sequence. It was found that there are homologues of the E. coli panE gene in B. subtiliawei, which were designated panE1 and panE2. Deletion analysis showed that the panE1 gene is responsible for 90% of pantothenic acid production, while the deletion of the panE2 gene had no significant effect on pantothenic acid production.
  • the promoter was replaced by the strong constitutive promoter P ⁇ and the ribosome binding site in front of the panE1 gene was replaced by the artificial binding site.
  • the 26panE1 fragment was cloned into a vector designed so that the P26panE1 fragment could subtilis integrate into the original panE1 locus in the Bacillus genome.
  • the strain resulting from transformation and homologous recombination is called PA303 and has the genotype P ⁇ panEL
  • the further stem construction was carried out by transforming PA327 with a plasmid which contained the P-si I v BNQ peron and the marker gene for spectinomycin.
  • One transformant was designated PA340 (genotype P 2 6pa n B CpP 2 6panE1, Pasi lvB NCspecR, trpC2 (Trp-)).
  • a deregulated ilvD cassette was introduced into the PA340 strain.
  • a plasmid which contains the ilvD gene under the control of the P ⁇ promoter with the artificial RBS2 was transformed into PA340.
  • the P26ÜVD gene was integrated into the original ilvD locus by homologous recombination.
  • the resulting one Strain PA374 has the genotype Paspa n B CP P-spanEI, P ⁇ i lvB NC PjsilvD, specR and trpC2 (Trp-).
  • strain PA374 In order to produce feed-free pantothenic acid with the strain PA374 ß-alanine, a deregulated pa nBC * t cassette which contains an artificial RBS for panD (NDIII; according to WO 01/21772) was introduced into strain PA374.
  • strain PA374 was first transformed with the plasmid pAN623 (FIG. 1).
  • a marker gene for chloramphenicol resistance was integrated by homologous recombination and at the same time the pa n B C-GDperon was deleted.
  • the resulting strain PA640 has the genotype ⁇ pa n B CD? 26panE1, P ⁇ i lv B NjCP ⁇ eilvD, specR, camR and trpC2 (Trp-).
  • pAN623 The construction of pAN623 is shown in Figure 1. It was prepared by ligation of a 4583 nucleotide Agel / B restriction fragment from plasmid pAN622 with a 1586 nucleotide Aval / B a Hfi restriction fragment from plasmid pECC4 (Prof. Losick; Harvard University) Agel and B a Hti produced cohesive ends are compatible with those produced with Aval and B gl (The origin of replication is described below. The resulting nucleotide sequence of the pECC4 fragment located between the Aval and B a Hti interfaces is shown in SEQ ID No. 2. Plasmid pAN622 (Fig.
  • Plasmid pASK-1BA5 was developed by Genosys Biotech nologies, Woodlands, Texas, USA. Construction of plasmid pAN408 is described below.
  • Plasmid pAN408 (Fig. 3) was ligated by ligating a 3145 nucleotide Hpal / Sacl restriction fragment from DNA from Bacillus subtilis GP275 (this is a variant of B. subtilis 168 Marburg strain ATCC 6051 with the wild type allele of pan BC DOperon) with a 3981 nucleotide Sacl / Pmel restoration fragment made from plasmid pBADMycHisA.
  • the Hpal / Sacl restriction fragment from Bacillus subtili £ P275 contains the pa n B C ID) peron (genolist.pasteur.fr access numbers are BG11519 (panB), BG11520 (panC) and BG1 1493 (panD)).
  • the restriction endonucleases Hpal and Pmel produce blunt ends that can be ligated together.
  • Plasmid pBADMycHisA was purchased from Firmalnvitrogen, Carlsbad, California, USA.
  • strain PA640 was transformed with genomic DNA from strain PA731 (genotype P 2 ⁇ pa nBC * p. Selection by pantothenic acid-free medium with tetracycline gave strain PA735A. This strain had the genotype F26pa n BC * pP26panE1, P ⁇ i lvB NC PasilvD, specR, tetR and trpC2 (Trp-).
  • a deregulated glyA cassette was subsequently introduced into strain PA735A and a deletion at the spollG locus was simultaneously introduced.
  • strain PA735A with the plasmid pAN683 was used. 4) transformed.
  • Plasmid pAN683 was prepared by ligation of a 5922 nucleotide Asp718l / Notl restriction fragment from plasmid pOLL30 (SEQ ID No. 1) with a 2138 nucleotide Asp718l / Notl restriction fragment from plasmid pAN398.
  • the nucleotide sequence of the restriction fragment from pOLL30 used for the construction of pAN683 is in SEQ ID No. 1 included.
  • pAN398 is a rop + variant of the standard vector pBR322 (genebank access number J01749) which contains a cassette for the expression of the glyA gene from B. subtilis ⁇ n.
  • Plasmid pAN398 also contains a chloramphenicol resistance gene from plasmid pC194 (Genbank accession number NC 002013).
  • the glyA expression cassette begins at a NotI interface with a transcription terminator that is located in the Bacillus subtilis genome immediately upstream of the bioW gene. This is followed by the P ⁇ promoter from the B. subtilissacteriophage SP01, an artificial RBS, the B. subtiliglyA gene, a double transcription terminator (T1T2) derived from the E. coli 23S rRNA transcript and an Asp718l interface.
  • T1T2 double transcription terminator
  • the glyA region in pAN398 was obtained as a template by PCR with DNA from the B. subtilis wild type.
  • the glyA sequence in pAN398 contains, compared to that in the B. subtilis genome (access number of the genolist.pasteur.fr library number BG10944 ( glyA)) published a base exchange sequence, which leads to the replacement of aspartate by asparagine in position 8 in the amino acid sequence.
  • pAN398 is inFig. 11, the complete DNA sequence of pAN398 is in SEQ ID No. 5 shown.
  • the above-described plasmid pAN683 (FIG. 4) contains a P ⁇ glyA cassette, a kanamycin resistance gene and flanking DNA fragments which are upstream and downstream of the spollG locus. Selection for kanamycin gave the strain PA753. This has the genotype P 26 pa nBC * P PapanEI, P ⁇ i lv BNPP ⁇ tsilvD, P ⁇ sglyA, ⁇ spollG, specR, tetR, kanR and trpC2 (Trp-). Then tryptophan prototrophic variants of PA753 were produced. For this purpose, PA753 was transformed with the plasmid pOLL31 (FIG. 5).
  • PCR product was cut with SpeI (this interface is contained in the 5'-PCR primer) and then with plasmid pASK-1BA3 (company Genosys Biotechnologies, Woodlands, Texas, USA), which had previously been digested with Xbal and Smal.
  • the cohesive ends produced with Xbal and Spei are compatible.
  • Pfx D N-Rblymerase provides PCR products with blunt ends that can be ligated to the blunt ends resulting from Smal digestion.
  • the resulting nucleotide sequence of the uncut trp-operon PCR product used for the construction of pOLL31 is shown in SEQ ID No. Third
  • strain PA354 which has the genotype P ⁇ epa n B CP P ⁇ panEI, P ⁇ ilvD, P ⁇ i lv B NCspecR, trpC2 (Trp-).
  • PA354 was transformed with genomic DNA from strain PA650, in which the end of the panC and the beginning of the panD gene were replaced by a chloramphenicol resistance gene.
  • chloramphenico strain PA630 was obtained.
  • PA630 was derived from strain genomic DNA PA651 transformed. This contains the panC * allele, which contains the artificial RBS NDIII for panD.
  • strain PA636 was obtained, which has the genotype P26pa n BC * pP26panE1, P ⁇ ilvD, P26ÜvB NpspecR, trpC2 (Trp-). PA636 was transformed with the NotI cut plasmid pAN680 (Fig. 6). An amplifiable P26pa n BC * ⁇ Cassette was integrated into the original locus by homologous recombination (selection for tetraz ⁇ clin). The resulting strain is called PA731.
  • Plasmid pOTP61 is described in WO 01/021772 and its sequence is described in SEQ ID No. 6 reproduced.
  • the construction of plasmid pAN678 is shown in Fig. 7. It was prepared by digesting plasmid pAN666 with Agel and B gl and isolating the 4071 nucleotide fragment. This fragment was ligated with an 1196 nucleotide Agel / B gl restriction fragment from plasmid pAN664 containing the panC * allele.
  • FIG. 8 shows the construction of plasmid pAN664.
  • Plasmid pAN622 (Fig. 2) was digested with Apal and B ⁇ to remove the 3 'end of the panC gene and the 5' end of the panD gene.
  • the 5442 nucleotide fragment was isolated and ligated to a 337 nucleotide Apal / B gl restriction fragment from plasmid pAN443 containing the artificial RBS for panD (NDIII).
  • Plasmid pAN443 is described in WO 01/021772.
  • Figure 9 shows the construction of pAN666.
  • Two restriction fragments from plasmid pAN654 were isolated: a 1415 nucleotide B ⁇ a Hh fragment and a 2606 nucleotide B ⁇ 'Smal fragment. This both fragments were ligated to a 411 nucleotide fragment from plasmid pAN426.
  • the latter fragment was prepared by digesting plasmid pAN426 with Xbal, filling in the protruding ends with T4 DNA polymerase and subsequent digestion with B a Hh.
  • the blunt end produced with deiT4 DNA polymerase can be ligated to the blunt end from digestion of plasmid pAN654 with Smal.
  • Plasmid pAN426 is described in WO 01/021772.
  • the construction of pAN654 is described below.
  • Fig. 10 shows the construction of plasmid pAN654.
  • the B. subtilis panB gene was primed with an interface for Xbal and an artificial RBS for panB at the 5 'end and the 5' half of a Smal interface at the 3 'end
  • the 3 'primer for the PCR reaction was synthesized with a 5' phosphate group.
  • the Pfx D-N polymerase (Invitrogen Life Technologies) used for the PCR reaction provides products with blunt ends that can be negated with the blunt ends from the Smal digestion.
  • the PCR product was digested with Xbal and the resulting 855 nucleotide fragment was ligated with a 3169 nucleotide Xbal / Smal restriction fragment from plasmid pASK-1 BA3 (Genosys Biotechnologies, Woodlands, Texas, USA).
  • the nucleotide sequence of the uncut panB PCR product, which was used for the construction of plasmid pAN654, is shown in SEQ ID No. 4 shown.
  • Strain PA374 was transformed with the plasmid pAN440 (WO 01/02772, Fig. 12). By homologous recombination (selection for chloramphenicol) the end of the panC- and the beginning of the panD- Gene replaced by a chloramphenicol resistance gene. The resulting strain is called PA650.
  • Strain PA650 was transformed with the plasmid pAN443 (WO 01/02772, Fig. 13).
  • the panC * allele (which contains the artificial RBS NDM I for panD) was introduced by homologous recombination, the panD gene was restored and the chloramphenicol resistance gene was also deleted.
  • Strain PA651 was obtained by selection on medium without pantothenic acid.
  • pantothenic acid concentration in the fermentation solution is conceivable by further media optimization, by increasing the fermentation time, by process and strain improvement and by combinations of the individual steps.
  • the pantothenic acid concentrations described above can also be achieved by fermentation of strains which are derivatives of the above-described PA766. Derivatives can be produced through classic strain development as well as through further genetic engineering manipulations.
  • the fermentation can be carried out according to procedures known per se in batch, fed-batch or repeated fed-batch operation or with continuous process control.
  • a major advantage of the process according to the invention is that the fermentation is carried out in a culture medium which, besides contains at least one carbon and nitrogen source as starting compounds no further precursor.
  • such precursors are understood to mean substances such as, for example, ⁇ -alanine and / or L-aspartate and / or L-valine and / or ⁇ -ketoisovalerate and / or combinations thereof.
  • the fermentation of the D-pantothenic acid-producing organism is carried out in a culture medium which contains a carbon and a nitrogen source, but to which no free ß-alanine and / or ß-alanine salts have been added or in the course is fed to the fermentation.
  • D-pantothenic acid in ranges of at least 35% by weight, preferably in concentration ranges of at least 40 to 50% by weight, particularly preferably of at least 50% by weight, according to the invention there is no addition of free ⁇ -alanine and / or ⁇ -alanine salts required.
  • ß-alanine and / or ß-alanine salts are not excluded according to the invention, so that consequently the yield of D-pantothenic acid can be further improved by adding ß-alanine and / or ß-alanine salts.
  • pantothenic acid can be increased, for example, by a further 50% by adding free ß-alanine and / or ß-alanine salts.
  • up to 20 g / l of free ß-alanine and / or ß-alanine salts can be added to the culture medium to further increase the pantothenic acid yield by more than 50%. It is preferred to add about 15 g / l of free ⁇ -alanine and / or ⁇ -alanine salts to the culture medium.
  • carbon sources suitable according to the invention for use in a culture medium for fermentation of the aforementioned organisms are sugars, such as starch hydrolysates (mono-, di-, oligosaccharides), preferably glucose or sucrose, and beet or cane sugar molasses, proteins, protein hydrolyzates, soybean meal, corn steep liquor, fats, free fatty acids, recirculated cells from fermentations already carried out or their hydrolyzates and yeast extract. These lists are not limitative of the present invention.
  • the present method is advantageously characterized in that the total sugar content is reduced to a minimum until the end of the fermentation, since this would otherwise make subsequent drying and / or formulation of the fermentation solution more difficult by sticking together.
  • This can be achieved according to the invention in that the fermentation is continued for some time after the carbon source has been consumed (in the case of cultivation in batch mode) or after the carbon supply (in the case of process control in fed-batch or repeated-fed-batch mode) is interrupted and / or regulated in such a way that the concentration of the carbon source is almost Is zero (for fed-batch, repeated-fed-batch or more continuous
  • Saturation value is continued in the fermentation solution.
  • nitrogen sources suitable according to the invention are ammonia, ammonium sulfate, urea, proteins, protein hydrolyzates or yeast extract. This list is also not limiting for the present invention.
  • the fermentation medium also contains mineral salts and / or
  • compositions of suitable fermentation media are widely known and accessible to the person skilled in the art.
  • the organism After the fermentation medium has been inoculated with a suitable D-pantothenic acid-producing organism (with cell densities known to the person skilled in the art), the organism is cultivated, if appropriate with the addition of an anti-foaming agent.
  • the pH of the medium can be adjusted using various inorganic or organic alkalis or acids, such as, for example, NaOH, KOH, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrochloric acid, formic acid, succinic acid or citric acid or combinations thereof. It is not only possible to use the above-mentioned means for adjusting the pH individually, but also to combine them.
  • the combination can be used in parallel or sequential of the named bases. For example, the sequential use of ammonia, for example in the form of ammonia gas, and NaOH is preferred.
  • ammonium concentration in the fermentation solution at the end of the fermentation is advantageously in the range from 0 to 20 g / l, preferably from 0-10 g / l, particularly preferably from 0-5 g / l lies.
  • D-pantothenic acid When used in the process according to the invention for the production of D-pantothenic acid, at least 35% by weight of D-pantothenic acid and / or salts thereof can be formed with this microorganism according to the invention by fermentation in a culture medium and corresponding preparation. Concentrations in the range of at least 40 to 50% by weight, particularly preferably at least 50% by weight, of D-pantothenic acid and / or salts thereof are preferably formed.
  • microorganism according to the invention meets the highest safety requirements, in particular with regard to the approval of products produced with genetically modified microorganisms, since its ability to reproduce via thermostable forms of persistence, e.g. thermostable spores, is excluded (sporulation knock-out mutant).
  • reproductive material is to be understood as meaning viable biological material, including its rest stages or forms of survival.
  • viable biological material including its rest stages or forms of survival.
  • These include the above viable material, for example cells or cell assemblies of microorganisms (such as bacteria, yeast, fungi), algae or protozoa, also viruses, genome elements capable of replication, and also spores and in particular thermostable spores.
  • Deactivation or killing of the reproductive material can generally e.g. through physical, chemical or enzymatic procedures that are part of the common laboratory routine.
  • thermal destruction such as e.g. sterilization or pasteurization, including radiation with ionizing or UV rays and sterile filtration.
  • Chemical methods are e.g. acid treatment, e.g. with hydrochloric acid or sulfuric acid, or the use of microbicidal gases, e.g. Formaldehyde or ozone.
  • the enzymatic methods include e.g. treatment with lysozyme.
  • the thermal destruction is carried out by heating the reproductive material.
  • thermal destruction offers the advantage of dispensing with auxiliary substances that would at least partially get into the product in the selected work-up process.
  • a thermal destruction takes place in step b). This can take place before or after the cell separation.
  • the previously enumerated possibilities of physical, chemical or enzymatic killing can also be used according to the invention for the successful 100% killing of material that can be propagated.
  • the advantage of the genetically modified microorganism according to the invention is that, due to its property of not forming thermostable spores, thermal killing under less stringent conditions, i.e. under more gentle conditions than with genetically modified ones. Microorganisms that form thermostable forms of persistence for later reproduction. “Thermal killing under less stringent conditions” means according to the invention that, for example, the medium containing the microorganism according to the invention can be treated more gently according to the invention without running the risk that subsequent contamination of the products due to microorganism cultures arising from thermostable spores can be expected According to the invention, there is a gentle thermal destruction over a holding time of 1 to 30 minutes at temperatures of approximately 50-140 ° C. Advantageous variants of the thermal destruction that is gentle on the invention include all conceivable combinations of low temperature with long holding times or high temperature lower stopping times.
  • the genetically modified microorganism according to the invention is no longer 100% capable of reproduction after heating at temperatures in the range from 50 ° C. to 140 ° C. over a period of about 1 to 30 minutes. Temperatures of> 60 ° C., for example about 60-120 ° C., and holding times of about 20-30 minutes are preferred preferably about 70-90 ° C and holding times of about 15-20 minutes, most preferably about 75-90 ° C and holding times of about 15-20 minutes and in particular about 85 ° C and a holding concert of about 15 minutes. Heating according to the invention at about 140 ° C. over a holding time of about 3 minutes is also advantageous.
  • a kill rate of 100% is achieved.
  • a 100% kill means that in 0.1 ml of the thermally killed and possibly diluted fermentation solution no reproductive material, in particular no cell of the genetically modified microorganism used, can be detected by growth on an antibiotic-free medium, which results in a cell density of less than 100 cfu / ml. This results in an animal feed supplement according to the invention which is free of contamination, i.e. 0% has reproductive material.
  • a killing rate according to the invention of 100% of reproductive material when performing a gentle thermal killing has the advantage that this e.g. Product contained in the fermentation solution must withstand less aggressive thermal requirements, i.e. product preparation is carried out more gently. This gentler product preparation advantageously results in lower losses or in increased yields of the desired product compared to common procedures.
  • the animal feed supplement according to the invention is thus contamination-free, ie it has a content of 0% of reproductive material. No cell growth could be detected by plating 0.1 ml of thermally treated fermentation solution, which corresponds to a cell density of less than 100 cfu / ml.
  • the present invention thus relates to a method for Production of animal feed supplement containing D-pantothenic acid and / or its salts, in which thermal killing of reproductive material at temperatures in the range from approximately 50-140 ° C. with holding times of approximately 1-30 minutes, preferably at temperatures of approximately 60-120 ° C.
  • the present invention furthermore relates to a method for producing animal feed supplement containing D-pantothenic acid and / or salts thereof, in which propagable material is thermally killed at a temperature of about 140 ° C. over a holding time of about 3 minutes.
  • insoluble constituents are separated from the fermentation solution in step c).
  • insoluble constituents include cells, cell assemblies, cell fragments, cell constituents, persistence forms, such as e.g. To understand spores or insoluble constituents of the fermentation medium.
  • the removal of the insoluble components after fermentation leads to a significant increase in the concentration of D-pantothenic acid and / or its salts in the end product.
  • Two requirements are imposed on the removal of the insoluble constituents from the fermentation solution.
  • the cell material should be separated as completely as possible in order to avoid high product concentrations in the To achieve the end product and, on the other hand, only minor product losses should occur for economic reasons.
  • the membranes used in accordance with the invention can, in an advantageous variant, be constructed from a separating layer which brings about the actual material separation and a single- or multilayer support layer which carries the separating layer and has coarser pores than the separating layer.
  • the separating layers and the support layer can consist of organic or inorganic polymers, ceramics, metal or carbon and must be stable in the reaction medium and at the process temperature.
  • the membranes preferred according to the invention have pore sizes between 1 and 1000 nm, preferably between 10 and 100 nm. For example, an ultrafiltration system with tube modules of the BTU-P19CAE type from Berghof was used
  • the membranes can be used in the form of hoses, tubes, capillaries, hollow fibers or flat membranes in flat, tube, multi-channel element, capillary or winding modules known per se.
  • the optimal transmembrane pressures between retentate and permeate are, depending on the diameter of the membrane pores or the separation limit (specified in molecular weight units), the mechanical stability of the membrane and depending on the membrane type 0.1 and 40 bar, preferably between 0.5 and 10, particularly preferably between 1 and 5 bar.
  • the optimal pressure is the pressure at which the permeate output is at a maximum. In this case, in the case where the feed (solution to be prepared) is supplied at too high a pressure, the transmembrane pressure can be adjusted by raising the permeate pressure.
  • the operating temperature depends on the stability of the product and the membrane. It is between about 20 and 90 ° C, preferably between about 40 and 70 ° C. Higher temperatures generally result in higher permeate flows.
  • Cell separation by means of membrane processes can take place in a so-called concentration mode, in which the cell mass is concentrated continuously (e.g. in at least one feed and bleed cycle) or discontinuously and the valuable product is obtained in the permeate.
  • the cell separation can advantageously also be carried out by another special form of membrane filtration, namely one
  • the diafiltration can be carried out discontinuously by passing the solution through a circuit containing a container, a pump and one or more membrane modules, and the pressures in the
  • Membrane modules are set so that permeate is obtained.
  • water or an aqueous solution is added continuously or at certain times, which the product to be separated cannot or only to a lesser extent
  • cell separation by means of diafiltration can also take place continuously, preferably several membrane modules in
  • water for example fully demineralized water
  • aqueous solution which does not contain the product to be separated or in a lower concentration than at the point of addition can be added.
  • the ultrafiltration or diafiltration can be carried out directly with the fermentation discharge or after treatment of the fermentation discharge, e.g. by centrifugation decantation or similar procedure or a combination thereof. Since a dilution of the valuable product occurs during the diafiltration, it is advantageous to concentrate the permeate or the collecting permeate consisting of several permeate fractions in a subsequent step to the desired concentration. This can e.g. by means of evaporation or by means of reverse osmosis, in each case using methods and apparatus known per se.
  • Centrifugation procedures are also known to those skilled in the art. Please refer to Centrifugal clarifiers and decanters for biotechnology (Technical Scientific Documentation No. 5, Third revised edition 1988 by P. Schenk, Westfalia Separator AG, Oelde, West Germany).
  • the solution containing D-pantothenic acid is treated for 1 to 15 minutes at 1000 to 8000 g and a temperature of 20 to 65 ° C.
  • the cells can be separated using conventional decanters or separators.
  • Fermentation solution is separated from the insoluble constituents by filtration, membrane technology, centrifugation, decanting or by combinations thereof, the product losses being less than 5% and the degree of separation for the insoluble constituents being greater than 95%.
  • insoluble constituents are separated from the fermentation solution containing D-pantothenate by ultrafiltration, preferably ultra-diafiltration.
  • insoluble constituents are separated from the fermentation solution containing D-pantothenate by centrifugation and subsequent decantation.
  • the separation of insoluble constituents from the fermentation solution containing D-pantothenate is achieved by a combination of centrifugation and decantation.
  • a particular choice of apparatus is, for example, a sedicator (type S3E from Flottweg) which is preferably used according to the invention.
  • a sedicator type S3E from Flottweg
  • the insoluble components of the fermentation solution are pressed with hydraulic support from a double-conical drum under a plunger.
  • a flocculant eg Sedipur CF 404, CF 504, CF 603
  • VE fully deionized
  • the cell mass is collected separately. This still contains considerable amounts of pantothenic acid in the extracellular water, which is mixed with water (and possibly flocculant) and passed again over the sediment in a subsequent washing step, further cell mass being separated off. This washing step proceeds from the procedure comparable to the first separation step. The second clearing is combined with the first.
  • the separation of the insoluble components, e.g. Cell mass from the fermentation solution can also be advantageously improved during centrifugation by using commercially available flocculants.
  • a multi-stage decanter and / or separator connection (co-current or counter-current mode of operation) is selected in which the insoluble constituents u. If it is mashed (diluted) with wash water or a process stream, the addition of flocculant before each stage leads to an improvement in the separation performance according to the invention. The loss of D-pantothenic acid can thus be considerably reduced.
  • the methods described for separating insoluble constituents from the fermentation solution containing D-pantothenic acid achieve degrees of separation of greater than 95%.
  • degrees of separation of approximately 98-100%, particularly preferably 100%, are achieved.
  • the solution containing D-pantothenic acid resulting from the separation can, if necessary before adding the calcium and / or magnesium salts and / or their bases, via a suitable evaporator, e.g. B. falling film evaporator, thin film evaporator or rotary evaporator.
  • a suitable evaporator e.g. B. falling film evaporator, thin film evaporator or rotary evaporator.
  • evaporators are e.g. B. manufactured by the companies GIG (4800 Attnang Puchheim, Austria), GEA Canzler (52303 Düren, Germany) Piessel (31103Hildesheim, Germany and Pitton (35274 Kirchhain, Deutschtad).
  • P-pantothenic acid is predominantly desirable in the form of its divalent salts, and above all the alkaline earth salts, since the divalent salts have less hygroscopic properties than monovalent salts of pantothenic acid and for further use, e.g. B. as animal feed supplement, thus less likely to cake.
  • the D-pantothenic acid formed is in the fermentation solution in the form depending on the buffer system used of the respective salt (s). Since the salts of D-pantothenic acid in the form of their monovalent cations are particularly disadvantageous, the fermentation solution is enriched with divalent cations according to the invention with the addition of calcium and / or magnesium salts or their bases, which can have a favorable effect on the drying properties. According to the invention, inorganic calcium and / or magnesium salts are advantageously to be understood as the corresponding halides.
  • these are preferably CaCl 2 and / or MgCl 2 .
  • Organic calcium and / or magnesium salts are understood to mean, for example, salts of organic anions. These are preferably z.
  • the use of bivalent cations in relation to the present D-pantothenic acid takes place in a ratio of 0.5 - 1.5: 1, preferably 0.5-1.0: 1, particularly preferably: 1: 1.
  • auxiliaries to improve the drying properties can be calcium hydroxide, calcium nitrate, calcium carbonate, calcium oxide, magnesium hydroxide and / or basic magnesium carbonate in the form a solid and / or as an aqueous suspension.
  • pH values below 12 preferably between 6-10, particularly preferably between 5-9, should be maintained according to the invention.
  • the calcium salts and / or magnesium salts and / or their bases are added to the fermentation solution containing D-pantothenate, preferably in the form of an aqueous dispersion. This prevents local, larger pH fluctuations and the formation of agglomerates of the insoluble constituents that may arise after the additives have been added.
  • the fermentation solution or suspension is dried and / or formulated by processes known per se, such as, for example, spray drying, spray granulation, fluidized bed drying,
  • Fluid bed granulation, drum drying or spin-flash drying (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6 01 edition, 1999, electronic release, chapter "Pryingof Solid Materials”) Pie spray drying can be carried out in cocurrent, countercurrent or mixed flow. All known atomizers can be used for atomization , especially centrifugal atomizers (atomizing disks), single substance nozzle or two substance nozzle. Preferred drying temperature conditions are 150 - 250 ° C tower inlet temperature and 70 - 130 ° C tower outlet temperature. However, it can also be dried at a higher or lower temperature level. In order to achieve a very low residual moisture, it is still possible A further drying step can be followed in a fluidized bed.
  • All known atomizers can be used for atomization , especially centrifugal atomizers (atomizing disks), single substance nozzle or two substance nozzle.
  • Preferred drying temperature conditions are 150 - 250 ° C tower inlet temperature and 70 - 130 ° C tower outlet temperature. However, it can also be dried
  • the spray drying can also be carried out in an FSD or SBD dryer (FSD: Fluidize ⁇ pray DryerSBD: SprayBed Dryer), as described by the companies Niro A / S (Soeborg / Copenhagen, Denmark and APV-Anhydro A / S (Soeborg / Copenhagen, D denmark) are built, perform a combination of spray dryer and fluidized bed represent.
  • a flow aid can be added during spray drying. This can reduce the deposits on the dryer wall and improve the flow behavior, especially with fine-grain powders. Silicates, stearates, phosphates and corn starch are particularly suitable as flow aids.
  • drying can also take place in a spray fluidized bed, which can be operated both continuously and discontinuously.
  • the solution can be sprayed in from above (top spray), from below (bottom spray) and from the side (side spray). Fine particles can be separated and recycled to set a desired particle size distribution and the associated product properties. Coarse material can also be ground in a mill and then also returned.
  • the method according to the invention is advantageous in the method described above to reduce complex work-up steps compared to known methods, in particular to dispense with the use of organic solvents, while at the same time providing a desired product with good biological value. This results in further savings on complex processing and disposal systems.
  • the method according to the invention is advantageously characterized in that it is simpler, less prone to failure, less time-consuming, significantly cheaper and thus more economical than conventional methods.
  • Process steps a) to d) according to the invention mentioned at the outset can be supplemented by one or more additional process steps which, on their own, are familiar to the person skilled in the art.
  • additional process steps which, on their own, are familiar to the person skilled in the art.
  • process steps a) to d) according to the invention are all possible combinations of the additional process steps with process steps a) to d) according to the invention.
  • the thermal destruction can also take place elsewhere in the process and does not have to be carried out immediately after the fermentation. There are also other methods, such as Sterilfitration,
  • Step c) or before or during drying and / or formulation
  • the addition of further additives can take place before or during the drying and / or formulation of the solution containing D-pantothenate.
  • Fillers (such as sugar, inorganic salts) are adjusted to a standardized content of D-pantothenic acid and / or its salts.
  • an additional filtration step can be carried out, in which some activated carbon is added to the solutions obtained during the process and this suspension is then filtered. Or the solutions obtained during fermentation can be passed through a small bed of activated carbon.
  • the quantities required for this Activated carbon used is in the range of a few percent by weight of the solution and is within the knowledge and judgment of the person skilled in the art.
  • These filtrations can be facilitated by adding a commercial flocculant (e.g. Sedipur CF 902 or Sedipur CL 930 from BASF AG, Ludwigshafen) to the respective solution before filtration.
  • a commercial flocculant e.g. Sedipur CF 902 or Sedipur CL 930 from BASF AG, Ludwigshafen
  • the fermentation solution is freed of the (killed) cell mass by heating reproducible material and then by membrane technology.
  • Calcium and / or magnesium salts are added to the cell-free solution in a ratio of 0.5 to 2 mol of salt per 1 mol of pantothenic acid in the solution.
  • This solution is subsequently dried by spray drying, which can be carried out in cocurrent, countercurrent and / or mixed stream, preferably in cocurrent and / or countercurrent, particularly preferably in cocurrent.
  • a centrifugal atomizer (atomizer disc), single-component nozzle or dual-component nozzle is used for atomization.
  • Preferred drying temperature conditions are 150 - 250 ° C tower inlet temperature and 70 - 130 ° C tower outlet temperature.
  • At least 35% by weight, preferably concentrations in the range of at least 40 to 50% by weight, particularly preferably at least 50% by weight, of D-pantothenic acid and / or its salts are formed by fermentation in the culture medium and corresponding preparation ,
  • pantothenic acid titers in the fermentation solutions can continue, ie up be increased to more than 50% by weight, preferably to more than 55% by weight, particularly preferably to more than 60% by weight.
  • the present invention furthermore relates to an animal feed supplement for use in animal feed and / or animal feed supplements, it being possible to produce it by a) using at least one organism producing D-pantothenic acid, the pantothenic acid (pan) and isoleucine / valine (ilv) Biosynthesis is deregulated and lacks the ability to form thermostable spores, b) reproductive material in the fermentation solution containing D-pantothenate is killed, c) insoluble constituents are separated from the fermentation solution containing D-pantothenate, and d) this solution is dried and / or formulation.
  • an animal feed supplement for use in animal feed and / or animal feed supplements, it being possible to produce it by a) using at least one organism producing D-pantothenic acid, the pantothenic acid (pan) and isoleucine / valine (ilv) Biosynthesis is deregulated and lacks the ability to form thermostable spores, b) reproductive material in the fermentation solution containing D-pantothenate
  • the animal feed supplement based on a genetically modified microorganism obtained by fermentation of at least one D-pantothenic acid, is characterized in that it contains D-pantothenic acid in a concentration of at least 35% by weight, preferably in a concentration of at least 40 contains up to 50% by weight, particularly preferably of at least 50% by weight, of D-pantothenic acid and / or its salts and has no reproducible material, in particular cells of the genetically modified microorganism.
  • the present invention relates to an animal feed supplement which contains the salts of D-pantothenic acid in a mixed form, preferably with divalent cations, contains particularly preferably as calcium and / or magnesium P-pantothenate.
  • an animal feed supplement is preferred which is characterized in that the content of monovalent cations is ⁇ 15% by weight.
  • the present invention also relates to the use of the animal feed supplement described as an additive to animal feed and / or animal feed supplements.
  • a calcium and / or magnesium P-pantothenate-containing animal feed supplement is obtained by the method described above, which satisfies the requirements for an animal feed or animal feed supplement or the addition to a feed or an animal feed supplement.
  • These requirements are, for example, a relatively high content of D-pantothenate and / or their salts and a good tolerance for the target organism as well as a biological value in the sense of the "vitamin effect" of the product according to the invention.
  • the batch medium was inoculated with 120 mL of the preculture.
  • the incubation was carried out for 48 h at 43 C and an overpressure in the gas space of 0.3 bar in a stirred 20 l bioreactor (from Infors, type Techfors).
  • a control algorithm was used which incrementally adjusted the dosing rate to the current needs of the culture based on the change in the pO 2 signal over time.
  • the pH was initially adjusted with NH 4 solution (25%) and H 3 PO 4 (20%) regulated to pH 7.2, after 40 h NH 4 solution was replaced by NaOH solution (25%).
  • the initial values of stirrer speed and gassing rate were 500 rpm and 5 l air / min.
  • the anti-foaming agent Tegospon T3062 (from Goldschmidt) was metered in as required. To prepare the batch medium, 300 g soy semolina, 0.76 g CaSO 4 2H 2 O and 6 ml Tegosipon T3062 were made up to a volume of 4.8 I with deionized (demineralized) water, stirred for 30 min and autoclaved (121 ° C, 30 min).
  • the trace element solution PSTE lOOOx contained per liter of VE- Water: 0.75 g Na 2 Mo0 4 2H 2 O, 2.1 g CoSO -7H 2 O, 0.25 g CuSO 4 -5H 2 O, 1.7 g MnSO H 2 O, 1.5 g ZnSO 4 -7H 2 O.
  • VE- Water 0.75 g Na 2 Mo0 4 2H 2 O, 2.1 g CoSO -7H 2 O, 0.25 g CuSO 4 -5H 2 O, 1.7 g MnSO H 2 O, 1.5 g ZnSO 4 -7H 2 O.
  • 25 kg of glucose H 2 O 12.0 l of demineralized water were added, the mixture was stirred for about 5 min and autoclaved (20 min, 121 ° C.). After cooling to approx. 50 ° C., this solution was filled into sterile glass bottles in 6.0 1 portions under sterile conditions.
  • cryostocks were produced in accordance with WO 02/072857 in SVY medium with 7.5 mg / l tetrazycline.
  • the production master was killed thermally in the fermenter.
  • the stirrer speed and gassing rate were reduced to 500 rpm and 5 l of air / min, the fermentation solution was heated to 85 ° C, kept at this temperature for 15 minutes while steaming the gas space and then cooled to 25 ° C.
  • the fermentation solution was removed using a steamable sampling valve located on the bottom of the vessel.
  • the killing of the production strain was demonstrated by plating 0.1 ml of various dilutions of the thermally treated fermentation solution on TBAB plates.
  • 30 g tryptose blood agar base (from Oxoid) are placed in 1.0 l demineralized water, stirred for approx. 5 min and autoclaved (121 ° C., 20 min). After cooling to about 50 "C agar plates are poured.
  • a laboratory module from Berghof (Eningen, Germany) was used for the UF diafiltration system, which was equipped with the tubular membrane 3750 from the same company.
  • the thermally killed fermentation solution was circulated from a template by means of a centrifugal pump over the UF membrane modules.
  • the retentate pressure was controlled by means of a valve which was circulated behind the membrane module.
  • the solution permeated through the membranes (permeate) containing the dissolved pantothenic acid was collected in a glass vessel.
  • the cell mass was first concentrated, followed by piafiltration, in which the permeate was constantly replaced by the same amount of water.
  • the insoluble constituents were separated from about 1 kg of fermentation solution in this way.
  • 3 kg of piafiltration water was used.
  • About 3.3 kg of permeate were obtained.
  • the average pantothenic acid concentration was 2% by weight.
  • P ies corresponds to a product loss of less than 3% compared to the amount of P-pantothenic acid in the original fermentation solution.
  • a flocculant (Sedipur CF 504) were added to each 1000 g of fermentation solution while stirring with a magnetic stirrer. Flakes formed from the finely suspended solid. The mixture was then further diluted with water (ratio: 1 g of water to 1 g of fermentation solution) and stirred briefly. The flocculated fermentation solution was distributed to centrifuge beakers. It was centrifuged (5 min at 3000 rpm) and then the clear run was decanted from the sediment. The sediment was diluted with water (ratio of 150 g water to approx. 100 g sediment) and the beaker was shaken until the entire sediment had detached from the beaker bottom.
  • a total of 3 batches of evaporation were carried out in a rotary evaporator to evaporate the fermentation solution which had already been separated from insoluble constituents.
  • the fermentation solutions from the removal of insoluble constituents were each separately concentrated by centrifugation or ultrafiltration.
  • the average dry weight of the fermentation solution before evaporation was approximately 5.7% by weight, the average pantothenic acid concentration approximately 2.5% by weight.
  • the dry matter was approximately 43% by weight in the first two fermentations and approximately 57% by weight in the third fermentation. The loss of pantothenic acid during evaporation was negligible.
  • the bubble of the rotary evaporator was filled with approx. 8 kg fermentation solution.
  • a pressure setpoint of 100 mbar and a set temperature of the heating bath of At about 65 ° C water was distilled off from the bubble.
  • a total of approx. 24 kg fermentation solution was evaporated in this way.
  • a total of 2.8 kg of concentrate were obtained, which contained about 1.3 kg of dry matter and about 600 g of pantothenic acid.
  • the average dry weight of the concentrate was 48% by weight, the average pantothenic acid concentration 19% by weight.
  • the pH of the concentrated solution remained almost unchanged compared to the diluted solution and averaged 6.6.
  • Fermentation removal of insoluble constituents by ultrafiltration, addition of 1.0 eq CaC based on the amount of pantothenic acid.
  • the supply air temperature was approx. 175 ° C
  • the exhaust air temperature approx. 85 ° C.
  • a two-fluid nozzle was used for atomization and the pressure of the atomizing air was 2 bar.
  • pantothenic acid content of the final products was determined by HPLC analysis. This was between 25 to ⁇ O% by weight of pantothenic acid.
  • the latter is located in the Bacillus subtilis chromosome immediately downstream of panD.
  • Plasmid pAN408 which contains the 3 'end of the birA gene, the complete panBCD operon and the ⁇ ' end of the dinG gene.
  • Existing recognition sites for restriction endonucleases correspond to the common name of the commercial name.
  • Restriction endonucleases correspond to the common name of the commercial name.
  • Plasmid pAN654 which contains the Bacillus subtle Sen panB with an artificial RBS.
  • Existing recognition sites for restriction endonucleases correspond to the common name of the commercial name.
  • Restriction endonucleases correspond to the common name of the commercial name.
  • Fig. 14 Structure of the UF diafiltration system
  • the fermentation solution (1) is filled into a stirred tank (3).
  • the fermentation solution is circulated from the stirred tank (3) via the ultrafiltration system (5).
  • the permeate (6) which is free of cells and contains the D-pantothenic acid, is discharged and collected in a vessel.
  • the cell mass is concentrated in the circuit and thus also in the stirred tank (3).
  • the diafiltration follows.
  • the fermentation solution from the stirred tank (3) continues to be circulated via the ultrafiltration system (5).
  • As much water (2) as permeate (6) is removed from the system to the stirred tank (3).
  • Fig. 15 Structure of the FSD (Fluidized SprayDryers) dryer
  • the drying of the processed fermentation solution (1) in a laboratory spray dryer shows the drying of the processed fermentation solution (1) in a laboratory spray dryer.
  • the fermentation solution (1) is conveyed with the peristaltic pump to the two-substance nozzle (1, 2 mm nozzle) (3) and sprayed there with compressed air (2 bar) (1.
  • Hot drying gas (air) (5) is fed into the drying tower (4)
  • the drying gas with the dry powder leaves the dryer (4) through the exhaust air line (7) and reaches the cyclone (8), in which the entrained dry powder is blown and the droplets produced by the nozzle are first dried in cocurrent with the drying gas
  • the exhaust air is led outside via the fan (9).
  • No. 1-5 are listed in a sequence listing.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement sowie dessen Verwendung.

Description

Verfahren zur Herstellungpines D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement, einen genetisch veränderten Mikroorganismus zum Einsatz in das Herstellungsverfahren sowie ein Tierfuttersupplement enthaltend D-Pantothensäure und/oder deren Salze.
Als ein Ausgangsprodukt der Biosynthese von Coenzym A ist D- Pantothenat in der Pflanzen- und Tierwelt weit verbreitet. Im Gegensatz zum Menschen, der die Pantothensäure in ausreichenden Mengen über die Nahrung zu sich nimmt, sind jedoch sowohl für Pflanzen als auch für Tiere häufig Mangelerscheinungen für D-Pantothenat beschrieben ie Verfügbarkeit von D-Pantothenat ist daher von großem wirtschaftlichen Interesse, insbesondere in der Tierfutterindustrie.
Nach dem bekannten Stand der Technik kann D-Pantothenat mittels chemischer Synthese aus D-Pantolacton und CaIcium-ß-Alaninat hergestellt werden (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 6 edition, 1999, electronic release, Kapitel „Vitamins"). Zur Bereitstellung von D-Pantolacton ist eine aufwendige, klassische Racematspaltung über diastereomere Salze erforderlich. Das aus der chemischen Synthese resultierende Verkaufsprodukt ist meist das Calciumsalz der D- Pantothensäure Calcium-D-Pantothenat.
Ferner sind biotechnologische Verfahren zur Herstellung von D- Pantothensäure mit Mikroorganismen (z.B. EP 0 590 857, WO 96/33283, US 6,013,492, WO 97/10340, DE 198 46 499.EP 1 001 027, EP 1 006 189, EP 1 006 192 und EP 1 006 193) bekannt. Gegenüber der chemischen Synthese liegt der Vorteil von Herstellungsverfahren mit Mikroorganismen in der selektiven (enantiomerenreinen) Bereitstellung der für den höheren Organismus verwertbaren D-Form der Pantothensäure. Eine aufwendige Racematspaltung, wie sie bei der chemischen Synthese erforderlich ist, entfällt somit.
So beschreiben EP 1 006 189 und EP 1 001 027 Verfahren zur Herstellung von Pantothenat bei dem in der Fermentationslösung ein Gehalt von höchstens 1 g/l D-Pantothensäure erreicht wird. Solche geringen Pantothensäure-Gehalte in der Fermentationslösung, also von weniger als 10 Gew.-% bezogen auf den Feststoffgehalt sind jedoch für eine wirtschaftliche Herstellung von D-Pantothensäure enthaltenden Tierfuttersupplementen wenig geeignet. Ferner erfordern die bislang beschriebenen Verfahren zur Isolierung des Produkts aus dem Fermentationsmedium zahlreiche aufwendige Aufarbeitungsschritte.
In der Offenlegungsschrift DE 100 16 321 ist einFermentationsverfahren zur Herstellung eines D-Pantothensäure-haltigen Tierfuttersupplements beschrieben. Dieses Verfahren, wie auch die zuvor genannten fermentativen Verfahren, erfordern jedoch zwingend, daß dem Mikroorganismus über das Fermentationsmedium die Pantothensäure- Vorstufe ß-Alanin zugeführt wird, um überhaupt wirtschaftliche Ausbeuten des gewünschten Produktes zu erzielen.
Ferner beschreiben US 6,013,492 und WO 96/332839 die Aufarbeitung der D-Pantothensäure aus der Fermentationslösung durch Abfiltern unlöslicher Bestandteile (z. B. Zellmaterial) vom Kulturmedium, eine Adsorption des Filtrats an Aktivkohle, eine sich anschließende Elution der D-Pantothensäure mit einem organischen Lösungsmittel, bevorzugt Methanol, eine Neutralisation mit Calciumhydroxid und eine abschließende Kristallisation von Calcium-D-Pantothenat. Dabeitreten während der Kristallisation erhebliche Wertproduktverluste auf. Ferner ist das verwendete organische Lösungsmittel nur schwer aus dem Produkt zu entfernen und macht eine aufwendige Lösungsmittelrückgewinnung erforderlich.
Die EP 0 590 857 beschreibt ein Fermentationsverfahrereur Herstellung von D-Pantothensäure, bei dem die Kultivierung eines Mikroorganismus die Zufütterung von ß-Alanin zwingend erfordert. Die Fermentationslösung wird zur Abtrennung der unlöslichen Bestandteile filtriert, dann über einen , Kationentauscher und anschließend über einen Anionenaustauscher geleitet, im Anschluß daran mit Calciumhydroxid neutralisiert, eingedampft, mit Aktivkohle versetzt, nochmals filtriert und unter Zusatz von Methanol und Caiciumchlorid kristallisiert. Das resultierende Calciumpantothenat-haltige Produkt enthält neben D-Pantothensäure in Form des Calciumsalzes noch Caiciumchlorid in einem Molverhältnis von 1:1. Zur Reduzierung des Calciumchloridgehalt.es ist eine Elektrodialyse mit anschließender Sprühtrocknung erforderlich. Dieses Verfahren ist wegen der Vielzahl aufwendiger Verfahrensschritte und der Verwendung organischer Lösungsmittel weder ökonomisch noch ökologisch.
Auch die Dokumente EP 1050219 und WO 01/83799beschreiben die fermentative Herstellung von D-Pantothensäure, bei der die Zufütterung von ß-Alanin als Vorstufe zwingend erforderlich ist. Bei der Aufarbeitung der D-Pantothensäure aus der Fermentationslösung wird die Abtrennung unlöslicher Bestandteile (z. B. Zellmaterial) vom Kulturmedium lediglich mittels einfacher Zentrifugation oder Filtration beschrieben. Solche einfachen Abtrennungsmethoden sind allerdings mit erheblichen Produktverlusten verbunden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines D- Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Tierfuttersupplements sowie ein verbessertes Verfahren zu dessen Herstellung, das von einer Zufütterung von ß-Alanin als kostenintensiver Vorstufe unabhängig ist, bei dem die Aufarbeitung des Produktes schonender erfolgt und Produktverluste vernachlässigbar sind.
Diese Aufgaben werden durch die vorliegende Erfindung durch die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur fermentativen Herstellung eines D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Tierfuttersupplements mittels eines genetisch veränderten Mikroorganismus gelöst.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zu r Herstellung eines D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement, wobei a) wenigstens ein D-Pantothensäure produzierender Organismus eingesetzt wird, dessen Pantothensäure- (pan)- und lsoleucin Valin-(ilv)-Biosynthese dereguliert ist und dem die Fähigkeit zur Bildung thermostabiler Sporen fehlt, b) vermehrungsfähiges Material in der D-Pantothenat enthaltenden Fermentationslösung abgetötet wird, c) unlösliche Bestandteile aus der D-Pantothenat enthaltenden Fermentationslösung abgetrennt werden und d) diese Lösung einer Trocknung und/oder Formulierung unterzogen wird.
Erfindungsgemäß ist unter der Formulierung „produzieren" zu verstehen, daß der Organismus größere Mengen D-Pantothensäure und/oder deren Salze synthetisieren kann, als für den eigenen Stoffwechselbedarf erforderlich sind. In einer erfindungsgemäß vorteilhaften Variante liegt die synthetisierte Menge an D-Pantothensäure und/oder deren Salze nicht zellintern vor, sondern wird idealerweise vollständig aus dem Organismus in das Kulturmedium abgegeben. Diese Ausschleusungkann aktiv oder passiv nach an sich bekannten Mechanismen, wie z.B. spezifische Membrantransportproteine, Poren oder durcrDiffusion, erfolgen.
Erfindungsgemäß werden als D-Pantothensäure produzierende Organismen Mikroorganismen eingesetzt. Hierzu zählen erfindungsgemäß Pilze, Hefen und/oder Bakterien. Erfindungsgemäß werden bevorzugt Pilze wie beispielsweise Mucor oder Hefen, wie z. B. Saccharomyces oder Debaromyces und hierbei bevorzugt Saccharaomyces cerevisiae eingesetzt. Vorteilhaft werden erfindungsgemäß coryneforme Bakterien oder Bacillaceae verwendet. Erfindungsgemäß umfaßt sind bevorzugt z. B. Bakterien der Gattungen Corynebacterium, Escherichia, Bacillus, Arthrobacter, Bevibacterium, Pseudomonas, Salmonella, Klebsieila, Proteus, Acinetobacter oder Rhizobium. Besonders bevorzugt sind hierbei beispielsweise Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium breve oder Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. lentimorbus, B. lentus, B. firmus, B.pantothenticus, B. circulans, B. coagulans, B. megaterium, B. pumilus, B. thuringiensis, B. brevis, B. stearothermophilus und andere Bacillusarten der Gruppe 1 , die durch ihre 16sRNA charakterisiert sind oder andere Stämme der Gruppe der Actinomycetales. Diese Aufzählung dient der Erläuterung und ist keinesfalls limitierend für die vorliegende Erfindung.
Darüber hinaus umfaßt die vorliegende Erfindung insbesondere den Einsatz genetisch veränderter Organismen zur erfindungsgemäßen Herstellung eines Tierfuttersupplements enthaltend freie D- Pantothensäure und/oder deren Salze._Solche genetisch veränderten Organismen können beispielsweise durch chemische Mutagenese und anschließende Selektion durch eine geeignetes „Screeningverfahren" isoliert werden. Erfindungsgemäß sind auch sogenannte „Produktionsstämme" umfaßt, die zur Herstellung des Produktes im Sinne der vorliegenden Erfindung geeignet sind und genetische Veränderungen hinsichtlich des Stoffwechselflusses in Richtung D-Pantothensäure aufweisen, wobei auch Veränderungen hinsichtlich der Ausschleusung von D-Pantothensäure und/oder deren Salzen über die Zellmembran inbegriffen sind. Dies kann z. B. durch Veränderungen an Schlüsselpositionen in relevanten Stoffwechsel -Biosynthesewegen des eingesetzten Organismus erreicht werden.
Denkbar ist auch der Einsatz transgener Organismen, die aus der Übertragung homologer und/oder heterologer Nukleotidsequenzen resultieren, welche zur Synthese des gewünschten Produktes erforderlich sind oder förderlich sein können. Hierbei ist die Überexpression und/oder Deregulation ein oder mehrerer Gene einzelnund/oder in Kombination, lokalisiert im Genom und/oder auf einem Vektor, denkbar.
Derartige transgene Organismen können in vorteilhafteiWeise zusätzliche Kopien und/oder genetisch veränderte Gene ausgewählt aus der Gruppe von panB, panC, panD, panE und/oder derenKombinationen und/oder sogar Organisationseinheiten, wie das panBCD-Operon enthalten und wie beispielsweise in WO 01/021772, WO 02/057474, WO 02/057476 oder WO 02/061108 beschrieben ist. Ferner können weitere Stoffwechselwege, wie z.B. der Isoleucin-Valin-Biosyntheseweg in den Organismen vorteilhaft manipuliert sein, wie beispielsweise in der EP 1 006 189, EP 1 006 192, EP 1 006 193 oder EP 1 001 027 beschrieben ist. Dadurchwerden verzweigtkettige Vorläufersubstanzen der Pantothensäure -Biosynthese vermehrt zur Verfügung gestellt. Vorteilhaft werden gegebenenfalls die Gene für diesen Biosyntheseweg d.h. ilvB, ilvN, ilvC und/oder ilvD überexprimiert, wie z.B. in WO 01/021772, WO 02/057474, WO 02/057476 oder WO 02/061108 beschrieben ist.
Darüber hinaus sind genetische Veränderungen der Aspartat-α- Decarboxylase(panD), z.B. durcfüberexpressioπund/oder Deregulation, in dem eingesetzten D-Pantothensäure produzierenden Organismus erfindungsgemäß umfaßt, wie z.B. in WO 01/021772, WO 02/057474, WO 02/057476 oder WO 02/061108 beschrieben ist.
Unter der Formulierung „Deregulation" ist erfindungsgemäßfolgendes zu verstehen:
Veränderung oder Modifikation mindestens eines Gens, das für ein Enzym in einem biosynthetischen Stoffwechselweg kodiert, so daß die Aktivität des Enzyms in dem Mikroorganismus verändert oder modifiziert ist. Bevorzugt ist, daß mindestens ein Gen, das für ein Enzym eines biosynthetischen Stoffwechselwegs kodiert, derart verändert ist, daß das Genprodukt verstärkt gebildet wird oder eine gesteigerte Aktivität aufweist. Der Begriff "deregulierter Stoffwechsel weg" schließt auch einen biosynthetischen Stoffwechselweg mit ein, in den mehr als ein Gen, das für mehr als ein Enzym kodiert, so verändert oder modifiziert ist, daß die Aktivitäten von mehr als einem Enzym verändert oder modifiziert sind. Veränderungen oder Modifikationen können beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf: Entfernen des endogenen Promotors oder regulatorischer Elemente; Einfügen starker Promotoren, induzierbarer Promotoren oder mehrerer Promotoren gleichzeitig; Entfernen regulatorischer Sequenzen, so daß die Expression des Genprodukts verändert ist; Änderung der chromosomalen Lage des Gens; Veränderungder DNA-Sequenz in der Nähe des Gens oder innerhalb des Gens wie z. B. der ribosomalen Bindungsstelle (RBS); Erhöhung der Kopienzahl des Gens im Genom oder durch Einbringung von Plasmiden verschiedener Kopienzahl; Modifikation von Proteinen (z.B. regulatorischen Proteinen, Suppressoren, Enhancem, transkriptionellen Aktivatoren, und ähnliche), die bei der Transkription des Gens und/oder bei der Translation zum Genprodukt eine Rolle spielen. Dazu zählen auch alle anderen Möglichkeiten zur Deregulation der Expression von Genen die Standder Technik sind wie z. B. die Verwendung von Antisense Oligonukleotiden, oder die Blockierung von Repressor Proteinen.
Deregulation kann auch Veränderungen inder kodierenden Region von Genen beinhalten, die z. B. zu Aufhebung von feedback Regulation in dem Genprodukt oder zu einer größeren oder kleineren spezifischen Aktivität des Genprodukts führen.
Darüber hinaus sind gentechnische Veränderungen an Enzymen erfindungsgemäß vorteilhaft, die den Abfluß von Vorstufen der Pantothensäure und/oder den Fluß der Pantothensäure zu Coenzym A beeinflussen. Beispielhaft für solche Enzymekodierende Gene sind: alsD, avtA, ilvE, ansB, coaA, coaX und andere mehr.Diese Aufzählung dient der Erläuterung und ist keinesfalls limitierend für die vorliegende Erfindung.
Weiterhin sind gentechnische Veränderungen vorteilhaft, welche die zelluläre Bereitstellung von Cofaktoren (z. B. von Methylentetrahydrofolat, Redoxäquivalenten u. ä.) in für die Pantothensäure-Produktion optimaler Menge sichern. In vorteilhafter Weise liegt in den genetisch veränderten Organismen der vorliegenden Erfindung somit ß-Alanin bereits in den Zellen in erhöhten Konzentrationen gegenüber entsprechend nicht-genetisch veränderten Organismen vor.Das heißt, freies ß-Alanin oder ß-Alanin-Salze müssen nicht als Precursor dem Kulturmedium zugesetzt werden.
Für das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines D- Pantothensäure und/oder deren Salzen enthaltenden
Tierfuttersupplements ist somit eine Zufütterung von Vorstufen der D- Pantothensäure nicht erforderlich ist. Beispielsweise ist eine Zufütterung von freiem ß-Alanin und/oder ß-Alanin-Salz nicht erforderlich.
Vorteilhaft sind Mikroorganismen, deren Pantothensäure -(pan)- und lsoleucin-Valin-(ilv)-Biosynthese und Asparat-α-Decarboxylase(panD) dereguliert ist. Weiterhin ist eine zusätzliche Überexpression der Ketopanthoat-Reduktase (panE) in den Mikroorganismen von Vorteil.
Weiterhin erfindungsgemäß von Vorteil ist, wenn gegebenenfalls das coaA-Gen, das für die Synthese von CoenzymA erforderlich ist, in seiner Aktivität erniedrigt ist oder (beispielsweise in Bacillus-Arten) ganz ausgeschaltet ist. Bacillus enthält nämlich neben coaA ein weiteres Gen für diese enzymatische Funktion (= coaX). Auch die Aktivität dieses Gens coaX oder des korrespondierenden Enzyms kann verändert, bevorzugt erniedrigt, oder sogar deletiert werden, sofern coaA selbst noch eine ausreichende, wenn auch erniedrigte Enzymaktivität aufweist, d.h. die Enzymaktivität von coaA nicht ganz verloren gegangen ist. Neben der Überexpression der verschiedenen Gene ist auch eine genetische Manipulation der Promotorregionen dieser Gene in der Art vorteilhaft, daß diese Manipulation zu einer Überexpression der Genprodukte führt, wie z.B. in WO 01/021772, WO 02/057474, WO 02/057476 oder WO 02/061108 beschrieben ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein genetisch veränderter Mikroorganismus, dessen Pantothensäure-(pan)- und lsoleucin/Valin-(ilv)- Biosynthese dereguliert ist und dem die Fähigkeit zur Bildung thermostabiler Sporen fehlt. Dieser erfindungsgemäßeMikroorganismus zeichnet sich ferner dadurch aus, daß ohne Zufütterung von freiem ß- Alanin und/oder ß-Alanin-Salz wenigstens 35 Gew.-% an D- Pantothensäure und/oder deren Salze bildet.
Erfindungsgemäß ebenfalls vorteilhaft sind Mikroorganismen, deren Pantothensäure-(pan)- und lsoleucin-Valin-(ilv)-Biosynthese und Asparat- α-Decarboxylase (panD) dereguliertst und denen zusätzlichdie Fähigkeit zur Bildung thermostabiler Sporen fehlt. Weiterhin ist eine zusätzliche Überexpression der Ketopanthoat-Reduktase (panE) in den Mikroorganismen von Vorteil.
Eine weitere erfindungsgemäße Variante vorteilhafte Mikroorganismen sind solche, deren Pantotheπsäure-(pan)- und Isoleucin-Valin-(ilv)- Biosynthese und Asparat-α-Decarboxylase(panD) dereguliertind deren Ketopanthoat-Reduktase (panE) überexprimiert ist und denen zusätzlich die Fähigkeit zur Bildung thermostabiler Sporen fehlt. Der erfindungsgemäße genetisch veränderteMikroorganismus ist nach Erhitzung bei Temperaturen im Bereich von 50°C bis 140 °C über einen Zeitraum von etwa 1 bis 30 Minuten zu 100 % nicht mehr vermehrungsfähig. Bevorzugt sind Temperaturen von > 60°C und Haltezeiten von etwa 20 - 30 Minuten, besonders bevorzugt etwa 70 - 90°C und Haltezeiten von etwa 15 - 20 Minuten, höchst bevorzugt etwa 75 - 90 °C und Haltezeiten von etwa 15 - 20 Minuten und insbesondere etwa 85°C und eine Haltezeit von etwa 15 Minuten. Erfindungsgemäß vorteilhaft ist auch eine Erhitzung bei etwa 140°C und eine Haltezeit von etwa 3 Minuten.
Bevorzugt handelt es sich bei den erfindungsgemäß genetisch veränderten Mikroorganismen um solche der Gattung Bacillus. Besonders bevorzugt der Spezies Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens, B. cereus, B. lentimorbus, B. lentus, B. firmus, B. pantothenticus, B. circulans, B. coagulans, B. megaterium, B. pumilus, B. thuringiensis, B. brevis, B. stearothermophilus und andere Bacillusarten der Gruppe 1 , die durch ihre 16sRNA charakterisiert sind. I nsbesondere handelt es sich um die Spezies B. subtilis, B. licheniformis oder B. amyloliquefaciens.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung des genetisch veränderten Mikroorganismus zur Herstellung eines D- Pantothenat und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement.
In einer Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung finden die in WO 01/21772 beschriebenen Bakterienstämme, wie z.B. PA 221 , PA 303 und PA 327 und/oder Derivatedavon Einsatz.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante findet erfindungsgemäß der Mikroorganismus Bacillus subtilis PA 766 Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren. Dieser Stamm Bacillus subtilis PA 766 wurde wie folgt hergestellt:
Ausgehend von dem Stamm Bacillus subtilis168 (Marburg Stamm ATCC 6051), der den Genotyp trpC2 (Trp ) ausweist, wurde über Transduktion des Trp+ Markers (aus dem Bacillussubtilis Wildtyp W23) der Stamm PY79 erzeugt. In den Stamm PY79 wurden durch klassische gentechnische Methoden (wie z. B. in Harwood, C.R. and Cutting, S.M. (editors), Molecular Biological Methods for Bacillu$1990) John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, England beschrieben) ΔpanB und ΔpanEI Mutationen eingebracht.
Der resultierendeStamm wurde mit genomischeBNA des Bacillus subtilis Stammes PA221 (Genotyp P26panBCPtrpC2 (Trp-)) und genomischer DNA des Bacillus subtilis Stammes PA303 (Genotyp P^panEI) transformiert. Der resultierende Stamm PA327 hat den Genotyp PϊβpanBCJP^panEI und ist Tryptophan auxotroph (Trp-).
Die Herstellung des Bacillus subtilis Stammes PA221 (Genotyp Piβpan BCJ3rpC2 (Trp)) ist in folgendem Abschnitt beschrieben : Durch klassische gentechnische Methoden wurde mit Hilfe der Sequenzinformation des pa nBCKDperons von E. coli (siehe Merkel et al., FEMS Microbiol. Lett., 143, 1996:247-252) ausgehend von einer Bacillus subtilis GP275 Plasmid-Bibliothek das panBCDOperon von Bacillus kloniert. Zur Klonierung wurde der E. coli Stamm BM4062 (birte) und die Information, daß das BacillusOperon in der Nähe des birA Gens liegt, verwendet. Das panBCDOperon wurde in ein in E. coli replizierbares Plasmid eingebracht. Zur Verbesserung der Expression des panB CD Operons wurden starke, konstitutive Promotoren des Bacillus subtilis Phagen SP01 (P^) verwendet und die Ribosomenbindungsstelle (=RBS) vordem panB-Gen durch eine artifizielle RBS ersetzt. Vor die PjspanBCD Kassette auf dem Plasmid wurde ein DNA Fragment.das unmittelbar upstream des nativen panB Gens in Bacilluäegt, ligiert. DiesesPlasmid wurde in den Bacillus subtiliStamm RL-1 (durch klassische Mutagenese erhaltenes Derivaties Bacillus subtiliä68 (Marburg Stamm ATCC 6051), Genotyp trpC2 (Trp-)) transformiert und durch homologe Rekombination wurde das native panBCB peron durch das p26panBCD Operon ersetzt. Der resultiereαte Stamm heißt PA221 und hat den Genotyp P26panBCP trpC2 (Trp-). Die Herstellungdes Bacillus subtilisStamms PA303 (Genotyp P^paπEI) ist in folgendem Abschnitt beschrieben :
Mit Hilfe der E. coli panE Gensequenz wurde die BacilluspanESequenz analog kloniert. Es zeigte sich, daß in B. subtiliawei Homologe des panE Gens von E. coli existieren, die mit panE1 und panE2 bezeichnet wurden. Durch Deletionsanalyserzeigte sich, daßdas panE1 Gen für 90 % der Pantothensäure Produktion verantwortlich ist, während die Deletiondes panE2 Gens keinen signifikanten Effekt auf die Pantothensäure Produktion hatte. Auch hier wurde analog zur Klonierung des pa nBCD Operons der Promotor durch den starken konstitutiven Promotor P^ ersetzt und die Ribosomenbindungsstelle vor dem panE1 Gen durch die artifizielle Bindungsstelleersetzt. Das 26panE1 Fragment wurde in einen Vektor kloniert, der so gestaltet war, daß das P26panE1 Fragment in den original panE1 Locus im Genom von Bacillus subtilisntegrieren konnte. De r nachTransformation und homologer Rekombination resultierende Stamm heißt PA303 und hat den Genotyp P^panEL
Die weitere Stammkonstruktion erfolgte durchTransformation von PA327 mit einem Plasmid, welches das P-si I v B N Q peron und das Marker-Gen für Spectinomycin enthieltDas Psi I v B N ©peron integrierte in den amyE locus, was durch PCR nachgewiesen wurde. Ein Transformante wurde als PA340 (Genotyp P26pa n B CpP26panE1 , Pasi lvB NCspecR, trpC2 (Trp-)) bezeichnet.
Des weiteren wurde in denStamm PA340 eine deregulierte ilvD-Kassette eingebracht. Dazu wurde ein Plasmid,welches das ilvD Gen unter der Kontrolle des P^ Promotors mit der artifiziellen RBS2 enthält, in PA340 transformiert. Dabei wurde das P26ÜVD Gen durch homologe Rekombination in den original ilvD locus integriert. Der resultierende Stamm PA374 hat den Genotyp Paspa n B CP P-spanEI , P^i lvB NC PjsilvD, specR und trpC2 (Trp-).
Um mit dem Stamm PA374 ß-Alanin zufütterungsfrei Pantothensäure zu produzieren, wurde eine deregulierte pa nBC*tKassette, die eine artifizielle RBS für panD (NDIII; gemäß WO 01/21772)enthält, in Stamm PA374 eingebracht. Dazu wurde Stamm PA374 zunächst mit dem Plasmid pAN623 (Fig. 1) transformiert. Durchhomologe Rekombination wurde ein Marker-Gen für Chloramphenicolresistenz integriert und gleichzeitig des pa n B C-GDperons deletiert. Der resultierendeStamm PA640 hat den Genotyp Δpa n B CD?26panE1 , P^i lv B NjCP∑eilvD, specR, camR und trpC2 (Trp-).
Die Konstruktion von pAN623 ist in Fig. 1 dargestellt.Es wurde durch Ligation eines 4583 Nucleotide langen Agel/B Restriktionsfragments aus Plasmid pAN622 mit einem 1586 Nucleotide langen Aval/B a Hfi Restriktionsfragment aus Plasmid pECC4 (Prof. Losick; Harvard University) hergestelltDie mit Agel and B a Hti produzierten kohäsivenen Enden sind kompatibel mit den mit Aval and B gl (produzierten. Der Replikationsursprung ist weiter unten beschrieben. Die resultierende Nucleotidsequenz des zwischen den Schnittstellen für Aval und B a Hti gelegenen pECC4-Fragments ist in SEQ ID No. 2 dargestellt. Plasmid pAN622 (Fig. 2) wurde durch Ligation eines 3207 Nucleotide langen Smal/Ncol Restriktionsfragments aus Plasmid pASK-1BA5 mit einem 2572 Nucleotide langen Restriktionsfragment aus pAN408 hergestellt. Dazu wurdepAN408 with B sReverdaut. Die resultierenden überstehenden Enden wurden mit T4 DNAPolymerase und den vier Nucleosidtriphosphaten aufgefüllt, anschließend wurde mit Ncol verdaut. Plasmid pASK-1BA5 wurde von der Firma Genosys Biotech nologies, Woodlands, Texas, USA bezogenDie Konstruktion von Plasmid pAN408 ist nachfolgend beschrieben.
Plasmid pAN408 (Fig. 3) wurde durch Ligation eines 3145 Nucleotide langen Hpal/Sacl Restriktionsfragmentsaus DNA von Bacillus subtilis GP275 (dieser ist eine Variante von B. subtilis 168 Marburg Stamm ATCC 6051 mit dem Wildtypallel des p a n B C DOperons) mit einem 3981 Nucleotide langen Sacl/Pmel Restictionsfragment aus Plasmid pBADMycHisA hergestellt. Das Hpal/Sacl Restriktionsfragment aus Bacillus subtili£P275 enthält das pa n B C ID)peron (Zugriffsnummern der Genbank genolist.pasteur.fr sind BG11519 (panB), BG11520 (panC) und BG1 1493 (panD)). The Restriktionsendonucleasen Hpal and Pmel erzeugen glatte Enden, die mit einander ligiert werden können. Plasmid pBADMycHisA wurde von der Firmalnvitrogen, Carlsbad, California, USA bezogen.
Anschließend wurde Stamm PA640 mit genomischerDNA von Stamm PA731 (Genotyp P2βpa nBC*p transformiert. Durch Selektion auf Pantothensäure-freiem Medium mit Tetrazyklin wurde der Stamm PA735A erhalten. Dieser hatden Genotyp F26pa n BC*pP26panE1 , P^i lvB N C PasilvD, specR, tetR und trpC2 (Trp-).
In Stamm PA735A wurde nachfolgend eine deregulierte glyA-Kassette eingebracht und gleichzeitigeine Deletion am spollG locus eingeführt. Dazu wurde Stamm PA735A mit dem Plasmid pAN683 f ig. 4) transformiert.
Plasmid pAN683 wurde durch Ligation eines 5922 Nucleotide langen Asp718l/Notl Restriktionsfragments aus Plasmid pOLL30 (SEQ ID No. 1) mit einem 2138 Nucleotide langen Asp718l/Notl Restriktionsfragment aus Plasmid pAN398 hergestellt. Die Nucleotidsequenz des für die Konstruktion von pAN683 eingesetzten Restriktionsfragments aus pOLL30 ist in SEQ ID No. 1 enthalten. pAN398 ist eine rop+- Variante des Standardvektors pBR322 (Genbankzugriffsnummer J01749) der eine Kassette zur Expression des glyA -Gens aus B. subtilisεnthält. Plasmid pAN398 enthält auch ein Chloramphenicolresistenz-Gen aus dem Plasmid pC194 (Genbankzugriffsnummer NC 002013). Die glyA- Expressionskassette beginnt an einer Notl -Schnittstelle, mit einem Transcriptionsterminator, der im Bacillus subtilis Genom unmittelbar stromaufwärts vom bioW-Gen liegt. Es folgen der P^ Promoter aus dem B. subtilißacteriophagen SP01 , eine artifizielle RBS, das B. subtiliglyA- Gen, ein doppelter Transcriptionsterminator (T1T2), der vom E. coli 23S rRNA-Transcript stammt, und eine Asp718l-Schnittstelle. Die verschiedenen Einzelkomponenten von pAN398 wurden zusammengefügtDie glyA-Region in pAN398 wurde durchPCR mit DNA aus dem B. subtilis Wildtyp als Template erhaltenDie glyA-Sequenz in pAN398 enthält jedoch gegenüber der im B. subtilis Genom (Zugriffsnummer der Genbank genolist.pasteur.fr BG10944 (glyA)) publizierten Sequenz einen Basenaustausch, der in der Aminosäuresequenz an Position 8 zum Austausch von Aspartat durch Asparagin führt. Diese Spontanmutation trat währendder Konstruktion von pAN398 auf, das mutierte glyA-Gen kodiert noch immer eine aktive Serinhydroxymethyltransferase. pAN398 ist inFig. 11 , die komplette DNA Sequenz von pAN398 ist in SEQ ID No. 5 dargestellt.
Das zuvobeschriebene Plasmid pAN683 (Fig. 4) enthält eine P∞glyA- Kassette, ein Kanamycin-Resistenz-Gen und flankierende DNA- Fragmente, die up- und downstream vom spollG locus liegen. Durch Selektion auf Kanamycin wurde der Stamm PA753erhalten. Dieser hat den Genotyp P26pa nBC*P PapanEI , P^i lv B N P P∑tsilvD, P∑sglyA, ΔspollG, specR, tetR, kanR und trpC2 (Trp-). Anschließend wurden Tryptophan prototrophe Varianten von PA753 hergestellt. Dazu wurde PA753 mit dem Plasmid pOLL31 (Fig. 5) transformiert. Diesesenthäft ein trpC* Allel von Stamm PY79. Durch Selektion auf Medium ohne Tryptophan wurde Stamm PA766 erhalten. Die Konstruktion von Plasmid pOLL31 ist in Fig.5 dargestellt. Ein Teil des B. subtilis trp Operons, der das gesamte trpC-Gen und flankierende Sequenzen enthält wurde mittels PCR mit der Pfx DNA Polymerase(Firma Invitrogen Life Technologies) undchromosomaler DNA von B. subtilis PY79 als Template amplifiziert. Stamm PY79 enthält ein funktionales trpC- Gen . Der 3 '-Primer für die PCR-Reaktion wurde mit einer 5'- Phosphatgruppe synthetisiert.Das PCR-Produkt wurde mit Spei (diese Schnittstelle ist in dem 5'-PCR-Primer enthalten) geschnitten und dann mit Plasmid pASK-1BA3 (Firma Genosys Biotechnologies, Woodlands, Texas, USA ) ligiert, das zuvor mit Xbal und Smal verdaut wordenwar. Die mit Xbal und Spei produzierten kohäsiven Enden sind kompatibel. Die Pfx D N-Rblymerase liefert PCR-Produkte mit glatten Enden, die mit den aus dem Verdau mit Smal resultierenden glatten Enden ligiert werden können. Die resultiβande Nucleotidsequenz des ungeschnittenen trp-Operon PCR-Produkts, das für die Konstruktion von pOLL31 eingesetzt wurde, zeigt SEQ ID No. 3.
Die Herstellungdes Bacillus subtilisStammes PA731 ist in folgendem Abschnitt beschrieben:
Ausgangspunkt war Stamm PA354, der den Genotyp P∑epa n B CP P∑βpanEI , P^ilvD, P^i lv B NCspecR, trpC2 (Trp-) besitzt. PA354 wurde mit genomischer DNA von Stamm PA650 transformiertpei dem das Ende des panC- und der Anfang des panD-Gens durch ein Chloramphenicol- Resistenz-Gen ersetzt sind. Durch Selektion auf Chloramphenicowurde Stamm PA630 erhalten. PA630 wurde mitgenomischer DNA von Stamm PA651 transformiert. Dieserenthält das panC*-Allel, das die artifizielle RBS NDIII für panD enthält. Durch Selektion auf Medium ohne Pantothensäure wurde Stamm PA636 erhalten, der den Genotyp P26pa n BC*pP26panE1 , P^ilvD, P26ÜvB NpspecR, trpC2 (Trp-) besitzt. PA636 wurde mit dem Notl geschnittenen Plasmid pAN680 (Fig. 6) transformiert. Durch homologe Rekombination(Selektion auf Tetraz^klin) wurde eine amplifizierbare P26pa n BC*ÖCassette in den Originallocus integriert. Der resultierendeStamm heißt PA731.
Die Konstruktion von Plasmid pAN680 ist in Fig.6 dargestellt. Ein 2101 Nucleotide langes Xbal/B a Hti Restriktionsfragment aus pAN678 wurde mit einem 7687 Nucleotide langen Xbal/B a Hti Restriktionsfragment aus Plasmid pOTP61 ligiert. Plasmid pOTP61 ist in WO 01/021772 beschrieben und seine Sequenz ist in SEQ ID No. 6 wiedergegeben. Die Konstruktion von Plasmid pAN678 ist in Fig. 7 dargestellt. Es wurde durch den Verdau von Plasmid pAN666 mit Agel and B gl und Isolierung des 4071 Nucleotide langen Fragments hergestellt.Dieses Fragment wurde mit einem 1196 Nucleotide Agel/B gl Restriktionsfragment aus Plasmid pAN664ligiert, das das panC*-Allel enthält.
Die Konstruktion von pAN666 und pAN664 istnachfolgend beschrieben. Fig. 8 zeigt die Konstruktion von Plasmid pAN664. Plasmid pAN622 (Fig. 2) wurde mit Apal and B § Verdaut, um das 3'-Ende des panC-Gens und das 5'-Ende des panD-Gens zu entfernen. Das 5442 Nucleotidelange Fragment wurde isoliert und mit einem 337 Nucleotide langen Apal/B gl Restriktionsfragment aus Plasmid pAN443 ligiert, das die artifizielle RBS für panD (NDIII) enthält. Plasmid pAN443 ist in WO 01/021772 beschrieben.
Fig. 9 zeigt die Konstruktion von pAN666. Zwei Restriktionsfragmente aus Plasmid pAN654 wurden isoliert: Ein 1415 Nucleotide langes B φΗ a Hh fragment und ein 2606 Nucleotide langes B φ'Smal Fragment. Diese beiden Fragmente wurden mit einem 411 Nucleotide langen Fragment aus Plasmid pAN426 ligiert. Das zuletzt genannte Fragment wurde durch Verdau von Plasmid pAN426 mit Xbal, Auffüllen der überstehenden Enden mitT4 DNAPolymerase und anschließenden Verdau mit B a Hh hergestelltDas mit deiT4 DNAPolymerase hergestellte glatte Ende kann mit dem glatten Ende aus dem Verdau von Plasmid pAN654 mit Smal ligiert werden. Plasmid pAN426 ist in WO 01/021772beschrieben. Die Konstruktion von pAN654 ist nachfolgend beschrieben. Fig. 10 zeigt die Konstruktion von Plasmid pAN654Das B. subtilis panB- Gen wurde mit Primern, die eine Schnittstelle für Xbal sowie eine artifizielle RBS für panB am 5' -Ende und die 5'-Hälfte einer Smal- Schnittstelle am 3'-Ende enthielten, apIifiziertDer 3'-Primer für die PCR- Reaction wurde mit einer 5'-Phosphatgruppe synthetisiert. Die für die PCR-Reaktion eingesetzte Pfx D- N -Polymerase (Firma Invitrogen Life Technologies) liefert Produkte mit glatten Enden, die mit den glatten Enden aus dem Smal-Verdau Negiert werdenkönnen. Das PCRProdukt wurde mit Xbal verdaut und das resultierende 855 Nucleotide lange Fragment wurde mit einem 3169 Nucleotide langen Xbal/Smal Restriktionsfragment aus Plasmid pASK-1 BA3 (Firma Genosys Biotechnologies, Woodlands, Texas, USA ) ligiert. Die Nucleotidsequenz des ungeschnittenen panB PCR -Products, das für die Konstruktion von Plasmid pAN654 eingesetzt wurde, ist in SEQ ID No. 4 dargestellt.
Die Herstellungdes Bacillus subtilisStammes PA650 ist in folgendem Abschnitt beschrieben:
Stamm PA374 wurde mit dem Plasmid pAN440 (WO 01/02772, Fig. 12) transformiert. Durch homologe Rekombination (Selektion auf Chloramphenicol) wurden das Ende des panC- und der Anfang des panD- Gens durch ein Chloramphenicol-Resistenz-Gen ersetzt. Der resultierende Stamm heißt PA650.
Die Herstellung des Bacillus subtilisStammes PA651 ist in folgendem Abschnitt beschrieben:
Stamm PA650 wurde mit dem Plasmid pAN443 (WO 01/02772, Fig. 13) transformiert. Durch homologe Rekombinationwurde das panC*-Allel (dieses enthält die artifizielle RBS NDM Ifü r panD) eingeführt, das panD- Gen wiederhergestellt und zudem das Chloramphenicol-Resistenz-Gen deletiert. Durch Selektion auf Medium ohnePantothensäure wurde Stamm PA651 erhalten.
Weitere Erhöhungen der Pantothensäure-Konzentration in der Fermentationslösung sind durch weitere Medienoptimierung, durch Erhöhung der Fermentationsdauer, durch Verfahrens- und Stammverbesserung sowie durch Kombinationen der einzelnen Schritte denkbar. So sind die oben beschriebenen Pantothensäure - Konzentrationen auch durch Fermentation von Stämmen zu erreichen, die Derivate des oben beschriebenerPA766 sind. Derivatekönnen durch klassische Stammentwicklung sowie durch weitere gentechnische Manipulationen hergestellt werden.
Erfindungsgemäß kann die Fermentation nach an sich bekannten Vorgehensweisen im batch-, fed-batch- oder repeated-fed-batch-Betrieb oder bei kontinuierlicher Prozeßführung durchgeführt werden.
Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß die Fermentation in einem Kulturmedium durchgeführt wird, das außer wenigstens einer Kohlenstoff- und Stickstoffquelle als Ausgangsverbindungen keine weiteren Vorstufeπ(Precursor) enthält. D.h. die Biosynthese von D-Pantothensäure ist von der Zufütterung weiterer Vorstufen unabhängig. Unter solchen Vorstufen sind erfindungsgemäß Substanzen wie z.B. ß-Alanin und/oder L-Aspartat und/oder L-Valin und/oder α-Ketoisovalerat und/oder deren Kombinationen zu verstehen. In einer bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Fermentation des D-Pantothensäure produzierenden Organismus in einem Kulturmedium durchgeführt, welches eine Kohlenstoff- und eine Stickstoffquelle enthält, dem aber kein freies ß-Alanin und/oder ß-Alanin- Salze zugesetzt ist oder im Verlauf der Fermentation zugefüh rt wird.
D. h. zur Herstellung on D-Pantothensäure in Bereichen von wenigstens 35 Gew.-%, bevorzugt in Konzentrationsbereichen von wenigstens 40 bis 50 Gew. -%, besonders bevorzugt von wenigstens 50 Gew.-% ist erfindungsgemäß keine Zufütterung von freiem ß-Alanin und/oder ß- Alanin-Salzen erforderlich.
Die Unabhängigkeit von der Zufütterung von Vorstufeπstellt insbesondere einen wesentlichen wirtschaftlichen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber bekannten Verfahren dar, da eine Vielzahl von Vorstufen sehr teuer sind.
Die Zugabevon ß-Alanin und/oder ß-Alanin-Salzen ist erfindungsgemäß jedoch nicht ausgeschlossen, so daß folglich die Ausbeute an D- Pantothen säure durch die Zugabe von ß-Alanin und/oder ß-Alanin-Salzen noch weiter verbessert werden kann.
Geht man beispielsweise davon aus, daß alle erforderlichen Vorstufen der Pantothensäure in ausreichender Menge vorhanden sind und lediglich die Aktivität des panD-Gens eine weitere Steigerung der Pantothensäure - Produktion limitiert, so kann die Ausbeute an Pantothensäure z.B. um weitere 50% durch die Zugabe von freiem ß-Alanin und/oder ß-Alanin- Salzen gesteigert werden.
In einer vorteilhaften Variante der vorliegenden Erfindung können bis zu 20 g/l an freiem ß-Alanin und/oder ß-Alanin-Salzen dem Kulturmedium zur zusätzlichen Steigerung der Pantothensäureausbeute um mehr als 50 % zugesetzt werden. Bevorzugt ist der Zusatz von etwa 15 g/l an freiem ß- Alanin und/oder ß-Alanin-Salzen zum Kulturmedium.
Beispiele erfindungsgemäß geeigneter Kohlenstoffquellen zum Einsatz in einem Kulturmedium zur Fermentation der zuvor genannten Organismen sind Zucker, wie Stärkehydrolysate (Mono-, Di-, Oligosaccharide), bevorzugt Glucose oder Saccharose sowie Rüben- oder Rohrzuckermelasse, Proteine, Proteinhydrolysate, Sojamehl, Maisquellwasser, Fette, freie Fettsäuren, rückgeführte Zellen aus bereits durchgeführten Fermentationen oder deren Hydrolysate sowie Hefeextrakt. Diese Aufzählungen sind nicht limitierendfür die vorliegende Erfindung.
Ferner zeichnet sich das vorliegende Verfahren in vorteilhafter Weise dadurch aus, daß der Gesamt-Zuckergehalt bis zum Ende der Fermentation auf ein Minimum reduziert wird, da dieser anderenfalls die spätere Trocknung und/oder Formulierung der Fermentationslösung durch Verkleben erschwert. Dies kann erfindungsgemäß dadurch erreicht werden, daß die Fermentation noch einige Zeit weitergeführt wird, nachdem die Kohlenstoffquelle verbraucht ist (bei Kultivierung im batch - Betrieb) oder nachdem die Kohlenstoffzufuhr (bei einer Prozeßführung im fed-batch oder repeated-fed-batch-Betrieb) unterbrochen ist und/oder derart reguliert ist, daß die Konzentration der Kohlenstoffquelle nahezu Null ist (bei fed-batch, repeated-fed-batch oder kontinuierlicher
Prozeßführung).
Dies erfolgt erfind ungsgiraäß dadurch, daß nach Unterbrechung der
Zudosierung der Kohlenstoffquelle (z. B. Zuckerlösung) die Fermentation bis zum Erreichen der Gelöstsauerstoffkonzentration (pO2) auf wenigstens
80 %, bevorzugt 90 % und besonders bevorzugt 95 % des
Sättigungswertes in der Fermentationslösung weitergeführt wird.
Beispiele erfindungsgemäß geeigneter Stickstoffquellen sind Ammoniak, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Proteine, Proteinhydrolysate oder Hefeextrakt. Auch diese Aufzählung ist nicht limitierend für die vorliegende Erfindung.
Ferner enthält das Fermentationsmedium Mineralsalze und/oder
Spurenelemente, wie Aminosäuren und Vitamine. Die genauen
Zusammensetzungen geeigneter Fermentationsmedien sind zahlreich bekannt und dem Fachmann zugänglich.
Nach Inokulation des Fermentationsmediums mit einem geeigneten D- Pantothensäure produzierenden Organismus (mit dem Fachmann bekannten Zelldichten) erfolgt, ggf. unter Zusatz eines Antischaummittels, die Kultivierung des Organismus.
Eine Einstellung des pH-Wertes des Mediums kann mit verschiedenen anorganischen oder organischen Laugen oder Säuren erfolgen, wie z.B. NaOH, KOH, Ammoniak, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Salzsäure, Ameisensäure, Bernsteinsäure oder Zitronensäure oder Kombinationen davon erfolgen. Hierbei ist nicht nur der Einsatz der genannten Mittel zur Einstellung des pH-Wertes einzeln, sondern auch deren Kombination möglich. Die Kombination kann den parallelenoder sequentiellen Einsatz der benannten Basen umfassen. Bevorzugt ist beispielsweise der sequentielle Einsatz von Ammoniak, z.B. in Form von Ammoniak-Gas, und NaOH. Die Umstellung von Ammoniak-Gas auf NaOH erfolgt erfindungsgemäß so, dass die Ammoniumkonzentration in der Fermentationslösung am Ende der Fermentation vorteilhaft im Bereich von 0 bis 20 g/l, bevorzugt von 0-10 g/l, besonders bevorzugt von 0-5 g/l liegt.
Bei Einsatz in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von D- Pantothensäure kann mit diesem erfindungsgemäßen Mikroorganismus wenigstens 35 Gew.-% D-Pantothensäure und/oder deren Salze durch Fermentation in einem Kulturmedium und entsprechende Aufbereitung gebildet werden. Bevorzugt werden Konzentrationen im Bereich von wenigstens 40 bis 50 Gew.-%, besonders bevorzugt wenigstens 50 Gew.- % an D-Pantothensäure und/oder deren Salze gebildet.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Mikroorganismus ist, daß er höchsten Sicherheitsanforderungen, insbesondere hinsichtlich der Zulassung von mit genetisch veränderten Mikroorganismen hergestellten Produkte erfüllt, da seine Vermehrungsfähigkeit über thermostabile Uberdauerungsformen, wie z.B. thermostabile Sporen, ausgeschlossen ist (Sporulations-Knock-out Mutante).
Generell ist es bei Einsatz eines genetisch veränderten Organismus in einer Fermentation erforderlich, aufgrund der genannten hohen Sicherheitsanforderungen an die Produktzulassung, seine Deaktivierung oder Abtötung vermehrungsfähigen Materials nach Beendigung der Fermentation vorzunehmen.
Unter vermehrungsfähigem Material ist erfindungsgemäß lebensfähiges biologisches Material, einschließlich seiner Ruhestadien bzw. Uberdauerungsformen zu verstehen. Dabei zählen zu dem genannten lebensfähigen Material beispielsweise Zellen oder Zellverbände von Mikroorganismen (wie z.B. Bakterien, Hefe, Pilze), Algen oder Protozoen, ferner Viren, replikationsfähige Genom-Elemente und auch Sporen und hierbei insbesondere thermostabile Sporen.
Eine Deaktivierung oder Abtötung des vermehrungsfähigen Materials kann allgemein z.B. durch physikalische, chemische oder enzymatische Vorgehensweisen, die zur gängigen Laborroutine zählen, erfolgen. Zu den gängigen physikalischen Methoden sind neben einer thermischen Abtötung, wie z.B. der Sterilisation oder Pasteurisierung, auch die Bestrahlung mit ionisierenden oder UV- Strahlen sowie die Sterilfiltration zu zählen. Chemische Methoden sind z.B. eine Säurebehandlung, beispielsweise mit Salzsäure oder Schwefelsäure oder die Verwendung mikrobizider Gase, wie z.B. Formaldehyd oder Ozon. Zu den enzymatischen Methoden gehört z.B. die Behandlung mit Lysozym.
Die thermische Abtötung erfolgt nach gängiger Laborpraxis durch eine Erhitzung des vermehrungsfähigen Materials.
Routinemäßig führt der Fachmann eine Sterilisation von Mikroorganismen enthaltenden Fermentationslösungen bei 121 CC über einen Zeitraum von 15-20 Minuten (im Autoklaven, d.h. bei 1 bar Druck)ader 180 °C über eine Zeit von 30 Minuten (im Heißluftsterilisator) durch. Eine routinemäßige Pasteurisierung erfolgt bei Temperaturen von 55-65 °C über einen Zeitraum von etwa 30 Minuten oder bei Temperaturen von 80-90 °C bei einer Haltezeit von etwa 3-5 Sekunden. Hitzeresistente Sporen werden bei der dem Fachmann bekannten Pasteurisierung jedoch nicht inaktiviert.
Eine thermische Abtötung bietet gegenüber anderen Verfahren den Vorteil eines Verzichts auf Hilfsstoffe, die bei dem gewählten Aufarbeitungsverfahren zumindest teilweise ins Produkt gelangen würden. Erfindungsgemäß findet in dem Verfahren zur Herstellung von D- Pantothensäure und/oder deren Salze in Schritt b) eine thermische Abtötung stattDieseSie kann vor oder nach der Zellabtrennung erfolgen. Die zuvor aufgezählten Möglichkeiten der physikalischen, chemischen oder enzymatischen Abtötung können erfindungsgemäß ebenfalls zur erfolgreichen 100%igen Abtötung vermehrungsfähigen Materials genutzt werden.
Vorteil des erfindungsgemäßen genetisch veränderten Mikroorganismus ist, daß aufgrund seiner Eigenschaft keine thermostabilen Sporen zu bilden, eine thermische Abtötung unter weniger stringenten Bedingungen, d.h. unter Produkt-schonenderen Bedingungen, erfolgen kann, als bei genetisch veränderten . Mikroorganismen, die thermostabile Uberdauerungsformen zur späteren Vermehrung bilden. Unter „thermische Abtötung unter weniger stringenten Bedingungen" ist erfindungsgemäß zu verstehen, daß z.B. das den erfindungsgemäßen Mikroorganismus enthaltende Medium erfindungsgemäß schonender behandelt werden kann, ohne Gefahr zu laufen, daß eine spätere Kontamination der Produkte, infolge von aus thermostabilen Sporen entstehenden Mikroorganismenkulturen, zu erwarten ist. So ist erfindungsgemäß eine schonende thermische Abtötung bei Temperaturen von etwa 50 - 140 °C über eine Haltezeit von 1 - 30 Minuten gegeben. Vorteilhafte Varianten der erfindungsgemäß schonenden thermischen Abtötung sind dabei alle denkbaren Kombinationen von niedriger Temperatur mit hohen Haltezeiten oder hoher Temperatur mit niedrigeren Haltezeiten.
Der erfindungsgemäße genetisch veränderte Mikroorganismus ist nach Erhitzung bei Temperaturen im Bereich von 50°C bis 140 °C über einen Zeitraum von etwa 1 bis 30 Minuten zu 100 % nicht mehr vermehrungsfähig. Bevorzugt sind Temperaturen von > 60°C, wie z.B. etwa 60 - 120°C, und Haltezeiten von etwa 20 - 30 Minuten, besonders bevorzugt etwa 70 - 90°C und Haltezeiten von etwa 15 - 20 Minuten, höchst bevorzugt etwa 75 - 90 °C und Haltezeiten von etwa 15 - 20 Minuten und insbesondere etwa 85°C und eine Haltezert von etwa 15 Minuten. Erfindungsgemäß vorteilhaft ist auch eine Erhitzung bei etwa 140°C über eine Haltezeit von etwa 3 Minuten.
Erfindungsgemäß wird eine Abtötung von 100 % erreicht. Eine 100% -ige Abtötung bedeutet, daß in 0,1 ml der thermisch abgetöteten und ggf. verdünnten Fermentationslösung kein vermehrungsfähiges Material, insbesondere keine Zelle des eingesetzten genetisch veränderten Mikroorganismus, durch Wachstum auf Antibiotika-freiem Medium, nachgewiesen werden kann, was einer Zelldichte von unter 100 cfu/ml entspricht. Dies resultiert in einem erfindungsgemäßen Tierfuttersupplement, das kontaminationsfrei ist, d.h. 0% vermehrungsfähiges Material aufweist.
Eine erfindungsgemäße Abtötungsrate von 100% an vermehrungsfähigem Material bei Durchführung einer schonenderenthermischen Abtötung hat zum Vorteil, daß das z.B. in der Fermentationslösung enthaltene Produkt weniger aggressiven thermischen Anforderungen standhalten muß, d.h. die Produktaufbereitung schonender erfolgt. Diese schonendere Produktaufbereitung resultiert vorteilhafter Weise in geringeren Verlusten bzw. in gesteigerten Ausbeuten an gewünschtem Produkt gegenüber gängigen Vorgehensweisen.
Ferner ist das erfindungsgemäße Tierfuttersupplement somit kontaminationsfrei, d.h. es weist einen Gehalt von 0% an vermehrungsfähigem Material auf. Durch Ausplattieren von 0,1 ml thermisch behandelter Fermentationslösung konnte kein Wachstum einer Zelle nachgewiesen werden, was einer Zelldichte von unter 100 cfu/ml entspricht. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement, bei dem eine thermische Abtötung vermehrungsfähigen Materials bei Temperaturen im Bereich von etwa 50 - 140°C bei Haltezeiten von etwa 1 - 30 Minuten, bevorzugt bei Temperaturen von etwa 60 - 120°C und Haltezeiten von etwa 20 - 30 Minuten, besonders bevorzugt etwa 70 - 90°C und Haltezeiten von etwa 15 - 20 Minuten, höchst bevorzugt etwa 75 - 90 °C und Haltezeiten von etwa 15 - 20 Minuten und insbesondere etwa 85°C und eine Haltezeit von etwa 15 Minuten. Gegentand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement, bei dem eine thermische Abtötung vermehrungsfähigen Materials bei einer Temperatur von etwa 140°C über eine Haltezeit von etwa 3 Minuten erfolgt.
Anschließend, erfolgt in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung eines D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement in Schritt c) die Abtrennung unlöslicher Bestandteile aus der Fermentationslösung.
Unter unlöslichen Bestandteilen sind dabei erfindungsgemäß Zellen, Zellverbände, Zellfragmente, Zellbestandteile, Uberdauerungsformen, wie z.B. Sporen oder unlösliche Bestandteile des Fermentationsmediums zu verstehen.
Die Abtrennung der unlöslichen Bestandteilenach der Fermentation führt zu einer signifikanten Erhöhung der Konzentration der D-Pantothensäure und/oder deren Salze im Endprodukt. Hierbei werden an die Abtrennung der unlöslichen Bestandteile aus der Fermentationslösung zwei Anforderungen gestellt. Einerseits soll das Zellmaterial möglichst vollständig abgetrennt werden, um hohe Produktkonzentrationen im Endprodukt zu erzielen und andererseits sollen dabei aus wirtschaftlichen Gründen nur geringe Produktverluste auftreten.
Allgemeine Verfahren zur Abtrennung von Feststoffen aus Flüssigkeiten sind dem Fachmann bekannt (siehe z.B. Perry's Chemical Engineers Handbook). Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt der Einsatz eines dem Fachmann an sich bekannten Membrantrennverfahrens, wie z.B. einer Ultrafiltration oder Mikrofiltration (siehe z.B. M. Mulder, Basic Principles of Membrane Technology, Kluwer Academic PublishersDordrecht, 1991) unter Verwendung von Membranen, die die Zellmasse zurück halten. Hierbei werden vorteilhaft asymmetrisch strukturierte, poröse Membranen eingesetzt.
D i ffirfindungsgemäß eingesetzten Membranen können in einer vorteilhaften Variante aus einer Trennschicht, welche die eigentliche Stofftrennung bewirkt, und einer ein- oder mehrlagigen Stützschicht, welche die Trennschicht trägt und gröbere Poren als die Trenn schicht aufweist, aufgebaut sein. Die Trennschichten sowie die Stützschicht können aus organischen oder anorganischen Polymeren, Keramik, Metall oder Kohlenstoff bestehen und müssen in dem Reaktionsmedium und bei der Prozesstemperatur stabilsein. Die erf dungsgemäß bevorzugten Membranen weisen Porengrößen zwischen 1 und 1000 nm, bevorzugt zwischen 10 und 100 nm auf. Beispielweise wurde eine Ultrafiltrations- Anlage mit Rohrmodulen vom TYP BTU-P19CAE der Firma Berghof eingesetzt
Die Membranen könnenin Form von Schläuchen, Rohren, Kapillaren, Hohlfasern oder Flachmembranen in an sich bekannten Flach-, Rohr-, Multikanalelement-, Kapillar- oder Wickelmodulen eingesetzt werden. Die optimalen transmembranerOrucke zwischen Retentatund Permeat liegen im wesentlichen, abhängig vom Durchmesserder Membranporen bzw. der Trenngrenze (angegeben in Molekulargewichtseinheiten), der mechanischen Stabilität der Membran und je nach Membran -Art zwischen 0,1 und 40 bar, bevorzugt zwischen 0,5 und 10, besonders bevorzugt zwischen 1 und 5 bar.Der optimaleDruck ist derDruck, bei demdie Permeatleistung maximal ist. Dabei kann in dem Fall in dem der Feed (aufzubereitende Lösung) mit einem zu hohenDruck zugeführt wird, der transmembrane Druck durch Anheben des Permeatdrucks argepasst werden.
Die Betriebstemperatur ist abhängig von der Produkt- und der Membranstabilität. Sie liegt zwischen etwa 20 und 90 °C, bevorzugt zwischen etwa 40 und 70 °C. Höhere Temperaturen führenim Allgemeinen zu höheren Permeatflüssen.
Die Zellabtrenumg mittels Membranverfahren kann zu einen in so genannten Aufkonzentrierungs -Modus erfolgen, bei dem kontinuierlich (z.B. in mindestens einem Feed- und Bleed -Kreislauf) oder diskontinuierlich die Zellmasse aufkonzentriert wird und das Wertprodukt im Permeat anfällt.
Die Zellabtrennung kann erfindungsgemäß in vorteilhafter Weise auch durch eine andere Sonderform der Membranfiltration, nämlich eine
Diafiltratiorerfolgen.
Die Diafiltration kanndiskontinuierlich erfolgen ndem die Lösung über einen Kreislauf, enthaltend einen Behälter, eine Pumpe und ein oder mehrere Membranmodule, geführt wird und dabei die Drücke in den
Membranmodulen so eingestellt werden, dassPermeat anfällt. Dabei wird stetig oder zu bestimmten Zeiten Wasser oder eine wässrige Lösung zugegeben, die das abzutrennende Produkt nicht oder in geringerer
Konzentration enthält, als zum Zeitpunkt der Zugabe in den
Trennkreislauf.
Die Zellabtrennung mittels Diafiltration kann erfindungsgemäßauch kontinuierlich erfolgen, wobei vorzugsweise mehrere Membranmodule in
Reihe geschaltet sind oder jeweils ein oder mehrere Membranmodul- enthaltende Pumpkreisläufe in Reihe geschaltet sind. Vor, zwischen oder nach den Membranmodulen oder Pumpkreisläufen kann Wasser (z.B. vollentsalztes Wasser) oder eine wässrige Lösung, die das abzutrennende Produkt nicht oder in geringerer Konzentration enthält als am Ort der Zugabe, zugegeben werden.
Erfindungsgemäß kann die Ultrafiltration oderDiafiltration direkt mit dem Fermentationsaustrag durchgeführt werden oder nach einer Behandlung des Fermentationsaustrages, z.B. durch Zentrifugationpekantierung oder ähnliches Vorgehen oder eine Kombination davon, erfolgen. Da bei der Diafiltrationeine Verdünnung des Wertproduktaeintritt, ist es vorteilhaft, das Permeat bzw. das aus mehreren Permeatfraktionen bestehende Sammelpermeat in einem nachfolgenden Schritt auf die gewünschte Konzentration aufzukonzentrieren. Dies kann z.B. mittels Eindampfung oder mittels Umkehrosmose, jeweils unter Verwendung an sich bekannter Verfa hren und Apparate, erfolgen.
Vorgehensweisen der Zentrifugation sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Hierzu sei auf Centrifugal clarifiers and decanters for biotechnology (Technical Scientific DocumentationNo.5, Third revised edition 1988 by P. Schenk, Westfalia Separator AG, Oelde, West Germany) verwiesen.
Bei der Zentrifugation wird die D-Pantothensäure enthaltende Lösung 1 bis 15 Minuten bei 1000 bis 8000 g und einer Temperatur von 20 bis 65 °C behandelt. Die Abtrennungder Zellen lenn mittels gängiger Dekanter oder Separatoren vorgenommen werden.
Erfindungsgemäß wird die D-Pantothenat enthaltende
Fermentationslösung durch Filtration, Membrantechnik, Zentrifugation, Dekantierung oder durch Kombinationen davon von den unlöslichen Bestandteilen getrennt wird, wobei die Produktverluste kleiner 5 % sind und der Abtrennungsgrad für die unlöslichen Bestandteile größer 95% ist. In einer Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Abtrennung unlöslicher Bestandteile aus der D-Pantothenat enthaltenden Fermentationslösung durch Ultrafiltration, bevorzugt Ultra - Diafiltration.
In einer anderen Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Abtrennung unlöslicher Bestandteile aus der D-Pantothenat enthaltenden Fermentationslösung durch Zentrifugation und anschließende Dekantierungerreicht.
In einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Abtrennung unlöslicher Bestandteile aus der D-Pantothenat enthaltenden Fermentationslösung durch eine Kombination aus Zentrifugation und Dekantierungerreicht.
Bevorzugt ist die Kombination mehrerer Apparate zu einer Kaskade. Eine besondere Apparatewahl stellt beispielsweise ein Sedikanter (Typ S3E der Firma Flottweg) dar, der erfindungsgemäß bevorzugt eingesetzt wird. In dem Sedikanter werden die unlöslichen Bestandteile der Fermenationslösung mit hydraulischer Unterstützung aus einer doppeltkonisch gebauten Trommel unter einer Tauchscheibe hindurchgedrückt. Zur Abtrennung der unlöslichen Bestandteile wird die thermisch behandelte Fermentationslösung kontinuierlich mit einem Flockungsmittel (z.B. Sedipur CF 404, CF 504, CF 603) und vollentsalztem-(VE)-Wasser versetzt und in einem statischen Mischer gemischt. Hierdurch wurde die Zellmasse geflockt und nachfolgend im Sedikanter abgetrennt. Der Klarlauf wird aufgefangen. Diese geklärte Flüssigkeit enthält den Hauptbestandteil der Pantothensäure. Die Zellmasse wird separat aufgefangen. Diese enthälün dem extrazellulären Wasser noch erhebliche Mengen Pantothensäure, die mit Wasser (und ggf. Flockungsmittel) gemischt und in einem nachfolgenden Waschschritt erneut über den Sedikanter geleitet wird, wobei weiter Zellmasse abgetrennt werden. Dieser Waschschritt verläuftvon der Vorgehensweise vergleichbar wie der erste Trennschritt. Der zweiteKlarlauf wird mit dem Ersten vereinigt.
Die Abtrennung der unlöslichen Bestandteile.wie z.B. Zellmasse, von der Fermentationlösung kann auch bei der Zentrifugation in vorteilhafter Weise durch den Einsatz von handelsüblichen Flockungsmitteln verbessert werden. Wird als eine weitere Variante eine mehrstufige Dekantemnd/oder Separator-Verschaltung (Gleichstrom oder Gegenstrom-Fahrweise) gewählt, in der die unlöslichen Bestandteile u. U. mit Waschwasser oder einem Prozeßstrom angemaischt (verdünnt) wird, führt die Zugabe von Flockungsmittel vor jeder Stufe erfindungsgemäß zu einer Verbesserung der Trennleistung.Der Verlust an D-Pantothensäure kann so erheblich reduziert werden.
Erfindungsgemäß werden mit den beschriebenen Methoden zur Abtrennung unlöslicher Bestandteile aus der D-Pantothensäure enthaltenden Fermentationslösung Abtrennungsgrade von größer 95% erreicht. Bevorzugt bei Einsatz einer Membranfiltration werden Abtrennungsgrade von etwa 98-100%, besonders bevorzugt von 100% erreicht.
Die aus der Abtrennung resultierendeD-Pantothensäure enthaltende Lösung kann, ggf. vor Zugabe der Calcium- und/oder Magnesiumsalze und/oder deren Basen, über einen geeigneten Verdampfer, z. B. Fallfilmverdampfer, Dünnschichtverdampfe oder Rotationsverdampfer aufkonzentriert werden. Solche Verdampfer werden z. B. von den Firmen GIG (4800 Attnang Puchheim, Österreich), GEA Canzler (52303 Düren, Deutschland)Piessel (31103Hildesheim, Deutschlandψnd Pitton (35274 Kirchhain, Deutschtad) hergestellt. Ferner ist die Herstellung von P-Pantothensäure vorwiegend in Form ihrer zweiwertigen Salze und hierbei vor allem der Erdalkali-Salze wünschenswert, da die zweiwertigen Salze weniger hygroskopische Eigenschaften aufweisen als einwertige Salze der Pantothensäure und für die weitere Verwendung, z. B. als Tierfuttersupplement, somit weniger stark zu Verbackungen neigen.
Aufgrund der während der Fermentation eingesetzten Basen, die wie zuvor beschrieben, z.B. NaOH, KOH, Ammoniak, Phosphorsäure, Schwefelsäure, Salzsäure, Ameisensäure, Bersteinsäure, Zitronensäure o.a. sein können, liegt die gebildete D-Pantothensäure in der Fermentationslösung je nach eingesetztem Puffersystem in Form des/der jeweiligen Salze(s) vor. Da hierbei insbesondere die Salze der D- Pantothensäure in Form ihrer einwertigen Kationen unvorteilhaft sind, wird die Fermentationslösung erfindungsgemäß unter Zugabe von Calcium - und/oder Magnesiumsalzen bzw. deren Basen an bivalenten Kationen angereichert, wodurch sich die Trocknungseigenschaften günstig beeinflussen lassen. Vorteilhaft sind erfindungsgemäß unter anorganischen Calcium- und/oder Magnesium -Salzen die entsprechenden Halogenide zu verstehen. Erfindungsgemäß bevorzugt sind dies CaCI2 und/oder MgCI2. Unter den organischen Calcium- und/oder Magnesium - Salzen sind beispielsweise Salze organischer Anionen zu verstehen. Bevorzugt sind dies z. B. Calcium- und/oder Magnesium -Formiat, -Acetat, -Propionat, -Glyzinat, -Citrat, -Glutamat, -Ascorbat und/oder -LactatDer Einsatz bivalenter Kationen in Relation zu der vorliegenden D- Pantothensäure erfolgt im Verhältnis 0,5 - 1 ,5 : 1 , bevorzugt 0,5 - 1 ,0 :1 , besonders bevorzugt: 1 :1.
Weitere Hilfsstoffe zur Verbesserung der Trocknungseigenschaften können Calciumhydroxid, Calciumnitrat, Calciumcarbonat, Calciumoxid, Magnesiumhydroxid und/oder basisches Magnesiumcarbonat in Form eines Feststoffes und/oder als wässrige Suspension sein. Bei der Zugabe von basischen Additiven sollten erfindungsgemäß pH-Werte kleiner 12, bevorzugt zwischen 6 - 10, besonders bevorzugt zwischen 5 - 9, eingehalten werden.
Die Zugabe der Calciumsalze und/oder Magnesiumsalzeund/oder deren Basen zu der D-Pantothenat enthaltenden Fermentationslösung erfolgt erfindungsgemäß bevorzugt in Form einerwässrigen Dispersbn . D ies verhindert lokale, größere pH -Schwankungen sowie die Bildung von Agglomeraten der nach Zugabe der Additive evtl. entstehenden unlöslichen Bestandteile.
Die Trocknung und/oder Formulierung der Fermentationslösungoder - Suspension erfolgt nach an sich bekannten Verfahren, wie beispielsweise Sprühtrocknung, Sprühgranulation, Wirbelschichttrocknung,
Wirbelschichtgranulation, Trommeltrocknung oder Spin-flash Trocknung (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 601 edition, 1999, electronic release, Kapitel „Pryingof Solid Materials")Pie Sprühtrocknung kann im Gleichstrom, Gegenstrom oder Mischstrom erfolgen. Zur Zerstäubung können alle bekannten Zerstäuber herangezogen werden, insbesondere Zentrifugalzerstäuber (Zerstäuberscheibe), Einstoffdüse oder Zweistoffdüse. Bevorzugte Trocknungstemperaturbedingungen sind 150 - 250 °C Turmeintrittstemperatur und 70 - 130 °C Turmaustrittstemperatur. Es kann aber auch bei höherem oder niedrigeren Temperaturniveau getrocknet werden. Um eine sehr niedrige Restfeuchte zu erzielen, kann noch ein weiterer Trocknungsschritt in einem Wirbelbett nachgeschaltet werden. Die Sprühtrocknuncäßt sich auch in einem FSD- oder SBD-Trockner(FSD: Fluidizeβpray DryerSBD: SprayBed Dryer), wie sie von den Firmen Niro A/S (Soeborg/Kopenhagen, Dänemark nd APV-Anhydro A/S (Soeborg/Kopenhagen, Dänemark) gebaut werden, durchführen, die eine Kombination von Sprühtrockner und Wirbelbett darstellen. Bei der Sprühtrocknung kann ein Fließhilfsmittel zugesetzt werden. Dadurchkönnen die Beläge an der Trocknerwandung reduziert und das Fließverhalten, gerade bei feinkörnigen Pulvern verbessert werden. Als Fließhilfsmittel kommen insbesondere Silikate, Stearate, Phosphate und Maisstärke in Betracht. Prinzipiell kann die Trocknung auch in einer Sprühwirbelschicht erfolgen, wobei diese sowohl kontinuierlich als auch diskontinuierlich betrieben werden kann. Das Einsprühen der Lösung kann sowohl von oben (Topspray), von unten (Bottomspray) als auch von der Seite (Sidespray) erfolgen. Zur Einstellung einer gewünschten Partikelgrößenverteilung und der damit verbundenen Produkteigenschaften können Feinpartikel abgetrennt und zurückgeführt werden. Ferner kann Grobgut in einer Mühle gemahlen und ebenfalls anschließend zurückgeführt werden.
Erfindungsgemäß vorteilhaft ist bei dem zuvor dargestellten Verfahren die Reduzierung aufwendiger Aufarbeitungsschritte gegenüber bekannten Verfahren, insbesondere der Verzicht auf den Einsatz organischer Lösungsmittel, bei gleichzeitiger Bereitstellung eines gewünschten Produktes mit guter biologischer Wertigkeit. Dies resultiert somit in weiteren Einsparungen an aufwendigen Aufbereitungs- und Entsorgungsanlagen. Somit zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren in vorteilhafter Weise dadurch aus, daß es einfacher, weniger störanfällig, weniger zeitaufwendig, deutlich kostengünstiger und damit wirtschaftlicher ist, als herkömmliche Verfahren.
Dies schließt jedoch nicht aus, daß das erfindungsgemäßeVerfahren variiert werden kann. Die eingangs genannten erfindurgsgemäßen Verfahrensschritte a) bis d) können durch einen oder mehrere zusätzlicher Verfahrensschritte ergänzt werden, die für sich genommen dem Fachmenschen vertraut sind. Hierbei sind alle denkbaren Kombinationen der zusätzlichen Verfahrensschritte mit den Verfahrensschritten a) bis d) erfindungsgemäß umfaßt.
So kann die thermische Abtötung auch an anderer Stelle des Verfahrens erfolgen und muss nicht unmittelbar nach der Fermentation durchgeführt werden. Dabei sind auch andere Methoden, wie z.B. Sterilfitration,
Bestrahlung mit ionisierenden oder UV-Strahlen, Einsatz mikrobizider
Gase (Formaldehyd, Ozon), chemische Abtötung, z.B. durch
Säurebehandlung oder enzymatische Lyse denkbar.
Außerdem kann die Zugabe von Calcium- und/oder Magnesiumsalzen oder deren Basen an bivalenten Erdalkalimetallen vor oder nach der
Abtötung vermehrungsfähigen Materials (Schritt b)) bzw. vor oder nach der Abtrennung unlöslicher Bestandteile aus der Fermentationslösung
(Schritt c)) bzw. vor oder während der Trocknung und/oder Formulierung
(Schritt d)) erfolgen.
Ferner kann in weiteren Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens vor oder während der Trocknung und/oder Formulierung der D-Pantothenat enthaltenden Lösung beispielsweise die Zugabe weiterer Zuschlagstoffe erfolgen.
Dies können z.B. Fließhilfsmittel wie Kieselsäure sein, die bevorzugt direkt in den Trockner eingeblasen werden. Ebenso kann mit geeigneten
Füllstoffen (wie z.B. Zucker, anorganische Salze) auf einen standardisierten Gehalt an D-Pantothensäure und/oder deren Salze eingestellt werden.
Um die farblichen Eigenschaften des Endproduktes zu verbessern, kann ein zusätzlicher Filtrationsschritt durchgeführt werden, bei dem den während des Verfahrens erhaltenen Lösungen etwas Aktivkohle zugesetzt wird und diese Suspension anschließend filtriert wird. Oder die während der Fermentation erhaltenen Lösungen können über ein kleines Aktivkohlebett geleitet werden. Die hierzu erforderlichen Mengen eingesetzter Aktivkohle liegen im Bereich weniger Gew.-% der Lösung und liegen im Wissen und Ermessen des Fachmanns. Diese Filtrationen können erleichtert werdenjndem der jeweiligen Lösung vor der Filtration ein handelsübliches Flockungshilfsmittel (z. B. Sedipur CF 902 oder Sedipur CL 930 der Firma BASF AG, Ludwigshafen) zugesetzt wird.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Fermentationslösung durch Erhitzen von vermehrungsfähigem Material und dann durch Membrantechnik von der (abgetöteten) Zellmasse befreit. Der zellfreien Lösung/verden Calcium und/oder Magnesiumsalze in einem Verhältnis von 0,5 bis 2 mol Salz pro 1 mol Pantothensäure in der Lösung zugegeben. Die sich anschließende Trocknung dieser Lösung erfolgt durch Sprühtrocknung, die im Gleichstrom, Gegenstrom und/oder Mischstrom, bevorzugt im Gleichstrom und/oder Gegenstrom, besonders bevorzugt im Gleichstrom erfolgen kann. Zur Zerstäubung wird ein Zentrifugalzerstäuber (Zerstäuberscheibe), Einstoffdüse oder Zweistoffdüse eingesetzt. Bevorzugte Trocknungstemperaturbedingungen sind 150 - 250 °C Turmeintrittstemperatur und 70 - 130 °C Turmaustrittstemperatur.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden wenigstens 35 Gew.-%, bevorzugt Konzentrationen im Bereich von wenigstens 40 bis 50 Gew.-%, besonders bevorzugt wenigstens 50 Gew.-% D-Pantothensäure und/oder deren Salze durch Fermentation im Kulturmedium und entsprechende Aufbereitung gebildet.
Durch Medie-α Stamm- und Fermentationsverfahrensentwicklung können die Pantothensäure-Titer in den Fermentationslösungen weiter, d.h. auf über 50 Gew.-%, bevorzugt auf über 55 Gew.-%, besonders bevorzugt auf über 60 Gew.-% gesteigert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Tierfuttersupplement zum Einsatz in Tierfutter und/oder Tierfutterergänzungsmitteln, wobei es herstellbar ist, indem a) wenigstens ein D-Pantothensäure produzierender Organismus eingesetzt wird, dessen Pantothensäure- (pan)- und lsoleucin/Valin-(ilv)-Biosynthese dereguliert ist und dem die Fähigkeit zur Bildung thermostabiler Sporen fehlt, b) vermehrungsfähiges Material in der D-Pantothenat enthaltenden Fermentationslösung abgetötet wird, c) unlösliche Bestandteile aus der D-Pantothenat enthaltenden Fermentationslösung abgetrennt werden und d) diese Lösung einer Trocknung und/oder Formulierung unterzogen wird.
Erfindungsgemäß zeichnet sich das Tierfuttersupplement, auf der Basis einer durch Fermentation wenigstens eines D-Pantothensäure produzierenden genetisch veränderten Mikroorganismus erhaltenen Fermentationslösung, dadurch aus, daß es D-Pantothensäure in einer Konzentration von wenigstens 35 Gew.-%, bevorzugt in einer Konzentration von wenigstens 40 bis 50 Gew.-%, besonders bevorzugt von wenigstens 50 Gew.-% D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthält und kein vermehrungsfähiges Material, insbesondere Zellen des genetisch veränderten Mikroorganismus, aufweist. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Tierfuttersupplement, das die Salze der D- Pantothensäure in einer Mischform, bevorzugt mit zweiwertigen Kationen, besonders bevorzugt als Calcium- und/oder Magnesium-P-Pantothenat enthält. Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Tierfuttersupplement, das sich dadurch auszeichnet, daß der Gehalt einwertiger Kationen < 15 Gew.-% ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung des beschriebenen Tierfuttersupplements als Zusatz zu Tierfutter und/oder Tierfutterergänzungsmitteln.
Erfindungsgemäß wird durch das zuvor beschriebene Verfahren ein Calcium- und/oder Magnesium-P-Pantothenat enthaltendes Tierfuttersupplement erhalten, das den Ansprüchen für ein Tierfutter oder Tierfutterergänzungsmittel oder den Zusatz zu einem Futtermittel oder einem Tierfutterergänzungsmittel genügt. Diese Anforderungen sind beispielsweise ein relativ hoher Gehalt an D-Pantothenat und/oder deren Salze und eine gute Verträglichkeit für den Zielorganismus sowie eine biologische Wertigkeit im Sinne der „Vitamin -Wirkung" des erfindungsgemäßen Produktes.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgendenBeispiele näher erläutert, die jedoch nicht limitierend für die Erfindung sind:
1. Fermentation Für die Anzucht der Vorkultur wurden zwei 2000 ml-Erlenmeyerkolben mit zwei Schikanen, die 250 ml SVY-Medium enthielten, mit je 2,0 ml einer Zellbank des Bacillus subtillis Stamms PA 766 beimpft und für 8 h bei 43 °C und 200 rpm in dem Schüttelinkubator Multitron (Fa. Infors) kultiviert. D as SVYMedium enthielt die in Tab. 1 enthaltenen Bestandteile. Zur Herstellung des Mediums wurden 25,0 g Veal Infusion Broth, 5,0 g Yeast Extract, 5,5 g Natriumglutamat H2O und 2,7 g (NH4)2SO4 in 750 ml vollentsalztem (VE-) Wasser gelöst und autoklaviert (121 °C, 20 min). Nach dem Erkalten wurden 200 ml separat autoklavierte (121 °C, 20 min) Lösung mit 136,1 g/l KH2PO und 174,2 g/l K2HPO4, 50 ml separat autoklavierte (121 °C, 20 min) Glucose H2O+MgCI2'6H2O+CaCl2-2H2O- Lösung (660 g/l Glucose H2O, 20 g/l MgCI2-6H2O+ 2 g/l CaCI2-2H2O) sowie 0,250 ml einer sterilfiltrierten Tetrazyclin-Lösung (30 g/l in 70 % Ethanol) zugesetzt.
Tab. 1 : SVY-Medium
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Für den Start der Hauptkultur wurde das Batchmedium mit 120 mL der Vorkultur beimpft. Die Inkubationerfolgte für 48 h bei 43 C und einem Überdruck im Gasraum von 0,3 bar in einem gerührten 20 l-Bioreaktor(Fa. Infors, Typ Techfors). Zur Dosierung des Feed-Mediums wurde ein Regelalgorithmus eingesetzt, der basierend auf der zeitlichen Änderung des pO2-Signals die Dosierrate inkrementell anden aktuellen Bedarf der Kultur anpassteDer pH-Wert wurde zunächst mit NH4-Lösung (25 %) und H3PO4 (20 %) auf pH 7,2 geregelt, nach 40 h wurde NH4-Lösung durch NaOH-Lösung (25 %) ersetzt. Die Anfangswertevon Rührerdrehzahl und Begasungsrate betrugen 500 rpm und 5 I Luft/min. Nach dem Abfall des pÜ2 wurde dieser über die Regelung von Rührerdrehzahl und Begasungsrate zwischen 10 und 30% gehalten. Das Antis<haummittel Tegospon T3062 (Fa. Goldschmidt) wurde nach Bedarf zudosiert. Für die Herstellung des Batch-Mediums wurden 300 g Sojagrieß, 0,76 g CaSO4 2H2O und 6 ml Tegosipon T3062 mit vollentsalztem (VE-) Wasser auf ein Volumen von 4,8 I aufgefüllt, 30 min gerührt und autoklaviert (121 °C, 30 min). Nach dem Erkalten wurden 200 ml separat autoklavierte (121 °C, 30 min) Natriumglutamat H2O-Lösung (165,9 g/l, VE -Wasser als Lösemittel), 300 ml separat autoklavierte MgSO4-7H2θ-Lösung (41 ,0 g/l, VE-Wasser als Lösemittel), 30 ml separat sterilfiltrierte Na3Citrat-5,5H2O+FeSO -7H O-Lösung (276,7 g/l Na3Citrat-5,5H2O und 3,7 g/l FeSO 7H2O, VE-Wasser als Lösemittel), 6 ml separat sterilfiltrierte Spurenelementelösung PSTE 1000x und 500 ml separat autoklavierte (121 °C, 30 min) Phosphat-Lösung (60 g/l KH2PO , 120 g/l K2HPO4, 78 g/l NaH2PO4 2H O und 150,8 g/l Na2HPO4-2H2O, VE-Wasser als Lösemittel) zugesetzt. Die Spurenelementelösung PSTE lOOOxenthielt pro Liter VE- Wasser: 0,75 g Na2Mo042H2O, 2,1 g CoSO -7H2O, 0,25 g CuSO4-5H2O, 1 ,7 g MnSO H2O, 1 ,5 g ZnSO4-7H2O. Für die Herstellung des Feed-Mediums wurden 25 kg Glucose H2O 12,0 I VE-Wasser zugesetzt, ca. 5 min gerührt und autoklaviert (20 min, 121 βC). Nach dem Abkühlen auf ca. 50 °C wurde diese Lösung unter sterilen Bedingungen in 6,0 1-Portionen in sterile Glasflaschen abgefüllt. 80 ml separat sterilfiltrierte Natriumglutamat H∑O-Lösung (414,9 g/l, VE- Wasser als Lösemittel), 60 ml separat sterilfiltrierte Na3Citrat-5,5H2θ+FeSO -7H2O-Lösung (276,7 g/l Na3Citrat-5,5H O und 3,7 g/l FeSO4-7H O, VE-Wasser als Lösemittel) und 12 ml separat sterilfiltrierte Spurenelementelösung PSTE 1000x (s. o.) wurden unter sterilen Bedingungen vereinigt. Der resultierendenLösung wurden 4,6 g CaSO -2H2O als Feststoff zugesetzt. Die resulierende Lösung wurde unter sterilen Bedingungen 6,0 I der Glucose H2θ-Lösung (s. o.) zugesetzt.
Tab. 2: Batch-Medium
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Für die Herstellung der Zellbank des Bacillus subtillis Stamms PA 766 wurden 500 ml-Erlenmeyerkolben mit 50 ml SVY-Medium (Tabelle 1) eingesetzt. Dieses wurde 1 % ig aus einem Cryostockdes Bacillus subtillis Stamms PA 766 beimpft und bei 37 °C und 200 rpm bis zu einer optischen Dichte der Kultursuspension bei einer Messwellenlängevon 600 nm (ODβoo) von ca. 8,0 angezogen. Die Kultursuspensiorwurde unter sterilen Bedingungen in ein steriles Becherglas mit sterilem Magnetrührer überführt. Nach Zugabe von 10 ml sterilen Glycerins (80 %) und Rühren (ca. 5 min) wurden Portionen zu 2,0 ml unter sterilen Bedingungen in sterilen Röhrchen (Fa. Greiner) abgefüllt und bei -80 °C gelagert. Die Herstellung der Cryostocks erfolgtegemäß WO 02/072857 in SVY- Medium mit 7,5 mg/l Tetrazyclin.
2. Thermische Abtötung:
Die Abtötung des Produktionsstammserfolgte thermisch im Fermenter. Dazu wurden Rührerdrehzahl und Begasungsrateauf 500 rpm und 5 I Luft/min reduziert, die Fermentationslösung auf 85°C aufgeheizt, unter Bedämpfung des Gasraums für 15 Minuten bei dieser Temperatur gehalten und anschließend auf 25°C abgekühlt. Die Entnahme von Fermentationslösung erfolgte durch einen am Gefäßboden befindlichen bedämpfbaren Probenahmehahn. Die Abtötungdes Produktionsstamms wurde durch Ausplattieren von 0,1 ml verschiedener Verdünnungen der thermisch behandelten Fermentationslösung auf TBAB -Platten nachgewiesen. Für die Herstellung von TBAB-Platten werden 30 g Tryptose Blood Agar Base (Fa.Oxoid) in 1,0 I VE-Wasser gegeben, ca. 5 min gerührt und autoklaviert (121 °C, 20 min). Nach dem Abkühlen auf ca. 50 "C werden Agarplatten gegossen.
3. Abtrennung unlöslicher Bestandteile:
Die Abtrennung unlöslicher Bestandteile aus der Fermentationslösung wurde zum einen mittels UF-Diafiltration (Fa. Berghof)und zum anderen mittels einer Laborzentrifuge durchgeführtDer Versuchsaufbau zur UF- Diafiltration ist in Fig.14 dargestellt.
3.1. Ultrafiltration (UF)/ Ultra-Diafiltration:
Für die UF-Diafiltrationsanlage wurde ein Labormodulder Fa. Berghof (Eningen, Deutschland) verwendet, das mitder Rohrmembran 3750 von der selben Firma bestückt war. Dabei wurde die thermischabgetötete Fermentationslösung aus einer Vorlage mittels einer Kreiselpumpe über die UF-Membranmodule gekreist. Der Retentatdruckwurde mittel eines hinter dem Membranmodul in den Kreislauf geschalteten Ventil geregelt. Die durch die Membranen permeierte Lösung(Permeat), die die gelöste Pantothensäure enthielt, wurde in einem Glasgefäß gesammelt. Zunächst wurde die Zellmasse aufkonzentriertPann schloss sich eine Piafiltration an, bei der das Permeat ständig durch die gleiche Menge Wasser ersetzt wurde.
Im ersten Versuch wurde von ca. 1 kg Fermentationslösung die unlöslichen Bestandteile auf diese Weise abgetrennt. Im Piafiltrationsschritt wurden 3 kg Piafiltrationswassereingesetzt. Man erhielt ca. 3,3 kg Permeat. Per Abtrennungsgrad für unlösliche Bestandteilelag bei 100 %. Pie durchschnittliche Pantothensäurekonzentration lag bei 2 Gew.-% . P ies entspricht einem Produktverlust von weniger als 3% gegenüber der P- Pantothensäuremenge der ursprünglichen Fermentationslösung.
3.2. Zentrifugation und nachfolgendeDekantierung:
Zu je 1000 g Fermentationslösung wurden unter Rühren mit einem Magnetrührer je 300 g einer 0,1 %ige wässrigen Lösung eines Flockungsmittels (Sedipur CF 504) zugegeben. Aus dem fein suspendierten Feststoff bildeten sich Flocken. Anschließend wurde mit Wasser weiter verdünnt (Verhältnis: 1 g Wasser zu 1 g Fermentationslösung) und kurz nachgerührt. Die ausgeflockte Fermentationslösung wurde auf Zentrifugenbecher verteilt. Es wurde zentrifugiert (5 min bei 3000 UPM) und danach der Klarlauf vom Sediment abdekantiert. Das Sediment wurde mit Wasserverdünnt (Verhältnis 150 g Wasser zu ca. 100 g Sediment) und der Becher solange geschüttelt, bis sich das gesamte Sediment vom Becherboden gelöst hatte. Da nach wurde erneut zentrifugiert (5 min bei 3000 UPM).Das Zentrat der ersten Waschung wurde abgetrennt. Danach wurde es mildem Klarlauf vereinigt. Erneut wurde im gleichen Verhältnis wie vorher Wasser zum Sediment zugegeben und man verfuhr wie bei der ersten Waschung der unlöslichen Bestandteile. Der Klarlauf und die Zentrate der beiden Waschungen wurden zur Weiterverarbeitung miteinander vereinigt. Zur Auswertung des Versuches wurden die Gewichte der eingesetzten Fermentationslösung, des Klarlaufes und der Zentrate der Waschungen bestimmt. Zusätzlich wurden jeweils die Trockenmassen und Pantothensäuregehälter gemessen. Folgende Beispiele wurden durchgeführt: 1) Es wurden 5220 g Fermentationslösung mit einer Trockenmasse von 12,5 % und 4,4 Gew% Pantothensäure zur Abtrennung unlöslicher Bestandteile eingesetzt. Mit dem oben beschriebenen Vorgehen wurden 10670 g Klarlauf mit einer Trockenmasse von 3,9 % und 20 g/l Pantothensäure, 1845 g Zentrat aus der ersten Waschung mit einer Trockenmasse von 1,2 % und einem Pantothensäuretiter von 3,7 g/l und 1770 g Zentrat aus der zweiten Waschung mit einer Trockenmasse von 0,7 % und 0,1 g/l Pantothensäure erhalten. Es wurden 69 % der Trockenmasse und 96 % der Pantothensäure aus der zur Abtrennung unlöslicher Bestandteile eingesetzten Fermentationslösung wiedergefunden. Die unlöslichen Bestandteilekonnte nahezu vollständig aus der Fermentationslösung abgetrennt werden und die vereinigten Klarläufe waren klar.
2) Es wurden 2600 g Fermentationslösung, die wie oben beschrieben im Laborfermenter hergestellt worden waren, mit einer Trockenmasse von 16,0 % und 6,1 Gew% Pantothensäure zur Abtrennung unlöslicher Bestandteile eingesetzt. Mit dem oben beschriebenen Vorgehen wurden 5120 g Klarlauf mit einer Trockenmasse von 4,4 % und 27 g/l Pantothensäure, 970 g Zentrat aus der ersten Waschung mit einer Trockenmasse von 1 ,0 % und einem Pantothensäuretiter von 7,0 g/l und 920 g Zentrat aus der zweiten Waschung mit einer Trockenmasse von 0,6 % und 3,4 g/l Pantothensäure erhalten. Es wurden 57 % der Trockenmasse und 93 % der Pantothensäure aus der zur Abtrennung unlöslicher Bestandteile eingesetzten Fermentationslösung wiedergefunden. Die unlöslichen Bestandteilekonnte nahezu vollständig aus der Fermentationslösung abgetrennt werden und die vereinigten Klarläufe waren klar.
3) Es wurden 2600 g Fermentationslösung, die wie oben beschrieben im Laborfermenter hergestellt worden waren, mit einer Trockenmasse von 18,4 % und 7,3 Gew% Pantothensäure zur Abtrennung unlöslicher Bestandteile eingesetzt. Mit dem oben beschriebenen Vorgehen wurden 4800 g Klarlauf mit einer Trockenmasse von 6 % und 37 g/l Pantothensäure, 980 g Zentrat aus der ersten Waschung mit einer Trockenmasse von 1 ,7 % und einem Pantothensäuretiter von 9,7 g/l und 920 g Klarlauf aus der zweiten Waschung mit einer Trockenmasse von 0,5 % und 3,5 g/l Pantothensäure erhalten. Es wurden 64 % der Trockenmasse und 100 % der Pantothensäure aus der zur Abtrennung unlöslicher Bestandteile eingesetzten Fermentionslösung wiedergefunden. D i e unlöslichen Bestandteile konnte nahezu vollständig aus der Fermentationslösung abgetrennt werden und die vereinigten Klarläufe waren klar.
4. Aufkonzentrierung:
Zur Eindampfung der bereits von unlöslichen Bestandteilen getrennten Fermentationslösung wurden insgesamt 3 batchweise Eindampfungen in einem Rotationsverdampfer vorgenommen. Es wurden die Fermentationslösungen aus der Abtrennung unlöslicher Bestandteile durch Zentrifugation oder Ultrafiltration jeweils getrennt aufkonzentriert. Die durchschnittthe Trockenmasse der Fermentationslösung betrug vor der Eindampfung ca. 5,7 Gew.-%, die durchschnittliche Pantothensäurekonzentration ca. 2,5 Gew.-%. Nach der Aufkonzentrierung lag die Trockenmasse bei den ersten beiden Fermentationen bei ca. 43 Gew.-%, bei der dritten Fermentation bei ca. 57 Gew.-%. Die Pantothensäureverluste währendder Eindampfung waren vernachlässigbar.
Bei jeder Eindampfungskampagne wurde die Blase des Rotationsverdampfers mit ca. 8 kg Fermentationslösung gefüllt. Bei einem Drucksollβrt von 100 mbar und einer Solltemperatur des Heizbades von ca. 65 °C wurde Wasser aus der Blase abdestilliert. Insgesamt wurden auf diese Weise ca. 24 kg Fermentationslsöung eingedampft. Es wurden insgesamt 2,8 kg Konzentrat erhalten, die ca. 1,3 kg Trockenmasse und ca. 600 g Pantothensäure enthielten. Die durchschnittlicheTrockenmasse des Konzentrates betrug 48 Gew.-%, die durchschnittliche Pantothensäurekonzentration 19 Gew.-% . Der pH-Wert der aufkonzentrierten Lösung blieb gegenüber der verdünnten Lösu ng nahezu unverändert und lag durchschnittlich bei 6,6.
5. Salzzugabe:
Unmittelbar vor Beginn der Spühtrocknung wurde in einem Gefäß 1 ,0-1 ,5 Äquivalente CaC (bezogen auf die Stoffmenge Pantothensäure) der aufkonzentrierten Fermentationslösng entweder a Is Feststoff oder als 45 %-ige Lösung unter Rühren zugesetzt. Insgesamt wurden drei Salzzugaben durchgeführt.
Bei allen drei Salzzugaben erhielt man eine feine Suspension, deren Trockenmasseanteil (gelöst und ungelöst) bezogen auf die gesamte Fermentationslösung ca. 45 Gew.-% betrug.
6. Sprühtrocknung:
Für die Sprühtrocknung im Laborsprühtrockner (Fa. Niro, Laborsprühtrockner Minor, Typ Hi-Tec) wurde die Sprühvorlage aus dem Vorlagegefäß zur Düsegepumpt und im Laborsprühturnrzerstäubt. Das Sprühtrockenpulver wurde über die Abluft im Zyklon abgeschieden. In Fig. 15 ist der Aufbau des verwendeten Laborsprühtrockners abgebildet. Im einzelnen wurden sechs Sprühtrocknungen mit folgenden Prozessparametern durchgeführt:
1. Fermentation, Abtrennung unlöslicher Bestandteile durch Ultrafiltration, Zugabe von 1,0 Äquivalente (eq) CaC bezogen auf Pantothensäurestoffmenge: Die Zulufttemperatur betrug 175 °C, die Ablufttemperatur 77 - 80 °C. Für die Zerstäubung wurde eine Zweistoffdüse verwendet undder Druck der Zerstäubungsluft betrug 2 bar.
2. Fermentation, Abtrennung unlöslicher Bestandteile durch Zentrifugation, Zugabe von 1 ,0 Äquivalenten CaCl2 bezogen auf Pantothensäurestoffmenge: Die Zulufttemperatur betrug 175 °C, die Ablufttemperatur 80 °C. Für die Zerstäu bung wurde eine Zweistoffdüse verwendet und der Druck der Zerstäubungslufbetrug 2 bar.
3. Fermentation, Abtrennung unlöslicher Bestandteile durch Ultrafiltration, Zugabe von 1 ,0 eq CaC bezogen auf PantothensäurestoffmengeDie Zulufttemperatur betrug ca. 175 °C, die Ablufttemperatur ca. 75 °C. Für die Zerstäubung wurde eine Zweistoffdüse verwendetund der Druck der Zerstäubungsluft betrug 2 bar.
4. Fermentation, Abtrennung unlöslicher Bestandteile durch Zentrifugation, Zugabe von 1 ,0 eq CaCb bezogen auf PantothensäurestoffmengeDie Zulufttemperatur betrug 175 °C, die Ablufttemperatur 80 °C. Für die Zerstäubung wurde eine Zweistoffdüse verwendetund der Druck der Zerstäubungsluft betrug 2 bar.
5. Fermentation, Abtrennung unlöslicher Bestandteile durch Ultrafiltration, Zugabe von 1 ,0 eq CaC bezogen auf PantothensäurestoffmengeDie Zulufttemperatur betrug ca. 175 °C, die Ablufttemperatur ca. 85 °C. Für die Zerstäubung wurde eine Zweistoffdüse verwendetund der Druck der Zerstäubungsluft betrug 2 bar.
6. Fermentation, Abtrennung unlöslicher Bestandteile durch Zentrifugation, Zugabe von 1 ,0 eq CaCb bezogen auf PantothensäurestoffmengeDie Zulufttemperatur betrug ca. 175 °C, die Ablufttemperatur ca. 80 °C. Für die Zerstäubung wurde eine Zweistoffdüse verwendet und der Druck der Zerstäubungsluft betrug 2 bar.
Der Pantothensäuregehalt der Endproduktewurde mittels HPLC-Analyse bestimmt. Dieser lag zwischen 25 bisδO Gew% Pantothensäure.
Legende zu den Figuren
Fig. 1
Schematische Darstellungdes Plasmids pAN623 zum Austausch des 3'- Endes von panB, des gesamten panC und des 5' -Endes von panP. Enthalten ist ein Cam-Resistenzgen. Vorhandene Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen entsprechen der gängigen Bezeichnung des handelsüblichen Namens.
Fig. 2
Konstruktion des Plasmids pAN622, das den größten Teil des panB -Gens, die kompletten Gen panC und panD und das 5'-Ende von dinG enthält.
Letzteres ist im Bacillus subtilis Chromosom unmittelbar stromabwärts von panD lokalisiert.
Vorhandene Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen entsprechen der gängigen Bezeichnung des handelsüblichen Namens.
Fig. 3
Konstruktion des Plasmids pAN408, das das 3'-Ende des birA-Gens, das komplette panBCD Operon und das δ'-Ende des dinG-Gens enthält. Vorhandene Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen entsprechen der gängigen Bezeichnung des handelsüblichen Namens.
Fig. 4
Konstruktion des Plasmids pAN683, mit dem eine P∑eglyA- Expressionskassette in der spollGA-sigE-sigG-Region des Bacillus subtilis-Genoms eingfügt wird. Vorhandene Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen entsprechen der gängigen Bezeichnung des handelsüblichen Namens. Fig- 5
Konstruktion des Plasmids pOLL31 , mit dem trpC -Mutanten in Stämme mit einem funktionellen trpC-Gen überführt werden. Vorhandene Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen entsprechen der gängigen Bezeichnung des handelsüblichen Namens.
Fig. 6
Konstruktion des Plasmids pAN680, das das panBCO-Operon und das TetR-Gen enthält. Vorhandene Erkennungsstellen für
Restriktionsendonukleasen entsprechen der gängigen Bezeichnung des handelsüblichen Namens.
Fig. 7
Konstruktion des Plasmids pAN678, das das Bacillus subtilispanBCD- Operon mit der artifiziellen RBS für panD (NDIII) enthält. Vorhandene Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen entsprechen der gängigen Bezeichnung des handelsüblichen Namens.
Fig. 8
Konstruktion des Plasmids pAN664, das den größten Teil des panB -Gens, das panC*- und das panD-Gen enthält. Vorhandene Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen entsprechen der gängigen Bezeichnung des handelsüblichen Namens.
Fig^θ
Konstruktion des Plasmids pAN666, das die Bacillus subtil& ene panB und panD enthält. Vorhandene Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen entsprechen der gängigen Bezeichnung des handelsüblichen Namens. Fig. 10
Konstruktion des Plasmids pAN654, das das Bacillus subtilteSen panB mit einer artifiziellen RBS enthält. Vorhandene Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen entsprechen der gängigen Bezeichnung des handelsüblichen Namens.
Fig. 11
Plasmids pAN398, das eine Expressionskassette für das Bacillus subtilis glyA-Gen enthält. Vorhandene Erkennungsstellen für
Restriktionsendonukleasen entsprechen der gängigen Bezeichnung des handelsüblichen Namens.
Fig. 12
Schematische Darstellung der Konstruktiondes Plasmids pAN440 zum Austausch des 3' -Endes von panC und des 5'-Endes von panD durch ein Chloramphenicolresistenz-Gen. Enthalten ist ein Cam-Resistenzgen. Vorhandene Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen entsprechen der gängigen Bezeichnung des handelsüblichen Namens.
Fig. 13
Schematische Darstellung des Plasmids pAN443 zum Einbau des 3 Endes des panC*-Allels, das eine artifizielle Ribosomenbindungsstelle NDII I (NewDesignll l)stromauwärts des 5'-Endes des panD-Gens aufweist. Vorhandene Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen entsprechen der gängigen Bezeichnung des handelsüblichen Namens.
Fig.14: Aufbau der UF Diafiltrationsanlage In Fig. 14 wird die Fermentationslösung (1) in einen Rührbehälter (3) gefüllt. Mit der Pumpe (4) wird die Fermentationslösung aus dem Rührbehälter (3) über die Ultrafiltrationsanlage(5) gekreist. Das Permeat (6), das frei von Zellen ist und die D-Pantothensäure enthält, wird ausgeschleust und in einem Gefäß aufgefangen. Während dieser Betriebsphase konzentriert sich die Zellmasse in dem Kreislauf und somit auch in dem Rührbehälter (3) auf. Nach der Aufkonzentrierungsphase schließt sich die Diafiltrationan. Die Fermentationslösung aus dem Rührbehälter (3) wird weiterhin über die Ultrafiltrationsanlage (5) gekreist. Gleichzeitig wird dem Rührbehälter (3) soviel Wasser (2) zugeführt, wie Permeat (6) aus dem System abgeführt wird.
Fig. 15: Aufbau des FSD-(Fluidized SprayDryers)-Trockners
In Fig. 15 ist die Trocknung der aufbereiteten Fermentationslösung (1) in einem Laborsprühtrockner dargestellt. Die Fermentationslösung(1) wird mit der Schlauchpumpe zu der Zweistoffdüse(1 ,2 mm Düse) (3) gefördert und dort mit Druckluft (2 bar) (1 übersprüht. Heißes Trocknungsgas (Luft) (5) wird in den Trocknungsturm (4) geblasen und die von der Düse hergestellten Tropfen werden zunächst im Gleichstrom mit dem Trocknungsgas im Trocknungsturm getrocknet. Das Trocknungsgas mit dem Trockenpulver verlässt durch die Abluftleitung (7) den Trockner (4) und gelangt in den Zyklon (8), in dem das mitgerissene Trockenpulver abgeschieden wird. Die Abluft wird über denVentilator (9) nach draußen geleitet.
Sequenzprotokoll
Die zur Herstellung von Plasmidengenutzten Nukleotidsequenzen SEQ IP
No. 1 - 5 sind in einem Sequenzprotokoll aufgeführt.

Claims

Ansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltendes Tierfuttersupplement, wobei a) wenigstens ein D-Pantothensäure produzierender Organismus eingesetzt wird, dessen Pantothensäure- (pan)- und lsoleucin/Valin-(ilv)-Biosynthese dereguliert ist und dem die Fähigkeit zur Bildung thermostabiler Sporen fehlt, b) vermehrungsfähiges Material in der D-Pantothenat enthaltenden Fermentationslösung abgetötet wird, c) unlösliche Bestandteile aus der D-Pantothenat enthaltenden Fermentationslösung abgetrennt werden und d) diese Lösung einer Trocknung und/oder Formulierung unterzogen wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als D- Pantothensäure produzierender Mikroorganismus ein Bakterium, eine Hefe oder ein Pilz eingesetzt wird.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus ein Bakterium aus der Familie der Bacillaceae eingesetzt wird.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Gattung Bacillus, bevorzugt der Spezies B. subtilis, B. licheniformis, B. amyloliquefaciens eingesetzt wird.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Einstellung des pH-Wertes in Schritt a) Ammoniak, bevorzugt Ammoniak-Gas, NaOH oder eine Kombination davon verwendet wird.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtötung vermehrungsfähigen Materials in Schritt b) thermisch erfolgt.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine thermische Abtötung vermehrungsfähigen Materials bei Temperaturen im Bereich von etwa 50 - 140°C bei Haltezeiten von etwa 1 - 30 Minuten, bevorzugt bei Temperaturen von etwa 60 - 120°C und Haltezeiten von etwa 20 - 30 Minuten, besonders bevorzugt etwa 70 - 90°C und Haltezeiten von etwa 15 - 20 Minuten, höchst bevorzugt etwa 75 - 90 °C und Haltezeiten von etwa 15 - 20 Minuten und insbesondere etwa 85°C und eine Haltezeit von etwa 15 Minuten erfolgt.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine thermische Abtötung vermehrungsfähigen Materials bei einer Temperatur von etwa 140°C über eine Haltezeit von etwa 3 Minuten erfolgt.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Fermentationslösung nach Abtrennung der unlöslichen Bestandteile in Schritt c) aufkonzentriert wird.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die D-Pantothenat enthaltende Lösung durch die Zugabe von Calcium- und/oder Magnesiumsalzen oder deren Basen an bivalenten Erdalkalimetallen angereichert wird.
11.Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens 35 Gew.-% an D-Pantothensäure und/oder deren Salze gebildet werden.
12. Tierfuttersupplement, auf der Basis einer D-Pantothensäure und/oder deren Salze enthaltenden Fermentationslösung, enthaltend wenigstens 35 Gew.-% D-Pantothensäure und/oder deren Salze, das kontaminationsfrei ist.
13. Verwendung des Tierfuttersupplements gemäß Anspruch 12 als Zusatz zu Tierfutter und/oder Tierfutterergänzungsmitteln.
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