KR100942133B1 - 신규 뉴클레오시드 하이드롤라제 ⅱ - Google Patents

Abstract

본 발명은 퓨린과 피리미딘 뉴클레오시드 모두에 대해 기질 특이성을 갖는 신규 뉴클레오시드 하이드롤라제 II 및 이를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 뉴클레오시드 하이드롤라제 II

Description

신규 뉴클레오시드 하이드롤라제 Ⅱ {Novel nucleoside hydrolase Ⅱ}

도 1은 본 발명의 신규한 뉴클레오시드 하이드롤라제 II를 코딩하는 유전자의 염기서열을 나타낸다.

도 2는 본 발명의 뉴클레오시드 하이드롤라제 II를 코딩하는 유전자의 연역 아미노산 서열과 크리티디아 파시쿨레이트 (Crithidia fasciculate), 레이쉬마니아 도노바니 (Leishmania donovani), 코리네박테리움 글루카미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 에스케리키아 콜라이 (Eschrichia coli) 및 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 아미노산 서열을 비교 분석한 결과이다.

Ca-NHII, 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 뉴클레오시드 하이드롤라제 II;

Cf-IUNH, 크리티디아 파시쿨레이트 유래의 이노신 및 우리딘에 특이적인 뉴클레오시드 하이드롤라제 (inosine-uridine-preferring nucleoside hydrolase);

Ld-NH, 레이쉬마니아 도노바니 유래의 뉴클레오타이드 하이드롤라제;

Cg-IUNH, 코리네박테리움 글루카미쿰 유래의 이노신-우리딘 하이드롤라제;

Ec-RihA, 에스케리키아 콜라이 유래의 리보뉴클레오시드 하이드롤라제;

Ec-RihB, 에스케리키아 콜라이 유래의 리보뉴클레오시드 하이드롤라제 B;

Ec-RihC, 에스케리키아 콜라이 유래의 리보뉴클레오시드 하이드롤라제 C;

Sc-URH1, 사카로마이세스 세레비지애 유래의 우리딘 리보하이드롤라제.

본 발명은 퓨린과 피리미딘 뉴클레오시드 모두에 대해 기질 특이성을 갖는 신규한 뉴클레오시드 하이드롤라제 II 에 관한 것이다.

뉴클레오시드와 그 유도체들은 항생물질, 항암물질, 항바이러스제 등과 같이 많은 용도를 지닌 것으로 보고되었다 (J. Virol, 72, 4858-4865).

뉴클레오시드를 분해에 관여하는 효소에는 뉴클레오시드 포스포릴라제 (nucleoside phosphorylase)와 뉴클레오시드 하이드롤라제 (nucleoside hydrolase)가 알려져 있다.

뉴클레오시드 포스포릴라제는 뉴클레오시드를 가역적으로 인산기의 전이를 수반하여 분해하며 실제로 염기 치환 반응을 통한 뉴클레오시드 유도체의 합성에 많은 보고가 되어 있다 (Biosci. Biotech. Biochem, 60, 1179-1180). 뉴클레오시드 하이드롤라제는 자연계에 널리 분포하지만 포유동물에는 존재하지 않는 효소로 주로 병원성 원생동물의 치료제의 목적으로 주로 연구되어 왔다 (Biochemistry, 38, 13147-13154). 이에 대한 목적으로 다양한 생물체로부터 분리된 뉴클레오시드 하이드롤라제 및 그 유전자에 대한 보고가 되고 있다.

본 발명자들은 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 야생주로부터 뉴클레오시드 하이드롤라제 II 을 코딩하는 신규한 유전자를 분리하고 그의 특성을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 퓨린과 피리미딘 뉴클레오시드 모두에 대해 기질 특이성을 갖는 신규한 뉴클레오시드 하이드롤라제 II 및 이를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자를 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872 야생주로부터 분리된 퓨린과 피리미딘 뉴클레오시드 모두에 대해 기질 특이성을 갖는 뉴클레오시드 하이드롤라제 II 을 제공한다.

본 발명에서, 용어 "뉴클레오시드 하이드롤라제" 는 리보즈와 퓨린 또는 피리미딘 사이의 N-글리코시딕 결합 (N-glycosidic bond)을 가수분해하는 효소를 일컫는다.

코리네박테리움 암모니아게네스는 그람-양성의 비병원성 박테리아로 인간의 식품, 동물의 식량, 약제학적 조성물로 사용되는 뉴클레오타이드 (예를 들면, 이노신-5-모노포스페이트 (inosine-5-monophosphate), 구아노신-5-모노포스페이트 (guanosine-5-monophosphate) 등) 또는 아미노산 (예를 들면, 글루타메이트, 라이신 등)을 대량 생산하는 산업적 용도로 매우 많이 사용되는 박테리아이다.

본 발명자는 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 야생주로부터 셧건(shot-gun) 클로닝을 통하여 라이브러리를 제작하고 이로부터 일련의 과정을 통해 뉴클레오시드 하이드롤라제 활성을 갖는 유전자를 확보하였다,

일반적으로, 뉴클레오시드 하이드롤라제는 그들의 기질 특이성에 따라 3개의 서브 클래스로 분류된다. 첫번째는 이노신 (inosine)과 우리딘에 특이적인 뉴클레오시드 N-리보하이드롤라제 (inosine-uridine nucleoside N-ribohydrolase) (Biochemistry, 35, 5971-5981), 두번째는 이노신, 아데노신 (adenosine) 및 구아노신 (guanosine)에 특이적 뉴클레오시드 하이드롤라제 (inosine-adenocine-guanosine-preferring nucleoside hydrolase) (J. Biol. Chem, 271, 21713-21719), 세번째는 이노신과 구아노신에 특이적인 뉴클레오시드 N-글리코하이드롤라제(guanosine-inosine-preferring nucleoside N-glycohydrolase) (J. Biol. Chem, 269, 23068-23073) 이다. 이외에도 사카로마이세스 세레비지애 유래의 우리딘 (uridine)에 기질 특이적인 효소 (Curr. Genet, 41, 132-141)가 알려졌으며, 에스케리키아 콜라이에서도 각기 다른 기질 특이성을 지닌 효소가 보고되었다 (J. Biol. Chem, 276, 884-894).

본 발명에 따른 뉴클레오시드 하이드롤라제는 상기한 바와 같은 공지의 뉴클 레오시드 하이드롤라제와는 달리 피리미딘 염기를 가지는 뉴클레오시드 및 퓨린 염기를 가지는 뉴클레오시드 모두에 대해 씨티딘 기질 특이성을 갖는 신규한 효소로서, 뉴클레오시드 하이드롤라제 II 라 명명한다. 본 발명의 뉴클레오시드 하이드롤라제 II가 기질 특이성을 나타내는 피리미딘 뉴클레오시드는 우리딘(염기: 우라실) 및 시티딘(염기: 시토신)을 포함하며, 퓨린 뉴클레오시드는 아데노신(염기: 아데닌), 구아노신(염기: 구아닌), 이노신(염기: 하이포크산틴) 또는 크산토신(염기: 크산틴)을 포함한다.

본 발명의 신규한 뉴클레오시드 하이드롤라제 II와, 회수경로 (salvage pathway)에 포함된 뉴클레오시드 하이드롤라제를 코딩하는 유전자와의 상동성을 GenBank에서 BLAST 검색하고 분석한 결과가 도 2에 나타나 있다.

본 발명은 뉴클레오시드 하이드롤라제 II의 천연형 아미노산 서열 (서열번호 2)을 갖는 단백질 뿐만 아니라 이와 기능적으로 동등한 활성을 나타내는 뉴클레오시드 하이드롤라제 II 단백질의 변이체를 본 발명의 범위에 포함한다.?? 뉴클레오시드 하이드롤라제 II 단백질의 변이체란 야생형 뉴클레오시드 하이드롤라제의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다.? 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).? 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화 (phosphorylation), 황화 (sulfation), 아크릴화 (acrylation), 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylation), 파네실화 (farnesylation) 등으로 수식될 수도 있다.? 야생형 단백질의 아미노산 서열에서 변이를 유발하는 방법에는 야생형 뉴클레오시드 하이드롤라제 II를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 변이시킴으로써 변경하고자 하는 아미노산 서열에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 갖도록 하는 방법이 있다.? 이런 방법은 당 업계에 공지되어 있으며?가장 대표적인 방법은 위치-지향성 돌연변이 유발 (Site-directed mutagenesis) 기술이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 야생주로부터 분리된, 퓨린과 피리미딘 뉴클레오시드 모두에 대해 기질 특이성을 갖는 뉴클레오시드 하이드롤라제 II를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자를 제공한다.

????????본 발명의 뉴클레오시드 하이드롤라제 II를 코딩하는 핵산 서열은 천연에서 분리되거나?인위적으로 합성 또는 유전적 재조합 방법을 통하여 제조할 수 있다.?? 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA (mRNA) 분자일 수 있다.?

본 발명의 퓨린과 피리미딘 뉴클레오시드 모두에 대해 기질 특이성을 갖는 뉴클레오시드 하이드롤라제 II를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 뉴클레오시드 하이드롤라제 II를 코딩하는 핵산 분자가 바람직하며, 특히 바람직하게는 서열번호 3의 핵산 분자이다.

본 발명의 뉴클레오시드 하이드롤라제 II를 유전적 재조합 방법을 이용하여 제공하고자 하는 경우, 이를 코딩하는 핵산 분자가 삽입된 재조합 벡터를 통해 제공할 수 있다.?

????????재조합 벡터란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 이러한 유전자 작제물은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어야 한다.? 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다.??재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

적합한 재조합 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인해서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.? 본 발명에서 사용되는 프로모터에는 예를 들어 숙주가 에스케리키아속균인 경우에는 trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λP L 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등, 숙주가 효모인 경우에는 PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등이 바람직하다.? 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임 (in frame)에 있어야 한다.? 또한, 재조합 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커, 복제를 위한 복제 기원, 시그널 서열 등을 포함할 수 있다.? 시그널 서열에는 숙주가 에스케리키아속균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 재조합 벡터로 적절한 숙주 세포를 형질감염시켜 이러한 형질전환체로부터 발현된 뉴클레오시드 하이드록실라제 Ⅱ을 분리하여 수득할 수 있으며, 예를 들어 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 슈도모나스 (Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 (Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포, 아스페르길러스 (Aspergillus)와 같은 진균, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비지애, 쉬조사카로마세스 (Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)와 같은 효모 등을 숙주 세포로 이용할 수 있다. ?재조합 벡터의 숙주세포로의 도입은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.? 이런 방법 에는 전기충격유전자전달법 (electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘 (CaPO₄) 침전, 염화 칼슘 (CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.? 배양한 형질전환체로부터 발현시킨 단백질은 통상의 방식으로 분리될 수 있으며, 예를 들어 세포를 원심분리하여 수집하고 초음파 파쇄기를 이용하여 분쇄하고, 세포 잔여물을 원심분리로 제거하여 상등액으로부터 분리할 수 있다.?? 과발현에 의해 응집된 뉴클레오시드 하이드롤라제 II 단백질은, 적절한 용액에서 단백질을 용해시키고 및 변성시키고 재폴딩시켜서 얻을 수 있다 (Kohno, Meth. Enzym., 185:187-195, 1990).? 글루타티온, 디티오트레이톨, β-머캅토에탄올, β-머캅토메탄올, 시스틴 및 시스타민의 산화 및 환원 시스템이 사용될 수 있으며 요소, 구아니딘, 아르기닌 등의 재폴딩제 등을 이용할 수 있다. 또한, 형질전환체로부터 획득한 단백질을 포함하는 용액을 염석 (예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전 (아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 뉴클레오시드 하이드롤라제 II단백질을 정제할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 어떤 형태로든 실시예에 의해 제한되는 것을 의미하지는 않는다.

<실시예>

실시예 1 : 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872 야생주로부터 퓨린 뉴클레오시드 분해 유전자의 분리

코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 야생주로부터 뉴클레오시드 하이드롤라제 II를 코딩하는 유전자를 분리하기 위해 야생주 균주를 영양 배지 (주 1)에서 배양하고 균체를 원심분리하여 확보한 다음 표준적인 방법으로 키트를 사용하여 염색체 DNA를 확보하였다. 확보된 DNA를 Sau3A1으로 15분간 37℃에서 효소처리한 후, 열처리하여 효소를 불활성화시키고 5 내지 10kb 크기의 DNA 절편을 아가로스 젤상에서 확보하였다. 이후, BamH1 효소 처리된 코리네-대장균 셔틀벡터인 pECCG117 (특허공개번호 1990-0016462)에 결합시켰다. 이 샘플을 뉴클레오시드를 분해하는 효소가 결핍된 대장균 변이주 (E. coli CGSC6885)에 형질전환하고 이노신을 함유한 (주2)의 배지에서 도말하였다. 이 배지에서 퓨린이 각각 탄소원 기질로 이용되는 유전자를 함유한 균주가 성장하면 빨간색을 띠게 되므로 (J. Bacteriol, vol;179, pp7679-7686), 빨간색 콜로니들을 분리하여 뉴클레오시드를 분해하는 유전자를 포함한 후보로 선별하였다.

실시예 2 : 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 야생주로부터 분리한 퓨린 뉴클레오시드 분해 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열 분석

실시예 1에서 분리한 유전자들의 염기서열 분석은 자동염기서열 분석장치 (model 310 Genetic analyzer; Perkin-Elmer Applied Biosystems 사)에 의해 수행하였다. 이 염기서열들의 비교분석은 NCBI, GenBank, EMBL 및 SwissPlot 데이터베이스에서 제공된 DNASIS 및 BLAST 프로그램에 의해 수행하였다. 상기 분석결과, 퓨린 뉴클레오시드에서 분리한 유전자는 1326 bp의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 1)을 가지고 308개의 아미노산 서열 (서열번호 2)을 암호화하였다. 이를 뉴클레오시드 하이드롤라제 II로 명명하였다. 상기 뉴클레오시드 하이드롤라제 II를 코딩하는 유전자의 염기 서열 및 연역 아미노산 서열을 각각 도 1에 나타내었다. 또한, 데이터베이스 검색을 통해, 뉴클레오시드 하이드롤라제 II를 코딩하는 유전자 와 다른 뉴클레오시드 하이드롤라제와 비교 분석한 결과를 도 2에 나타내었다.

실시예 3 : 뉴클레오시드 하이드롤라제 II의 기질 특이성 검정

뉴클레오시드 하이드롤라제 II의 기질 특이성을 알아보기 위해 이 유전자의 ORF 부분을 발현벡터 pTrc99A (Promega사)에 클로닝한 후, 대장균 변이주 (E. coli CGSC6885)에 형질전환하였다. 이 형질전환된 대장균을 37℃에서 하루동안 배양한 후, 원심분리하여 균체를 확보하였다. 이 균체를 세포벽 파쇄장치 (Ultrasonic disrupter; Sonics & Materials Co)를 이용하여 파쇄한 후, 조효소액을 확보하였다. 이 효소액을 퓨린과 피리미딘 뉴클레오시드 각각 0.125M을 포함하는 100mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.0)에 첨가하여 30℃에서 반응시켰다. 이 반응을 0.35%의 트리클로로아세트산 용액을 첨가하여 종료시킨 후, 각각의 기질인 뉴클레오시드와 그 생성물인 염기들을 고압력 액체크로마토그래피 (high-pressure liquid chromatography, Waters Co.)를 이용하여 분석하였다. 퓨린과 피리미딘 뉴클레오시드 기질에 대한 특이성을 효소활성도 (unit)로 나타내었다. 즉, 분당 1mmol의 뉴클레오시드를 소비하는데 필요한 효소량 (mg)으로 하나의 unit를 정의하였다. 상기의 결과를 표 2에 나타내었다.

^a NH II, 뉴클레오시드 하이드롤라제 II; 대조군, CGSC 6885/pTrc99A.

^b 기질 특이성: 밀리유니트 (mUnit)

상기한 표로부터 확인되는 바와 같이, 뉴클레오시드 하이드롤라제 II은 퓨린과 피리미딘 뉴클레오시드 모두에 대해 기질 특이성을 보였다.

본 발명의 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 야생주로부터 분리한 뉴클레오시드 하이드롤라제 II를 코딩하는 유전자와 그 특성을 밝힘으로써, 향후 뉴클레오시드 하이드롤라제를 결실시키는 등의 조작을 통해 뉴클레오시드 생산율을 향상시켜 뉴클레오시드를 생산하는 미생물을 개발하는데 이용될 수 있다.

<110> CJ <120> Novel nucleoside hydrolase II <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1326 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 <220> <221> CDS <222> (203)..(1126) <400> 1 actagtggat ctttatggtc acgacgtcaa agtggaattt gttgaccacg tgcgggcaat 60 ggaaaagttt gactccgtcg agcagctttt ggaagtcatg gctaaagacg tgcagaaaac 120 ccgcactttg ctagctcagg atgtgcaagc acataagatg gcgcctgaga cctactttct 180 acaagcagaa agctaaaagc ca atg aag atg att tta gat cta gac 226 Met Lys Met Ile Leu Asp Leu Asp 1 5 acc ggt atc gat gat gcc ttt gcg ttg gcc tat gcc atc gca cac ccg 274 Thr Gly Ile Asp Asp Ala Phe Ala Leu Ala Tyr Ala Ile Ala His Pro 10 15 20 ggt atc gat ttg att ggt gtc acc gga act tat ggc aat gtc acc att 322 Gly Ile Asp Leu Ile Gly Val Thr Gly Thr Tyr Gly Asn Val Thr Ile 25 30 35 40 gaa caa ggc atg gcc aat acc cag gca ctg ttg acg cta ctg ggc gca 370 Glu Gln Gly Met Ala Asn Thr Gln Ala Leu Leu Thr Leu Leu Gly Ala 45 50 55 gcc gat gtg ccc gta tat gcc gga cgc gct atc gat ggc ttt gag gta 418 Ala Asp Val Pro Val Tyr Ala Gly Arg Ala Ile Asp Gly Phe Glu Val 60 65 70 tct gaa gcc tct gct cgt att cac ggg cgc aat ggc gtg ggt gag gta 466 Ser Glu Ala Ser Ala Arg Ile His Gly Arg Asn Gly Val Gly Glu Val 75 80 85 gat atc gct gca gat gat gcg caa tct gct ggc gat gca ctt gaa ttt 514 Asp Ile Ala Ala Asp Asp Ala Gln Ser Ala Gly Asp Ala Leu Glu Phe 90 95 100 tta agc gaa gca gcg gcg aaa tac ggc gat gat ttg gtg atc gtt ccc 562 Leu Ser Glu Ala Ala Ala Lys Tyr Gly Asp Asp Leu Val Ile Val Pro 105 110 115 120 acc ggc gcg caa acg acg ctt gcg cgg gct tta gaa aaa gat cct gca 610 Thr Gly Ala Gln Thr Thr Leu Ala Arg Ala Leu Glu Lys Asp Pro Ala 125 130 135 ttg cga ggc att cgc atg gtc agc atg ggc ggc gcc tta acc gtc ccg 658 Leu Arg Gly Ile Arg Met Val Ser Met Gly Gly Ala Leu Thr Val Pro 140 145 150 gga aat gtg tca cca gcg gct gag gca aat atc tcc cag gac cca gtc 706 Gly Asn Val Ser Pro Ala Ala Glu Ala Asn Ile Ser Gln Asp Pro Val 155 160 165 tct tcc aac act gtg tac cag ttg gct gag gat atg acc atg gtg ggc 754 Ser Ser Asn Thr Val Tyr Gln Leu Ala Glu Asp Met Thr Met Val Gly 170 175 180 ttg gat gtc act atg caa aca cag ctc aca cgt gct gag gcg gat tcg 802 Leu Asp Val Thr Met Gln Thr Gln Leu Thr Arg Ala Glu Ala Asp Ser 185 190 195 200 tgg cgg gga acg cca gct gga gat gtc ttt gct gat atg gcc ggc tat 850 Trp Arg Gly Thr Pro Ala Gly Asp Val Phe Ala Asp Met Ala Gly Tyr 205 210 215 tac atc gac gct tat cag gaa aat aat ccg cac atg gat ggc tgc gcc 898 Tyr Ile Asp Ala Tyr Gln Glu Asn Asn Pro His Met Asp Gly Cys Ala 220 225 230 ttg cat gac ccg ttg gcc gtg gcg gtt gca gct gat cct gac ttg gtg 946 Leu His Asp Pro Leu Ala Val Ala Val Ala Ala Asp Pro Asp Leu Val 235 240 245 gat tgt ttg att ctt ccc ctg cag gtc gat acc gaa ggc ccc acc att 994 Asp Cys Leu Ile Leu Pro Leu Gln Val Asp Thr Glu Gly Pro Thr Ile 250 255 260 ggt cgc aca att gga cgg tgg gat ggc tct gag gta gaa acc cgt gta 1042 Gly Arg Thr Ile Gly Arg Trp Asp Gly Ser Glu Val Glu Thr Arg Val 265 270 275 280 gcc gtt ggg gta aac gtg gat agt ttc gtg ccg gat ttc atc gac aag 1090 Ala Val Gly Val Asn Val Asp Ser Phe Val Pro Asp Phe Ile Asp Lys 285 290 295 ctg gcg caa cta ttt gga cga ttg gtc caa aac cag taag ataagttatc 1140 Leu Ala Gln Leu Phe Gly Arg Leu Val Gln Asn Gln 300 305 gctttatgac tgcagttcgc agcagttgtg aagtagtggc gcaagctgct tttttcatgc 1200 ggactgaaat aactaatagg agataatctc atggcattga ccgctgagaa gaagtccgaa 1260 atcctcaagg aattcggcct gcacgagacc gatactggtt ccccagaagc acaggttgct 1320 ttgttg 1326 <210> 2 <211> 308 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 <400> 2 Met Lys Met Ile Leu Asp Leu Asp Thr Gly Ile Asp Asp Ala Phe Ala 1 5 10 15 Leu Ala Tyr Ala Ile Ala His Pro Gly Ile Asp Leu Ile Gly Val Thr 20 25 30 Gly Thr Tyr Gly Asn Val Thr Ile Glu Gln Gly Met Ala Asn Thr Gln 35 40 45 Ala Leu Leu Thr Leu Leu Gly Ala Ala Asp Val Pro Val Tyr Ala Gly 50 55 60 Arg Ala Ile Asp Gly Phe Glu Val Ser Glu Ala Ser Ala Arg Ile His 65 70 75 80 Gly Arg Asn Gly Val Gly Glu Val Asp Ile Ala Ala Asp Asp Ala Gln 85 90 95 Ser Ala Gly Asp Ala Leu Glu Phe Leu Ser Glu Ala Ala Ala Lys Tyr 100 105 110 Gly Asp Asp Leu Val Ile Val Pro Thr Gly Ala Gln Thr Thr Leu Ala 115 120 125 Arg Ala Leu Glu Lys Asp Pro Ala Leu Arg Gly Ile Arg Met Val Ser 130 135 140 Met Gly Gly Ala Leu Thr Val Pro Gly Asn Val Ser Pro Ala Ala Glu 145 150 155 160 Ala Asn Ile Ser Gln Asp Pro Val Ser Ser Asn Thr Val Tyr Gln Leu 165 170 175 Ala Glu Asp Met Thr Met Val Gly Leu Asp Val Thr Met Gln Thr Gln 180 185 190 Leu Thr Arg Ala Glu Ala Asp Ser Trp Arg Gly Thr Pro Ala Gly Asp 195 200 205 Val Phe Ala Asp Met Ala Gly Tyr Tyr Ile Asp Ala Tyr Gln Glu Asn 210 215 220 Asn Pro His Met Asp Gly Cys Ala Leu His Asp Pro Leu Ala Val Ala 225 230 235 240 Val Ala Ala Asp Pro Asp Leu Val Asp Cys Leu Ile Leu Pro Leu Gln 245 250 255 Val Asp Thr Glu Gly Pro Thr Ile Gly Arg Thr Ile Gly Arg Trp Asp 260 265 270 Gly Ser Glu Val Glu Thr Arg Val Ala Val Gly Val Asn Val Asp Ser 275 280 285 Phe Val Pro Asp Phe Ile Asp Lys Leu Ala Gln Leu Phe Gly Arg Leu 290 295 300 Val Gln Asn Gln 305 <210> 3 <211> 924 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 <220> <221> gene <222> (1)..(924) <400> 3 atgaagatga ttttagatct agacaccggt atcgatgatg cctttgcgtt ggcctatgcc 60 atcgcacacc cgggtatcga tttgattggt gtcaccggaa cttatggcaa tgtcaccatt 120 gaacaaggca tggccaatac ccaggcactg ttgacgctac tgggcgcagc cgatgtgccc 180 gtatatgccg gacgcgctat cgatggcttt gaggtatctg aagcctctgc tcgtattcac 240 gggcgcaatg gcgtgggtga ggtagatatc gctgcagatg atgcgcaatc tgctggcgat 300 gcacttgaat ttttaagcga agcagcggcg aaatacggcg atgatttggt gatcgttccc 360 accggcgcgc aaacgacgct tgcgcgggct ttagaaaaag atcctgcatt gcgaggcatt 420 cgcatggtca gcatgggcgg cgccttaacc gtcccgggaa atgtgtcacc agcggctgag 480 gcaaatatct cccaggaccc agtctcttcc aacactgtgt accagttggc tgaggatatg 540 accatggtgg gcttggatgt cactatgcaa acacagctca cacgtgctga ggcggattcg 600 tggcggggaa cgccagctgg agatgtcttt gctgatatgg ccggctatta catcgacgct 660 tatcaggaaa ataatccgca catggatggc tgcgccttgc atgacccgtt ggccgtggcg 720 gttgcagctg atcctgactt ggtggattgt ttgattcttc ccctgcaggt cgataccgaa 780 ggccccacca ttggtcgcac aattggacgg tgggatggct ctgaggtaga aacccgtgta 840 gccgttgggg taaacgtgga tagtttcgtg ccggatttca tcgacaagct ggcgcaacta 900 tttggacgat tggtccaaaa ccag 924

Claims (3)

1. 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872 야생주로부터 분리되는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지며 우리딘, 시티딘, 아데노신, 구아노신, 이노신 및 크산토신에 대해 기질 특이성을 갖는 뉴클레오시드 하이드롤라제.
2. 삭제
3. 제1항의 뉴클레오시드 하이드롤라제를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자.

Images