CN108796619A - 赖氨酸脱羧酶突变体文库构建及高或低活力突变株高通量筛选的方法 - Google Patents

赖氨酸脱羧酶突变体文库构建及高或低活力突变株高通量筛选的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物酶突变体文库构建及高或低活力突变株高通量筛选的方法，具体涉及适用于长度高于2000bp的基因如赖氨酸脱羧酶基因的易错PCR定向进化突变体文库的构建方法及高或低活力突变株高通量筛选的方法。本发明采用易错PCR分段突变、PCR整合、DpnI酶消化、系列pH指示剂指示pH变化的方法，解决了常规易错PCR方法无法有效构建长片段基因突变体文库、连接效率低、pH变化超过指示剂指示范围的难题，为从赖氨酸脱羧酶的突变体文库中筛选出酶活提高或降低的突变株提供了快速、简便的方法。

Description

赖氨酸脱羧酶突变体文库构建及高或低活力突变株高通量筛 选的方法
技术领域
本发明涉及生物酶突变体文库构建及高或低活力突变株高通量筛选的方法，具体涉及适用于长度高于2000bp的基因如赖氨酸脱羧酶基因的易错 PCR定向进化突变体文库的构建方法及高或低活力突变株高通量筛选的方法。
背景技术
戊二胺(1,5-戊二胺)，又叫尸胺，因其首次分离于腐败的尸体中因此得名。因为其在农业、医学及工业上具有广泛的应用而越来越受到关注。在工业上其可以与二元酸进行聚合反应生成新型尼龙—一种优质的高分子材料，用于替代对石油依赖度非常大的聚酰胺尼龙6.6。
戊二胺可以通过生物法制备，其方法主要有两种，一种是一步法制备，即通过细胞的自身代谢系统中的赖氨酸合成途径将葡萄糖转化成赖氨酸后再通过赖氨酸脱羧酶(EC4.1.1.18)将赖氨酸脱羧生成戊二胺，整个过程在细胞内统一完成；另一种方法是通过细胞表达大量的赖氨酸脱羧酶，然后在发酵液中添加外源的赖氨酸，使表达的赖氨酸脱羧酶将赖氨酸脱羧生成戊二胺。在这两种方法中，关键步骤之一是通过赖氨酸脱羧酶将赖氨酸上的羧基脱去，得到戊二胺。在这个过程中赖氨酸脱羧酶催化能力的高低直接影响赖氨酸脱羧的效率。为提高在催化过程中的催化效率，通常采取的办法可以包括增加酶量，但是这种方法增加了成本。另外由于一般使用的是含有酶的细胞，增加反应中的细胞量的会增加后处理的成本。
提高酶活是提高催化能力的另一种方法。提高酶活是指提高单位质量或重量的酶的催化活力或能力。提高酶活的方法有优化反应体系中的组分、pH 或者通过分子改造，对酶蛋白的氨基酸序列进行改造。分子改造赖氨酸脱羧酶可以有两种方法，一种是基于蛋白分子三维结构及催化机理的理性设计，包含理性计算、定点突变等；另一种是基于高通量筛选的定向进化。
定向进化是模仿达尔文进化论，人为地对蛋白分子进行随机的突变，构建突变体文库，再在人为的筛选压力下对突变体文库进行筛选，得到预期目标的突变体。易错PCR定向进化是构建突变体文库的最为简便基础的方法，其基本原理是通过调整反应体系中的锰离子、镁离子及四种不同的dNTPs改变taq酶的保真性，在使用taq酶扩增目标基因的过程中随机地引入突变。但是常规的基于taq酶的易错PCR也存在其缺点，主要是其适用于长度在1000bp左右的基因片段，而对于长度高于2000bp的基因则较难扩增出来。高通量筛选方法则是根据酶催化底物或产物特征，建立易于快速检测或区分的指示方法。
在一些需求中，则需要酶活适度降低的赖氨酸脱羧酶。
本领域依然存在对适用于构建基于易错PCR的长度高于2000bp的基因如赖氨酸脱羧酶基因的突变体文库的方法的需求，存在提高或降低赖氨酸脱羧酶酶活的迫切需求。
发明内容
本发明的一个方面涉及一种大片段基因突变体文库的构建方法，其利用易错PCR进行，其特征在于利用易错PCR分段突变所述大片段基因，然后将分段突变产生的片段化的文库通过PCR整合的方法整合到质粒上，任选地，用DpnI酶消化没有整合片段的质粒，其中大片段基因是指长度大于1500 个碱基对(bp)的基因，分段突变是指将大片段基因按照其位置分段，并对每一分段进行突变，然后通过PCR整合的方法将各突变片段整合起来，分段的长度为大于500bp对小于1500bp，同时要求能够通过一步易错PCR建立突变，PCR整合是指将含有上述大片段基因的质粒作为模板，将上述各突变分段作为引物，利用PCR的方法扩增整个质粒，以用突变片段替换质粒上基因中对应的未突变片段。大于3000bp的片段可以进行多次分段突变并整合实现。所述大片段基因的长度可以为1500bp、1600bp、1700bp、1800bp、1900bp、 2000bp、2200bp、2400bp、2600bp、2800bp、3000bp、3500bp、4000bp、5000bp、 6000bp、7000bp、8000bp或更大。所述突变体文库的规模可以为10、50、100、 200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、 9000、10000或更大。
在一些实施方案中，所述大片段基因编码生物酶，优选地，所述生物酶为赖氨酸脱羧酶，优选地，所述赖氨酸脱羧酶为微生物来源的赖氨酸脱羧酶，更优选地，所述赖氨酸脱羧酶为大肠杆菌(Escherichia coli)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的赖氨酸脱羧酶。
在一些实施方案中，易错PCR的反应条件为本领域的常规易错PCR反应条件，优选地，易错PCR反应体系中的锰离子的浓度为0.2-0.3mM。
本发明的第二方面涉及一种高或低活力赖氨酸脱羧酶突变株的高通量筛选方法，其包括步骤：1)将根据上述第一方面所述的构建方法获得的突变体文库转化宿主微生物，所述宿主微生物无特定要求，只要能表达赖氨酸脱羧酶即可，优选地，所述宿主微生物为蜂房哈夫尼菌或枯草芽孢杆菌，优选地，所述宿主微生物为表达T7启动子控制的基因的菌株，优选地，所述宿主微生物为大肠杆菌；2)将转化有突变体文库的宿主微生物涂布在质粒对应抗性的固体培养基上，获得单菌落，所述质粒无特殊要求，只要有表达元件如启动子、终止子，可表达赖氨酸脱羧酶基因即可，优选地，所述质粒为 pET30a，优选地，所述抗性为卡那霉素抗性，优选地，所述固体培养基为 LB培养基；3)培养单菌落；4)向单菌落培养物中加入赖氨酸溶液和磷酸吡哆醛并反应0.5-5小时，例如0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时或5小时；5)终止反应后加入单pH指示剂或混合pH指示剂，根据颜色变化挑出高或低活力赖氨酸脱羧酶突变株。
在一些实施方案中，本发明的高通量筛选方法还包括将颜色变化明显的克隆挑出后培养，测定最终赖氨酸的转化率并与对照比较的步骤。
在一些实施方案中，所述步骤3)、4)和/或5)在深孔板中进行，优选地，所述深孔板为12孔、24孔、48孔、96孔、192孔或384孔深孔板。
在一些实施方案中，所述赖氨酸溶液的溶剂为水、柠檬酸缓冲液或醋酸缓冲液，优选地，所述赖氨酸溶液的溶剂为醋酸缓冲液，优选地，0.4M的醋酸缓冲液，优选地，赖氨酸溶液的浓度为10％(质量百分数，下同)，优选地，赖氨酸溶液的初始pH为4.0-6.5，优选5.0-6.0。
在一些实施方案中，所述单指示剂选自溴甲酚紫、溴百里酚蓝、中性红、亚甲基蓝、酚红，或所述混合指示剂选自溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1(质量比，下同)、中性红/亚甲基蓝＝1/1、溴百里酚蓝/酚红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝3/1，其中混合指示剂优选溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1、中性红/亚甲基蓝＝1/1、溴百里酚蓝/酚红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝3/1，更优选溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1，溴百里酚蓝/酚红＝1/1，溴百里酚蓝/中性红＝3/1。
在一些实施方案中，单菌落培养物与10％赖氨酸溶液的体积比为1:1-5:1，优选2:1-4:1。
在一些实施方案中，转化率通过核磁共振的方法测定。
换言之，本发明采用PCR整合的方法建立突变体文库，主要是将利用易错PCR分段突变产生的片段化的文库通过PCR整合的方法整合到质粒上，然后再通过DpnI酶将没有整合片段的质粒消化掉，从而有效提高文库的阳性率，克服了常规酶切连接方法中效率低的难题。
本发明采用分段突变的方法有效地克服了长片段基因进行易错PCR时效率低不易成功的缺点，使得基于锰/镁离子的易错PCR可以对大片段基因进行易错建库。
本发明的方法还改进了指示剂的选择。现有技术的方法都是在反应体系中加入固定指示剂，或者在反应结束后加入固定指示剂，但是这种方法存在缺陷，即因为一些客观条件，批次与批次之间的实验条件存在差异，又因为指示剂存在pH指示范围，超过该范围颜色变化不灵敏，在实验筛选过程中就会遇到pH变化超过指示剂指示范围的问题，使得筛选工作无法继续。而本发明的方法提供了一系列pH范围的指示剂，并且在实验结束、筛选开始前进行指示剂筛选，确定好指示剂后再用所选指示剂筛选突变体文库。
而且本发明的方法巧妙地利用了赖氨酸脱羧反应的特点，利用脱羧反应时pH值发生变化的现象，利用指示剂颜色变化即可表征pH变化，从而直观地获知突变体的赖氨酸脱羧酶活性高低，实现高通量筛选的目的。
本发明采用易错PCR分段突变、PCR整合、DpnI酶消化、系列pH指示剂指示pH变化的方法，解决了常规易错PCR方法无法有效构建长片段基因突变体文库、连接效率低、pH变化超过指示剂指示范围的难题，为从赖氨酸脱羧酶的突变体文库中筛选出酶活提高的突变株提供了快速、简便的方法。
附图说明
图1：显示了CadA诱导表达的蛋白电泳结果。
图2：显示了本发明的易错PCR分段突变、PCR整合构建长片段基因突变体文库的示意图。
图3：显示了各种混合pH指示剂在本发明的赖氨酸脱羧酶催化反应体系中的颜色变化情况。其中溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1在加入300ul细胞催化后的颜色为淡黄色，而在400ul细胞催化后的颜色为蓝色，中性红/亚甲基蓝＝1/1 在加入300ul细胞催化后的颜色为紫色，而在400ul细胞催化后的颜色为蓝绿色，溴百里酚蓝/酚红＝1/1在加入300ul细胞催化后的颜色为黄色，而在 400ul细胞催化后的颜色为淡蓝色，溴百里酚蓝/中性红＝1/1在加入300ul细胞催化后的颜色为粉色，而在400ul细胞催化后的颜色为灰紫色，溴百里酚蓝/中性红＝3/1在加入300ul细胞催化后的颜色为淡粉红色，而在400ul细胞催化后的颜色为淡蓝色。
图4显示了本发明高通量筛选方法的指示剂显色结果，其中第一列第八排的孔中液体为为紫蓝色，第十二列第八排孔中液体为紫色，第七列为浅黄，第一行第八列为浅紫，第一列第四行为土黄。这些颜色变化与孔中的pH有关，随着pH由低升高，颜色有浅黄-黄-土黄-浅紫-紫色-紫蓝色变化。
具体实施方式
本发明的目的在于提供对适用于构建基于易错PCR的长度高于2000bp 的基因如赖氨酸脱羧酶基因的突变体文库的构建方法及提高酶活力的高通量筛选方法。
分段建立突变体文库的方法虽然在本领域出现过，但是在现有技术中，其主要是建立分段文库，而不是完整的基因文库。比如已知某蛋白的C端对于蛋白的细胞定位或者某功能影响比较大，那么只对该片段进行突变并建库筛选。建库采用的方法通常是易错PCR以及酶切连接。通过酶切连接的方法进行建库，其效率低下，对于长片段的基因建库效率更加低。而本发明的方法联合利用两次或多次分段PCR建库，建立基因全长的突变体文库。采用分段建库的方法，解决了常规方法无法实现大片段有效建库的难题。另外采用 PCR整合的方法将突变片段整合到质粒上，大大提高了建库的效率。如果采用分段突变然后依次酶切连接，那么会大大降低第一次酶切连接进去的片段的突变覆盖率，同时增加突变文库中该片段突变的重复度。
本发明在高通量筛选赖氨酸脱羧酶突变体时提供了一系列的颜色指示剂，可以根据筛选实验进行的程度灵活的选用合适的指示剂进行后续筛选。而目前的一些高通量筛选方法，其固定了指示剂，这使得筛选过程要求比较严格，即该过程必须与实验设计时条件一模一样。不然当实验条件出现偏差时，很难采用给定的指示剂进行筛选。
本发明将分段突变和PCR整合联用，大大提高了大片段基因文库建立的效率。
易错PCR就是在常规的PCR中加入适量锰离子和镁离子，降低其扩增过程中的保真性能。目前有商业化的易错PCR试剂盒可供使用，效率比自行配制的高。易错PCR使用的酶为普通的taq酶，活性没有特殊要求。PCR整合的酶为高保真酶，比如TAKARA的PrimerStar、NEB的Phusion，Q5等，活力越高越好
在一个实施方案中，对来源于大肠杆菌K12(Escherichia coli K12)的赖氨酸脱羧酶CadA(GenBank No.NP_418555)构建分段突变体文库以及从突变体文库中高通量筛选酶活提高的突变株。本发明的方法解决了常规易错 PCR方法无法有效构建长片段基因突变体文库的难题，同时本发明的高通量筛选方法为从数量巨大的赖氨酸脱羧酶突变体文库中筛选出酶活提高的突变株提供了快速、简便的方法。
在一个实施方案中，本发明以大肠杆菌的基因组为模板克隆出赖氨酸脱羧酶CadA，并将其克隆至质粒pET30a上。将CadA分成长度约为1000bp 的片段进行易错PCR：按照长度分将CadA的起始密码子ATG之后的 800-1200bp分为上半段，将CadA的终止密码子TAA之前的800-1200bp分为下半段；按功能分将CadA中的plp(磷酸吡哆醛)结合区域分为“plp段”。通过易错PCR对这些片段突变并将质粒上的未突变的片段替换为突变后的片段，建立突变体文库。
本发明使用的宿主微生物没有任何特别限制，例如菌株可以是本领域中已知的可以用于表达T7启动子控制的基因的菌株，如大肠杆菌BL21(DE3)，大肠杆菌JM109(DE3)等，尤其是大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明中使用易错PCR对CadA分段进行突变时，50ul的反应体系中使用的5mM的锰离子的体积优选0.5-5ul，更优选2-3ul，也即反应体系中最终锰离子的浓度优选0.05-0.5mM，更优选0.2-0.3mM。
在高通量培养细胞过程时，所用培养器可以是24孔、48孔、96孔、194 孔或384孔深孔板，优选48或96孔板。
本发明中高通量筛选时，诱导表达的发酵液与10％赖氨酸溶液的体积比优选1:1-5:1，更优选2:1-4:1。虽然可以使用其它浓度的赖氨酸溶液，但是一则比例要重新计算，二则赖氨酸溶液里面还携带缓冲液，不能通过理论计算来推理出该比例，需要通过实验调试，而10％赖氨酸溶液可以在本发明的反应体系中良好反应。溶解赖氨酸的溶液可以是水、柠檬酸缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液等酸性缓冲系统，例如0.1M的柠檬酸缓冲液、0.4M的醋酸-醋酸钠缓冲液，更优选0.4M的醋酸-醋酸钠缓冲液。赖氨酸溶液的初始pH优选 4.0-6.5，更优选5.0-6.0。本发明选择上述pH范围是因为在实际研发中发现，初始pH要临近于指示剂的变色范围pH，且低于该值。这样当反应进行后pH 上升，正好落在变色区间，易于检出。太低使得大多数有益突变不能筛出，只能筛选活力变化超级明显的突变体，但是这样的话文库需要非常大，工作量也超级大；但是如果pH选的太高且低于变色范围，那么筛选噪音则比较大，复筛工作量比较大；如果pH选的高于指示剂变色范围，那么反应结束后所有的孔的颜色都一样，无法实现根据pH变化目测筛选活性发生改变的突变体的目的。同时，选择上述pH范围还考虑到目前的cada的酶活最适pH 为5-6。
本发明中使用的指示剂可以是单指示剂，例如选自溴甲酚紫、溴百里酚蓝、中性红、亚甲基蓝、酚红，或混合指示剂，例如选自溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1、中性红/亚甲基蓝＝1/1、溴百里酚蓝/酚红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝3/1，其中混合指示剂优选溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1、中性红/亚甲基蓝＝1/1、溴百里酚蓝/酚红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝3/1，更优选溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1，溴百里酚蓝/酚红＝1/1，溴百里酚蓝/中性红＝3/1。所述单指示剂浓度为1g/L，在反应体系中添加量为50-200ul/1000ul，优选10ul/1000ul，所述混合指示剂是将1g/L的单指示剂按比例混合，如溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1即为1g/L的溴甲酚紫与1g/L 溴百里酚蓝按体积比1:1混匀，溴百里酚蓝/中性红＝3/1即为1g/L溴百里酚蓝与1g/L的中性红按体积比3:1混合，在反应体系中添加量为 50-200ul/1000ul，优选10ul/1000ul。上述指示剂的变色点在6-8之间，随pH 值变化颜色有差异，可以目视区分pH的变化。
本发明的高通量筛选方法是将突变体文库在96孔板中培养及诱导表达后，取200-600微升发酵液与100微升的10％的赖氨酸反应，并使用溴甲酚紫/溴百里酚蓝、溴百里酚蓝/酚红、甲酚红/百里酚蓝等指示剂指示反应液的 pH变化，通过目测颜色变化强度即可筛选出目标克隆，如果有配套设施(自动分液器、自动接种仪、高通量酶标仪)则可以实现目标克隆的自动化筛选。以此获得酶活力提高的赖氨酸脱羧酶的突变体。
在一个实施方案中，本发明的实验步骤如下：
(1)按照大肠杆菌基因组的CadA序列设计引物，以大肠杆菌基因组作为模板，通过PCR方法将赖氨酸脱羧酶CadA扩增出来并插入到载体pET30a 上，测序鉴定是否正确插入，正确插入的质粒命名为pET30CA。
(2)通过改变PCR体系中的锰离子及dNTPs的比例，对CadA基因进行分段突变，并通过PCR的方法将分段突变的基因片段整合到质粒pET30CA 上，替换原有的未突变的片段。
(3)将整合好的突变质粒转化到BL21中，涂布在卡那霉素抗性的LB 固体培养基上，经过夜(16h，下同)培养后接种至96孔的深孔板中培养，该板定义为母板。母板在温度为37℃、转速为220rpm的摇床(仪器购自上海世平实验设备有限公司，标准型大容量恒温培养摇床，型号SPH-211B) 中过夜培养。
(4)次日早上将过夜培养的96孔板中的液转接至新的装有600ul LB的 96孔板中，该板定义为子板。母板和子板各孔中的菌液一一对应。
(5)子板中的菌液在温度为37℃、转速为220rpm的摇床中培养3h后分别加入IPTG至终浓度为0.1mM。继续培养5h。
(6)将子板中的菌液按200-600微升分装至新的空的96孔板中，该板命为反应板，反应板与子板中各孔一一对应。
(7)将100微升溶于水或柠檬酸缓冲液或醋酸缓冲液的10％的赖氨酸加入到反应板中，加入磷酸吡哆醛到各孔中使得最终浓度达到0.1mM。在温度为37℃、转速为220rpm的摇床中反应2小时。
(8)反应终止后加入混合指示剂对溴甲酚紫/溴百里酚蓝、溴百里酚蓝/ 酚红、甲酚红/百里酚蓝，观察颜色差异，找出颜色变化最为明显的克隆。
(9)将颜色变化明显的克隆挑出后在液体LB试管中过夜培养，经转接、诱导后与40％(质量百分数，下同)的赖氨酸按6:4反应2h，测最终赖氨酸的转化率并与对照比较。
(10)将在试管中验证活力提高的克隆送样测序。
本发明中转化率的测定通过核磁共振的方法测定，当然也可以采用其它方式测定转化率，但是没有核磁检测快速。
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
以下实施例对比例中提到的PCR扩增、质粒提取、酶切、酶切产物连接、转化的具体步骤、条件参数等均按所购相关酶和试剂的说明书建议的条件进行。其中PCR扩增所用的DNA聚合酶、酶切所用的限制性内切酶、酶切产物连接所用的连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。质粒提取试剂盒、 DNA胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒均购自康宁生命科学(吴江)有限公司，商标Axygen，引物均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，商标INVITROGEN；有特别说明的除外。
如无特殊说明，以下实施例、对比例中提到的转化方法如下：将10μl 的连接产物或2μl的质粒加入至100μl的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴20min后在42℃中热激90s。冰上孵育5min后加入1ml的LB培养基。涂布至相对应的抗性平板上。
OD600测量方法：将3ml的未培养细胞的培养基加入到1cm宽的比色皿中，在UV-8000紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)中600nm下吸收光值(ABS)校零。将比色皿洗净晾干后加入2.9ml未培养细菌的培养基，加入0.1ml的发酵液混匀后在UV-8000紫外可见分光光度计中测试600nm 下的吸收光值。仪器显示数值乘以30即为发酵液的OD600。
实施例1.大肠杆菌赖氨酸脱羧酶CadA表达载体的构建
(1)CadA基因的扩增
将大肠杆菌KG1665(北京天恩泽生物技术有限公司)在LB培养基中培养过夜(37℃，220rpm)，次日取4ml菌液，用基因组抽提试剂盒(Axygen， AP-MN-P-250G)提取其基因组。用根据大肠杆菌赖氨酸脱羧酶CadA的基因序列设计的引物CadAF 5’-GGAATTCCATATGATGAACGTTATTGCA ATAT-3’(SEQ ID NO:1)和CadAR 5’-CCCAAGCTTCCTTGTACGAGCT AATTAT-3’(SEQ ID NO：2)以基因组(GenBank:U00096.3)为模板扩增出 CadA基因片段。扩增引物上设计NdeI和HindIII酶切位点。扩增方法为常规PCR方法，使用的DNA聚合酶为宝生物工程(大连)有限公司(TAKARA) 的Max DNA聚合酶。
扩增体系如下：
组分 体积(微升)
基因组DNA 1.5
CadAF 1.5
CadAR 1.5
Primerstar MAX(Takara) 25
ddH2O 20.5
扩增条件如下：
将PCR扩增产物通过凝胶电泳分离并将长度为2.2kb处的核酸片段割下来。再用DNA gel extraction试剂盒(Axygen，AP-GEL-250G)回收DNA片段。
(2)将回收的CadA基因片段和质粒pET30a均用HindIII和NdeI在37℃下酶切过夜，酶切体系及条件如下：
将酶切产物通过凝胶电泳分离并将CadA泳道中长度为2.2kb处的核酸片段及pET30a泳道中长度为5.3kb处的核酸片段割下来。再用DNA gel extraction试剂盒(Axygen，AP-GEL-250G)回收DNA片段。
(3)将割胶回收的产物按照如下比例用Takara的T4连接酶在16℃中连接过夜。过夜连接后直接转化至大肠杆菌BL21(DE3)(北京天恩泽生物技术有限公司)中，并涂布至含有卡那霉素的LB固体培养基中培养过夜。
(4)挑取上述LB固体平板上的单克隆6-10个接种于含有50mg/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养16小时，提取质粒并用NdeI和HindIII酶切鉴定，将能够切下2.2k bp的片段的克隆送样至测序公司测序。
(5)将测序为阳性的克隆标记为pET30CA，并保存好。
实施例2.CadA的诱导表达
(1)将质粒pET30CA转化至大肠杆菌BL21(DE3)，得到菌株 BLpET30CA。将空质粒pET30转化至BL21(DE3)中，得到对照菌株 BLpET30。
(2)将对照BLpET30及BLpET30CA接种至5ml的LB液体培养基的试管中(含卡那霉素50mg/ml)，各接种两管，在37℃、220rpm的摇床中过夜培养。
(3)将步骤(2)过夜培养的菌液以2％(v/v)的转接量转接至新的5ml 液体LB培养基中(含卡那霉素50mg/ml)，继续在37℃、220rpm的摇床中培养。
(4)培养至OD600达到0.6时，加入IPTG诱导表达，IPTG终浓度为 0.1mM。继续在37℃、220rpm的摇床中培养。
(5)诱导表达6h后收集1ml菌液并离心。分开收集上清及菌渣。在800ul 上清中加入200ul的SDS-PAGE上样缓冲液(配方：250mM Tris-HCl(pH6.8)，10％(w/v)SDS,0.5％(w/v)溴酚蓝，50％(v/v)甘油，5％(v/v)β-巯基乙醇))；将菌渣在800ul的PBS缓冲液中重悬，再加入200ul的SDS-PAGE上样缓冲液。
(6)将上述样品在100℃中煮沸10min。
(7)将(6)中样品加入到12％的SDS-PAGE凝胶中电泳，染色并脱色。
(8)CadA诱导表达的蛋白电泳结果如图1所示，结果表明构建好的质粒在大肠杆菌中经诱导后可以表达出目标蛋白CadA。
实施例3.突变体文库的构建
对CadA进行分段突变建库，按照长度分别将CadA的起始密码子ATG 之后的800-1200bp分为“上半段”，将CadA的终止密码子TAA之前的 800-1200bp分为“下半段”；按功能分将CadA中的plp结合区域(552-1241bp) 分为“plp段”。根据上半段、下半段及plp段的基因序列信息设计突变引物 UF 5’-TGTTTAACTTTAAGAAGGAGA-3’(SEQ ID NO：3),UR 5’-TCTTCGTTTACGTCACCT-3’(SEQ ID NO：4)；DF 5’- CCAACTTCTCACCGATTTA-3’(SEQ ID NO：5),DR 5’- TCAAGACCCGTTTAGA GGC-3’(SEQ ID NO：6)；plpF 5’-GTAGCCTGTTCTATGATTTCTT-3’(SEQ ID NO：7),plpR 5’-TTACCT GCATTGCCTTTC-3’(SEQ IDNO：8)。在PCR管中加入如下试剂：5ul 的10×rTaq Buffer(Takara)，8ul的dNTPx(2.5mM的dATP，1.25mM的dTTP， 1.25mM的dCTP，2.5mM的dGTP)，1.5ul的UF或DF或plpF，1.5ul的UR 或DR或plpR(UR与UF配合使用，DR与DF配合使用，plpR与plpF配合使用)，0.5ul的pET30CA(100ng/ul)，0.5ul或1ul或1.5ul或2ul或2.5ul或 3ul或3.5ul或4ul或4.5ul或5ul的5mM的氯化锰溶液，1ul的rTaq DNA聚合酶(Takara)，用水补齐体系至50ul。在PCR仪中按如下程序反应：第一步，94℃，2min，1个循环；第二步，94℃，30s，50℃，30s，72℃，2min， 30-35个循环；第三步72℃，5min，1个循环。
不同浓度的锰离子在本发明的易错PCR反应体系中对所扩增片段的产物突变率见下表：
可见，增加浓度的锰离子对扩增产物造成的突变率逐步增加，然而考虑到本发明的需求及实际PCR反应的效率，并非突变率越高越好。在本发明的反应条件下，反应体系中最终锰离子的浓度优选0.05-0.5mM，更优选 0.2-0.3mM，即控制突变率在2-3‰之间。
将PCR产物经核酸电泳分离回收后按如下体系配制整合PCR反应体系： 25ul的2×primerstar MAX(Takara)，6ul的“上半段”或“下半段”或“plp段”， 0.5ul的pET30CA(100ng/ul)，18.5ul的水。在PCR仪中按如下程序反应：第一步，98℃，1min，1个循环；第二步，98℃，10s，58℃，10s，72℃， 5min，30个循环；第三步72℃，5min，1个循环。
如需构建全长的突变体文库，可以将“上半段”和“下半段”的突变产物及模板交叉使用，如将“上半段”整合突变后的产物作为模板，与“下半段”再次进行整合，构建全长突变；或者将“下半段”整合突变后的产物作为模板，与“上半段”再次进行整合，构建全长突变。
将构建整合好的PCR产物经PCR清洁试剂盒(Axygen)回收后，加入 DpnI酶在37℃中消化过夜。将消化后的反应液转化至BL21(DE3)中，并涂布至含有卡那霉素的固体LB平板上，即构建好了CadA的分段或全长突变体文库。突变体文库的构建原理见图2。
实施例4.高通量细胞培养
(1)将固体LB培养基上的单克隆逐个接种至含有600ul液体LB培养基的96孔深孔板(最大容量为2.2ml)中，记为母板。在温度为37℃、转速为220rpm的摇床中过夜培养。
(2)次日早晨按2％(v/v)的接种量将上述(1)中的培养物转接至新的含有600ul液体LB培养基的96孔深孔板中，该板记为子板。母板与子板各孔中菌液一一对应。在温度为37℃、转速为220rpm的摇床中培养。
(3)培养3小时后加入IPTG诱导，IPTG的终浓度为0.1mM，继续在温度为37℃、转速为220rpm的摇床中培养6小时。收集96孔板并存放在4℃冰箱中。
实施例5.反应体系中不同菌液添加量对赖氨酸脱羧转化率的影响
取不同体积的在96孔板中诱导的培养液，体积分别为100ul、200ul、 300ul、400ul和500ul，与100ul的10％的赖氨酸溶液混匀。混匀后再加入磷酸吡哆醛(plp)至终浓度为0.1mM。在温度为37℃、转速为220rpm的摇床中反应，反应2h后通过离心去除细胞来终止反应并利用核磁共振方法测出各体系中的赖氨酸脱羧转化率。
赖氨酸转化率的测定方法为：取600ul的诱导后菌液与400ul的浓度为 40％(质量百分数，下同)的赖氨酸盐酸盐及5ul的0.1M的磷酸吡哆醛混匀。在温度为37℃，转速为220rpm的摇床中反应2h。反应结束后离心收集反应液上清。上清通过核磁共振分析(Bruker400MHZ)分别测定反应液中残留的赖氨酸以及产生的戊二胺，通过计算戊二胺的摩尔量除以剩余的赖氨酸和戊二胺的总摩尔量即得发酵液对赖氨酸的转化率。
实施例6 筛选体系中不同缓冲液对筛选时的pH的影响
将100g赖氨酸分别溶于1L水或不同的缓冲溶液中，缓冲溶液为0.1M 的柠檬酸缓冲液或0.4M的醋酸钠-醋酸缓冲液。溶有赖氨酸的缓冲液的初始 pH设为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5。取300ul的96孔板中诱导的培养液与 100ul的上述赖氨酸溶液混匀。混匀后再加入磷酸吡哆醛(plp)至终浓度为 0.1mM。在温度为37℃、转速为220rpm的摇床中反应，反应2h后终止反应并测出各体系中pH变化。结果如下表：
上述结果表明，水和柠檬酸缓冲液都不适于高通量筛选方法，其中使用水-赖氨酸直接反应的话，pH变化太大，容易使结果不稳定；柠檬酸变化太小甚至于无，容易使得活性提高较少的突变株漏检，降低实验的成功率。
实施例7不同指示剂的颜色变化
选择醋酸缓冲液配制的10％赖氨酸溶液，初始pH为5.5，取100ul与300ul 的96孔板中诱导的培养液混匀。混匀后再加入磷酸吡哆醛(plp)至终浓度为0.1mM。在温度为37℃、转速为220rpm的摇床中反应，反应2h后终止反应。终止反应后将反应液离心收集上清并以50ul每管分装至新的离心管中，在离心管中加入不同的混合指示剂。混合指示剂选自溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1、中性红/亚甲基蓝＝1/1、溴百里酚蓝/酚红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红、溴百里酚蓝/中性红＝3/1。观测颜色变化。
为了比较指示剂在催化能力提高的反应体系中的变化，做如下实验。取 400ul的96孔板中诱导的培养液，离心后移除100ul上清。用剩余的上清将菌渣重悬得到悬液。由于反应体系中赖氨酸加入量是过量的，理论上该300ul 的重悬液比直接从96孔板中取的菌液的催化能力提高了33％。将这300ul 重悬液与100ul初始pH为5.5的醋酸缓冲液配制的10％赖氨酸溶液混匀，混匀后再加入磷酸吡哆醛(plp)至终浓度为0.1mM。在温度为37℃、转速为220rpm的摇床中反应，反应2h后终止反应。终止反应后将反应液离心，收集上清并以50ul每管分装至新的离心管中，在离心管中加入不同的混合指示剂。混合指示剂选自溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1、中性红/亚甲基蓝＝1/1、溴百里酚蓝/酚红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝3/1。观测颜色。结果如图3所示，结果表明提高酶量可以改变加入指示剂的反应体系的最终颜色。
实施例8.突变株的高通量筛选
将突变体文库中的单菌落逐个接种至96孔板中，经实施例4中高通量培养后，将菌液取300ul移至一块新的96孔板中，该板记为反应板，反应板与母板及子板中各孔一一对应。在反应板中各加入100ul，pH＝5.5，浓度为 10％的溶于醋酸-醋酸钠缓冲液的赖氨酸溶液，再在各孔中加入plp至终浓度为0.1mM，混匀。将混匀后的反应板在温度为37℃、转速为220rpm的摇床中反应，反应2h后终止反应。取100ul的反应液移至96孔的酶标板中，加入5ul混合指示剂(溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1)显色。结果如图4所示。结果表明，利用本法，可以明显地观察到不同突变株之间的活性差异。
序列表
<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司
<120> 赖氨酸脱羧酶突变体文库构建及高活力突变株高通量筛选的方法
<130> LZ1700067CN01
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物CadAF
<400> 1
ggaattccat atgatgaacg ttattgcaat at 32
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物CadAR
<400> 2
cccaagcttc cttgtacgag ctaattat 28
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变引物UF
<400> 3
tgtttaactt taagaaggag a 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变引物UR
<400> 4
tcttcgttta cgtcacct 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变引物DF
<400> 5
ccaacttctc accgattta 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 突变引物DR
<400> 6
tcaagacccg tttagaggc 19
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物plpF
<400> 7
gtagcctgtt ctatgatttc tt 22
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物plpR
<400> 8
ttacctgcat tgcctttc 18

Claims (10)

1.一种大片段基因突变体文库的构建方法，其利用易错PCR进行，其特征在于利用易错PCR分段突变所述大片段基因，然后将分段突变产生的片段化的文库通过PCR整合的方法整合到质粒上，任选地，用DpnI酶消化没有整合片段的质粒，其中大片段基因是指长度大于1500个碱基对的基因，分段突变是指将大片段基因按照其位置分段，并对每一分段进行突变，然后通过PCR整合的方法将各突变片段整合起来，分段的长度为大于500个碱基对小于1500个碱基对，PCR整合是指将含有上述大片段基因的质粒作为模板，将上述各突变分段作为引物，利用PCR的方法扩增整个质粒，以用突变片段替换质粒上基因中对应的未突变片段。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其中所述大片段基因编码生物酶，优选地，所述生物酶为赖氨酸脱羧酶，优选地，所述赖氨酸脱羧酶为微生物来源的赖氨酸脱羧酶，更优选地，所述赖氨酸脱羧酶为大肠杆菌或哈夫尼菌来源的赖氨酸脱羧酶。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其中易错PCR的反应条件为本领域的常规易错PCR反应条件，优选地，易错PCR反应体系中的锰离子的浓度为0.2-0.3mM。
4.一种高或低活力赖氨酸脱羧酶突变株的高通量筛选方法，其包括步骤：1)将根据权利要求2或3所述的构建方法获得的突变体文库转化宿主微生物，优选地，所述宿主微生物为表达T7启动子控制的基因的菌株，优选地，所述宿主微生物为大肠杆菌；2)将转化有突变体文库的宿主微生物涂布在质粒对应抗性的固体培养基上，获得单菌落，优选地，所述质粒为pET30a，优选地，所述抗性为卡那霉素抗性，优选地，所述固体培养基为LB培养基；3)培养单菌落；4)向单菌落培养物中加入赖氨酸溶液和磷酸吡哆醛并反应0.5-5小时；5)终止反应后加入单pH指示剂或混合pH指示剂，根据颜色变化挑出高或低活力赖氨酸脱羧酶突变株。
5.根据权利要求4所述的高通量筛选方法，其还包括将颜色变化明显的克隆挑出后培养，测定最终赖氨酸的转化率并与对照比较的步骤。
6.根据权利要求4或5所述的高通量筛选方法，其中所述步骤3)、4)和/或5)在深孔板中进行，优选地，所述深孔板为12孔、24孔、48孔、96孔、192孔、384孔深孔板。
7.根据权利要求4到6任一项所述的高通量筛选方法，其中所述赖氨酸溶液的溶剂为水、柠檬酸缓冲液或醋酸缓冲液，优选地，所述赖氨酸溶液的溶剂为醋酸缓冲液，优选地，赖氨酸溶液的浓度为10％，优选地，赖氨酸溶液的初始pH为4.0-6.5，优选5.0-6.0。
8.根据权利要求4到7任一项所述的高通量筛选方法，其中所述单指示剂选自溴甲酚紫、溴百里酚蓝、中性红、亚甲基蓝、酚红，或所述混合指示剂选自溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1、中性红/亚甲基蓝＝1/1、溴百里酚蓝/酚红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝3/1，其中混合指示剂优选溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1、中性红/亚甲基蓝＝1/1、溴百里酚蓝/酚红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝1/1、溴百里酚蓝/中性红＝3/1，更优选溴甲酚紫/溴百里酚蓝＝1/1，溴百里酚蓝/酚红＝1/1，溴百里酚蓝/中性红＝3/1，比值为质量比。
9.根据权利要求4到8任一项所述的高通量筛选方法，其中单菌落培养物与10％赖氨酸溶液的体积比为1:1-5:1，优选2:1-4:1。
10.根据权利要求5到9任一项所述的高通量筛选方法，其中转化率通过核磁共振的方法测定。
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