BR102018075897A2 - método para a produção fermentativa de l-lisina - Google Patents

Abstract

a presente invenção torna disponíveis bactérias excretoras de l-lisina inovadoras da espécie corynebacterium glutamicum, as quais têm a habilidade de excretar l-lisina, contêm em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade de uma malato:quinona reductase, em que o aminoácido na posição 228 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo contém qualquer aminoácido proteinogênico diferente de valina e um método para produzir l-lisina com o uso de tal bactéria.

Description

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO FERMENTATIVA DE L-LISINA

[0001]	A L-lisina é usada em medicina humana,	na
indústria	farmacêutica,	na indústria	alimentícia	e
particularmente em nutrição	de animais.
[0002]	Sabe-se que a	L-lisina é	produzida	por

fermentação de cepas da espécie Corynebacterium glutamicum. Devido à grande importância econômica, tem-se trabalhado continuamente para melhorar os métodos de produção. As melhorias podem estar relacionadas com a tecnologia de fermentação como, por exemplo, agitação e fornecimento de oxigênio, ou a composição do meio de nutriente, por exemplo, a concentração de açúcar durante a fermentação, ou o processamento do caldo de fermentação para uma forma de produto adequada, por exemplo, por secagem e granulação do caldo de fermentação ou cromatografia de troca iônica ou pode se relacionar com as propriedades de desempenho intrínseco do próprio microrganismo.

[0003] Os métodos usados para melhorar as propriedades de desempenho desses microrganismos são os de mutagênese, seleção e triagem de mutantes. As cepas obtidas desse modo são resistentes a antimetabólitos ou são auxotróficas para metabólitos de importância regulatória e produzem L-lisina. Um antimetabólito bem conhecido é o análogo de L-lisina S(2-aminoetil)-L-cisteína (consultar, por exemplo, Tosaka et al.: Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752, (1978)).

[0004] Métodos de tecnologia de DNA recombinante foram usados de modo similar por diversos anos para melhoramento de cepas produtoras de L-lisina da espécie Corynebacterium

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2/95 glutamicum, modificando-se, isto é, melhorando ou atenuando, genes de biossíntese de L-lisina individuais e investigando-se o efeito na produção de L-lisina.

[0005] As sequências de nucleotídeo dos cromossomos de várias bactérias ou cepas, respectivamente, da espécie Corynebacterium glutamicum e sua análise foram reveladas. Essas informações estão disponíveis em bancos de dados publicamente acessíveis e podem ser usadas para propósitos de desenvolvimento de cepas. Um de tais bancos de dados é o banco de dados GenBank do NCBI (Centro Nacional de Informações Biotecnológicas [National Center for Biotechnology Information], U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 EUA) .

[0006] Durante o procedimento de anotação para um cromossomo sequenciado de um organismo, estruturas identificadas, como, por exemplo, genes ou sequências de codificação são dotadas de um identificador exclusivo denominado locus_tag pelo fornecedor das informações do banco de dados.

[0007] A sequência de nucleotídeos do cromossomo de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 e sua análise foram descritos por Ikeda e Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109(2003)) e no documento EP1108790A2. As informações estão disponíveis no NCBI sob o número de acesso NC_003450. Na sequência de cromossomos revelada sob o número de acesso NC_003450, locus_tag NCgl1926 identifica uma sequência de nucleotídeos que codifica uma malato:quinona oxidoredutase. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo está disponível sob o identificador NP_60120.

[0008] A sequência de nucleotídeos do cromossomo

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ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum e sua análise foram independentemente descritos por Kalinowski et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 5-25 (2003)). As informações estão disponíveis no NCBI sob o número de acesso NC_006958. Locus_tag CGTRNA_RS09800 identifica uma sequência de nucleotídeos que codifica uma malato:quinona oxidoredutase. A designação cg2192 de old_locus_tag também é usada na técnica. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo está disponível sob o identificador WP_011014814.

[0009] As sequências de nucleotídeo de locus_tag NCgl1926 e CGTRNA_RS09800 são idênticas.

[0010] Lv et al. (Journal of Bacteriology 194(3), 742743 (2012)) descrevem o sequenciamento do cromossomo de Corynebacterium glutamicum ATCC14067, uma cepa anteriormente denominada Brevibacterium flavum. As informações estão disponíveis no NCBI sob o número de acesso AGQQ02000001 e AGQQ02000002. A sequência de nucleotídeos do cromossomo de Corynebacterium glutamicum ATCC13869, uma cepa anteriormente denominada Brevibacterium lactofermentum, e sua análise foram reveladas por Chen et al. no NCBI sob o número de acesso NZ_CP016335.

[0011] A malato:quinona oxidoredutase é uma enzima associada a membrana que catalisa a oxidação de malato em oxaloacetato com quinonas que funcionam como aceptores de elétrons. A caracterização bioquímica e genética da enzima de Corynebacterium glutamicum e sua função foram descritas por Molenaar et al. (European Journal of 254, 395-403 (1998)) e Molenaar et al. (Journal of Bacteriology 182(24), 6884-6891 (2000)). Molenaar et al. se referia à enzima como EC 1.1.99.16. De acordo com a Nomenclatura de Enzimas da

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IUBMB atual, a enzima recebe a designação sistemática EC 1.1.5.4 com malato desidrogenase (quinona) como nome aceito e (S)-malato:quinona oxidoredutase como nome sistemático. A técnica usa a abreviação Mqo para a enzima ou para o polipeptídeo, respectivamente. O gene que codifica o polipeptídeo Mqo é denominado mqo. Informações referentes a sinais de transcrição, por exemplo, região -10 de um promotor, a sequência líder não traduzida de 5' (5'-UTR), e sinais de tradução, por exemplo, sítio de ligação de ribossomo (RBS), do gene mqo (old_locus_tag cg2192) podem ser encontradas em Pfeifer-Sancar et al. (BMC Genomics 14:888 (2013)) e Han et al. (Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology 15:264-276, 2008).

[0012] O documento US20020028490A1 descreve o efeito favorável de superexpressão de malato:quinona oxidoredutase em produção de L-lisina e L-treonina por Corynebacterium glutamicum.

[0013] O documento WO02086137A2 descreve o efeito favorável de atenuar ou eliminar a atividade de malato:quinona oxidoredutase na produção de L-lisina por Corynebacterium glutamicum.

[0014] O documento WO03029457A1 descreve, do mesmo modo, o efeito favorável de atenuar ou eliminar a atividade de malato:quinona oxidoredutase na produção de L-lisina por Corynebacterium glutamicum.

[0015] O documento US20060166338A1 descreve o efeito favorável de uma troca de aminoácido na posição 111 da sequência de aminoácidos da malato:quinona oxidoredutase na produção de L-lisina em Corynebacterium glutamicum.

[0016] O objetivo da presente invenção consiste em

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5/95 fornecer medidas inovadoras para a produção fermentativa de L-lisina por bactérias da espécie Corynebacterium glutamicum.

[0017] Para alcançar o objetivo definido acima, a presente invenção torna disponíveis bactérias excretoras de L-lisina inovadoras da espécie Corynebacterium glutamicum, as quais têm a habilidade de excretar L-lisina, contêm em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade de uma malato:quinona redutase, em que o aminoácido na posição 228 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo contém qualquer aminoácido proteinogênico diferente de valina.

[0018] A presente invenção torna disponível, ainda, métodos para produzir a dita L-lisina com o uso das ditas bactérias em um processo fermentativo e para fabricar um produto contendo a dita L-lisina do caldo de fermentação.

[0019] Os objetivos subjacentes à presente invenção foram solucionados pelos meios descritos nas reivindicações.

[0020] Consequentemente, a presente invenção fornece o seguinte:

[0021] Uma bactéria da espécie Corynebacterium glutamicum, a qual tem a habilidade de excretar L-lisina, contém em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade de uma malato:quinona oxidoredutase e compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, em que o aminoácido valina na posição 228 é substituído por um aminoácido proteinogênico diferente, preferencialmente por ácido aspártico ou ácido glutâmico, de modo particular preferencial ácido aspártico.

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6/95 [0022] Constatou-se que as bactérias modificadas de acordo com a invenção excretaram L-lisina, em um meio adequado sob condições de fermentação adequadas de uma maneira aumentada em relação a um ou mais parâmetros selecionados a partir de concentração de produto (isto é, quantidade de L-lisina produzida por volume, ou unidade de massa, respectivamente, de meio/caldo de fermentação (por exemplo, g/l ou g/kg)), rendimento de produto (isto é, quantidade de L-lisina produzida por fonte de carbono consumida (por exemplo, g/g ou kg/kg)), taxa de formação de produto (isto é, quantidade de L-lisina produzida por volume, ou unidade de massa, respectivamente, de meio/caldo de fermentação e unidade de tempo (por exemplo, g/l x h ou g/kg x h)), e taxa de formação de produto específica (isto é, quantidade de L-lisina produzida por unidade de tempo e unidade de massa do produtor (por exemplo, g/h x g de massa seca)) em comparação à bactéria não modificada.

[0023] É evidente que uma maior concentração de produto facilita a fabricação de produto, por exemplo, purificação e isolamento. Um rendimento de produto aumentado reduz a quantidade de matéria-prima necessária. Uma taxa de formação de produto aumentada reduz o tempo necessário para um ciclo de fermentação, aumentando, desse modo, a disponibilidade de um dado fermentador.

[0024] As bactérias de acordo com a invenção contribuem, então, para a melhora de aspectos técnicos e econômicos da fabricação de L-lisina ou produtos contendo L-lisina.

[0025] Em uma modalidade adicional, a bactéria de acordo com a invenção contém em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de um

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7/95 polipeptídeo que tem atividade de malato:quinona oxidoredutase que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:2, em que o aminoácido valina na posição 228 da sequência de aminoácidos codificada da SEQ ID NO:2 é substituído por ácido aspártico, e que compreende a sequência de nucleotídeos das posições 1001 a 2500 da SEQ ID NO: 1, sendo que a nucleobase na posição 1683 é adenina ou compreende a sequência de nucleotídeos das posições 1001 a 2500 da SEQ ID NO:3.

[0026] Em uma modalidade adicional, a bactéria de acordo com a invenção contém em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo que tem atividade de malato:quinona oxidoredutase que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:2, em que o aminoácido valina na posição 228 da sequência de aminoácidos codificada da SEQ ID NO:2 é substituído por um aminoácido proteinogênico diferente, preferencialmente por ácido aspártico ou ácido glutâmico, de modo particularmente preferencial por ácido aspártico, e em que a extremidade 5' da sequência codificadora desse polinucleotídeo é diretamente conectada à extremidade 3' do polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeos das posições 781 a 1000 da SEQ ID NO:1 ou da SEQ ID NO:3. Em particular, a bactéria da espécie Corynebacterium glutamicum de acordo com a presente invenção contém em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:2, sendo que o aminoácido na posição 228 é ácido aspártico e tem a atividade de uma malato:quinona oxidoredutase que

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8/95 compreende a sequência de nucleotídeos das posições 781 a 2500 da SEQ ID NO:3 ou a sequência de nucleotídeos das posições 781 a 2500 da SEQ ID NO:1, sendo que a nucleobase na posição 1683 é adenina. Em outras palavras, a bactéria de acordo com a presente invenção pode conter em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos que compreende a sequência de nucleotídeos das posições 781 a 2500 da SEQ ID NO:1, sendo que a nucleobase na posição 1683 é adenina, ou a sequência de nucleotídeos das posições 781 a 2500 da SEQ ID NO:3.

[0027] O termo L-lisina, quando mencionado no presente documento, em particular no contexto de formação de produto, também compreende suas formas iônicas e sais, por exemplo, monocloridrato de ou sulfato de L-lisina.

[0028] Para a prática da presente invenção, bactérias da espécie Corynebacterium glutamicum são usadas. Uma descrição do gênero Corynebacterium e da espécie Corynebacterium glutamicum compreendida por esse gênero pode ser encontrada no artigo “Corynebacterium de K. A. Bernard e G. Funke em Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria (Bergey's Manual Trust, 2012) .

[0029] As cepas adequadas de Corynebacterium glutamicum são cepas selvagens dessa espécie, por exemplo, cepas ATCC13032, ATCC14067 e ATCC13869, e cepas excretoras de Llisina obtidas dessas cepas selvagens.

[0030] A cepa ATCC13032 (também disponível como DSM20300) é a cepa do tipo taxonômico da espécie Corynebacterium glutamicum. A cepa ATCC14067 (também disponível como DSM20411) também é conhecida sob a designação desatualizada Brevibacterium flavum. A cepa

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ATCC13869 (também disponível como DSM1412) também é conhecida sob a designação desatualizada Brevibacterium lactofermentum. Um estudo taxonômico desse grupo de bactérias baseado em hibridização de DNA-DNA foi feito por Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41(2), 255-260, 1991). Uma análise comparativa de várias cepas da espécie Corynebacterium glutamicum baseada em análise de sequência foi fornecido por Yang e Yang (BMC Genomics 18(1) :940) .

[0031] Uma multitude de cepas que excretam L-lisina do gênero Corynebacterium, em particular da espécie Corynebacterium glutamicum, foi obtida na técnica durante as últimas décadas, tendo início em cepas como ATCC13032, ATCC14067, ATCC13869 e similares. Foram obtidas como resultado de programas de desenvolvimento de cepa com o uso, entre outros, de métodos como mutagênese clássica, seleção para resistência antimetabólito, bem como amplificação e modificação de promotor de genes da via biossíntética do L-aminoácido em questão por métodos de engenharia genética. Resumos podem ser encontrados em L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005) ou H. Yukawa e M. Inui (Corynebacterium glutamicum Biology and Biotechnology, Springer Verlag, 2013).

[0032] As cepas que excretam L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum são amplamente conhecidas na técnica e podem ser usadas para o propósito da presente invenção. Por exemplo, Blombach et al. (Applied and Environmental Microbiology 75(2), 419-427, 2009) descrevem uma cepa DM1933, a qual está depositada sob número de

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10/95 acesso DSM25442 de acordo com o tratado de Budapeste. A cepa DM1933 foi obtida a partir de ATCC13032 por diversas etapas de desenvolvimento de cepa. Além disso, a cepa de Corynebacterium glutamicum excretora de L-lisina DM2031, depositada de acordo com o Tratado de Budapeste como DSM32514 pode ser usada. A cepa DM2031 é um derivado desenvolvida adicionalmente de DM1933 que tem habilidade melhorada de excreção de L-lisina. Outras cepas Corynebacterium glutamicum que excretam L-lisina são descritas, por exemplo, nos documentos WO2008033001A1 e EP0841395A1.

[0033] As cepas que excretam L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum contêm tipicamente um polinucleotídeo que codifica uma variante de polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação. Uma variante de polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação significa uma aspartoquinase que é menos sensível, ou dessensibilizada, respectivamente, à inibição por misturas de L-lisina e L-treonina, por exemplo, 10 mM cada, ou misturas do análogo de L-lisina S-(2-aminoetil)-Lcisteína e L-treonina, por exemplo, S-(2-aminoetil)-Lcisteína 50 mM e L-treonina 10 mM, em comparação à forma selvagem da enzima, que está contida em cepas selvagens como, por exemplo, ATCC13032, ATCC14067 e ATCC13869. O número EC para aspartoquinase é EC 2.7.2.4. Descrições de polinucleotídeos de Corynebacterium glutamicum que codificam uma variante de polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação são dadas, por exemplo, nos documentos US5688671, US6844176 e US6893848. Uma lista resumida pode ser encontrada, entre outros, no documento

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US20090311758A1. O símbolo usado na técnica para um gene que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase é lysC. Caso o gene codifique uma variante de polipeptídeo resistente a realimentação, a técnica usa tipicamente símbolos como lysC^fbr com fbr indicando resistência a realimentação.

[0034] Consequentemente, as ditas cepas que excretam Llisina da espécie Corynebacterium glutamicum usadas para as medidas da presente invenção contêm de preferência pelo menos uma cópia de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação.

[0035] A SEQ ID NO:5 mostra a sequência de nucleotídeos da sequência de codificação do polipeptídeo de aspartoquinase da cepa ATCC13032 e a SEQ ID NO:6 mostra a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado. Sabese, na técnica (consultar documento US6893848), que a troca do aminoácido Thr na posição 311 da SEQ ID NO:6 por Ile confere à enzima resistência à realimentação para inibição por misturas de L-lisina e L-treonina.

[0036] Consequentemente, é preferencial que a sequência de aminoácidos da dita aspartoquinase resistente à realimentação polipeptídeo compreenda a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 contendo isoleucina na posição 311.

[0037] A dita troca de amino pode ser alcançada ao trocar a nucleobase citosina (c) na posição 932 da SEQ ID NO:5 para produzir timina (t). O códon acc para treonina é, então, alterado para o códon atc para isoleucina.

[0038] Sabe-se, ainda, na técnica que a troca do códon de início gtg da sequência de codificação para o polipeptídeo de aspartoquinase por atg melhora a expressão

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12/95 do polipeptídeo (consultar, por exemplo, documento EP2796555A2).

[0039] Consequentemente, é preferencial que a sequência que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação seja iniciada com um códon de início atg.

[0040] Resumos referentes ao melhoramento de cepas que excretam L-lisina de Corynebacterium glutamicum podem ser encontrados, entre outros, em L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005), V. F. Wendisch (Amino Acid Biosynthesis - Pathways, Regulation and Metabolic Engineering, Springer Verlag, 2007), H. Yukawa e M. Inui (Corynebacterium glutamicum Biology and Biotechnolgy, Springer Verlag, 2013) ou A. Yokota e M. Ikeda (Amino Acid Fermentation, Springer Verlag, 2017), e Eggeling e Bott (Applied Microbiology and Biotechnology 99 (9), 3387-3394, 2015).

[0041] Caso uma cepa selvagem, por exemplo, ATCC13032, ATCC13869 ou ATCC14067, seja, em uma primeira etapa, submetida às medidas da presente invenção, a cepa resultante é submetida, em uma segunda etapa, a um programa de desenvolvimento de cepa alvejada na L-lisina para obter uma bactéria de acordo com a presente invenção.

[0042] O termo DSM denota o depositório Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen localizado em Braunschweig, Alemanha. O termo ATCC denota o depositório American Type Culture Collection localizado em Manasass, Virginia, EUA.

[0043] Os detalhes referentes à bioquímica e à estrutura química de polinucleotídeos e polipeptídeos, como presente em seres vivos, como bactérias como Corynebacterium

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13/95 glutamicum ou Escherichia coli, por exemplo, podem ser encontrados, entre outros, no livro Biochemie por Berg et al (Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, Berlim, Alemanha, 2003; ISBN 3-8274-1303-6).

[0044] Os polinucleotídeos consistindo em monômeros de ribonucleotídeos contendo as bases nucleotídicas ou as bases, respectivamente, adenina (a), guanina (g), citosina (c) e uracila (u) são chamados de ribopolinucleotídeos ou ácido ribonucleico (DNA). Os polinucleotídeos consistindo em monômeros de ribonucleotídeos contendo as nucleobases ou as bases, respectivamente, adenina (a), guanina (g), citosina (c) e uracila (u) são chamados de ribopolinucleotídeos ou ácido ribonucleico (RNA). Os monômeros nos ditos polinucleotídeos são covalentemente ligados entre si por uma ligação de 3',5'-fosfodiéster. Por convenção, os polinucleotídeos de fita simples são escritos da direção 5'- para 3'-. Consequentemente, um polinucleotídeo tem uma extremidade 5' e uma extremidade 3'. A ordem dos monômeros de nucleotídeo no polinucleotídeo é comumente denominada sequência de nucleotídeos. Consequentemente, um polinucleotídeo é caracterizado pela sua sequência de nucleotídeos. Para o propósito desta invenção, desoxirribopolinucleotídeos são preferenciais. Em bactérias, por exemplo, Corynebacterium glutamicum ou Escherichia coli, o DNA está tipicamente presente em forma de fita dupla. Consequentemente, o comprimento de uma molécula de DNA é tipicamente dado em pares de bases (pb). A sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo específico é denominada sequência de codificação (cds). Um tripleto de nucleotídeos que especifica um aminoácido ou um

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sinal de parada para a	tradução	é	denominado	códon.	Os
códons que especificam	diferentes	aminoácidos	são	bem
conhecidos na técnica.
[0045] Um gene de um ponto	de	vista químico é	um
polinucleotídeo,	de	preferência,		um
desoxirribopolinucleotídeo.
[0046] O DNA pode ser	sintetizado	de novo pelo	método	da

fosforamidita (McBride e Caruthers: Tetrahedon Letters 24(3) 245- 248 (1983)). Resumos referentes de novo à síntese de DNA podem ser encontrados no artigo de revisão de Kosuri e Chruch (Nature Methods 11(5), 499 - 507 (2014)) ou no artigo de Graf et al. no livro Systems Biology and Synthetic Biology” de P. Fu e S. Panke (John Wiley, US, 2009, pp 411-438).

[0047] O termo gene se refere a um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo específico (sequência de codificação) e o códon de parada adjacente. Em um sentido mais amplo, o termo inclui sequências reguladoras precedentes e subsequentes à sequência de codificação. A sequência precedente é localizada na extremidade 5' da sequência de codificação e também é denominada sequência a montante. Um promotor é um exemplo de uma sequência reguladora localizada em 5' em relação à sequência de codificação. A sequência após a sequência de codificação está localizada em sua extremidade 3' e também é denominada sequência a jusante. No contexto da presente invenção, a dita sequência regulatória, a qual compreende, entre outros, o promotor e o sítio de ligação de ribossomo, do gene mqo que precede sua sequência codificadora está localizada da posição 781 a

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1000 da SEQ ID NO:1 ou da SEQ ID NO:3. Um terminador transcricional é um exemplo de uma sequência reguladora localizada em 3' em relação à sequência de codificação.

[0048] Os polipeptídeos consistem em monômeros de Laminoácido unidos por ligações peptídicas. Para a abreviação de L-aminoácidos, o código de uma letra e o código de três letras da IUPAC (União Internacional de Química Pura e Aplicada) é usado. Devido à natureza da biossíntese de polipeptídeo, os polipeptídeos têm uma extremidade amino terminal e uma extremidade carboxil terminal também denominadas extremidade N-terminal e extremidade C-terminal. A ordem dos L-aminoácidos ou resíduos de L-aminoácido, respectivamente, no polipeptídeo é comumente denominada sequência de aminoácidos. Os polipeptídeos também são denominados proteínas.

[0049] Além disso, é conhecido na técnica que o códon de iniciação ou códon de partida, respectivamente, gtg de uma sequência de codificação, assim como atg, codifica o aminoácido metionina. Sabe-se, na técnica, que o aminoácido N-terminal metionina de um polipeptídeo codificado pode ser removido por uma aminopeptidase durante ou após tradução (Jocelyn E. Krebs, Elliott S. Goldstein e Stephan T. Kilpatrick: Lewin's Genes X, Jones e Bartlett Publishers, EUA, 2011).

[0050] Os L-aminoácidos proteinogênicos devem ser compreendidos como os L-aminoácidos presentes em proteínas naturais, ou seja, proteínas de microrganismos, plantas, animais e seres humanos. Os L-aminoácidos proteinogênicos compreendem ácido L-aspártico, L-asparagina, L-treonina, Lserina, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-glicina, L

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16/95 alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, Llisina, L-triptofano, L-arginina, L-prolina e, em alguns casos, L-selenocisteína e L-pirrolisina. É comum na técnica se referir a esses L-aminoácidos proteinogênicos sem aludir à configuração L no átomo de carbono α do L-aminoácido; por exemplo, L-valina pode ser simplesmente denominada valina, L-ácido aspártico pode ser simplesmente denominado ácido aspártico, etc.

[0051] Os ensinamentos e as informações quanto ao manuseio e trabalho experimental com polinucleotídeos podem ser encontrados, entre outros, no livro de J. Sambrook et al (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), o livro de C. R. Newton e A. Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, 1994) e o livro de D. Rickwood e B. D. Hames (Gel electrophoresis of nucleic acids, a practical approach, IRL Press, 1982).

[0052] Para análise de sequência de polinucleotídeos e polipeptídeos, por exemplo, alinhamentos de sequência, o programa Clustal W (Larkin et al.: Clustal W e Clustal X versão 2.0. Em: Bioinformatics 23, 2947-2948 (2007)) ou o software público, como o CLC Genomics Workbench (Qiagen, Hilden, Alemanha) ou o programa MUSCLE fornecido pela Instituto Europeu de Bioinformática (EMBL-EBI, Hinxton, Reino Unido) pode ser usado.

[0053] Corynebacterium glutamicum, em particular, cepa ATCC13032 e cepas excretoras de L-lisina obtidas a partir da mesma durante um programa de desenvolvimento de cepa, contém em seu cromossomo, entre outros, um gene que codifica um polipeptídeo que tem a atividade de uma

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17/95 malato:quinona oxidoredutase e que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2. A sequência codificadora é mostrada na SEQ ID NO:1 posições 1001 a 2500. A sequência codificadora pode conter mutações silenciosas que não alteram a sequência de aminoácidos do polipeptídeo Mqo. Por exemplo, o aminoácido Phe na posição 410 da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4 pode ser especificado pelo códon ttc ou pelo códon ttt (consultar posições 2228 a 2230, em particular, posição 2230, da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3). Esse contexto também é conhecido como degeneração do código genético na técnica.

[0054] Durante o trabalho para a presente invenção, constatou-se que modificar bactérias excretoras de L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum ao trocar o aminoácido valina na posição 228 da sequência de aminoácidos codificada do polipeptídeo Mqo mostrado na SEQ ID NO:2 por um ácido aspártico ou ácido glutâmico preferencial proteinogênico diferente, particular preferencial ácido aspártico, aumentou sua habilidade de excretar L-lisina em comparação à bactéria não modificada.

[0055] A pessoa versada na técnica está ciente de diversos métodos de mutagênese para alcançar a dita modificação na Corynebacterium glutamicum.

[0056] Uma bactéria mutante de acordo com a invenção pode ser obtida por mutagênese in vivo clássica executada com populações celulares de cepas de Corynebacterium glutamicum com o uso de substâncias mutagênicas, por exemplo, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, ou luz ultravioleta. A sequência de nucleotídeos que compreende o sítio de mutagênese no gene mqo pode ser amplificada por

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PCR com o uso de iniciadores selecionados a partir da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3. Sequenciando-se o produto de PCR, os mutantes desejados são identificados. Detalhes referentes a essa abordagem podem ser encontrados, entre outros, no documento US7754446.

[0057] Um método adicional é a edição de genoma assistida por CRISPR-Cpf1 descrita por Jiang et al. (Nature Communications 8: 15179 DOI: 10; 1038/ncomms15179).

[0058] Outro método comum de realizar mutação de genes de Corynebacterium glutamicum é o método de substituição de gene descrito por Schwarzer e Pühler (Bio/Technology 9, 8487 (1991)) e adicionalmente elaborado por Schâfer et al. (Gene 145, 69-73 (1994)) .

[0059] Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998)) usaram o método de substituição de gene para inativar o gene pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica piruvato carboxilase. Schâfer et al. usaram o método para incorporar uma deleção na região de gene homthrB de Corynebacterium glutamicum. No documento EP1094111, o método foi usado para incorporar uma deleção no gene pck de Corynebacterium glutamicum que codifica fosfoenol piruvato carboxiquinase. No documento US7585650, o método foi aplicado ao gene zwf para realizar uma troca de aminoácido na posição 321 da sequência de aminoácidos da subunidade Zwf da glicose 6-fosfato desidrogenase. No documento US7754446, o método foi aplicado ao gene rel para realizar uma troca de aminoácido na posição 38 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de GTP-pirofosfato quinase.

[0060] No método de substituição de gene, uma mutação, por exemplo, uma deleção, inserção ou substituição de pelo

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19/95 menos uma nucleobase, é fornecida por um polinucleotídeo isolado que compreende a sequência de nucleotídeos do gene em questão ou uma parte do mesmo que contém a mutação.

[0061] No contexto da presente invenção, a sequência de nucleotídeos do gene em questão é o gene mqo.

[0062] No contexto da presente invenção, a mutação é uma substituição de pelo menos uma nucleobase localizada no códon que especifica o aminoácido valina na posição 228 da sequência de aminoácidos codificada (consultar SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:3) do polipeptídeo Mqo.

[0063] Como uma consequência da dita mutação, o códon especifica um aminoácido proteinogênico diferente de valina, preferencialmente ácido aspártico ou ácido glutâmico, de modo particularmente preferencial, ácido aspártico. Os códons que especificam ácido aspártico são gat ou gac. O códon gac é preferencial.

[0064] O códon para o aminoácido na posição 228 tem a posição de 1682 a 1684 na SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3. A sequência de nucleotídeos da posição 1682 a 1684, em particular, o nucleotídeo na posição 1683, também pode ser denominada sítio de mutação.

[0065] A sequência de nucleotídeos que sofreu mutação do gene em questão ou uma parte do mesmo que contém a mutação compreende i) uma sequência de nucleotídeos na extremidade 5' do sítio de mutação, a qual também é denominada sequência flanqueadora 5' ou sequência a montante na técnica, ii) uma sequência de nucleotídeos na extremidade 3' do sítio de mutação, a qual também é denominada sequência flanqueadora 3' ou sequência a jusante na técnica, e iii) a sequência de nucleotídeos do sítio de

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20/95 mutação entre i) e ii).

[0066] A dita sequência flanqueadora 5' e a sequência flanqueadora 3' necessárias para recombinação homóloga têm tipicamente um comprimento de pelo menos 200 pb, pelo menos 400 pb, pelo menos 600 pb ou pelo menos 800 pb. O comprimento máximo é tipicamente 1000 pb, 1500 pb ou 2000 pb.

[0067] Um exemplo de uma sequência de nucleotídeos que sofreu mutação no contexto da presente invenção compreende a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:1 das posições 1083 a 2283 com adenina na posição 1683. Outro exemplo de uma sequência de nucleotídeos que sofreu mutação

no contexto da presente invenção compreende a sequência de
nucleotídeos	mostrada na SEQ ID	NO:3	das posições 1083	a
2283.
[0068] Um	exemplo adicional	de	uma sequência	de
nucleotídeos	que sofreu mutação	no	contexto da presente

invenção compreende a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:7. A sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:7 corresponde à SEQ ID NO:3 das posições 882 a 2484. A SEQ ID NO:7 contém uma parte da sequência codificadora do gene mqo que sofreu mutação. A dita parte da sequência codificadora presente na SEQ ID NO:7 codifica a extremidade N'-terminal do polipeptídeo Mqo, isto é, os aminoácidos das posições 1 a 494. A dita parte da sequência codificadora não tem a sequência que codifica a extremidade c-terminal do polipeptídeo Mqo (consultar SEQ ID NO:8).

[0069] A sequência flanqueadora 5' compreende a sequência de nucleotídeos das posições 1 a 801 da SEQ ID NO:7. A sequência flanqueadora 3' consiste na sequência de

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21/95 nucleotídeos das posições 803 a 1603 da SEQ ID NO:7. O sítio de mutação está na posição 802.

[0070] A sequência de nucleotídeos que sofreu mutação fornecida é clonada em um vetor de plasmídeo que não é capaz de replicação autônoma em Corynebacterium glutamicum. O dito vetor de plasmídeo que compreende a dita sequência de nucleotídeos que sofreu mutação é subsequentemente transferido para a cepa desejada de Corynebacterium glutamicum por transformação ou conjugação. Após dois eventos de recombinação homóloga que compreendem um evento de recombinação dentro da sequência flanqueadora 5' fornecido pelo vetor de plasmídeo com a sequência homóloga do cromossomo de Corynebacterium glutamicum e um evento de recombinação dentro da sequência flanqueadora 3' fornecida pelo vetor de plasmídeo com a sequência homóloga do cromossomo de Corynebacterium glutamicum, um realizando a integração e o outro realizando a excisão do dito vetor de plasmídeo, a mutação é incorporada no cromossomo de Corynebacterium glutamicum. Desse modo, a sequência de nucleotídeos do gene em questão contida no cromossomo da dita cepa desejada é substituída pela sequência de nucleotídeos que sofreu mutação.

[0071] Um evento de recombinação homóloga também pode ser denominado permutação.

[0072] É preferencial que as cepas de Corynebacterium glutamicum excretoras de L-lisina da presente invenção tenham a habilidade de excretar k 0,25 g/l, preferencialmente k 0,5 g/l, particularmente preferencial k 1,0 g/l de L-lisina em um meio adequado sob condições adequadas.

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22/95 [0073] A invenção fornece, ainda, um processo fermentativo para produzir L-lisina, com o uso da Corynebacterium glutamicum da presente invenção.

[0074] Em um processo fermentativo de acordo com a invenção, uma Corynebacterium glutamicum modificada de acordo com a presente invenção e que tem a habilidade de excretar L-lisina é cultivada em um meio adequado sob condições adequadas. Devido à sua habilidade de excretar o dito L-lisina, a concentração do L-lisina aumenta e se acumula no meio durante o processo fermentativo e o Llisina é, então, produzido.

[0075] O processo fermentativo pode ser um processo descontínuo, como um processo de batelada ou um processo de batelada alimentada, ou um processo contínuo. Um resumo referente à natureza geral de processos de fermentação está disponível no livro por H. Chmiel (Bioprozesstechnik, Spektrum Akademischer Verlag, 2011), no livro de C. Ratledge e B. Kristiansen (Basic Biotechnology, Cambridge University Press,2006) ou no livro de V.C. Hass e R. Portner (Praxis der Bioprozesstechnik Spektrum Akademischer Verlag, 2011).

[007 6] Um meio adequado usado para a produção de Llisina por um processo fermentativo contém uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo, íons inorgânicos e outros compostos orgânicos, conforme necessário.

[0077] As fontes de carbono adequadas incluem glicose, frutose, sacarose, bem como os matérias-primas correspondentes, como hidrolisado de amido, melaços ou xarope de milho com alto teor de frutose.

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23/95 [0078] Como fonte de nitrogênio, compostos contendo nitrogênio orgânico, como peptonas, extrato de carne, hidrolisados de soja ou ureia, ou compostos inorgânicos, como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, nitrato de amônio, gás de amônio ou amônia aquosa, podem ser usados.

[0079] Como fonte de fósforo, ácido fosfórico, dihidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato de dipotássio ou os sais contendo sódio correspondentes podem ser usados.

[0080] Íons inorgânicos, como potássio, sódio, magnésio, cálcio, ferro e demais elementos-traço etc. são fornecidos como sais de ácido sulfúrico, ácido fosfórico ou ácido clorídrico.

[0081] Outros compostos orgânicos representam fatores de crescimento essenciais, como vitaminas, por exemplo, tiamina ou biotina ou L-aminoácidos, por exemplo, Lhomoserina.

[0082] Os componentes de meio podem ser adicionados à cultura na forma de uma única batelada ou podem ser alimentados durante o cultivo de uma maneira adequada.

[0083] Durante o processo fermentativo, o pH da cultura pode ser controlado empregando-se compostos básicos, como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou amônia aquosa, ou compostos ácidos, como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico de uma maneira adequada. O pH é geralmente ajustado a um valor de 6,0 a 8,5, preferencialmente 6,5 a 8,0. Para controlar a formação de espuma, é possível empregar agentes antiespumantes, como, por exemplo, poliglicol ésteres de ácido graxo. Para manter a

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24/95 estabilidade de plasmídeos, é possível adicionar ao meio substâncias seletivas adequadas, como, por exemplo, antibióticos. O processo fermentativo é preferencialmente realizado sob condições aeróbicas. A fim de manter essas condições, oxigênio ou misturas de gás contendo oxigênio, como, por exemplo, ar, são introduzidos na cultura. O processo fermentativo é realizado, quando adequado, a uma pressão elevada, por exemplo, a uma pressão elevada de 0,03 a 0,2 MPa. A temperatura da cultura é normalmente de 25 °C a 40 °C, preferencialmente de 30 °C a 37 °C. Em um processo descontínuo, o cultivo é continuado até que uma quantidade da L-lisina suficiente para ser recuperado tenha sido formada. O cultivo é, então, concluído. Esse objetivo é normalmente alcançado em 10 horas a 160 horas. Em processos contínuos, períodos mais longos de cultivo são possíveis.

[0084] Exemplos de meios e condições de cultura adequados podem ser encontrados, entre outros, em L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005) e nos documentos de patente US5770409, US5990350, US 5275940, US5763230 e US6025169.

[0085] Então, o processo fermentativo resulta em um caldo de fermentação que contém a L-lisina desejada.

[0086] Consequentemente, um método para a produção fermentativa de L-lisina é fornecido, o qual compreende as etapas de

a) cultivar uma Corynebacterium glutamicum da presente invenção em um meio adequado sob condições adequadas, e

b) acumular a dita L-lisina no meio para produzir um caldo de fermentação contendo L-lisina.

[0087] Um produto contendo a L-lisina é, então,

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25/95 recuperado em líquido ou sólido do caldo de fermentação.

[0088] Um caldo de fermentação significa um meio em que um Corynebacterium glutamicum da invenção foi cultivado por um certo tempo e sob certas condições.

[0089] Quando o processo fermentativo é concluído, o caldo de fermentação resultante compreende consequentemente:

a) a biomassa (massa celular) da Corynebacterium glutamicum da invenção, em que a dita biomassa foi produzida devido à propagação das células da dita

Corynebacterium glutamicum,

b) a L-lisina desejada acumulada durante o processo fermentativo,

c) os subprodutos orgânicos acumulados durante o processo fermentativo, e

d) os componentes do meio empregado que não foram consumidos no processo fermentativo.

[0090] Os subprodutos orgânicos incluem compostos que podem ser formados pelo Corynebacterium da invenção durante o processo fermentativo além da produção da L-lisina.

[0091] O caldo de fermentação é removido do vaso de cultura ou tanque de fermentação, coletado quando adequado e usado para fornecer um produto contendo a L-lisina, em forma líquida ou sólida. A expressão recuperar o produto contendo L-lisina também é usada para tanto. No caso mais simples, o próprio caldo de fermentação contendo L-lisina, o qual foi removido do tanque de fermentação, constitui o produto recuperado.

[0092] O caldo de fermentação pode ser subsequentemente

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26/95 submetido a uma ou mais das medições selecionadas a partir

do grupo que consiste em:
a) remoção parcial	(>	0 % a <	80	%) a completa	(100 %)	ou
quase completa (> 80	o, %,	> 90 %	,	> 95 %, > 96 %,	> 97 %,	>
98 %, > 99 %) da água,
b) remoção parcial	(>	0 % a <	80	%) a completa	(100 %)	ou
quase completa (> 80	o, %,	> 90 %	,	> 95 %, > 96 %,	> 97 %,	>
98 %, > 99 %) da	biomassa,		sendo que a	última	é
opcionalmente inativada	antes da	remoção,
c) remoção parcial	(>	0 % a <	80	%) a completa	(100 %)	ou
quase completa (> 80	o, %,	> 90 %	,	> 95 %, > 96 %,	> 97 %,	>
98 %, > 99 %, > 99,3	o, %,	> 99,7	%)	dos subprodutos	orgânicos

formados durante o processo fermentativo, e

d) remoção parcial (>0 % a <80 %) a completa (100 %) ou quase completa (> 80 %, > 90 %, > 95 %, > 96 %, > 97 %, > 98 %, > 99 %, > 99,3 %, > 99,7 %) dos componentes residuais do meio empregado ou dos materiais de entrada residuais, respectivamente, os quais não foram consumidos no processo fermentativo.

[0093] Uma grande quantidade de instruções técnicas para medições a), b), c) e d) está disponível na técnica.

[0094] A remoção de água (medição a) ) pode ser alcançada, entre outros, por evaporação, com o uso, por exemplo, de um evaporador de filme descendente, por osmose reversa ou nanofiltração. Os concentrados então obtidos podem ser adicionalmente finalizados por secagem por aspersão ou granulação por aspersão. Do mesmo modo, é possível secar o caldo de fermentação diretamente com o uso de secagem por aspersão ou granulação por aspersão.

[0095] A remoção da biomassa (medição b)) pode ser

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27/95 alcançada, entre outros, por centrifugação, filtração ou decantação ou uma combinação desses.

[0096] A remoção dos subprodutos orgânicos (medição c)) ou remoção de componentes residuais do meio (medição d) pode ser alcançada, entre outros, por cromatografia, por exemplo, cromatografia por troca de íons, tratamento com carbono ativado ou cristalização. Caso os subprodutos orgânicos ou componentes residuais do meio estejam presentes no caldo de fermentação como sólidos, podem ser removidos pela medição b).

[0097] Instruções gerais sobre métodos de separação, purificação e granulação podem ser encontradas, entre outros, no livro de R. Ghosh Principles of Bioseperation Engineering” (World Scientific Publishing, 2006), o livro de F. J. Dechow Seperation and Purification Techniques in Biotechnology” (Noyes Publications, 1989), o artigo Bioseparation” de Shaeiwitz et al. (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Wiley-VCH, 2012) e o livro de P. Serno et al Granulieren” (Editio Cantor Verlag, 2007) .

[0098] Um esquema de processamento a jusante para produtos de L-lisina pode ser encontrado no artigo Llysine Production” de R. Kelle et al. (L. Eggeling e M. Bott (Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, 2005)) . O documento US5279744 ensina a fabricação de um produto de L-lisina purificado por cromatografia por troca de íons. O documento US5431933 ensina a fabricação de produtos de L-aminoácido secos, por exemplo, um produto de L-lisina, contendo a maioria dos constituintes do caldo de fermentação.

[0099] Então, uma concentração ou purificação da L

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28/95 lisina é alcançada e um produto que tem o teor desejado da dita L-lisina é fornecido.

[0100] Por fim, a L-lisina pode ser isolada do caldo de cultura e cristalizada na forma de um sal, preferencialmente na forma do sal de ácido clorídrico de Llisina.

[0101] A análise de L-lisina para determinar sua concentração em um ou mais períodos durante a fermentação pode ocorrer separando-se a L-lisina por meio de cromatografia por troca de íons, preferencialmente cromatografia por troca de cátions, com derivatização póscoluna subsequente com o uso de ninidrina, como descrito em Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)). Também é possível empregar orto-ftalaldeído em vez de ninidrina para a derivatização pós-coluna. Um artigo de visão geral sobre cromatografia por troca de íons pode ser encontrado em Pickering (LC.GC (Magazine of Chromatographic Science 7(6):484-487 (1989)). É possível, do mesmo modo, realizar uma derivatização pré-coluna, por exemplo, com o uso de orto-ftalaldeído ou isotiocianato de fenila, e fracionar os derivados de aminoácido resultantes por cromatografia de fase reversa (RP), preferencialmente na forma de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Um método desse tipo é descrito, por exemplo, em Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51:1167-1174 (1979)). A detecção é realizada fotometricamente (absorção, fluorescência). Uma resenha referente à análise de aminoácido pode ser encontrada, entre outros, no livro Bioanalytik por Lottspeich e Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha 1998).

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SEÇÃO EXPERIMENTAL A) MATERIAIS e MÉTODOS [0102] Os kits, iniciadores e produtos químicos de biologia molecular usados e alguns detalhes dos métodos aplicados são brevemente descritos no presente documento.

1. Antibióticos e produtos químicos

a. Canamicina: Solução de canamicina de Streptomyces kanamyceticus adquirida junto à Sigma Aldrich (St. Louis, EUA, n° de Cat. K0254).

b. Ácido nalidíxico: Sal de sódio de ácido nalidíxico disponível junto à Sigma Aldrich (St. Louis, EUA, n° de Cat. N4382).

c. Se não for declarado de outro modo, todos os produtos químicos foram adquiridos analiticamente puros junto à Merck (Darmstadt, Alemanha), Sigma Aldrich (St. Louis, EUA) ou Carl-Roth (Karlsruhe, Alemanha).

2. Cultivo [0103] Se não for declarado de outro modo, todos os procedimentos de cultivo / incubação foram realizados como a seguir:

a. Caldo de LB (MILLER) da Merck (Darmstadt, Alemanha; n° de Cat. 110285) foi usado para cultivar cepas de E. coli em meio líquido. As culturas líquidas (10 ml de meio líquido por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foram incubadas no agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Einsbach, Alemanha) a 37 °C e 200 rpm.

b. Ágar de LB (MILLER) da Merck (Darmstadt, Alemanha n° de Cat. 110283) foi usado para cultivo de cepas de E. coli em placas de ágar. As placas de ágar foram incubadas a

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30/95 °C em uma mini-incubadora INCU-Line® da VWR (Radnor, EUA) .

c. Caldo de infusão cérebro-coração (BHI) da Merck (Darmstadt, Alemanha; n° de Cat. 110493) foi usado para cultivar cepas de C. glutamicum em meio líquido. As culturas líquidas (10 ml de meio líquido por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foram incubadas no agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Einsbach, Alemanha) a 33 °C e 200 rpm.

d. Ágar cérebro-coração (ágar BHI) da Merck (Darmstadt,

Alemanha; n° de Cat. 113825) foi usado para cultivo de cepas de C. glutamicum em placas de ágar. As placas de ágar foram incubadas a 33 °C em uma incubadora da Heraeus

Instruments com controlador de temperatura Kelvitron® (Hanau, Alemanha).

3. Determinação de densidade óptica

a. A densidade óptica de suspensões bacterianas em culturas de frasco de agitação foi determinada a 600 nm (OD600) com o uso do BioPhotometer da Eppendorf AG (Hamburgo, Alemanha).

b. A densidade óptica de suspensões bacterianas produzidas no sistema de microfermentação Wouter Duetz (WDS) (Placas de 24 poços) foi determinada a 660 nm (OD660) com o leitor de placa GENios™ da Tecan Group AG (Mânnedorf, Suíça).

4. Centrifugação

a. Centrífuga de bancada para tubos de reação com um volume de até 2 ml

As suspensões bacterianas com um volume máximo de 2 ml foram levadas à sedimentação com o uso de tubos de reação

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31/95 de 1 ml ou 2 ml (por exemplo, Eppendorf Tubes® 3810X) com o uso de uma centrífuga Eppendorf 5417 R (5 min a 13.000 rpm).

b. Centrífuga de bancada para tubos com um volume de até ml

As suspensões	bacterianas com	um volume máximo	de 50	ml
foram levadas	à	sedimentação	com o	uso de	tubos	de
centrífuga de	15	ml ou 50 ml	(por	exemplo,	Tubos	de
Centrífuga Cônica	de 50 ml FalconTM)	com o uso de	uma

centrífuga Eppendorf 5810 R por 10 min a 4.000 rpm.

5. Isolamento de DNA

a. O DNA plasmidial foi isolado de células de E. coli com o uso do Kit QIAprep Spin Miniprep da Qiagen (Hilden, Alemanha, Cat. n° 27106).

b. O DNA total de C. glutamicum foi isolado com o uso do método de Eikmanns et al. (Microbiology 140, 1817-1828, 1994).

6. Reação em cadeia de polimerase (PCR) [0104] A PCR com uma polimerase de correção de leitura (alta fidelidade) foi usada para amplificar um segmento de DNA desejado antes de montagem ou sequenciamento de Sanger. a. O Kit de DNA Polimerase de Alta Fidelidade Phusion® (Phusion Kit) de New England BioLabs Inc. (Ipswich, EUA; n° de Catálogo M0530) foi usado para amplificação de correção de modelo de regiões de DNA selecionadas de acordo com as instruções do fabricante (consultar tabela 1).

[0105] Tabela 1: Condições de termociclagem para PCR com Kit de DNA Polimerase de Alta Fidelidade Phusion® de NEB Inc.

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Programa PCR
Etapa	Tempo [min]	T [°C]	Descrição
1	00:30	98	Etapa de desnaturação inicial
2	00:05	98	Etapa de desnaturação
3	00:30	60	Etapa de recozimento
4	00:xx	72	Etapa de alongamento 15-30 s por kb de DNA
			Repetir etapa 2 a 4: 30 x
5	05:00	72	Etapa de alongamento final
6	Aguardar	4	Etapa de resfriamento

b. Iniciador [0106] Os oligonucleotídeos usados foram sintetizadas por Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha) com o uso do método de fosforamidita descrito por McBride e Caruthers (Tetrahedron Lett. 24, 245-248, 1983) .

c. Modelo [0107] Como modelo de PCR, uma solução adequadamente diluída de DNA plasmidial isolado ou de DNA total isolado de uma cultura líquida de C. glutamicum ou o DNA total

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33/95 contido em uma colônia foi usada (PCR de colônia) . Para a dita PCR de colônia, o modelo foi preparado obtendo-se material celular com um palito de uma colônia em uma placa de ágar e colocando-se o material celular diretamente no tubo de reação de PCR. O material celular foi aquecido por 10 s com 800 W em um forno de micro-ondas do tipo Mikrowave

Grill da SEVERIN Elektrogerãte GmbH (Sundern, Alemanha) e, então, os reagentes de PCR foram adicionados ao modelo no tubo de reação de PCR.

d. Ciclizador de PCR [0108] PCRs foram realizadas em Ciclizadores de PCR do tipo Mastercycler ou Mastercycler nexus gradient da Eppendorf AG (Hamburgo, Alemanha).

. Detecção de mutações com o uso de FRET [0109] A presença de uma dada mutação, por exemplo, uma troca de nucleobase, foi detectada por PCR em tempo real em combinação com sondas de hibridização de FRET. O termo FRET é a abreviação de transferência de energia de ressonância de fluorescência. Como o instrumento de PCR em tempo real, um Lightcycler da Roche Diagnostics® foi usado (consultar abaixo).

[0110] Esse método foi, por exemplo, usado por M. J. Lay e C. T. Wittwer (Clinical Chemistry 42 (12), 2262-2267 (1997)) para a genotipagem de fator V de Leiden. Cyril DS Mamotte (The Clinical Biochemist Reviews 27, 63-75 (2006) revisa a genotipagem de substituições de nucleotídeo único com o uso desse método. Resumos referentes a esse método podem ser encontrados nos livros Lewin's Genes XII de Jocelyn E. Krebs, Elliott S. Goldstein e Stephan T. Kilpatrick (Jones e Bartlett Publishers, EUA, 2018),

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Molecular Diagnostics, 12 Tests that changed everything de W. Edward Highsmith (Humana Press, Springer, Nova York, 2014) ou em outras publicações da técnica.

[0111] A sonda de doador de hibridização de FRET foi identificada com o corante fluorescente fluoresceína e a sonda de aceptor com o corante fluorescente LC-Red640. Em essência, o método de detecção compreendia três etapas: PCR de colônia, hibridização por sonda e análise de curva de fusão subsequente. O método é simplesmente denominado PCR em tempo real no presente documento.

a. Iniciadores e Sondas

Os oligonucleotídeos usados foram sintetizados por eurofins genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha).

b. Modelo [0112] Como modelo de PCR, o DNA total contido em uma colônia foi usado. Foi preparado obtendo-se material celular com um palito de uma colônia em uma placa de ágar e colocando-se o material celular diretamente no tubo de reação de PCR. O material celular foi aquecido por 10 s com 800 W em um forno de micro-ondas do tipo Mikrowave & Grill da SEVERIN Elektrogerâte GmbH (Sundern, Alemanha) e, então, os reagentes de PCR foram adicionados ao modelo no tubo de reação de PCR.

e. Mistura de Reação [0113] O kit de PCR de sonda Type-it® Fast SNP (Kit Type-it) da Qiagen (Hilden, Alemanha, n° de Catálogo 206045) foi usado para detecção em tempo real das mutações. Portanto, 2,5 pl do Qiagen Fast SNP Puffer (2x) foram misturados com 0,5 pl de cada um dos Iniciadores de LC-PCR [10 μΜ] e 0,5 pl de cada uma das sondas de aceptor e

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35/95 doador diluídas a 1:500 [100 pmol/μΐ] para obter a mistura principal para a PCR em tempo real.

[0114] Tabela 2: Condições de termociclização para PCR com o LightCycler® (etapas 1-3) e análise de curva de fusão (etapas 4-6).

Programa PCR
Etapa	Tempo [s]	T [°C]	Descrição
1	15	95	Etapa de desnaturação (e Ativação de DNA polimerase HotStarTaqTM)
2	05	55	Etapa de recozimento
3	30	72	Etapa de alongamento
			Repetir etapa 1 a 3: 50 x
4	10	95	Etapa de desnaturação Hibridização por sonda Análise de curva de fusão Resfriamento
5	30	40
6		40- 80
7		80- 40

f. Ciclizador de PCR

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36/95 [0115] As reações foram executadas em um Instrumento LightCycler® 2.0 e analisadas com o Software 4.1 LightCycler® da Roche Diagnostics (Rotkreuz, Suíça).

8. Digestão de enzima de restrição de DNA [0116] As endonucleases de restrição FastDigest (FD) e o tampão associado da ThermoFisher Scientific (Waltham, EUA) foram usados para digestão de restrição de DNA plasmidial. As reações foram realizadas de acordo com as instruções do manual do fabricante.

9. Determinação do tamanho de fragmentos de DNA [0117] O tamanho de fragmentos de DNA foi determinado por eletroforese capilar automatizada com o uso do QIAxcel da Qiagen (Hilden, Alemanha).

10. Purificação de amplificados de PCR e fragmentos de restrição [0118] Os amplificados de PCR e fragmentos de restrição foram limpos com o uso do QIAquick PCR Purification Kit da Qiagen (Hilden, Alemanha; n° de Catálogo 28106), acordo com as instruções do fabricante.

11. Determinação de concentração de DNA [0119] A concentração de DNA foi medida com o uso do Espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 da PEQLAB Biotechnologie GmbH, desde 2015 com a marca VWR (Erlangen, Alemanha).

12. Montagem de Gibson [0120] Vetores que permitem a integração da mutação desejada no cromossomo foram feitos com o uso do método de Gibson et al. (Science 319, 1215—20, 2008) . O Kit de Montagem de Gibson da New England BioLabs Inc. (Ipswich, EUA; n° de Catálogo E2611) foi usado para esse propósito. A mistura de reação, contendo o vetor restrito e pelo menos

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37/95 um inserto de DNA, foi incubada a 50 °C por 60 min. 0,5 μΐ da mistura de Montagem foram usados para um experimento de transformação.

13. Transformação química de E. coli

a. Células Stellar™ de E. coli quimicamente competentes foram adquiridas junto à Clontech Laboratories Inc. (Mountain View, EUA; n° de Catálogo 636763) e transformadas de acordo com o protocolo do fabricante (PT5055-2).

Essas células foram usadas como hospedeiros de transformação para misturas de reação obtidas por Montagem de Gibson. As bateladas de transformação foram cultivadas de um dia para o outro por aproximadamente 18 h a 37 °C e os transformantes contendo plasmídeos foram selecionados em ágar de LB suplementado com 50 mg/l de canamicina.

b. A cepa S17-1 de E. coli K-12 foi usada como doadora para transferência conjugacional de plasmídeos com base em pK18mobsacB de E. coli para C. glutamicum. A cepa S17-1 é descrita por Simon, R. et al. (Bio/Technology 1, 784-794, 1983). Está disponível junto à American Type Culture Collection sob o número de acesso ATCC47055.

[0121] As células de E. coli S17-1 quimicamente competentes foram feitas como a seguir: Uma pré-cultura de 10 ml de meio de LB (10 ml de meio líquido por frasco de Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foi inoculada com 100 pl suspensão bacteriana de cepa S17-1 e a cultura foi incubada de um dia para o outro por cerca de 18 h a 37 °C e 250 rpm. A cultura principal (70 ml de LB contidos em um frasco de Erlenmeyer de 250 ml com 3 defletores) foi inoculada com 300 μl da pré-cultura e incubada até um OD600 de 0,5-0,8 a 37 °C. A cultura foi centrifugada por 6 min a

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38/95 °C e 4000 rpm e o sobrenadante foi descartado. O pélete celular foi ressuspenso em 20 ml de solução estéril gelada de CaCl2 50 mM e incubado no gelo por 3 0 min. Após outra etapa de centrifugação, o pélete foi ressuspenso em 5 ml de solução gelada de CaCl2 50 mM e a suspensão foi incubada no gelo por 30 min. A suspensão celular foi, então, ajustada a uma concentração final de glicerol a 20 % (v/v) com glicerol estéril gelado a 85 %. A suspensão foi dividida em alíquotas de 50 pl e armazenada a -80 °C.

[0122] Para transformar células S17-1, o protocolo de acordo com Tang et al. (Nucleic Acids Res. 22(14), 28572858, 1994) com um choque térmico de 45 s foi usado.

14. Conjugação de C. glutamicum [0123] O sistema de plasmídeo pK18mobsacB descrito por Schâfer et al. (Gene 145, 69 - 73, 1994) foi usado para integrar fragmentos de DNA desejado no cromossomo de C. glutamicum. Um método de conjugação modificada de Schâfer et al. (Journal of Bacteriology 172, 1663 - 1666, 1990) foi usado para a transferência do respectivo plasmídeo para a cepa recipiente de C. glutamicum desejada.

[0124] As culturas líquidas das cepas de C. glutamicum foram realizadas em meio de BHI a 33 °C. O choque térmico foi realizado a 48,5 °C por 9 min. Transconjugantes foram selecionados plaqueando-se a batelada de conjugação em ágar de EM8 (Tabela 4) , a qual foi suplementada com 25 mg/l de canamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. As placas de ágar de EM8 foram incubadas por 72 h a 33 °C.

[0125] Tabela 4: Composição do ágar de EM8

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Componentes	Concentração (g/l)
Glicose (estéril-filtrada)	23
CSL (milhocina)	30
Peptona de farinha de soja (Merck, Alemanha)	40
(NH4)2SO4	8
Ureia	3
KH2PO4	4
MgSO4 · 7 H2O	0,5
FeSO4 · 7 H2O	0,01
CuSO4 · 5 H2O	0,001
ZnSO4 · 7 H2O	0,01
Pantotenato de cálcio, D(+)	0,01
Tiamina	0,001
Inositol	0,1
Ácido nicotínico	0,001
Biotina (estéril-filtrada)	0,005
CaCO3 (autoclavada separadamente)	1,6
Ágar-Ágar (Merck, Alemanha)	14

[0126] Palitos estéreis foram usados para a transferência dos transconjugantes para ágar de BHI, o qual foi suplementado com 25 mg/l de canamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. As placas de ágar foram incubadas por 20 h a 33 °C. As culturas dos respectivos transconjugantes

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40/95 produzidos dessa maneira foram, então, propagadas adicionalmente por 24 h a 33 °C em 10 ml de meio de BHI contido em frascos Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Uma alíquota foi obtida da cultura líquida, adequadamente diluída e plaqueada (tipicamente 100 a 200 pl) em ágar de BHI que foi suplementado com sacarose a 10 %. As placas de ágar foram incubadas por 48 h a 33 °C. As colônias em crescimento nas placas de ágar contendo sacarose foram, então, examinadas para o fenótipo de sensibilidade à canamicina. Para fazê-lo, um palito foi usado para remover material celular da colônia e transferi-lo para ágar de BHI contendo 25 mg/l de canamicina e para ágar de BHI contendo sacarose a 10 %. As placas de ágar foram incubadas por 60 h a 33 °C. Clones que se provaram sensíveis à canamicina e resistentes à sacarose foram examinados para integração do fragmento de DNA desejado por meio de PCR.

15. Determinação de sequências de nucleotídeos [0127] Sequências de nucleotídeos de moléculas de DNA foram determinadas por Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha) por sequenciamento de ciclo, com o uso do método de terminação de cadeia de didesoxi de Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences EUA 74, 5463 - 5467, 1977), em Analisadores de DNA 3730xl da Applied Biosystems® (Carlsbad, CA, EUA) . O software Clonemanager Professional 9 da Scientific & Educational Software (Denver, EUA) foi usado para visualizar e avaliar as sequências.

16. Estoques de glicerol de cepas de E.coli e C. glutamicum [0128] Para um armazenamento de longo período de cepas

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41/95 de E.coli e C. glutamicum, estoque de glicerol foram preparados. Os clones de E. coli selecionados foram cultivados em 10 ml de meio de LB suplementado com 2 g/l de glicose. Os clones de C. glutamicum selecionados foram cultivados em meio de BHI concentrado duas vezes suplementado com 2 g/l de glicose. Culturas de cepas de E. coli contendo plasmídeo foram suplementadas com 50 mg/l de canamicina. Culturas de cepas de C. glutamicum contendo plasmídeo foram suplementadas com 25 mg/l de canamicina. O meio estava contido em frascos Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Foi inoculado com um laço de células obtido a partir de uma colônia e a cultura foi incubada por cerca de 18 h a 37 °C e 200 rpm no caso de E. coli e 33 °C e 200 rpm no caso de C. glutamicum. Após o dito período de incubação, 1,2 ml de glicerol estéril a 85 % (v/v) foram adicionados à cultura. A suspensão celular contendo glicerol obtida foi, então, dividida em alíquotas em porções de 2 ml e armazenada a -80 °C.

17. Sistema de cultivo de acordo com Wouter Duetz (WDS) [0129] O sistema de cultivo de escala em mililitros de acordo com Duetz (Trends Microbiol. 2007; 15(10):469-75) foi usado para investigar o desempenho das cepas de C. glutamicum construídas. Para esse propósito, microplacas de 24 poços profundas (placas WDS de 24 poços) da EnzyScreen BV (Heemstede, Holanda; n° de Cat. CR1424) preenchidas com 2,5 ml de meio foram usadas.

[0130] Pré-culturas das cepas foram feitas em 10 ml de meio de BHI concentrado duas vezes. O meio estava contido em um frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Foi

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42/95 inoculado com 100 μΐ de uma cultura de estoque de glicerol e a cultura foi incubada por 24 h a 33 °C e 200 rpm.

[0131] Após o dito período de incubação, as densidades ópticas OD600 das pré-culturas foram determinadas.

[0132] As culturas principais foram feitas inoculando-se os poços contendo 2,5 ml de meio da Placa de WDS de 24 poços com uma alíquota da pré-cultura para produzir uma densidade óptica OD600 de 0,1.

[0133] Como meio para a cultura principal, o meio de CGXII descrito por Keilhauer et al. (J. Bacteriol. 1993 Set; 175(17): 5595-5603) foi usado. Por conveniência, a composição do meio de CGXII é mostrada na tabela 8.

[0134] Tabela 8: Composição do meio de CGXII de Keilhauer.

Componentes	Concentração (g/l)
MOPS (ácido 3-(N-morfolino)propanossulfônico)	42
(NH4)2SO4	20
Ureia	5
KH2PO4	1
K2HPO4	1
MgSO4 · 7 H2O	0,25
CaCl2	0,01
FeSO4 · 7 H2O	0,01
MnSO4 H2O	0,01
ZnSO4 · 7 H2O	0,001
CuSO4 · 5 H2O	0,0002

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Componentes	Concentração (g/l)
NiCl2 6 H2O	0,00002
Biotina (estéril-filtrada)	0,0002
Ácido protocatecuico (estéril-filtrado)	0,03
Fonte de carbono (estéril-filtrado)	conforme
ajustar o pH a 7 com NaOH

[0135] Essas culturas principais foram incubadas por aproximadamente 45 h a 33 °C e 300 rpm em um agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Bottmingen, Suíça) até o consumo completo de glicose.

[0136] A concentração de glicose na suspensão foi analisada com o medidor de glicose no sangue OneTouch Vita® da LifeScan (Johnson & Johnson Medical GmbH, Neuss, Alemanha).

[0137] Após o cultivo, as suspensões de cultura foram transferidas para uma microplaca de poço profundo. Uma parte da suspensão de cultura foi adequadamente diluída para medir o OD600. Outra parte da cultura foi centrifugada e a concentração de L-aminoácidos, em particular L-lisina, e glicose residual foram analisadas no sobrenadante.

18. Analisador de aminoácido [0138] A concentração de L-lisina e outros Laminoácidos, por exemplo, L-valina, nos sobrenadantes de cultura foi determinada por cromatografia por troca de íons com o uso de um analisador de aminoácido SYKAM S433 da SYKAM Vertriebs GmbH (Fürstenfeldbruck, Alemanha). Como fase sólida, uma coluna com trocador de cátion esférico à

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44/95 base de poliestireno (Peek LCA N04/Na, dimensão 150 x 4,6 mm) da SYKAM foi usada. Dependendo do L-aminoácido, a separação ocorre em um ciclo isocrático com o uso de uma mistura de tampões A e B para eluição ou por eluição de gradiente com o uso dos ditos tampões. Como tampão A, uma solução aquosa contendo, em 20 l, 263 g de citrato de trissódio, 120 g de ácido cítrico, 1100 ml de metanol, 100 ml de HCl a 37 % e 2 ml de ácido octanoico (pH final 3,5) foi usada. Como tampão B, uma solução aquosa contendo, em 20 l, 392 g de citrato de trissódio, 100 g de ácido bórico e 2 ml de ácido octanoico (pH final 10,2) foi usada. Esses aminoácidos livres foram coloridos com ninidrina através de derivatização pós-coluna e detectados fotometricamente a 570 nm.

19. Determinação de glicose com sistema de fluxo contínuo (CFS) [0139] Um analisador de fluxo contínuo multicanal SANplus da SKALAR Analytic GmbH (Erkelenz, Alemanha) foi usado para determinar a concentração de glicose no sobrenadante. A glicose foi detectada com um ensaio acoplado de enzima (Hexoquinase/ Glicose-6-FosfatoDesidrogenase) por formação de NADH.

B) RESULTADOS EXPERIMENTAIS

Exemplo 1

Sequência do gene mqo de cepa DM1933 e DM2463 de C. glutamicum [0140] A cepa DM1933 é um produtor de L-lisina descrito por Blombach et al. (Applied and Environmental Microbiology 75(2), 419-427, 2009). É depositada de acordo com o tratado de Budapeste no DSMZ sob o número de acesso DSM25442.

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45/95 [0141] A cepa DM2463 é um produtor de L-lisina obtido de ATCC13032 durante um programa de melhoramento de múltiplas etapas que tem como objetivo parâmetros de desempenho aumentados para a produção de L-lisina.

[0142] A sequência de nucleotídeos do cromossomo da cepa DM1933 e da cepa DM2463 foi determinada por tecnologia de sequenciamento de genoma completo Illumina (Illumina Inc. , San Diego, CA, EUA). Consultar, por exemplo, Benjak et al.

(2015) Whole-Genome Sequencing for Comparative Genomics and De Novo Genome Assembly. Em: Parish T., Roberts D. (eds) Mycobacteria Protocols. Methods in Molecular Biology, Vol 1285. Humana Press, NY, US) e Bennet, S. (Pharmacogenomics 5 (4) , 433-438, 2004) .

[0143] Constatou-se que a sequência de nucleotídeos da sequência de codificação de mqo da cepa DM1933, incluindo a sequência de nucleotídeos a montante e a jusante da mesma, é idêntica àquela de ATCC13032 mostrada na SEQ ID NO:1.

[0144] Constatou-se que a sequência de nucleotídeos da sequência codificadora de mqo da cepa DM2463, incluindo a sequência de 1000 nucleobases a montante e 1003 nucleobases a jusante da mesma, é diferente em duas posições àquela de ATCC13032 mostrada na SEQ ID NO:1. Em vez da nucleobase timina na posição 1683 da SEQ ID NO:1, a nucleobase correspondente na cepa DM2463 é adenina. Em vez da nucleobase citosina na posição 2230 da SEQ ID NO:1, a nucleobase correspondente na cepa DM2463 é timina.

[0145] Como consequência da mutação na posição 1683, o aminoácido na posição 228 da sequência de aminoácidos codificada do polipeptídeo Mqo da cepa DM2463 é ácido aspártico (abreviado como D ou Asp) . 0 aminoácido na

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46/95 posição 228 da sequência de aminoácidos codificada do polipeptídeo Mqo da cepa ATCC13032 é valina (abreviada como V ou Val) como mostrado na SEQ ID NO:2. Essas alteração ou troca, respectivamente, na sequência de aminoácidos de valina para ácido aspártico é abreviada como V228D.

[0146] A mutação na posição 2230 é uma mutação silenciosa. Não resulta em uma alteração do aminoácido na posição 410 da sequência de aminoácidos codificada, a qual é fenilalanina.

[0147] A sequência de nucleotídeos da sequência codificadora mqo da cepa DM2463, incluindo a sequência de nucleotídeos a montante e a jusante da mesma, também é mostrada na SEQ ID NO:3. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo Mqo codificado da cepa DM2463 é mostrada na SEQ ID NO:4.

[0148] DM1933 contém em seu cromossomo uma variante do gene de aspartoquinase que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação. O dito polipeptídeo de aspartoquinase resistente à realimentação tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 da listagem de sequências, em que o aminoácido treonina (Thr) na posição 311 da sequência de aminoácidos é substituído por isoleucina (Ile). No documento US 7.338.790, a abreviação lysC T311I” é usada para indicar a dita troca. Blombach et al. usam a abreviação lysC(T311I).

Exemplo 2

Construção do plasmídeo pK18mobsacB_mqo'_V228D [0149] O plasmídeo pK18mobsacB_mqo'_V228D foi construído para possibilitar a incorporação da mutação que causa a troca de aminoácido V228D (consultar o exemplo 1) para a

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47/95 sequência de nucleotídeos da sequência codificadora mqo da cepa DM1933. O plasmídeo é baseado no vetor móvel pK18mobsacB descrito por Schâfer et al. (Gene 145, 69-73, 1994). Para a construção de pK18mobsacB_mqo'_V228D, o método de Montagem de Gibson foi usado.

[0150] Com esse propósito, dois polinucleotídeos ou moléculas de DNA, respectivamente, foram feitos: Um polinucleotídeo denominado mqo'_V228D compreendia a extremidade 5' da sequência codificadora mqo, incluindo a mutação que leva à troca de aminoácido de valina na posição 228 para aspartato (V228D). O segundo polinucleotídeo era o pK18mobsacB plasmidial linearizado por tratamento com endonuclease de restrição Xbal.

[0151] O polinucleotídeo mqo'_V228D foi sintetizado por PCR com o uso de DNA total isolado de uma cultura DM2463 de C. glutamicum como modelo e oligonucleotídeos 1f-mqo-pK18 e 1r-mqo-pK18 como iniciadores (tabela 9) . Os iniciadores também são mostrados na SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:10 da listagem de sequências. Para a PCR, o Kit Phusion foi usado com uma etapa de alongamento (consultar tabela 4, etapa 4) de 30 s.

[0152] Tabela 9: Lista de iniciadores usados e tamanho de amplificado durante PCR com Kit Phusion.

Síntese de amplificado	nome	sequência	tamanho [pb]
mqo'_V228D	1f-mqo- pK18	GGTACCCGGGGATCCTCCCACGCGTCAG TCAAAA	1634
1r-mqo- pK18	GCCTGCAGGTCGACTAGGGTCTTCTGGG TGCGT

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48/95 [0153] A sequência de nucleotídeos do amplificado mqo'_V228D é mostrada na SEQ ID NO:11. Contém a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:7.

[0154] O amplificado mqo'_V228D contém uma sequência de 801 bps de comprimento a montante e uma sequência de 801 bps a jusante da mutação (consultar posição 818 da SEQ ID NO:11 ou posição 802 da SEQ ID NO:7), causando a troca de aminoácido de valina (V) para ácido aspártico (D) na cepa DM2463.

[0155] Em sua extremidade 5' e extremidade 3', é equipada com uma sequência de nucleotídeos, cada uma sobrepondo a sequência correspondente de pK18mobsacB cortado com Xbal.

[0156] As sequências em sobreposição são necessárias para a técnica de montagem de Gibson.

[0157] O pK18mobsacB plasmidial foi linearizado com a endonuclease de restrição Xbal. A mistura de digestão foi controlada subsequentemente por eletroforese capilar, purificada e a concentração de DNA quantificada.

[0158] Para a montagem do plasmídeo pK18mobsacB_mqo'_V228D, os dois polinucleotídeos, isto é, o vetor pK18mobsacB cortado com Xbal e o amplificado mqo'_V228D foram misturados com os ingredientes do Kit de Montagem de Gibson. A mistura de montagem então obtida foi usada para transformar células Stellar™ de E. coli quimicamente competentes.

[0159] Os 22 transformantes resistentes a canamicina foram analisados por PCR em tempo real (consultar tabela 2) com o uso do Kit Type-it e os iniciadores LC-mqo1 e LC-mqo2 para a amplificação de PCR e oligonucleotídeos mqo228_C

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 99/151

49/95 como sonda de aceptor e mqo228_A como sonda de doador para análise de curva de fusão. Os iniciadores mostrados na tabela 10 e sob SEQ ID NO:13 a e as sondas são

SEQ ID NO:16 da listagem de sequências.

[0160]

Tabela 10: Lista de iniciadores e sondas usadas em tempo real.

para PCR

nome	sequência
LC-mqo1	ATGAAGGCACCGACATCAAC
LC-mqo2	TGCAAGGCGATTAAGTTGGG
mqo228_C1	ACGTTCTTGTCGGTCACGAT
mqo228_A2	GAAGTTTGCCTTGATGGTCTTGGTGTCGCCAGTGT

na aceptor identificada com LC-Red640 ¹ sonda de extremidade 5' e fosforilada na extremidade 3' ² sonda de doador identificada com fluoresceína na extremidade 3' [0161]

O DNA plasmidial de três transformantes então caracterizado como contendo a mutação desejada foi isolado e o polinucleotídeo mqo'_V228D criado no plasmídeo durante a montagem de Gibson analisada por sequenciamento de

Sanger. Para análise de sequência, os iniciadores pVW_1.p, pCV22_2.p (tabela 11), LC-mqo1 e LC-mqo2 (tabela 10) foram usados. Esses também são mostrados sob SEQ ID NO:17 e 18 e

SEQ ID NO:13 e 14 da listagem de sequências.

[0162]

Tabela 11:

Lista de iniciadores usados para sequenciamento de Sanger.

análise de	nome	sequência
mqo'_V228D	pVW_1.p	GTGAGCGGATAACAATTTCACAC
pCV22_2.p	TGCAAGGCGATTAAGTTGGG

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 100/151

50/95 [0163] A análise das sequências de nucleotídeo então obtidas mostrou que o polinucleotídeo mqo'_V228D contido no plasmídeo dos três transformantes analisados tinha a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO:11. Um dos ditos transformantes foi denominado Stellar/ pK18mobsacB_mqo'_V228D e armazenado como um estoque de glicerol para demais experimentos.

Exemplo 3

Construção da cepa DM1933_mqo_V228D [0164] O plasmídeo pK18mobsacB_mqo'_V228D obtido no exemplo 2 foi usado para incorporar a mutação (consultar posição 818 da SEQ ID NO:11) que leva à troca de aminoácido V228D (consultar SEQ ID NO:12) no cromossomo do produtor de L-lisina DM1933.

[0165] Células quimicamente competentes de E. coli cepa S17-1 foram transformadas com DNA plasmidial de pK18mobsacB_mqo'_V228D. O método de conjugação modificado de Schãfer et al. (Journal of Bacteriology 172, 1663 1666, 1990) como descrito em materiais e métodos foi usado para transferência conjugada para a cepa DM1933 e para seleção de clones de transconjugante em virtude de sua resistência à sacarose e fenótipo de sensibilidade à canamicina.

[0166] Os clones transconjugantes foram analisados por PCR em tempo real com o uso do Kit Type-it e os iniciadores LC-mqo1 e LC-mqo2 para amplificação de PCR e mqo228_C como sonda de aceptor e mqo228_A como sonda de doador para análise de curva de fusão (tabela 10).

[0167] Um dos clones de transconjugante então caracterizado foi denominado DM1933_mqo_V228D. A cultura de

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 101/151

51/95 estoque de glicerol do clone de transconjugante foi preparada e usada como material de partida para investigações adicionais.

[0168] A sequência de nucleotídeos da região cromossômica da cepa DM1933_mqo_V228D contendo a sequência de nucleotídeos que sofreu mutação foi analisada por sequenciamento de Sanger.

[0169] Para esse propósito, um amplificado de PCR foi produzido estendendo o sítio de mutação. Uma PCR de colônia foi feita com o uso dos iniciadores mqo-E1 e mqo-oP1 (consultar tabela 12) e o Kit NEB Phusion com um tempo de alongamento de 45 s (tabela 1, etapa 4). O amplificado obtido foi, então, sequenciado com o uso dos iniciadores LC-mqo1 e LC-mqo2 (consultar tabela 10) . As sequências de nucleotídeos dos iniciadores usados nesse contexto também são mostradas na SEQ ID NO:19 e 20.

[0170] Tabela 12: Lista de iniciadores usados para PCR de colônia.

amplificação/detecção de	nome	sequência	tamanho [pb]
mqo_V228D	mqo- E1	GCCTTCAACTGTGTCAGTT C	1648
mqo- oP1	GAGGATCCGCAGAGAACTC GCGGAGATA

[0171] A sequência de nucleotídeos obtida é mostrada na SEQ ID NO:21. O resultado mostrou que a cepa DM1933_mqo_V228D continha a mutação desejada, ou a sequência de nucleotídeos que sofreu mutação desejada, respectivamente, em seu cromossomo.

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 102/151

52/95 [0172] Então, o gene mqo da cepa DM1933 foi submetido à mutação com o efeito de que o aminoácido valina na posição 228 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo Mqo codificado foi substituído por ácido aspártico.

Exemplo 4 [0173] Produção de L-lisina pela cepa DM1933_mqo_V228D [0174] As cepas DM1933 (referência) e DM1933_mqo_V228D obtidas no exemplo 3 foram analisadas quanto à sua habilidade de produzir L-lisina de glicose por cultivo de batelada com o uso de sistema de cultivo de acordo com Wouter Duetz.

[0175] Como meio, CGXII contendo 20 g/l de glicose como fonte de carbono foi usado. As culturas foram incubadas por cerca de 45 h até o consumo completo de glicose como confirmado por análise de glicose com o uso de medidor de glicose no sangue e as concentrações de L-lisina e a densidade óptica OD660 foram determinadas. O resultado do experimento é apresentado na tabela 14.

[0176] Tabela 14: Produção de L-lisina pela cepa

DM1933_mqo_V228D.

cepa	L-lisina1 (g/l)	OD6 6 0
DM1933	3,9	8,3
DM19 3 3_mqo_V2 2 8D	4,3	8,0

¹ como L-lisina x HCl [0177] O experimento mostra que a produção de L-lisina foi aumentada na cepa DM1933_mqo_V228D em comparação à cepa principal DM1933.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Evonik Degussa GmbH <120> Método para a produção fermentativa de L-lisina

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 103/151

53/95 <130> número de depósito: 201700371 <160> 22 <170> PatentIn versão 3.5 <210> 1 <211> 3503 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(3503) <223> sequência de nucleotídeos que compreende locus_tag NCgl1926 revelada no número de acesso GenBank NC 003450 <220>

<221> misc_feature <222> (781)..(781) <223> nucleobase adenina <220>

<221> CDS <222> (1001)..(2500) <220>

<221> misc_feature <222> (1682) . . (1684) <223> códon gtc para valina na posição 228 <220>

<221> misc_feature <222> (1683)..(1683) <223> nucleobase timina <220>

<221> miscfeature

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 104/151

54/95 <222> (2228)..(2230) <223> códon ttc para fenilalanina na posição 410 <220>

<221> misc_feature <222> (2230)..(2230) <223> nucleobase citosina <220>

<221> misc_feature <222> (2501)..(2503) <223> códon de parada <400> 1 tccgtatgct cctcaccata actgttgagg ggacatccac gtgggtggaa agaggtgtag gccgtacaca gtccgtcatg attgtctggg gccgagctcg catctgattc aaatgttcac aactttgcaa atcccgtgct gtgtacccac tatggccaac tgttcggcag cccaaacctc ggggtgatca accagcgctg agaggaacga gagatgacct tgccactgct gcaaaaccgg ccgtgaaccc ttgtagcgca atggtgaggt atacgtataa gtggtgaaac attgggggag tgtttattca gctttcttgt acttgcattc agaactcgcg cgcctgggat gcttgatgaa gaatcttctc tgagtccacc cggcagcagc gtcctggacg cattgtggaa acagcaacgc caaccgttgt tttggtagcc cgataggtcg ttccgcgata ggggtagcgc gctcgaggtg aagaaacaag gggtgctggc gagataaaag gatggttgtg cagtggtgga aatggcagct agtggaatgg tgttaagtca gtaggagcgt aaactccgcg tgggcgggca cacaacatct ctctcccagg attgttggtg ctactcatgt gggggaggaa gcaggcgtac aagggtaacg gatcatttat gaagttgaac ggggagcgtt tacatcatgt ggattgcttg gcgacgggga gggaagtaat ccacattttc aattcagtgt gcaaaagact gtttcattat aagtctggtt tggtgtgcgc ttgcgaattg ttcgcatgag actctatatt ccccacgcgt gagatgacgc atg tca gat

Met Ser Asp 1 gta gtt ctc aag aac gca ccg agg att acc gat gag gca gat tgcccaacac ccagccacgg tgcgcatctg ctagctcagg gggcaagatc taagatcaat ggaagaagta cgtccgcgtg ccgggtcgtc tccactgctg gagtcgactg cacatttact aaaggggaat cacggacaat cagtcaaaaa cttgtgttgg tcc ccg

Ser Pro att ggt

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1015

1063

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 105/151

55/95

Lys

Asn

Ala

Pro

Arg 10

Ile

Thr

Asp Glu

Ala 15

Asp

Val

Val

Leu

Ile 20

Gly

gcc

ggt

atc

atg

agc

tcc

acg

ctg

ggt

gca

atg

ctg

cgt

cag

ctg

gag

1111

Ala

Gly

Ile

Met

Ser

Ser

Thr

Leu

Gly

Ala

Met

Leu

Arg

Gln

Leu

Glu

25

30

35

cca

agc

tgg

act

cag

atc

gtc

ttc

gag

cgt

ttg

gat

gga

ccg

gca

caa

1159

Pro

Ser

Trp

Thr

Gln

Ile

Val

Phe

Glu

Arg

Leu

Asp

Gly

Pro

Ala

Gln

40

45

50

gag

tcg

tcc

tcc

ccg

tgg

aac

aat

gca

gga

acc

ggc

cac

tct

gct

cta

1207

Glu

Ser

Ser

Ser

Pro

Trp

Asn

Asn

Ala

Gly

Thr

Gly

His

Ser

Ala

Leu

55

60

65

tgc

gag

ctg

aac

tac

acc

cca

gag

gtt

aag

ggc

aag

gtt

gaa

att

gcc

1255

Cys

Glu

Leu

Asn

Tyr

Thr

Pro

Glu

Val

Lys

Gly

Lys

Val

Glu

Ile

Ala

70

75

80

85

aag

gct

gta

gga

atc

aac

gag

aag

ttc

cag

gtt

tcc

cgt

cag

ttc

tgg

1303

Lys

Ala

Val

Gly

Ile

Asn

Glu

Lys

Phe

Gln

Val

Ser

Arg

Gln

Phe

Trp

90

95

100

tct

cac

ctc

gtt

gaa

gag

gga

gtg

ctg

tct

gat

cct

aag

gaa

ttc

atc

1351

Ser

His

Leu

Val

Glu

Glu

Gly

Val

Leu

Ser

Asp

Pro

Lys

Glu

Phe

Ile

105

110

115

aac

cct

gtt

cct

cac

gta

tct

ttc

ggc

cag

ggc

gca

gat

cag

gtt

gca

1399

Asn

Pro

Val

Pro

His

Val

Ser

Phe

Gly

Gln

Gly

Ala

Asp

Gln

Val

Ala

120

125

130

tac

atc

aag

gct

cgc

tac

gaa

gct

ttg

aag

gat

cac

cca

ctc

ttc

cag

1447

Tyr

Ile

Lys

Ala

Arg

Tyr

Glu

Ala

Leu

Lys

Asp

His

Pro

Leu

Phe

Gln

135

140

145

ggc

atg

acc

tac

gct

gac

gat

gaa

gct

acc

ttc

acc

gag

aag

ctg

cct

1495

Gly

Met

Thr

Tyr

Ala

Asp

Asp

Glu

Ala

Thr

Phe

Thr

Glu

Lys

Leu

Pro

150

155

160

165

ttg

atg

gca

aag

ggc

cgt

gac

ttc

tct

gat

cca

gta

gca

atc

tct

tgg

1543

Leu

Met

Ala

Lys

Gly

Arg

Asp

Phe

Ser

Asp

Pro

Val

Ala

Ile

Ser

Trp

170

175

180

atc

gat

gaa

ggc

acc

gac

atc

aac

tac

ggt

gct

cag

acc

aag

cag

tac

1591

Ile

Asp

Glu

Gly

Thr

Asp

Ile

Asn

Tyr

Gly

Ala

Gln

Thr

Lys

Gln

Tyr

185

190

195

ctg

gat

gca

gct

gaa

gtt

gaa

ggc

act

gaa

atc

cgc

tat

ggc

cac

gaa

1639

Leu

Asp

Ala

Ala

Glu

Val

Glu

Gly

Thr

Glu

Ile

Arg

Tyr

Gly

His

Glu

200

205

210

gtc

aag

agc

atc

aag

gct

gat

ggc

gca

aag

tgg

atc

gtg

acc

gtc

aag

1687

Val

Lys

Ser

Ile

Lys

Ala

Asp

Gly

Ala

Lys

Trp

Ile

Val

Thr

Val

Lys

215

220

225

aac

gta

cac

act

ggc

gac

acc

aag

acc

atc

aag

gca

aac

ttc

gtg

ttc

1735

Asn

Val

His

Thr

Gly

Asp

Thr

Lys

Thr

Ile

Lys

Ala

Asn

Phe

Val

Phe

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 106/151

56/95

230 gtc

Val cca

Pro cgt

Arg gg^c

Gly acc

Thr

310 ggc Gly aag

Lys cag Gln cag

Gln aac

Asn

390 aag

Lys ttg

Leu cct

Pro tgc

Cys

235

240

245

ggc Gly

gca Ala

ggc Gly

gga Gly 250

tac Tyr

gca Ala

ctg Leu

gat Asp

ctg Leu 255

ctt Leu

cgc Arg

agc Ser

gca Ala

ggc Gly 260

atc Ile

cag

gtc

aag

ggc

ttc

gct

gga

ttc

cca

gta

tcc

ggc

ctg

tgg

ctt

Gln

Val

Lys

Gly

Phe

Ala

Gly

Phe

Pro

Val

Ser

Gly

Leu

Trp

Leu

265

270

275

tgc

acc

aac

gag

gaa

ctg

atc

gag

cag

cac

gca

gcc

aag

gta

tat

Cys

Thr

Asn

Glu

Glu

Leu

Ile

Glu

Gln

His

Ala

Ala

Lys

Val

Tyr

280

285

290

aag

gca

tct

gtt

ggc

gct

cct

cca

atg

tct

gtt

cct

cac

ctt

gac

Lys

Ala

Ser

Val

Gly

Ala

Pro

Pro

Met

Ser

Val

Pro

His

Leu

Asp

295

300

305

cgc

gtt

atc

gag

ggt

gaa

aag

ggt

ctg

ctc

ttt

gga

cct

tac

ggt

Arg

Val

Ile

Glu

Gly

Glu

Lys

Gly

Leu

Leu

Phe

Gly

Pro

Tyr

Gly

315

320

325

tgg

acc

cct

aag

ttc

ttg

aag

gaa

ggc

tcc

tac

ctg

gac

ctg

ttc

Trp

Thr

Pro

Lys

Phe

Leu

Lys

Glu

Gly

Ser

Tyr

Leu

Asp

Leu

Phe

330

335

340

tcc

atc

cgc

cca

gac

aac

att

cct

tcc

tac

ctt

ggc

gtt

gct

gct

Ser

Ile

Arg

Pro

Asp

Asn

Ile

Pro

Ser

Tyr

Leu

Gly

Val

Ala

Ala

345

350

355

gaa

ttt

gat

ctg

acc

aag

tac

ctt

gtc

act

gaa

gtt

ctc

aag

gac

Glu

Phe

Asp

Leu

Thr

Lys

Tyr

Leu

Val

Thr

Glu

Val

Leu

Lys

Asp

360

365

370

gac

aag

cgt

atg

gat

gct

ctt

cgc

gag

tac

atg

cca

gag

gca

caa

Asp

Lys

Arg

Met

Asp

Ala

Leu

Arg

Glu

Tyr

Met

Pro

Glu

Ala

Gln

375

380

385

ggc

gat

tgg

gag

acc

atc

gtt

gcc

gga

cag

cgt

gtt

cag

gtt

att

Gly

Asp

Trp

Glu

Thr

Ile

Val

Ala

Gly

Gln

Arg

Val

Gln

Val

Ile

395

400

405

cct

gca

gga

ttc

cct

aag

ttc

ggt

tcc

ctg

gaa

ttc

ggc

acc

acc

Pro

Ala

Gly

Phe

Pro

Lys

Phe

Gly

Ser

Leu

Glu

Phe

Gly

Thr

Thr

410

415

420

atc

aac

aac

tcc

gaa

ggc

acc

atc

gcc

gga

ttg

ctc

ggt

gct

tcc

Ile

Asn

Asn

Ser

Glu

Gly

Thr

Ile

Ala

Gly

Leu

Leu

Gly

Ala

Ser

425

430

435

gga

gca

tcc

atc

gca

cct

tcc

gca

atg

atc

gag

ctg

ctt

gag

cgt

Gly

Ala

Ser

Ile

Ala

Pro

Ser

Ala

Met

Ile

Glu

Leu

Leu

Glu

Arg

440

445

450

ttc

ggt

gac

cgc

atg

atc

gag

tgg

ggc

gac

aag

ctg

aag

gac

atg

Phe

Gly

Asp

Arg

Met

Ile

Glu

Trp

Gly

Asp

Lys

Leu

Lys

Asp

Met

455

460

465

1783

1831

1879

1927

1975

2023

2071

2119

2167

2215

2263

2311

2359

2407

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 107/151

57/95 atc cct tcc tac ggc aag aag ctt gct tcc gag cca gca ctg ttt gag 2455

Ile Pro Ser Tyr Gly Lys Lys Leu Ala Ser Glu Pro Ala Leu Phe Glu

470 475 480 485 cag cag tgg gca cgc acc cag aag acc ctg aag ctt gag gaa gcc 2500

Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys Leu Glu Glu Ala

	490		495		500
taaatcttct	aactgctttc	tttaaagcac	ccgcacatgt	ctgttgaggt	ttcacctgcg	2560
gagacaatct	ccgccttcat	gggttggaac	tgacacagtt	gaaggcatgt	cgggtgcttt	2620
gcgtattctt	tgccagtgtg	atttaggcga	caccaataat	ttattgggta	tccaccaatt	2680
accgctgtga	gcactgcaaa	ttacgtattc	gaaaagccat	gtccaccacg	tgttctatcc	2740
tggcggcatg	caaaaaatca	ccccaaacat	ctggtgccaa	ggcaccgcag	acgaagcagc	2800
cgaattctac	gtcaatgcgt	tttctgagtt	tccgggtggc	gcagaagtac	tcaccacagt	2860
taagtatccc	gaagctggct	tgctggactt	ccaggagcct	ttcgcaggaa	aaaccttgac	2920
ggtggaactc	gctatctcag	gctttaagat	catcttgatc	aatgctggtg	aagagttcac	2980
tcccaaccca	tcgatcagct	tcatggtgaa	ttttgatgcg	gtgcgtgatg	aaaatgccaa	3040
agagcacctt	gatgcggtgt	gggaaaaact	ccatgaaggc	ggcagcacac	tgatgccagt	3100
cgatacttac	ccattttcgg	aatactacgg	gtgggtacaa	gacaaatatg	gtgtgagctg	3160
gcaattgatg	ctcagccgcc	cagaagaaaa	gccaggtccc	gcagtaatcc	caacgctctt	3220
atttggtggg	gcagctcaaa	atcaggcagg	cccagctcaa	gaaaactacg	ttgaggtgtt	3280
cccgaactcc	caacttggtg	atcgtgcacc	ttatggacag	caaacaggtc	ctgccactcc	3340
tgaggccctc	atgttttccc	agttccaact	cgacggtcag	tggattttcg	cgatggattc	3400
cggagttgag	caagatttca	ccttcagtga	gggtgtctca	ttgatgtatg	aagctcatgg	3460
tcaagaagaa	ctcgatgcca	tctggaatgc	actctcggca	gtt		3503
<210> 2
<211> 500
<212> PRT
<213> Corynebacterium	glutamicum	ATCC13032

<400> 2

Met

Ser

Asp

Ser

Pro Lys

Asn

Ala

Pro

Arg

Ile

Thr

Asp

Glu

Ala

Asp

1

5

10

15

Val

Val

Leu

Ile

Gly Ala

Gly

Ile

Met

Ser

Ser

Thr

Leu

Gly

Ala

Met

20

25

30

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 108/151

58/95

Leu

Arg

Gln 35

Leu

Glu

Pro

Ser

Trp 40

Thr

Gln

Ile

Val

Phe 45

Glu

Arg

Leu

Asp

Gly

Pro

Ala

Gln

Glu

Ser

Ser

Ser

Pro

Trp

Asn

Asn

Ala

Gly

Thr

50

55

60

Gly

His

Ser

Ala

Leu

Cys

Glu

Leu

Asn

Tyr

Thr

Pro

Glu

Val

Lys

Gly

65

70

75

80

Lys

Val

Glu

Ile

Ala

Lys

Ala

Val

Gly

Ile

Asn

Glu

Lys

Phe

Gln

Val

85

90

95

Ser

Arg

Gln

Phe

Trp

Ser

His

Leu

Val

Glu

Glu

Gly

Val

Leu

Ser

Asp

100

105

110

Pro

Lys

Glu

Phe

Ile

Asn

Pro

Val

Pro

His

Val

Ser

Phe

Gly

Gln

Gly

115

120

125

Ala

Asp

Gln

Val

Ala

Tyr

Ile

Lys

Ala

Arg

Tyr

Glu

Ala

Leu

Lys

Asp

130

135

140

His

Pro

Leu

Phe

Gln

Gly

Met

Thr

Tyr

Ala

Asp

Asp

Glu

Ala

Thr

Phe

145

150

155

160

Thr

Glu

Lys

Leu

Pro

Leu

Met

Ala

Lys

Gly

Arg

Asp

Phe

Ser

Asp

Pro

165

170

175

Val

Ala

Ile

Ser

Trp

Ile

Asp

Glu

Gly

Thr

Asp

Ile

Asn

Tyr

Gly

Ala

180

185

190

Gln

Thr

Lys

Gln

Tyr

Leu

Asp

Ala

Ala

Glu

Val

Glu

Gly

Thr

Glu

Ile

195

200

205

Arg

Tyr

Gly

His

Glu

Val

Lys

Ser

Ile

Lys

Ala

Asp

Gly

Ala

Lys

Trp

210

215

220

Ile

Val

Thr

Val

Lys

Asn

Val

His

Thr

Gly

Asp

Thr

Lys

Thr

Ile

Lys

225

230

235

240

Ala

Asn

Phe

Val

Phe

Val

Gly

Ala

Gly

Gly

Tyr

Ala

Leu

Asp

Leu

Leu

245

250

255

Arg

Ser

Ala

Gly

Ile

Pro

Gln

Val

Lys

Gly

Phe

Ala

Gly

Phe

Pro

Val

260

265

270

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 109/151

59/95

Ser Gly

Leu 275

Trp

Leu

Arg

Cys

Thr 280

Asn

Glu

Glu

Leu

Ile 285

Glu

Gln

His

Ala

Ala

Lys

Val

Tyr

Gly

Lys

Ala

Ser

Val

Gly

Ala

Pro

Pro

Met

Ser

290

295

300

Val

Pro

His

Leu

Asp

Thr

Arg

Val

Ile

Glu

Gly

Glu

Lys

Gly

Leu

Leu

305

310

315

320

Phe

Gly

Pro

Tyr

Gly

Gly

Trp

Thr

Pro

Lys

Phe

Leu

Lys

Glu

Gly

Ser

325

330

335

Tyr

Leu

Asp

Leu

Phe

Lys

Ser

Ile

Arg

Pro

Asp

Asn

Ile

Pro

Ser

Tyr

340

345

350

Leu

Gly

Val

Ala

Ala

Gln

Glu

Phe

Asp

Leu

Thr

Lys

Tyr

Leu

Val

Thr

355

360

365

Glu

Val

Leu

Lys

Asp

Gln

Asp

Lys

Arg

Met

Asp

Ala

Leu

Arg

Glu

Tyr

370

375

380

Met

Pro

Glu

Ala

Gln

Asn

Gly

Asp

Trp

Glu

Thr

Ile

Val

Ala

Gly

Gln

385

390

395

400

Arg

Val

Gln

Val

Ile

Lys

Pro

Ala

Gly

Phe

Pro

Lys

Phe

Gly

Ser

Leu

405

410

415

Glu

Phe

Gly

Thr

Thr

Leu

Ile

Asn

Asn

Ser

Glu

Gly

Thr

Ile

Ala

Gly

420

425

430

Leu

Leu

Gly

Ala

Ser

Pro

Gly

Ala

Ser

Ile

Ala

Pro

Ser

Ala

Met

Ile

435

440

445

Glu

Leu

Leu

Glu

Arg

Cys

Phe

Gly

Asp

Arg

Met

Ile

Glu

Trp

Gly

Asp

450

455

460

Lys

Leu

Lys

Asp

Met

Ile

Pro

Ser

Tyr

Gly

Lys

Lys

Leu

Ala

Ser

Glu

465

470

475

480

Pro

Ala

Leu

Phe

Glu

Gln

Gln

Trp

Ala

Arg

Thr

Gln

Lys

Thr

Leu

Lys

485

490

495

Leu Glu Glu Ala

500

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 110/151

60/95

Met 1

Ser

Asp

Ser

Pro 5

Lys

Asn

Ala

Pro

Arg 10

Ile

Thr

Asp

Glu

Ala 15

Asp

Val

Val

Leu

Ile

Gly

Ala

Gly

Ile

Met

Ser

Ser

Thr

Leu

Gly

Ala

Met

20

25

30

Leu

Arg

Gln

Leu

Glu

Pro

Ser

Trp

Thr

Gln

Ile

Val

Phe

Glu

Arg

Leu

35

40

45

Asp

Gly

Pro

Ala

Gln

Glu

Ser

Ser

Ser

Pro

Trp

Asn

Asn

Ala

Gly

Thr

50

55

60

Gly

His

Ser

Ala

Leu

Cys

Glu

Leu

Asn

Tyr

Thr

Pro

Glu

Val

Lys

Gly

65

70

75

80

Lys

Val

Glu

Ile

Ala

Lys

Ala

Val

Gly

Ile

Asn

Glu

Lys

Phe

Gln

Val

85

90

95

Ser

Arg

Gln

Phe

Trp

Ser

His

Leu

Val

Glu

Glu

Gly

Val

Leu

Ser

Asp

100

105

110

Pro

Lys

Glu

Phe

Ile

Asn

Pro

Val

Pro

His

Val

Ser

Phe

Gly

Gln

Gly

115

120

125

Ala

Asp

Gln

Val

Ala

Tyr

Ile

Lys

Ala

Arg

Tyr

Glu

Ala

Leu

Lys

Asp

130

135

140

His

Pro

Leu

Phe

Gln

Gly

Met

Thr

Tyr

Ala

Asp

Asp

Glu

Ala

Thr

Phe

145

150

155

160

Thr

Glu

Lys

Leu

Pro

Leu

Met

Ala

Lys

Gly

Arg

Asp

Phe

Ser

Asp

Pro

165

170

175

Val

Ala

Ile

Ser

Trp

Ile

Asp

Glu

Gly

Thr

Asp

Ile

Asn

Tyr

Gly

Ala

180

185

190

Gln

Thr

Lys

Gln

Tyr

Leu

Asp

Ala

Ala

Glu

Val

Glu

Gly

Thr

Glu

Ile

195

200

205

Arg

Tyr

Gly

His

Glu

Val

Lys

Ser

Ile

Lys

Ala

Asp

Gly

Ala

Lys

Trp

210

215

220

Ile

Val

Thr

Val

Lys

Asn

Val

His

Thr

Gly

Asp

Thr

Lys

Thr

Ile

Lys

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 111/151

61/95

225

Ala

Arg

Ser

Ala

Val

305

Phe

Tyr

Leu

Glu

Met

385

Arg

Glu

Leu

Glu

230

235

Asn Phe

Ser Ala

Gly Leu

275

Ala Lys

290

Pro His

Gly Pro

Leu Asp

Gly Val

355

Val Leu

370

Pro Glu

Val Gln

Phe Gly

Leu Gly

435

Leu Leu

450

Val Phe

245

Gly Ile

260

Trp Leu

Val Tyr

Leu Asp

Tyr Gly

325

Leu Phe

340

Ala Ala

Lys Asp

Ala Gln

Val Ile

405

Thr Thr

420

Ala Ser

Glu Arg

Val Gly

Ala Gly

Pro Gln

Val Lys

265

Arg Cys

Gly Lys

295

Thr Arg

310

Gly Trp

Lys Ser

Gln Glu

Gln Asp

375

Asn Gly

390

Lys Pro

Leu Ile

Pro Gly

Cys Phe

455

Thr Asn

280

Ala Ser

Val Ile

Thr Pro

Ile Arg

345

Phe Asp

360

Lys Arg

Asp Trp

Ala Gly

Asn Asn

425

Ala Ser

440

Gly

Gly Tyr

250

Gly Phe

Glu Glu

Val Gly

Glu Gly

315

Lys Phe

330

Pro Asp

Leu Thr

Met Asp

Glu Thr

395

Phe Pro

410

Ser Glu

Ile Ala

Asp Arg Met

Ala Leu

Asp Leu

255

Ala Gly

Leu Ile

285

Ala Pro

300

Glu Lys

Leu Lys

Asn Ile

Lys Tyr

365

Ala Leu

380

Ile Val

Lys Phe

Gly Thr

Pro Ser

445

Ile Glu

460

Phe Pro

270

Glu Gln

Pro Met

Gly Leu

Glu Gly

335

Pro Ser

350

Leu Val

Arg Glu

Ala Gly

Gly Ser

415

Ile Ala

430

Ala Met

Trp Gly

240

Leu

Val

His

Ser

Leu

320

Ser

Tyr

Thr

Tyr

Gln

400

Leu

Gly

Ile

Asp

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 112/151

62/95

Lys Leu

465

Lys Asp

Met Ile

470

Pro Ser

Tyr Gly

Pro Ala

Leu Phe

Glu

485

Gln Gln Trp Ala Arg

Lys Lys

475

Thr Gln

Leu Ala

Ser Glu

480

Lys Thr Leu Lys

490

495

Leu Glu Glu Ala

500 <210> 3 <211> 3503 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> misc_feature <222> (781)..(781) <223> nucleobase adenina <220>

<221> CDS <222> (1001)..(2500) <220>

<221> misc_feature <222> (1682)..(1684) <223> códon gac para ácido aspártico na posição 228 <220>

<221> mutação <222> (1683)..(1683) <223> nucleobase adenina <220>

<221> misc_feature <222> (2228)..(2230) <223> códon ttt para fenilalanina na posição 410 <220>

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 113/151

63/95 <221> misc_feature <222> (2230) . . (2230) <223> nucleobase timina <220>

<221> misc_feature <222> (2501)..(2503) <223> códon de parada <400> 3 tccgtatgct cccaaacctc cgcctgggat gatggttgtg ggggagcgtt tgcccaacac60 cctcaccata ggggtgatca gcttgatgaa cagtggtgga tacatcatgt ccagccacgg120 actgttgagg accagcgctg gaatcttctc aatggcagct ggattgcttg tgcgcatctg180 ggacatccac agaggaacga tgagtccacc agtggaatgg gcgacgggga ctagctcagg240 gtgggtggaa gagatgacct cggcagcagc tgttaagtca gggaagtaat gggcaagatc300 agaggtgtag tgccactgct gtcctggacg gtaggagcgt ccacattttc taagatcaat360 gccgtacaca gcaaaaccgg cattgtggaa aaactccgcg aattcagtgt ggaagaagta420 gtccgtcatg ccgtgaaccc acagcaacgc tgggcgggca gcaaaagact cgtccgcgtg480 attgtctggg ttgtagcgca caaccgttgt cacaacatct gtttcattat ccgggtcgtc540 gccgagctcg atggtgaggt tttggtagcc ctctcccagg aagtctggtt tccactgctg600 catctgattc atacgtataa cgataggtcg attgttggtg tggtgtgcgc gagtcgactg660 aaatgttcac gtggtgaaac ttccgcgata ctactcatgt ttgcgaattg cacatttact720 aactttgcaa attgggggag ggggtagcgc gggggaggaa ttcgcatgag aaaggggaat780 atcccgtgct tgtttattca gctcgaggtg gcaggcgtac actctatatt cacggacaat840 gtgtacccac gctttcttgt aagaaacaag aagggtaacg ccccacgcgt cagtcaaaaa900 tatggccaac acttgcattc gggtgctggc gatcatttat gagatgacgc cttgtgttgg960 tgttcggcag agaactcgcg gagataaaag gaagttgaac atg tca gat tcc ccg1015

Met Ser Asp Ser Pro aag aac gca ccg agg att acc gat gag gca gat gta gtt ctc att ggt1063

Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp Val Val Leu IleGly

1520 gcc ggt atc atg agc tcc acg ctg ggt gca atg ctg cgt cag ctg gag1111

Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met Leu Arg Gln Leu Glu

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 114/151

64/95

30 35

cca

agc

tgg

act

cag

atc

gtc

ttc

gag

cgt

ttg

gat

gga

ccg

gca

caa

1159

Pro

Ser

Trp

Thr

Gln

Ile

Val

Phe

Glu

Arg

Leu

Asp

Gly

Pro

Ala

Gln

40

45

50

gag

tcg

tcc

tcc

ccg

tgg

aac

aat

gca

gga

acc

ggc

cac

tct

gct

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1207

Glu

Ser

Ser

Ser

Pro

Trp

Asn

Asn

Ala

Gly

Thr

Gly

His

Ser

Ala

Leu

55

60

65

tgc

gag

ctg

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tac

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cca

gag

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aag

ggc

aag

gtt

gaa

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1255

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Glu

Leu

Asn

Tyr

Thr

Pro

Glu

Val

Lys

Gly

Lys

Val

Glu

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Ala

70

75

80

85

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gct

gta

gga

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gag

aag

ttc

cag

gtt

tcc

cgt

cag

ttc

tgg

1303

Lys

Ala

Val

Gly

Ile

Asn

Glu

Lys

Phe

Gln

Val

Ser

Arg

Gln

Phe

Trp

90

95

100

tct

cac

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gga

gtg

ctg

tct

gat

cct

aag

gaa

ttc

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1351

Ser

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Leu

Val

Glu

Glu

Gly

Val

Leu

Ser

Asp

Pro

Lys

Glu

Phe

Ile

105

110

115

aac

cct

gtt

cct

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tct

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ggc

cag

ggc

gca

gat

cag

gtt

gca

1399

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Pro

Val

Pro

His

Val

Ser

Phe

Gly

Gln

Gly

Ala

Asp

Gln

Val

Ala

120

125

130

tac

atc

aag

gct

cgc

tac

gaa

gct

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aag

gat

cac

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ttc

cag

1447

Tyr

Ile

Lys

Ala

Arg

Tyr

Glu

Ala

Leu

Lys

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Pro

Leu

Phe

Gln

135

140

145

ggc

atg

acc

tac

gct

gac

gat

gaa

gct

acc

ttc

acc

gag

aag

ctg

cct

1495

Gly

Met

Thr

Tyr

Ala

Asp

Asp

Glu

Ala

Thr

Phe

Thr

Glu

Lys

Leu

Pro

150

155

160

165

ttg

atg

gca

aag

ggc

cgt

gac

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tct

gat

cca

gta

gca

atc

tct

tgg

1543

Leu

Met

Ala

Lys

Gly

Arg

Asp

Phe

Ser

Asp

Pro

Val

Ala

Ile

Ser

Trp

170

175

180

atc

gat

gaa

ggc

acc

gac

atc

aac

tac

ggt

gct

cag

acc

aag

cag

tac

1591

Ile

Asp

Glu

Gly

Thr

Asp

Ile

Asn

Tyr

Gly

Ala

Gln

Thr

Lys

Gln

Tyr

185

190

195

ctg

gat

gca

gct

gaa

gtt

gaa

ggc

act

gaa

atc

cgc

tat

ggc

cac

gaa

1639

Leu

Asp

Ala

Ala

Glu

Val

Glu

Gly

Thr

Glu

Ile

Arg

Tyr

Gly

His

Glu

200

205

210

gtc

aag

agc

atc

aag

gct

gat

ggc

gca

aag

tgg

atc

gtg

acc

gac

aag

1687

Val

Lys

Ser

Ile

Lys

Ala

Asp

Gly

Ala

Lys

Trp

Ile

Val

Thr

Asp

Lys

215

220

225

aac

gta

cac

act

ggc

gac

acc

aag

acc

atc

aag

gca

aac

ttc

gtg

ttc

1735

Asn

Val

His

Thr

Gly

Asp

Thr

Lys

Thr

Ile

Lys

Ala

Asn

Phe

Val

Phe

230

235

240

245

gtc

ggc

gca

ggc

gga

tac

gca

ctg

gat

ctg

ctt

cgc

agc

gca

ggc

atc

1783

Val

Gly

Ala

Gly

Gly

Tyr

Ala

Leu

Asp

Leu

Leu

Arg

Ser

Ala

Gly

Ile

250

255

260

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 115/151

65/95

cca Pro

cag Gln

gtc Val

aag Lys 265

ggc Gly

ttc Phe

gct Ala

gga Gly

ttc Phe 270

cca Pro

gta Val

tcc Ser

ggc Gly

ctg Leu 275

tgg Trp

ctt Leu

1831

cgt

tgc

acc

aac

gag

gaa

ctg

atc

gag

cag

cac

gca

gcc

aag

gta

tat

1879

Arg

Cys

Thr

Asn

Glu

Glu

Leu

Ile

Glu

Gln

His

Ala

Ala

Lys

Val

Tyr

280

285

290

ggc

aag

gca

tct

gtt

ggc

gct

cct

cca

atg

tct

gtt

cct

cac

ctt

gac

1927

Gly

Lys

Ala

Ser

Val

Gly

Ala

Pro

Pro

Met

Ser

Val

Pro

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Leu

Asp

295

300

305

acc

cgc

gtt

atc

gag

ggt

gaa

aag

ggt

ctg

ctc

ttt

gga

cct

tac

ggt

1975

Thr

Arg

Val

Ile

Glu

Gly

Glu

Lys

Gly

Leu

Leu

Phe

Gly

Pro

Tyr

Gly

310

315

320

325

ggc

tgg

acc

cct

aag

ttc

ttg

aag

gaa

ggc

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tac

ctg

gac

ctg

ttc

2023

Gly

Trp

Thr

Pro

Lys

Phe

Leu

Lys

Glu

Gly

Ser

Tyr

Leu

Asp

Leu

Phe

330

335

340

aag

tcc

atc

cgc

cca

gac

aac

att

cct

tcc

tac

ctt

ggc

gtt

gct

gct

2071

Lys

Ser

Ile

Arg

Pro

Asp

Asn

Ile

Pro

Ser

Tyr

Leu

Gly

Val

Ala

Ala

345

350

355

cag

gaa

ttt

gat

ctg

acc

aag

tac

ctt

gtc

act

gaa

gtt

ctc

aag

gac

2119

Gln

Glu

Phe

Asp

Leu

Thr

Lys

Tyr

Leu

Val

Thr

Glu

Val

Leu

Lys

Asp

360

365

370

cag

gac

aag

cgt

atg

gat

gct

ctt

cgc

gag

tac

atg

cca

gag

gca

caa

2167

Gln

Asp

Lys

Arg

Met

Asp

Ala

Leu

Arg

Glu

Tyr

Met

Pro

Glu

Ala

Gln

375

380

385

aac

ggc

gat

tgg

gag

acc

atc

gtt

gcc

gga

cag

cgt

gtt

cag

gtt

att

2215

Asn

Gly

Asp

Trp

Glu

Thr

Ile

Val

Ala

Gly

Gln

Arg

Val

Gln

Val

Ile

390

395

400

405

aag

cct

gca

gga

ttt

cct

aag

ttc

ggt

tcc

ctg

gaa

ttc

ggc

acc

acc

2263

Lys

Pro

Ala

Gly

Phe

Pro

Lys

Phe

Gly

Ser

Leu

Glu

Phe

Gly

Thr

Thr

410

415

420

ttg

atc

aac

aac

tcc

gaa

ggc

acc

atc

gcc

gga

ttg

ctc

ggt

gct

tcc

2311

Leu

Ile

Asn

Asn

Ser

Glu

Gly

Thr

Ile

Ala

Gly

Leu

Leu

Gly

Ala

Ser

425

430

435

cct

gga

gca

tcc

atc

gca

cct

tcc

gca

atg

atc

gag

ctg

ctt

gag

cgt

2359

Pro

Gly

Ala

Ser

Ile

Ala

Pro

Ser

Ala

Met

Ile

Glu

Leu

Leu

Glu

Arg

440

445

450

tgc

ttc

ggt

gac

cgc

atg

atc

gag

tgg

ggc

gac

aag

ctg

aag

gac

atg

2407

Cys

Phe

Gly

Asp

Arg

Met

Ile

Glu

Trp

Gly

Asp

Lys

Leu

Lys

Asp

Met

455

460

465

atc

cct

tcc

tac

ggc

aag

aag

ctt

gct

tcc

gag

cca

gca

ctg

ttt

gag

2455

Ile

Pro

Ser

Tyr

Gly

Lys

Lys

Leu

Ala

Ser

Glu

Pro

Ala

Leu

Phe

Glu

470

475

480

485

cag

cag

tgg

gca

cgc

acc

cag

aag

acc

ctg

aag

ctt

gag

gaa

gcc

2500

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 116/151

66/95

Gln Gln Trp Ala Arg Thr Gln Lys Thr Leu Lys Leu Glu Glu Ala

	490		495		500
taaatcttct	aactgctttc	tttaaagcac	ccgcacatgt	ctgttgaggt	ttcacctgcg	2560
gagacaatct	ccgccttcat	gggttggaac	tgacacagtt	gaaggcatgt	cgggtgcttt	2620
gcgtattctt	tgccagtgtg	atttaggcga	caccaataat	ttattgggta	tccaccaatt	2680
accgctgtga	gcactgcaaa	ttacgtattc	gaaaagccat	gtccaccacg	tgttctatcc	2740
tggcggcatg	caaaaaatca	ccccaaacat	ctggtgccaa	ggcaccgcag	acgaagcagc	2800
cgaattctac	gtcaatgcgt	tttctgagtt	tccgggtggc	gcagaagtac	tcaccacagt	2860
taagtatccc	gaagctggct	tgctggactt	ccaggagcct	ttcgcaggaa	aaaccttgac	2920
ggtggaactc	gctatctcag	gctttaagat	catcttgatc	aatgctggtg	aagagttcac	2980
tcccaaccca	tcgatcagct	tcatggtgaa	ttttgatgcg	gtgcgtgatg	aaaatgccaa	3040
agagcacctt	gatgcggtgt	gggaaaaact	ccatgaaggc	ggcagcacac	tgatgccagt	3100
cgatacttac	ccattttcgg	aatactacgg	gtgggtacaa	gacaaatatg	gtgtgagctg	3160
gcaattgatg	ctcagccgcc	cagaagaaaa	gccaggtccc	gcagtaatcc	caacgctctt	3220
atttggtggg	gcagctcaaa	atcaggcagg	cccagctcaa	gaaaactacg	ttgaggtgtt	3280
cccgaactcc	caacttggtg	atcgtgcacc	ttatggacag	caaacaggtc	ctgccactcc	3340
tgaggccctc	atgttttccc	agttccaact	cgacggtcag	tggattttcg	cgatggattc	3400
cggagttgag	caagatttca	ccttcagtga	gggtgtctca	ttgatgtatg	aagctcatgg	3460
tcaagaagaa	ctcgatgcca	tctggaatgc	actctcggca	gtt		3503

<210> 4 <211> 500 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4

Met 1

Ser

Asp

Ser

Pro 5

Lys

Asn

Ala

Pro Arg 10

Ile

Thr

Asp

Glu

Ala 15

Asp

Val

Val

Leu

Ile

Gly

Ala

Gly

Ile

Met

Ser

Ser

Thr

Leu

Gly

Ala

Met

20

25

30

Leu

Arg

Gln

Leu

Glu

Pro

Ser

Trp

Thr

Gln

Ile

Val

Phe

Glu

Arg

Leu

35

40

45

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 117/151

67/95

Asp	Gly 50	Pro	Ala	Gln	Glu	Ser 55	Ser	Ser
Gly 65	His	Ser	Ala	Leu	Cys 70	Glu	Leu	Asn
Lys	Val	Glu	Ile	Ala 85	Lys	Ala	Val	Gly
Ser	Arg	Gln	Phe 100	Trp	Ser	His	Leu	Val 105
Pro	Lys	Glu 115	Phe	Ile	Asn	Pro	Val 120	Pro
Ala	Asp 130	Gln	Val	Ala	Tyr	Ile 135	Lys	Ala
His 145	Pro	Leu	Phe	Gln	Gly 150	Met	Thr	Tyr
Thr	Glu	Lys	Leu	Pro 165	Leu	Met	Ala	Lys
Val	Ala	Ile	Ser 180	Trp	Ile	Asp	Glu	Gly 185
Gln	Thr	Lys 195	Gln	Tyr	Leu	Asp	Ala 200	Ala
Arg	Tyr 210	Gly	His	Glu	Val	Lys 215	Ser	Ile
Ile 225	Val	Thr	Asp	Lys	Asn 230	Val	His	Thr
Ala	Asn	Phe	Val	Phe 245	Val	Gly	Ala	Gly
Arg	Ser	Ala	Gly 260	Ile	Pro	Gln	Val	Lys 265

Trp	Asn 60	Asn	Ala	Gly	Thr
Thr 75	Pro	Glu	Val	Lys	Gly 80
Asn	Glu	Lys	Phe	Gln 95	Val
Glu	Gly	Val	Leu 110	Ser	Asp
Val	Ser	Phe 125	Gly	Gln	Gly
Tyr	Glu 140	Ala	Leu	Lys	Asp
Asp 155	Asp	Glu	Ala	Thr	Phe 160
Arg	Asp	Phe	Ser	Asp 175	Pro
Asp	Ile	Asn	Tyr 190	Gly	Ala
Val	Glu	Gly 205	Thr	Glu	Ile
Ala	Asp 220	Gly	Ala	Lys	Trp
Asp 235	Thr	Lys	Thr	Ile	Lys 240
Tyr	Ala	Leu	Asp	Leu 255	Leu
Phe	Ala	Gly	Phe 270	Pro	Val

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 118/151

68/95

Ser

Ala

Val

305

Phe

Tyr

Leu

Glu

Met

385

Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

465

Pro

Leu

Gly Leu

Trp

Leu

Arg

Cys

Thr Asn 280

Glu

Glu

Leu

Ile 285

Glu

Gln

His

275

Ala

Lys

Val

Tyr

Gly

Lys

Ala

Ser

Val

Gly

Ala

Pro

Pro

Met

Ser

290

295

300

Pro

His

Leu

Asp

Thr

Arg

Val

Ile

Glu

Gly

Glu

Lys

Gly

Leu

Leu

310

315

320

Gly

Pro

Tyr

Gly

Gly

Trp

Thr

Pro

Lys

Phe

Leu

Lys

Glu

Gly

Ser

325

330

335

Leu

Asp

Leu

Phe

Lys

Ser

Ile

Arg

Pro

Asp

Asn

Ile

Pro

Ser

Tyr

340

345

350

Gly

Val

Ala

Ala

Gln

Glu

Phe

Asp

Leu

Thr

Lys

Tyr

Leu

Val

Thr

355

360

365

Val

Leu

Lys

Asp

Gln

Asp

Lys

Arg

Met

Asp

Ala

Leu

Arg

Glu

Tyr

370

375

380

Pro

Glu

Ala

Gln

Asn

Gly

Asp

Trp

Glu

Thr

Ile

Val

Ala

Gly

Gln

390

395

400

Val

Gln

Val

Ile

Lys

Pro

Ala

Gly

Phe

Pro

Lys

Phe

Gly

Ser

Leu

405

410

415

Phe

Gly

Thr

Thr

Leu

Ile

Asn

Asn

Ser

Glu

Gly

Thr

Ile

Ala

Gly

420

425

430

Leu

Gly

Ala

Ser

Pro

Gly

Ala

Ser

Ile

Ala

Pro

Ser

Ala

Met

Ile

435

440

445

Leu

Leu

Glu

Arg

Cys

Phe

Gly

Asp

Arg

Met

Ile

Glu

Trp

Gly

Asp

450

455

460

Leu

Lys

Asp

Met

Ile

Pro

Ser

Tyr

Gly

Lys

Lys

Leu

Ala

Ser

Glu

470

475

480

Ala

Leu

Phe

Glu

Gln

Gln

Trp

Ala

Arg

Thr

Gln

Lys

Thr

Leu

Lys

485

490

495

Glu Glu Ala

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 119/151

69/95

500 <210> 5 <211> 1266 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <220>

<221> CDS <222> (1)..(1263) <400> 5 gtg gcc

Met Ala gaa cgc

Glu Arg ctg gtc

Leu Val gga aat

Gly Asn gaa ctt

Glu Leu gaa atg

Glu Met gtc gcc

Val Ala att aga

Ile Arg gat gtc

Asp Val cta gaa Leu Glu gat atg

Asp Met atg gct

Met Ala ggc tct

Gly Ser att gtt

Ile Val aag atc

Lys Ile

130 gat gtc Asp Val

145 cag gct

Gln Ala

100 gat gtc Asp Val

115 tgc att Cys Ile acc acg Thr Thr gta cag

Val Gln aac gtc Asn Val gtg gtt

Val Val ctt gca

Leu Ala ctc ctg

Leu Leu att gag

Ile Glu ggt gtg Gly Val act cca

Thr Pro gtt gct

Val Ala ttg ggt

Leu Gly

150 aaa tat

Lys Tyr gct gaa

Ala Glu gtc tgc

Val Cys gcg gca

Ala Ala act gct Thr Ala ggc ggt Gly Gly cgg atc Arg Ile 25 tcc gca Ser Ala gtg aat

Val Asn ggt gag Gly Glu tcc ctt

Ser Leu ctc acc

Leu Thr ggt cgt

Gly Arg

120 ggt ttc

Gly Phe

135 cgt ggt Arg Gly ggc gca

Gly Ala acc gag

Thr Glu

105 gtg cgt Val Arg cag ggt

Gln Gly ggt tct

Gly Ser tcc tcg

Ser Ser ctt gag

Leu Glu gtt gcc

Val Ala atg gga

Met Gly ccc gtt

Pro Val cgt att Arg Ile gaa gcc Glu Ala cgc cac

Arg His gaa gca

Glu Ala gtt aat

Val Asn

0 gac acc Asp Thr

155 acc aag

Thr Lys gac acc

Asp Thr ccg cca

Pro Pro agt gcg

Ser Ala aag gct

Lys Ala acg gat

Thr Asp gct cgt

Ala Arg

144

192 tct aac

Ser Asn caa tct

Gln Ser gga aac

Gly Asn

110 ctc gat

Leu Asp

125 aaa gaa Lys Glu act gca

Thr Ala gct ctc

Ala Leu ttc acg

Phe Thr gca cgc Ala Arg gag ggc

Glu Gly acc cgc

Thr Arg gtt gcg

Val Ala

160

240

288

336

384

432

480

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 120/151

70/95

ttg Leu

gca Ala

gct Ala

gct Ala

ttg Leu 165

aac Asn

gct Ala

gat Asp

gtg Val

tgt Cys 170

gag Glu

att Ile

tac Tyr

tcg Ser

gac Asp 175

gtt Val

528

gac

ggt

gtg

tat

acc

gct

gac

ccg

cgc

atc

gtt

cct

aat

gca

cag

aag

576

Asp

Gly

Val

Tyr

Thr

Ala

Asp

Pro

Arg

Ile

Val

Pro

Asn

Ala

Gln

Lys

180

185

190

ctg

gaa

aag

ctc

agc

ttc

gaa

gaa

atg

ctg

gaa

ctt

gct

gct

gtt

ggc

624

Leu

Glu

Lys

Leu

Ser

Phe

Glu

Glu

Met

Leu

Glu

Leu

Ala

Ala

Val

Gly

195

200

205

tcc

aag

att

ttg

gtg

ctg

cgc

agt

gtt

gaa

tac

gct

cgt

gca

ttc

aat

672

Ser

Lys

Ile

Leu

Val

Leu

Arg

Ser

Val

Glu

Tyr

Ala

Arg

Ala

Phe

Asn

210

215

220

gtg

cca

ctt

cgc

gta

cgc

tcg

tct

tat

agt

aat

gat

ccc

ggc

act

ttg

720

Val

Pro

Leu

Arg

Val

Arg

Ser

Ser

Tyr

Ser

Asn

Asp

Pro

Gly

Thr

Leu

225

230

235

240

att

gcc

ggc

tct

atg

gag

gat

att

cct

gtg

gaa

gaa

gca

gtc

ctt

acc

768

Ile

Ala

Gly

Ser

Met

Glu

Asp

Ile

Pro

Val

Glu

Glu

Ala

Val

Leu

Thr

245

250

255

ggt

gtc

gca

acc

gac

aag

tcc

gaa

gcc

aaa

gta

acc

gtt

ctg

ggt

att

816

Gly

Val

Ala

Thr

Asp

Lys

Ser

Glu

Ala

Lys

Val

Thr

Val

Leu

Gly

Ile

260

265

270

tcc

gat

aag

cca

ggc

gag

gct

gcg

aag

gtt

ttc

cgt

gcg

ttg

gct

gat

864

Ser

Asp

Lys

Pro

Gly

Glu

Ala

Ala

Lys

Val

Phe

Arg

Ala

Leu

Ala

Asp

275

280

285

gca

gaa

atc

aac

att

gac

atg

gtt

ctg

cag

aac

gtc

tct

tct

gta

gaa

912

Ala

Glu

Ile

Asn

Ile

Asp

Met

Val

Leu

Gln

Asn

Val

Ser

Ser

Val

Glu

290

295

300

gac

ggc

acc

acc

gac

atc

acc

ttc

acc

tgc

cct

cgt

tcc

gac

ggc

cgc

960

Asp

Gly

Thr

Thr

Asp

Ile

Thr

Phe

Thr

Cys

Pro

Arg

Ser

Asp

Gly

Arg

305

310

315

320

cgc

gcg

atg

gag

atc

ttg

aag

aag

ctt

cag

gtt

cag

ggc

aac

tgg

acc

1008

Arg

Ala

Met

Glu

Ile

Leu

Lys

Lys

Leu

Gln

Val

Gln

Gly

Asn

Trp

Thr

325

330

335

aat

gtg

ctt

tac

gac

gac

cag

gtc

ggc

aaa

gtc

tcc

ctc

gtg

ggt

gct

1056

Asn

Val

Leu

Tyr

Asp

Asp

Gln

Val

Gly

Lys

Val

Ser

Leu

Val

Gly

Ala

340

345

350

ggc

atg

aag

tct

cac

cca

ggt

gtt

acc

gca

gag

ttc

atg

gaa

gct

ctg

1104

Gly

Met

Lys

Ser

His

Pro

Gly

Val

Thr

Ala

Glu

Phe

Met

Glu

Ala

Leu

355

360

365

cgc

gat

gtc

aac

gtg

aac

atc

gaa

ttg

att

tcc

acc

tct

gag

att

cgt

1152

Arg

Asp

Val

Asn

Val

Asn

Ile

Glu

Leu

Ile

Ser

Thr

Ser

Glu

Ile

Arg

370

375

380

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 121/151

71/95

att Ile 385

tcc Ser

gtg Val

ctg Leu

atc Ile

cgt Arg 390

gaa Glu

gat Asp

gat Asp

ctg Leu

gat Asp 395

gct Ala

gct Ala

gca Ala

cgt Arg

gca Ala 400

ttg

cat

gag

cag

ttc

cag

ctg

ggc

ggc

gaa

gac

gaa

gcc

gtc

gtt

tat

Leu

His

Glu

Gln

Phe

Gln

Leu

Gly

Gly

Glu

Asp

Glu

Ala

Val

Val

Tyr

405

410

415

gca

ggc

acc

gga

cgc

taa

Ala

Gly

Thr

Gly

Arg

420

1200

1248

1266 <210> 6 <211> 421 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum ATCC13032 <400> 6

Met 1

Ala

Leu

Val

Val 5

Gln

Lys

Tyr

Gly

Gly 10

Ser

Ser

Leu

Glu

Ser 15

Ala

Glu

Arg

Ile

Arg 20

Asn

Val

Ala

Glu

Arg 25

Ile

Val

Ala

Thr

Lys 30

Lys

Ala

Gly

Asn

Asp 35

Val

Val

Val

Val

Cys 40

Ser

Ala

Met

Gly

Asp 45

Thr

Thr

Asp

Glu

Leu 50

Leu

Glu

Leu

Ala

Ala 55

Ala

Val

Asn

Pro

Val 60

Pro

Pro

Ala

Arg

Glu 65

Met

Asp

Met

Leu

Leu 70

Thr

Ala

Gly

Glu

Arg 75

Ile

Ser

Asn

Ala

Leu 80

Val

Ala

Met

Ala

Ile 85

Glu

Ser

Leu

Gly

Ala 90

Glu

Ala

Gln

Ser

Phe 95

Thr

Gly

Ser

Gln

Ala 100

Gly

Val

Leu

Thr

Thr 105

Glu

Arg

His

Gly

Asn 110

Ala

Arg

Ile

Val

Asp 115

Val

Thr

Pro

Gly

Arg 120

Val

Arg

Glu

Ala

Leu 125

Asp

Glu

Gly

Lys

Ile 130

Cys

Ile

Val

Ala

Gly 135

Phe

Gln

Gly

Val

Asn 140

Lys

Glu

Thr

Arg

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 122/151

72/95

Asp Val

145

Leu Ala

Asp Gly

Leu Glu

Thr Thr

Ser Lys

210

Val Pro

225

Ile Ala

Ala Ala

Val Tyr

180

Lys Leu

195

Ile Leu

Leu Arg

Gly Ser

Leu Gly

150

Leu Asn

165

Thr Ala

Ser Phe

Val Leu

Arg Gly

Ala Asp

Asp Pro

Glu Glu

200

Arg Ser

215

Gly Ser

Val Cys

170

Arg Ile

185

Met Leu

Val Glu

Gly Val

Ala Thr

260

Ser Asp

Lys Pro

275

Ala Glu

290

Ile Asn

Val Arg

230

Met Glu

245

Asp Lys

Gly Glu

Ile Asp

Ser Ser

Tyr Ser

Asp Ile

Pro Val

250

Ser Glu

Ala Lys

265

Ala Ala

280

Met Val

295

Lys Val

Leu Gln

Asp Gly

305

Thr Thr

Asp Ile

310

Thr Phe

Thr Cys

Arg Ala

Met Glu

Ile Leu

325

Asn Val

Leu Tyr

340

Asp Asp

Gly Met

Lys Ser

355

His Pro

Arg Asp

Val Asn

Val Asn

Lys Lys

Gln Val

Gly Val

360

Ile Glu

Leu Gln

330

Gly Lys

345

Thr Ala

Leu Ile

Asp Thr

155

Glu Ile

Val Pro

Glu Leu

Tyr Ala

220

Asn Asp

235

Glu Glu

Val Thr

Phe Arg

Asn Val

300

Pro Arg

315

Val Gln

Val Ser

Glu Phe

Ser Thr

Thr Ala

Tyr Ser

Asn Ala

190

Ala Ala

205

Arg Ala

Pro Gly

Ala Val

Val Leu

270

Ala Leu

285

Ser Ser

Ser Asp

Gly Asn

Leu Val

350

Met Glu

365

Ser Glu

Val Ala

160

Asp Val

175

Gln Lys

Val Gly

Phe Asn

Thr Leu

240

Leu Thr

255

Gly Ile

Ala Asp

Val Glu

Gly Arg

320

Trp Thr

335

Gly Ala

Ala Leu

Ile Arg

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 123/151

73/95

370

375

380

Ile 385

Ser

Val

Leu

Ile

Arg 390

Glu Asp Asp

Leu

Asp 395

Ala

Ala

Ala

Arg

Ala 400

Leu

His

Glu

Gln

Phe

Gln

Leu

Gly

Gly

Glu

Asp

Glu

Ala

Val

Val

Tyr

405

410

415

Ala Gly Thr Gly Arg

420 <210> 7 <211> 1603 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(801) <223> sequência a montante do sítio de mutação (sequência flanqueadora 5') <220>

<221>

CDS <222>

(120)..(1601) <220>

<221> misc_feature <222> (801)..(803) <223> códon gac para ácido aspártico na posição 228 <220>

<221> mutação <222> (802)..(802) <223> nucleobase adenina <220>

<221> misc_feature <222> (803)..(1603) <223> sequência a jusante do sítio de mutação (sequência flanqueadora 3')

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 124/151

74/95 <220>

<221> misc_feature <222> (1347) . . (1349) <223> códon ttt para fenilalanina na posição 410 <220>

<221> misc_feature <222> (1349)..(1349) <223> nucleobase timina <400> 7 cccacgcgtc agtcaaaaat atggccaaca cttgcattcg ggtgctggcg atcatttatg60 agatgacgcc ttgtgttggt gttcggcaga gaactcgcgg agataaaagg aagttgaac119 atg tca gat tcc ccg aag aac gca ccg agg att acc gat gag gca gat167

Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu AlaAsp

5 1015 gta gtt ctc att ggt gcc ggt atc atg agc tcc acg ctg ggt gca atg215

Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly AlaMet

2530 ctg cgt cag ctg gag cca agc tgg act cag atc gtc ttc gag cgt ttg263

Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu ArgLeu

4045 gat gga ccg gca caa gag tcg tcc tcc ccg tgg aac aat gca gga acc311

Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala GlyThr

5560 ggc cac tct gct cta tgc gag ctg aac tac acc cca gag gtt aag ggc359

Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val LysGly

70 7580 aag gtt gaa att gcc aag gct gta gga atc aac gag aag ttc cag gtt407

Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe GlnVal

9095 tcc cgt cag ttc tgg tct cac ctc gtt gaa gag gga gtg ctg tct gat455

Ser Arg Gln Phe Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu SerAsp

100 105110 cct aag gaa ttc atc aac cct gtt cct cac gta tct ttc ggc cag ggc503

Pro Lys Glu Phe Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly GlnGly

115 120125 gca gat cag gtt gca tac atc aag gct cgc tac gaa gct ttg aag gat551

Ala Asp Gln Val Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu LysAsp

130 135140

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 125/151

75/95

cac His 145

cca Pro

ctc Leu

ttc Phe

cag Gln

ggc Gly 150

atg Met

acc Thr

tac Tyr

gct Ala

gac Asp 155

gat Asp

gaa Glu

gct Ala

acc Thr

ttc Phe 160

599

acc

gag

aag

ctg

cct

ttg

atg

gca

aag

ggc

cgt

gac

ttc

tct

gat

cca

647

Thr

Glu

Lys

Leu

Pro

Leu

Met

Ala

Lys

Gly

Arg

Asp

Phe

Ser

Asp

Pro

165

170

175

gta

gca

atc

tct

tgg

atc

gat

gaa

ggc

acc

gac

atc

aac

tac

ggt

gct

695

Val

Ala

Ile

Ser

Trp

Ile

Asp

Glu

Gly

Thr

Asp

Ile

Asn

Tyr

Gly

Ala

180

185

190

cag

acc

aag

cag

tac

ctg

gat

gca

gct

gaa

gtt

gaa

ggc

act

gaa

atc

743

Gln

Thr

Lys

Gln

Tyr

Leu

Asp

Ala

Ala

Glu

Val

Glu

Gly

Thr

Glu

Ile

195

200

205

cgc

tat

ggc

cac

gaa

gtc

aag

agc

atc

aag

gct

gat

ggc

gca

aag

tgg

791

Arg

Tyr

Gly

His

Glu

Val

Lys

Ser

Ile

Lys

Ala

Asp

Gly

Ala

Lys

Trp

210

215

220

atc

gtg

acc

gac

aag

aac

gta

cac

act

ggc

gac

acc

aag

acc

atc

aag

839

Ile

Val

Thr

Asp

Lys

Asn

Val

His

Thr

Gly

Asp

Thr

Lys

Thr

Ile

Lys

225

230

235

240

gca

aac

ttc

gtg

ttc

gtc

ggc

gca

ggc

gga

tac

gca

ctg

gat

ctg

ctt

887

Ala

Asn

Phe

Val

Phe

Val

Gly

Ala

Gly

Gly

Tyr

Ala

Leu

Asp

Leu

Leu

245

250

255

cgc

agc

gca

ggc

atc

cca

cag

gtc

aag

ggc

ttc

gct

gga

ttc

cca

gta

935

Arg

Ser

Ala

Gly

Ile

Pro

Gln

Val

Lys

Gly

Phe

Ala

Gly

Phe

Pro

Val

260

265

270

tcc

ggc

ctg

tgg

ctt

cgt

tgc

acc

aac

gag

gaa

ctg

atc

gag

cag

cac

983

Ser

Gly

Leu

Trp

Leu

Arg

Cys

Thr

Asn

Glu

Glu

Leu

Ile

Glu

Gln

His

275

280

285

gca

gcc

aag

gta

tat

ggc

aag

gca

tct

gtt

ggc

gct

cct

cca

atg

tct

1031

Ala

Ala

Lys

Val

Tyr

Gly

Lys

Ala

Ser

Val

Gly

Ala

Pro

Pro

Met

Ser

290

295

300

gtt

cct

cac

ctt

gac

acc

cgc

gtt

atc

gag

ggt

gaa

aag

ggt

ctg

ctc

1079

Val

Pro

His

Leu

Asp

Thr

Arg

Val

Ile

Glu

Gly

Glu

Lys

Gly

Leu

Leu

305

310

315

320

ttt

gga

cct

tac

ggt

ggc

tgg

acc

cct

aag

ttc

ttg

aag

gaa

ggc

tcc

1127

Phe

Gly

Pro

Tyr

Gly

Gly

Trp

Thr

Pro

Lys

Phe

Leu

Lys

Glu

Gly

Ser

325

330

335

tac

ctg

gac

ctg

ttc

aag

tcc

atc

cgc

cca

gac

aac

att

cct

tcc

tac

1175

Tyr

Leu

Asp

Leu

Phe

Lys

Ser

Ile

Arg

Pro

Asp

Asn

Ile

Pro

Ser

Tyr

340

345

350

ctt

ggc

gtt

gct

gct

cag

gaa

ttt

gat

ctg

acc

aag

tac

ctt

gtc

act

1223

Leu

Gly

Val

Ala

Ala

Gln

Glu

Phe

Asp

Leu

Thr

Lys

Tyr

Leu

Val

Thr

355

360

365

gaa

gtt

ctc

aag

gac

cag

gac

aag

cgt

atg

gat

gct

ctt

cgc

gag

tac

1271

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 126/151

76/95

Glu Val 370

Leu

Lys

Asp

Gln

Asp 375

Lys

Arg Met

Asp

Ala 380

Leu

Arg

Glu

Tyr

atg

cca

gag

gca

caa

aac

ggc

gat

tgg

gag

acc

atc

gtt

gcc

gga

cag

Met

Pro

Glu

Ala

Gln

Asn

Gly

Asp

Trp

Glu

Thr

Ile

Val

Ala

Gly

Gln

385

390

395

400

cgt

gtt

cag

gtt

att

aag

cct

gca

gga

ttt

cct

aag

ttc

ggt

tcc

ctg

Arg

Val

Gln

Val

Ile

Lys

Pro

Ala

Gly

Phe

Pro

Lys

Phe

Gly

Ser

Leu

405

410

415

gaa

ttc

ggc

acc

acc

ttg

atc

aac

aac

tcc

gaa

ggc

acc

atc

gcc

gga

Glu

Phe

Gly

Thr

Thr

Leu

Ile

Asn

Asn

Ser

Glu

Gly

Thr

Ile

Ala

Gly

420

425

430

ttg

ctc

ggt

gct

tcc

cct

gga

gca

tcc

atc

gca

cct

tcc

gca

atg

atc

Leu

Leu

Gly

Ala

Ser

Pro

Gly

Ala

Ser

Ile

Ala

Pro

Ser

Ala

Met

Ile

435

440

445

gag

ctg

ctt

gag

cgt

tgc

ttc

ggt

gac

cgc

atg

atc

gag

tgg

ggc

gac

Glu

Leu

Leu

Glu

Arg

Cys

Phe

Gly

Asp

Arg

Met

Ile

Glu

Trp

Gly

Asp

450

455

460

aag

ctg

aag

gac

atg

atc

cct

tcc

tac

ggc

aag

aag

ctt

gct

tcc

gag

Lys

Leu

Lys

Asp

Met

Ile

Pro

Ser

Tyr

Gly

Lys

Lys

Leu

Ala

Ser

Glu

465

470

475

480

cca

gca

ctg

ttt

gag

cag

cag

tgg

gca

cgc

acc

cag

aag

acc

ct

Pro

Ala

Leu

Phe

Glu

Gln

Gln

Trp

Ala

Arg

Thr

Gln

Lys

Thr

485 490

1319

1367

1415

1463

1511

1559

1603 <210> 8 <211> 494 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 8

Met 1

Ser Asp

Ser

Pro 5

Lys

Asn

Ala

Pro

Arg 10

Ile

Thr

Asp

Glu

Ala 15

Asp

Val

Val

Leu

Ile 20

Gly

Ala

Gly

Ile

Met 25

Ser

Ser

Thr

Leu

Gly 30

Ala

Met

Leu

Arg

Gln 35

Leu

Glu

Pro

Ser

Trp 40

Thr

Gln

Ile

Val

Phe 45

Glu

Arg

Leu

Asp

Gly 50

Pro

Ala

Gln

Glu

Ser 55

Ser

Ser

Pro

Trp

Asn 60

Asn

Ala

Gly

Thr

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 127/151

77/95

Gly 65

His

Ser

Ala

Leu

Cys 70

Glu

Leu

Asn

Tyr

Thr 75

Pro

Glu

Val

Lys

Lys

Val

Glu

Ile

Ala

Lys

Ala

Val

Gly

Ile

Asn

Glu

Lys

Phe

Gln

85

90

95

Ser

Arg

Gln

Phe

Trp

Ser

His

Leu

Val

Glu

Glu

Gly

Val

Leu

Ser

100

105

110

Pro

Lys

Glu

Phe

Ile

Asn

Pro

Val

Pro

His

Val

Ser

Phe

Gly

Gln

115

120

125

Ala

Asp

Gln

Val

Ala

Tyr

Ile

Lys

Ala

Arg

Tyr

Glu

Ala

Leu

Lys

130

135

140

His

Pro

Leu

Phe

Gln

Gly

Met

Thr

Tyr

Ala

Asp

Asp

Glu

Ala

Thr

145

150

155

Thr

Glu

Lys

Leu

Pro

Leu

Met

Ala

Lys

Gly

Arg

Asp

Phe

Ser

Asp

165

170

175

Val

Ala

Ile

Ser

Trp

Ile

Asp

Glu

Gly

Thr

Asp

Ile

Asn

Tyr

Gly

180

185

190

Gln

Thr

Lys

Gln

Tyr

Leu

Asp

Ala

Ala

Glu

Val

Glu

Gly

Thr

Glu

195

200

205

Arg

Tyr

Gly

His

Glu

Val

Lys

Ser

Ile

Lys

Ala

Asp

Gly

Ala

Lys

210

215

220

Ile

Val

Thr

Asp

Lys

Asn

Val

His

Thr

Gly

Asp

Thr

Lys

Thr

Ile

225

230

235

Ala

Asn

Phe

Val

Phe

Val

Gly

Ala

Gly

Gly

Tyr

Ala

Leu

Asp

Leu

245

250

255

Arg

Ser

Ala

Gly

Ile

Pro

Gln

Val

Lys

Gly

Phe

Ala

Gly

Phe

Pro

260

265

270

Ser

Gly

Leu

Trp

Leu

Arg

Cys

Thr

Asn

Glu

Glu

Leu

Ile

Glu

Gln

275

280

285

Ala

Ala

Lys

Val

Tyr

Gly

Lys

Ala

Ser

Val

Gly

Ala

Pro

Pro

Met

Gly

Val

Asp

Gly

Asp

Phe

160

Pro

Ala

Ile

Trp

Lys

240

Leu

Val

His

Ser

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 128/151

78/95

290

295

300

Val Pro

305

Phe Gly

Tyr Leu

Leu Gly

Glu Val

370

Met Pro

385

Arg Val

Glu Phe

Leu Leu

Glu Leu

450

Lys Leu

465

Pro Ala

His Leu

Pro Tyr

Asp Leu

340

Val Ala

355

Leu Lys

Glu Ala

Gln Val

Gly Thr

420

Gly Ala

435

Leu Glu

Lys Asp

Leu Phe

Asp Thr

310

Gly Gly

325

Phe Lys

Ala Gln

Asp Gln

Gln Asn

390

Ile Lys

405

Thr Leu

Ser Pro

Arg Cys

Met Ile

470

Glu Gln

485

Arg Val

Trp Thr

Ser Ile

Glu Phe

360

Asp Lys

375

Gly Asp

Pro Ala

Ile Asn

Gly Ala

440

Phe Gly

455

Pro Ser

Gln Trp

Ile Glu

Pro Lys

330

Arg Pro

345

Asp Leu

Gly Glu

315

Phe Leu

Asp Asn

Thr Lys

Lys Gly

Lys Glu

Ile Pro

350

Tyr Leu

365 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> sequência artificial

Arg Met

Asp Ala

380

Leu Arg

Trp Glu

Thr Ile

395

Val Ala

Leu Leu

320

Gly Ser

335

Ser Tyr

Val Thr

Gly Phe

410

Asn Ser

425

Ser Ile

Asp Arg

Tyr Gly

Ala Arg

490

Pro Lys

Phe Gly

Glu Gly

Ala Pro

Met Ile

460

Lys Lys

475

Thr

Thr Ile

430

Ser Ala

445

Glu Trp

Leu Ala

Gln Lys Thr

Glu Tyr

Gly Gln

400

Ser Leu

415

Ala Gly

Met Ile

Gly Asp

Ser Glu

480

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 129/151

79/95 <220>

<223>

iniciador

<220>

<221>	misc_feature
<222>	(1) . . (34)
<223>	iniciador 1f-mqo-pK18
<400>	9

ggtacccggg gatcctccca cgcgtcagtc aaaa

<210>	10
<211>	33
<212>	DNA
<213>	sequência artificial

<220>

<223>

iniciador

<220>

<221>	misc_feature
<222>	(1) . . (33)
<223>	iniciador 1r-mqo-pK18
<400>	10

gcctgcaggt cgactagggt cttctgggtg cgt <210> 11 <211> 1634 <212> DNA <213> sequência artificial <220>

<223> amplificado de Corynebacterium glutamicum DM2463 <220>

<221> misc_feature

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 130/151

80/95 <222> (1) . . (1634) <223> polinucleotídeo mqo'_V228D <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> sobreposição em 5' a pK18mobsacB-XbaI <220>

<221> misc_feature <222> (17)..(1619)

<223>	sequência de	nucleotídeos	da	SEQ ID NO:7
<220>
<221>	misc_feature
<222>	(17) . . (1619)
<223>	sequência de	nucleotídeos	de	DM2463

<220>

<221> misc_feature <222> (17)..(817) <223> sequência a montante da mutação de sítio (sequência flanqueadora 5') <220>

<221> CDS <222> (136)..(1617) <220>

<221> misc_feature <222> (817)..(819) <223> códon gac para ácido aspártico na posição 228 <220>

<221> mutação <222> (818)..(818) <223> nucleobase adenina <220>

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 131/151

81/95 <221> misc_feature <222> (819) . . (1619) <223> sequência a jusante do sítio de mutação (sequência flanqueadora 3') <220>

<221> misc_feature <222> (1363)..(1365) <223> códon ttt para fenilalanina na posição 410 <220>

<221> misc_feature <222> (1365)..(1365) <223> nucleobase timina <220>

<221> misc_feature <222> (1620)..(1634) <223> sobreposição em 3' a pK18mobsacB-XbaI <400> 11 ggtacccggg gatcctccca cgcgtcagtc aaaaatatgg ccaacacttg cattcgggtg60 ctggcgatca tttatgagat gacgccttgt gttggtgttc ggcagagaac tcgcggagat120 aaaaggaagt tgaac atg tca gat tcc ccg aag aac gca ccg agg att acc171

Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr

510

gat Asp

gag Glu

gca Ala 15

gat Asp

gta Val

gtt Val

ctc Leu

att Ile 20

ggt Gly

gcc Ala

ggt Gly

atc Ile

atg Met 25

agc Ser

tcc Ser

acg Thr

219

ctg

ggt

gca

atg

ctg

cgt

cag

ctg

gag

cca

agc

tgg

act

cag

atc

gtc

267

Leu

Gly

Ala

Met

Leu

Arg

Gln

Leu

Glu

Pro

Ser

Trp

Thr

Gln

Ile

Val

30

35

40

ttc

gag

cgt

ttg

gat

gga

ccg

gca

caa

gag

tcg

tcc

tcc

ccg

tgg

aac

315

Phe

Glu

Arg

Leu

Asp

Gly

Pro

Ala

Gln

Glu

Ser

Ser

Ser

Pro

Trp

Asn

45

50

55

60

aat

gca

gga

acc

ggc

cac

tct

gct

cta

tgc

gag

ctg

aac

tac

acc

cca

363

Asn

Ala

Gly

Thr

Gly

His

Ser

Ala

Leu

Cys

Glu

Leu

Asn

Tyr

Thr

Pro

65

70

75

gag

gtt

aag

ggc

aag

gtt

gaa

att

gcc

aag

gct

gta

gga

atc

aac

gag

411

Glu

Val

Lys

Gly

Lys

Val

Glu

Ile

Ala

Lys

Ala

Val

Gly

Ile

Asn

Glu

80

85

90

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 132/151

82/95

aag Lys

ttc Phe

cag Gln 95

gtt Val

tcc Ser

cgt Arg

cag Gln

ttc Phe 100

tgg Trp

tct Ser

cac His

ctc Leu

gtt Val 105

gaa Glu

gag Glu

gga Gly

459

gtg

ctg

tct

gat

cct

aag

gaa

ttc

atc

aac

cct

gtt

cct

cac

gta

tct

507

Val

Leu

Ser

Asp

Pro

Lys

Glu

Phe

Ile

Asn

Pro

Val

Pro

His

Val

Ser

110

115

120

ttc

ggc

cag

ggc

gca

gat

cag

gtt

gca

tac

atc

aag

gct

cgc

tac

gaa

555

Phe

Gly

Gln

Gly

Ala

Asp

Gln

Val

Ala

Tyr

Ile

Lys

Ala

Arg

Tyr

Glu

125

130

135

14 0

gct

ttg

aag

gat

cac

cca

ctc

ttc

cag

ggc

atg

acc

tac

gct

gac

gat

603

Ala

Leu

Lys

Asp

His

Pro

Leu

Phe

Gln

Gly

Met

Thr

Tyr

Ala

Asp

Asp

145

150

155

gaa

gct

acc

ttc

acc

gag

aag

ctg

cct

ttg

atg

gca

aag

ggc

cgt

gac

651

Glu

Ala

Thr

Phe

Thr

Glu

Lys

Leu

Pro

Leu

Met

Ala

Lys

Gly

Arg

Asp

160

165

170

ttc

tct

gat

cca

gta

gca

atc

tct

tgg

atc

gat

gaa

ggc

acc

gac

atc

699

Phe

Ser

Asp

Pro

Val

Ala

Ile

Ser

Trp

Ile

Asp

Glu

Gly

Thr

Asp

Ile

175

180

185

aac

tac

ggt

gct

cag

acc

aag

cag

tac

ctg

gat

gca

gct

gaa

gtt

gaa

747

Asn

Tyr

Gly

Ala

Gln

Thr

Lys

Gln

Tyr

Leu

Asp

Ala

Ala

Glu

Val

Glu

190

195

200

ggc

act

gaa

atc

cgc

tat

ggc

cac

gaa

gtc

aag

agc

atc

aag

gct

gat

795

Gly

Thr

Glu

Ile

Arg

Tyr

Gly

His

Glu

Val

Lys

Ser

Ile

Lys

Ala

Asp

205

210

215

220

ggc

gca

aag

tgg

atc

gtg

acc

gac

aag

aac

gta

cac

act

ggc

gac

acc

843

Gly

Ala

Lys

Trp

Ile

Val

Thr

Asp

Lys

Asn

Val

His

Thr

Gly

Asp

Thr

225

230

235

aag

acc

atc

aag

gca

aac

ttc

gtg

ttc

gtc

ggc

gca

ggc

gga

tac

gca

891

Lys

Thr

Ile

Lys

Ala

Asn

Phe

Val

Phe

Val

Gly

Ala

Gly

Gly

Tyr

Ala

240

245

250

ctg

gat

ctg

ctt

cgc

agc

gca

ggc

atc

cca

cag

gtc

aag

ggc

ttc

gct

939

Leu

Asp

Leu

Leu

Arg

Ser

Ala

Gly

Ile

Pro

Gln

Val

Lys

Gly

Phe

Ala

255

260

265

gga

ttc

cca

gta

tcc

ggc

ctg

tgg

ctt

cgt

tgc

acc

aac

gag

gaa

ctg

987

Gly

Phe

Pro

Val

Ser

Gly

Leu

Trp

Leu

Arg

Cys

Thr

Asn

Glu

Glu

Leu

270

275

280

atc

gag

cag

cac

gca

gcc

aag

gta

tat

ggc

aag

gca

tct

gtt

ggc

gct

1035

Ile

Glu

Gln

His

Ala

Ala

Lys

Val

Tyr

Gly

Lys

Ala

Ser

Val

Gly

Ala

285

290

295

300

cct

cca

atg

tct

gtt

cct

cac

ctt

gac

acc

cgc

gtt

atc

gag

ggt

gaa

1083

Pro

Pro

Met

Ser

Val

Pro

His

Leu

Asp

Thr

Arg

Val

Ile

Glu

Gly

Glu

305

310

315

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 133/151

83/95

aag Lys

ggt Gly

ctg Leu

ctc Leu 320

ttt Phe

gga Gly

cct Pro

tac Tyr

ggt Gly 325

ggc Gly

tgg Trp

acc Thr

cct Pro

aag Lys 330

ttc Phe

ttg Leu

1131

aag

gaa

ggc

tcc

tac

ctg

gac

ctg

ttc

aag

tcc

atc

cgc

cca

gac

aac

1179

Lys

Glu

Gly

Ser

Tyr

Leu

Asp

Leu

Phe

Lys

Ser

Ile

Arg

Pro

Asp

Asn

335

340

345

att

cct

tcc

tac

ctt

ggc

gtt

gct

gct

cag

gaa

ttt

gat

ctg

acc

aag

1227

Ile

Pro

Ser

Tyr

Leu

Gly

Val

Ala

Ala

Gln

Glu

Phe

Asp

Leu

Thr

Lys

350

355

360

tac

ctt

gtc

act

gaa

gtt

ctc

aag

gac

cag

gac

aag

cgt

atg

gat

gct

1275

Tyr

Leu

Val

Thr

Glu

Val

Leu

Lys

Asp

Gln

Asp

Lys

Arg

Met

Asp

Ala

365

370

375

380

ctt

cgc

gag

tac

atg

cca

gag

gca

caa

aac

ggc

gat

tgg

gag

acc

atc

1323

Leu

Arg

Glu

Tyr

Met

Pro

Glu

Ala

Gln

Asn

Gly

Asp

Trp

Glu

Thr

Ile

385

390

395

gtt

gcc

gga

cag

cgt

gtt

cag

gtt

att

aag

cct

gca

gga

ttt

cct

aag

1371

Val

Ala

Gly

Gln

Arg

Val

Gln

Val

Ile

Lys

Pro

Ala

Gly

Phe

Pro

Lys

400

405

410

ttc

ggt

tcc

ctg

gaa

ttc

ggc

acc

acc

ttg

atc

aac

aac

tcc

gaa

ggc

1419

Phe

Gly

Ser

Leu

Glu

Phe

Gly

Thr

Thr

Leu

Ile

Asn

Asn

Ser

Glu

Gly

415

420

425

acc

atc

gcc

gga

ttg

ctc

ggt

gct

tcc

cct

gga

gca

tcc

atc

gca

cct

1467

Thr

Ile

Ala

Gly

Leu

Leu

Gly

Ala

Ser

Pro

Gly

Ala

Ser

Ile

Ala

Pro

430

435

440

tcc

gca

atg

atc

gag

ctg

ctt

gag

cgt

tgc

ttc

ggt

gac

cgc

atg

atc

1515

Ser

Ala

Met

Ile

Glu

Leu

Leu

Glu

Arg

Cys

Phe

Gly

Asp

Arg

Met

Ile

445

450

455

460

gag

tgg

ggc

gac

aag

ctg

aag

gac

atg

atc

cct

tcc

tac

ggc

aag

aag

1563

Glu

Trp

Gly

Asp

Lys

Leu

Lys

Asp

Met

Ile

Pro

Ser

Tyr

Gly

Lys

Lys

465

470

475

ctt

gct

tcc

gag

cca

gca

ctg

ttt

gag

cag

cag

tgg

gca

cgc

acc

cag

1611

Leu

Ala

Ser

Glu

Pro

Ala

Leu

Phe

Glu

Gln

Gln

Trp

Ala

Arg

Thr

Gln

480

485

490

1634 aag acc ctagtcgacc tgcaggc Lys Thr <210> 12 <211> 494 <212> PRT <213> sequência artificial <220>

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 134/151

84/95 <223> Construto Sintético <400> 12

Met 1

Ser Asp

Ser

Pro 5

Lys

Asn

Ala

Pro

Arg 10

Ile

Thr

Asp

Glu

Ala 15

Asp

Val

Val

Leu

Ile

Gly

Ala

Gly

Ile

Met

Ser

Ser

Thr

Leu

Gly

Ala

Met

20

25

30

Leu

Arg

Gln

Leu

Glu

Pro

Ser

Trp

Thr

Gln

Ile

Val

Phe

Glu

Arg

Leu

35

40

45

Asp

Gly

Pro

Ala

Gln

Glu

Ser

Ser

Ser

Pro

Trp

Asn

Asn

Ala

Gly

Thr

50

55

60

Gly

His

Ser

Ala

Leu

Cys

Glu

Leu

Asn

Tyr

Thr

Pro

Glu

Val

Lys

Gly

65

70

75

80

Lys

Val

Glu

Ile

Ala

Lys

Ala

Val

Gly

Ile

Asn

Glu

Lys

Phe

Gln

Val

85

90

95

Ser

Arg

Gln

Phe

Trp

Ser

His

Leu

Val

Glu

Glu

Gly

Val

Leu

Ser

Asp

100

105

110

Pro

Lys

Glu

Phe

Ile

Asn

Pro

Val

Pro

His

Val

Ser

Phe

Gly

Gln

Gly

115

120

125

Ala

Asp

Gln

Val

Ala

Tyr

Ile

Lys

Ala

Arg

Tyr

Glu

Ala

Leu

Lys

Asp

130

135

140

His

Pro

Leu

Phe

Gln

Gly

Met

Thr

Tyr

Ala

Asp

Asp

Glu

Ala

Thr

Phe

145

150

155

160

Thr

Glu

Lys

Leu

Pro

Leu

Met

Ala

Lys

Gly

Arg

Asp

Phe

Ser

Asp

Pro

165

170

175

Val

Ala

Ile

Ser

Trp

Ile

Asp

Glu

Gly

Thr

Asp

Ile

Asn

Tyr

Gly

Ala

180

185

190

Gln

Thr

Lys

Gln

Tyr

Leu

Asp

Ala

Ala

Glu

Val

Glu

Gly

Thr

Glu

Ile

195

200

205

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 135/151

85/95

Arg

Ile

225

Ala

Arg

Ser

Ala

Val

305

Phe

Tyr

Leu

Glu

Met

385

Arg

Glu

Leu

Tyr Gly His Glu Val Lys Ser Ile Lys Ala Asp Gly Ala Lys

210 215 220

Val Thr

Asn Phe

Ser Ala

Gly Leu

275

Ala Lys

290

Pro His

Gly Pro

Leu Asp

Gly Val

355

Val Leu

370

Pro Glu

Val Gln

Phe Gly

Leu Gly

Asp Lys

Val Phe

245

Gly Ile

260

Trp Leu

Val Tyr

Leu Asp

Tyr Gly

325

Leu Phe

340

Ala Ala

Lys Asp

Ala Gln

Val Ile

405

Thr Thr

420

Ala Ser

Asn Val

230

Val Gly

Pro Gln

Arg Cys

Gly Lys

295

Thr Arg

310

Gly Trp

Lys Ser

Gln Glu

Gln Asp

375

Asn Gly

390

Lys Pro

Leu Ile

Pro Gly

His Thr

Gly Asp

235

Thr Lys

Thr Ile

Ala Gly

Val Lys

265

Thr Asn

280

Ala Ser

Val Ile

Thr Pro

Ile Arg

345

Phe Asp

360

Lys Arg

Asp Trp

Ala Gly

Asn Asn

425

Ala Ser

Gly Tyr

250

Ala Leu

Asp Leu

255

Gly Phe

Glu Glu

Val Gly

Glu Gly

315

Lys Phe

330

Pro Asp

Leu Thr

Met Asp

Glu Thr

395

Phe Pro

410

Ser Glu

Ile Ala

Ala Gly

Leu Ile

285

Ala Pro

300

Glu Lys

Leu Lys

Asn Ile

Lys Tyr

365

Ala Leu

380

Ile Val

Lys Phe

Gly Thr

Pro Ser

Phe Pro

270

Glu Gln

Pro Met

Gly Leu

Glu Gly

335

Pro Ser

350

Leu Val

Arg Glu

Ala Gly

Gly Ser

415

Ile Ala

430

Ala Met

Trp

Lys

240

Leu

Val

His

Ser

Leu

320

Ser

Tyr

Thr

Tyr

Gln

400

Leu

Gly

Ile

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 136/151

86/95

435

440

445

Glu Leu

450

Leu Glu

Arg Cys

Lys Leu

465

Lys Asp

Met Ile

470

Pro Ala Leu Phe

Glu Gln

485

Phe Gly

455

Pro Ser

Gln Trp

Asp Arg

Tyr Gly

Ala Arg

490

Met Ile

460

Lys Lys

475

Thr

Glu Trp

Gly Asp

Leu Ala

Ser Glu

480

Gln Lys Thr

<210>	13
<211>	20
<212>	DNA
<213>	sequência artificial

<220>

<223>

iniciador

<220>

<221>	misc_feature
<222>	(1)..(20)
<223>	iniciador LC-mqo1

<400> 13 atgaaggcac cgacatcaac

<210>	14
<211>	20
<212>	DNA
<213>	sequência artificial

<220>

<223>

iniciador

<220>

<221>	misc_feature
<222>	(1)..(20)
<223>	iniciador LC-mqo2

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 137/151

87/95 <400> 14 tgcaaggcga ttaagttggg 20

<210>	15
<211>	20
<212>	DNA
<213>	sequência artificial

<220>

<223>

sonda

<220>

<221>	misc_feature
<222>	(1)..(20)
<223>	sonda de aceptor mqo228_C

<220>

<221>	misc_feature
<222>	(10)..(10)
<223>	nucleobase timina
<400>	15

acgttcttgt cggtcacgat 20

<210>	16
<211>	35
<212>	DNA
<213>	sequência artificial

<220>

<223>

sonda

<220>

<221>	misc_feature
<222>	(1)..(35)
<223>	sonda de doador mqo228_A
<400>	16

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 138/151

88/95 gaagtttgcc ttgatggtct tggtgtcgcc agtgt <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> sequência artificial <220>

<223> iniciador <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(23) <223> iniciador pVW_1.p <400> 17 gtgagcggat aacaatttca cac 23 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> sequência artificial <220>

<223> iniciador <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> iniciador pCV22_2.p <400> 18 tgcaaggcga ttaagttggg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> sequência artificial

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 139/151

89/95 <220>

<223> iniciador <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> iniciador mqo-E1 <400> 19 gccttcaact gtgtcagttc

<210>	20
<211>	28
<212>	DNA
<213>	sequência artificial

<220>

<223>

iniciador

<220>

<221>	misc_feature
<222>	(1)..(28)
<223>	iniciador mqo-oP1

<400> 20 gaggatccgc agagaactcg cggagata <210> 21 <211> 1648 <212> DNA <213> sequência artificial <220>

<223> amplificado de Corynebacterium glutamicum cepa DM1933_mqo_V228D <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(28)

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 140/151

90/95

<223>	sequência de	nucleotídeos	de	iniciador mqo-oP1
<220>
<221>	misc_feature
<222>	(9) . . (1648)
<223>	sequência de	nucleotídeos	da	cepa DM1933_mqo_V228D

<220>

<221> CDS <222> (43)..(1542) <220>

<221> misc_feature <222> (724)..(726) <223> códon gac para ácido aspártico na posição 228 <220>

<221> misc_feature <222> (725)..(725) <223> nucleobase adenina <220>

<221> misc_feature <222> (1270)..(1272) <223> códon ttt para fenilalanina na posição 410 <220>

<221> misc_feature <222> (1271)..(1271) <223> nucleobase timina <220>

<221> misc_feature <222> (1543)..(1545) <223> códon de parada <220>

<221> miscfeature

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 141/151

91/95 <222> (1630) . . (1648) <223> sequência de nucleotídeos do complemento reverso de iniciador mqo-E1 <400> 21 gaggatccgc agagaactcg cggagataaa aggaagttga ac atg tca gat tcc54

Met Ser Asp Ser ccg aag aac gca ccg agg att acc gat gag gca gat gta gtt ctc att102

Pro Lys Asn Ala Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp Val Val LeuIle

10 1520 ggt gcc ggt atc atg agc tcc acg ctg ggt gca atg ctg cgt cag ctg150

Gly Ala Gly Ile Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met Leu Arg GlnLeu

3035 gag cca agc tgg act cag atc gtc ttc gag cgt ttg gat gga ccg gca198

Glu Pro Ser Trp Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu Asp Gly ProAla

4550 caa gag tcg tcc tcc ccg tgg aac aat gca gga acc ggc cac tct gct246

Gln Glu Ser Ser Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr Gly His SerAla

6065 cta tgc gag ctg aac tac acc cca gag gtt aag ggc aag gtt gaa att294

Leu Cys Glu Leu Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly Lys Val GluIle

7580 gcc aag gct gta gga atc aac gag aag ttc cag gtt tcc cgt cag ttc342

Ala Lys Ala Val Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val Ser Arg GlnPhe

90 95100 tgg tct cac ctc gtt gaa gag gga gtg ctg tct gat cct aag gaa ttc390

Trp Ser His Leu Val Glu Glu Gly Val Leu Ser Asp Pro Lys GluPhe

105 110115 atc aac cct gtt cct cac gta tct ttc ggc cag ggc gca gat cag gtt438

Ile Asn Pro Val Pro His Val Ser Phe Gly Gln Gly Ala Asp GlnVal

120 125130 gca tac atc aag gct cgc tac gaa gct ttg aag gat cac cca ctc ttc486

Ala Tyr Ile Lys Ala Arg Tyr Glu Ala Leu Lys Asp His Pro LeuPhe

135 140145 cag ggc atg acc tac gct gac gat gaa gct acc ttc acc gag aag ctg534

Gln Gly Met Thr Tyr Ala Asp Asp Glu Ala Thr Phe Thr Glu LysLeu

150 155160 cct ttg atg gca aag ggc cgt gac ttc tct gat cca gta gca atc tct582

Pro Leu Met Ala Lys Gly Arg Asp Phe Ser Asp Pro Val Ala IleSer

165 170 175180 tgg atc gat gaa ggc acc gac atc aac tac ggt gct cag acc aag cag630

Trp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ile Asn Tyr Gly Ala Gln Thr LysGln

185 190195

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 142/151

92/95

tac Tyr

ctg Leu

gat Asp

gca Ala 200

gct Ala

gaa Glu

gtt Val

gaa Glu

ggc Gly 205

act Thr

gaa Glu

atc Ile

cgc Arg

tat Tyr 210

ggc Gly

cac His

678

gaa

gtc

aag

agc

atc

aag

gct

gat

ggc

gca

aag

tgg

atc

gtg

acc

gac

726

Glu

Val

Lys

Ser

Ile

Lys

Ala

Asp

Gly

Ala

Lys

Trp

Ile

Val

Thr

Asp

215

220

225

aag

aac

gta

cac

act

ggc

gac

acc

aag

acc

atc

aag

gca

aac

ttc

gtg

774

Lys

Asn

Val

His

Thr

Gly

Asp

Thr

Lys

Thr

Ile

Lys

Ala

Asn

Phe

Val

230

235

240

ttc

gtc

ggc

gca

ggc

gga

tac

gca

ctg

gat

ctg

ctt

cgc

agc

gca

ggc

822

Phe

Val

Gly

Ala

Gly

Gly

Tyr

Ala

Leu

Asp

Leu

Leu

Arg

Ser

Ala

Gly

245

250

255

260

atc

cca

cag

gtc

aag

ggc

ttc

gct

gga

ttc

cca

gta

tcc

ggc

ctg

tgg

870

Ile

Pro

Gln

Val

Lys

Gly

Phe

Ala

Gly

Phe

Pro

Val

Ser

Gly

Leu

Trp

265

270

275

ctt

cgt

tgc

acc

aac

gag

gaa

ctg

atc

gag

cag

cac

gca

gcc

aag

gta

918

Leu

Arg

Cys

Thr

Asn

Glu

Glu

Leu

Ile

Glu

Gln

His

Ala

Ala

Lys

Val

280

285

290

tat

ggc

aag

gca

tct

gtt

ggc

gct

cct

cca

atg

tct

gtt

cct

cac

ctt

966

Tyr

Gly

Lys

Ala

Ser

Val

Gly

Ala

Pro

Pro

Met

Ser

Val

Pro

His

Leu

295

300

305

gac

acc

cgc

gtt

atc

gag

ggt

gaa

aag

ggt

ctg

ctc

ttt

gga

cct

tac

1014

Asp

Thr

Arg

Val

Ile

Glu

Gly

Glu

Lys

Gly

Leu

Leu

Phe

Gly

Pro

Tyr

310

315

320

ggt

ggc

tgg

acc

cct

aag

ttc

ttg

aag

gaa

ggc

tcc

tac

ctg

gac

ctg

1062

Gly

Gly

Trp

Thr

Pro

Lys

Phe

Leu

Lys

Glu

Gly

Ser

Tyr

Leu

Asp

Leu

325

330

335

340

ttc

aag

tcc

atc

cgc

cca

gac

aac

att

cct

tcc

tac

ctt

ggc

gtt

gct

1110

Phe

Lys

Ser

Ile

Arg

Pro

Asp

Asn

Ile

Pro

Ser

Tyr

Leu

Gly

Val

Ala

345

350

355

gct

cag

gaa

ttt

gat

ctg

acc

aag

tac

ctt

gtc

act

gaa

gtt

ctc

aag

1158

Ala

Gln

Glu

Phe

Asp

Leu

Thr

Lys

Tyr

Leu

Val

Thr

Glu

Val

Leu

Lys

360

365

370

gac

cag

gac

aag

cgt

atg

gat

gct

ctt

cgc

gag

tac

atg

cca

gag

gca

1206

Asp

Gln

Asp

Lys

Arg

Met

Asp

Ala

Leu

Arg

Glu

Tyr

Met

Pro

Glu

Ala

375

380

385

caa

aac

ggc

gat

tgg

gag

acc

atc

gtt

gcc

gga

cag

cgt

gtt

cag

gtt

1254

Gln

Asn

Gly

Asp

Trp

Glu

Thr

Ile

Val

Ala

Gly

Gln

Arg

Val

Gln

Val

390

395

400

att

aag

cct

gca

gga

ttt

cct

aag

ttc

ggt

tcc

ctg

gaa

ttc

ggc

acc

1302

Ile

Lys

Pro

Ala

Gly

Phe

Pro

Lys

Phe

Gly

Ser

Leu

Glu

Phe

Gly

Thr

405

410

415

420

acc

ttg

atc

aac

aac

tcc

gaa

ggc

acc

atc

gcc

gga

ttg

ctc

ggt

gct

1350

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 143/151

93/95

Thr

Leu

Ile Asn

Asn 425

Ser

Glu

Gly Thr

Ile 430

Ala

Gly

Leu

Leu

Gly 435

Ala

tcc

cct

gga

gca

tcc

atc

gca

cct

tcc

gca

atg

atc

gag

ctg

ctt

gag

1398

Ser

Pro

Gly

Ala

Ser

Ile

Ala

Pro

Ser

Ala

Met

Ile

Glu

Leu

Leu

Glu

440

445

450

cgt

tgc

ttc

ggt

gac

cgc

atg

atc

gag

tgg

ggc

gac

aag

ctg

aag

gac

1446

Arg

Cys

Phe

Gly

Asp

Arg

Met

Ile

Glu

Trp

Gly

Asp

Lys

Leu

Lys

Asp

455

460

465

atg

atc

cct

tcc

tac

ggc

aag

aag

ctt

gct

tcc

gag

cca

gca

ctg

ttt

1494

Met

Ile

Pro

Ser

Tyr

Gly

Lys

Lys

Leu

Ala

Ser

Glu

Pro

Ala

Leu

Phe

470

475

480

gag

cag

cag

tgg

gca

cgc

acc

cag

aag

acc

ctg

aag

ctt

gag

gaa

gcc

1542

Glu

Gln

Gln

Trp

Ala

Arg

Thr

Gln

Lys

Thr

Leu

Lys

Leu

Glu

Glu

Ala

485

490

495

500

taaatcttct aactgctttc tttaaagcac ccgcacatgt ctgttgaggt ttcacctgcg 1602 gagacaatct ccgccttcat gggttggaac tgacacagtt gaaggc 1648 <210> 22 <211> 500 <212> PRT <213> sequência artificial <220>

<223> Construto Sintético <400> 22

Met Ser Asp Ser Pro Lys Asn Ala

5

Pro Arg Ile Thr Asp Glu Ala Asp

15

Val Val Leu Ile Gly Ala Gly Ile

Met Ser Ser Thr Leu Gly Ala Met

30

Leu Arg Gln Leu Glu Pro Ser Trp

40

Thr Gln Ile Val Phe Glu Arg Leu 45

Asp Gly Pro Ala Gln Glu Ser Ser

55

Ser Pro Trp Asn Asn Ala Gly Thr

Gly His Ser Ala Leu Cys Glu Leu

6570

Lys Val Glu Ile Ala Lys Ala Val

Asn Tyr Thr Pro Glu Val Lys Gly

7580

Gly Ile Asn Glu Lys Phe Gln Val

9095

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 144/151

94/95

Ser

Pro

Ala

His

145

Thr

Val

Gln

Arg

Ile

225

Ala

Arg

Ser

Ala

Val

305

Phe

Arg Gln

Lys Glu

115

Asp Gln

130

Pro Leu

Glu Lys

Ala Ile

Thr Lys

195

Tyr Gly

210

Val Thr

Asn Phe

Ser Ala

Gly Leu

275

Ala Lys

290

Pro His

Gly Pro

Phe Trp

100

Phe Ile

Val Ala

Phe Gln

Leu Pro

165

Ser Trp

180

Gln Tyr

His Glu

Asp Lys

Val Phe

245

Gly Ile

260

Trp Leu

Val Tyr

Leu Asp

Tyr Gly

325

Ser His

Asn Pro

Tyr Ile

135

Gly Met

150

Leu Met

Ile Asp

Leu Asp

Val Lys

215

Asn Val

230

Val Gly

Pro Gln

Arg Cys

Gly Lys

295

Thr Arg

310

Gly Trp

Leu Val

105

Glu Glu

Gly Val

Val Pro

120

His Val

Ser Phe

125

Lys Ala

Thr Tyr

Ala Lys

Glu Gly

185

Ala Ala

200

Ser Ile

His Thr

Ala Gly

Val Lys

265

Thr Asn

280

Ala Ser

Val Ile

Thr Pro

Arg Tyr

Ala Asp

155

Gly Arg

170

Thr Asp

Glu Val

Lys Ala

Gly Asp

235

Gly Tyr

250

Gly Phe

Glu Glu

Val Gly

Glu Gly

315

Lys Phe

330

Glu Ala

0

Asp Glu

Asp Phe

Ile Asn

Glu Gly

205

Asp Gly

220

Thr Lys

Ala Leu

Ala Gly

Leu Ile

285

Ala Pro

300

Glu Lys

Leu Lys

Leu Ser

110

Gly Gln

Leu Lys

Ala Thr

Ser Asp

175

Tyr Gly

190

Thr Glu

Ala Lys

Thr Ile

Asp Leu

255

Phe Pro

270

Glu Gln

Pro Met

Gly Leu

Glu Gly

335

Asp

Gly

Asp

Phe

160

Pro

Ala

Ile

Trp

Lys

240

Leu

Val

His

Ser

Leu

320

Ser

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 145/151

95/95

Tyr

Leu

Glu

Met

385

Arg

Glu

Leu

Glu

Lys

465

Pro

Leu

Leu

Asp

Leu 340

Phe

Lys

Ser

Ile

Arg 345

Pro

Asp

Asn

Ile

Pro 350

Ser

Gly

Val

Ala

Ala

Gln

Glu

Phe

Asp

Leu

Thr

Lys

Tyr

Leu

Val

355

360

365

Val

Leu

Lys

Asp

Gln

Asp

Lys

Arg

Met

Asp

Ala

Leu

Arg

Glu

370

375

380

Tyr

Thr

Tyr

Pro Glu Ala Gln Asn Gly Asp Trp Glu Thr Ile Val Ala Gly 390 395

Val Gln Val Ile Lys

Pro Ala Gly Phe Pro Lys

405

410

Phe Gly Ser

415

Phe

Gly

Thr 420

Thr

Leu

Ile

Asn

Asn 425

Ser

Glu

Gly

Thr

Ile 430

Ala

Leu

Gly

Ala

Ser

Pro

Gly

Ala

Ser

Ile

Ala

Pro

Ser

Ala

Met

435

440

445

Leu

Leu

Glu

Arg

Cys

Phe

Gly

Asp

Arg

Met

Ile

Glu

Trp

Gly

450

455

460

Leu

Lys

Asp

Met

Ile

Pro

Ser

Tyr

Gly

Lys

Lys

Leu

Ala

Ser

470

475

Ala

Leu

Phe

Glu

Gln

Gln

Trp

Ala

Arg

Thr

Gln

Lys

Thr

Leu

485

490

495

Gly

Ile

Asp

Glu

480

Lys

Glu Glu Ala

500

Gln

400

Leu

Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 146/151

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Bactéria da espécie Corynebacterium glutamicum caracterizada por ter a habilidade de excretar L-lisina contendo em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a atividade de uma malato:quinona oxidoredutase e que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, em que o aminoácido valina na posição 228 é substituído por um aminoácido proteinogênico diferente.
2. 2. Bactéria, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito aminoácido na posição 228 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 é ácido aspártico ou ácido glutâmico.
3. 3. Bactéria, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o dito aminoácido na posição 228 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 é ácido aspártico.
4. 4. Bactéria, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 1001 a 2500 da SEQ ID NO:1, em que a nucleobase na posição 1683 é adenina.
5. 5. Bactéria, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 1001 a 2500 da SEQ ID NO:3.
6. 6. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a extremidade 5' do polinucleotídeo que codifica a dita

   Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 147/151

   2/3 sequência de aminoácidos é diretamente conectada à extremidade 3' do polinucleotídeo que compreende a sequência de nucleotídeos das posições 781 a 1000 da SEQ ID NO:1 ou da SEQ ID NO:3.
7. 7. Bactéria, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 781 a 2500 da SEQ ID NO:3.
8. 8. Bactéria, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 781 a 2500 da SEQ ID NO:1, em que a nucleobase na posição 1683 é adenina.
9. 9. Método para a produção fermentativa de uma L-lisina caracterizado por compreender as etapas de

   a) cultivar a bactéria, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em um meio adequado sob condições adequadas, e

   b) acumular L-lisina no meio para formar um caldo de fermentação contendo L-lisina.
10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 9, sendo que o dito método é caracterizado por compreender fabricar um produto contendo L-lisina a partir do dito caldo de fermentação.
11. 11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 10, sendo que o dito método é caracterizado por compreender extrair ou eliminar substancialmente a água do dito caldo de fermentação.
12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 11,

    Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 148/151

    3/3 caracterizado pelo fato de que pelo menos 40 % (p/p) , preferencialmente pelo menos 90 % (p/p), mais preferencialmente pelo menos 95 % (p/p), de água são extraídos do caldo de fermentação.
13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a dita fabricação compreende uma etapa de purificação.
14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de purificação é selecionada a partir do grupo que consiste em tratamento com carvão, troca iônica e cristalização.
15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por compreender adicionalmente o isolamento de L-lisina do caldo de fermentação e a cristalização de Llisina na forma de um sal.

    Petição 870180162528, de 13/12/2018, pág. 149/151