BR102020001442A2 - Método para a produção fermentativa de l-lisina - Google Patents

Abstract

método para a produção fermentativa de l-lisina. a presente invenção fornece uma bactéria da espécie corynebacterium glutamicum, que tem a capacidade de excretar l-lisina, contendo em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo mutado que tem a função assumida de uma aciltransferase, hidrolase, alfa/beta hidrolase ou de um pimeloil-acp metil éster esterase e um método para a produção de l-lisina usando tal bactéria.

Description

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO FERMENTATIVA DE L-LISINA

[0001] A presente invenção se refere a uma bactéria da espécie Corynebacterium glutamicum, que tem a capacidade de excretar L-lisina, contendo em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo mutado que tem a função assumida de uma aciltransferase, hidrolase, alfa/beta hidrolase ou de um pimeloil-ACP metil éster esterase e um método para a produção de L-lisina usando tal bactéria.

[0002] A L-lisina é usada em medicina humana, na indústria farmacêutica, na indústria alimentícia e particularmente em nutrição de animais. A L-lisina é produzida por fermentação de cepas da espécie Corynebacterium glutamicum. Os métodos usados para melhorar as propriedades de desempenho desses microrganismos são aqueles de mutagênese, seleção e triagem de mutantes. Métodos de tecnologia de DNA recombinante foram usados de modo similar por diversos anos para melhoramento de cepas produtoras de L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum, modificando-se, isto é, melhorando ou atenuando, genes individuais envolvidos em biossíntese de L-lisina e investigando-se o efeito na produção de Llisina.

[0003] As sequências de nucleotídeos dos cromossomos de várias bactérias ou cepas, respectivamente, da espécie Corynebacterium glutamicum e sua análise foram reveladas. Esta informação está disponível nas bases de dados de acesso público e pode ser usada para fins de desenvolvimento de cepa. Um de tais bancos de dados é o banco de dados GenBank do NCBI (Centro Nacional de Informações Biotecnológicas [National Center for Biotechnology Information], U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 EUA). Durante o procedimento de anotação para um cromossomo sequenciado de um organismo, estruturas identificadas, como, por exemplo, genes ou sequências de codificação são dotadas de um identificador exclusivo denominado locus_tag pelo fornecedor das informações do banco de dados.

[0004] A sequência de nucleotídeos do cromossomo de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 e sua análise foram descritos por Ikeda e Nakagawa (Applied Microbiology and Biotechnology 62, 99-109(2003)) e no documento EP1108790 A2. As informações estão disponíveis no NCBI sob o número de acesso NC_003450.

[0005] O locus_tag NCgl0292 identifica uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo sendo um membro da superfamília alfa/beta hidrolase. O número EC é dado como 3.3.2.9. Prevê-se ainda que o produto do gene é uma hidrolase ou uma aciltransferase. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo tendo um comprimento de 331 aminoácidos está disponível também sob o identificador NP_599549.

[0006] A sequência de nucleotídeos do cromossomo ATCC13032 de Corynebacterium glutamicum e sua análise foram independentemente descritas por Kalinowski et al. (Journal of Biotechnology 104 (1-3), 5-25 (2003)). As informações estão disponíveis no NCBI sob o número de acesso NC_006958. Locus_tag CGTRNA_RS01565 identifica uma sequência de nucleotídeos que codifica uma alfa/beta hidrolase prevista.
A designação cg0358 de old_locus_tag também é usada na técnica. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo tendo um comprimento de 331 aminoácidos está disponível também sob o identificador WP_011013543.

[0007] As sequências de nucleotídeo de locus_tag NCgl0292 e CGTRNA_RS01565 são idênticas.

[0008] A sequência de nucleotídeos do cromossomo R de Corynebacterium glutamicum e sua análise foram descritas por Yukawa et al. (Microbiology 153(4):1042-1058 (2007)). Está disponível no NCBI sob o número de acesso AP009044. Locus_tag cgR_0383 identifica uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína hipotética. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo tendo um comprimento de 331 aminoácidos está disponível também sob o identificador BAF53347. A região a partir da posição 54 a 329 da sequência de aminoácidos é chamada MhpC e uma previsão de função como pimeloil-ACP metil éster carboxil esterase é dada.

[0009] O gene mhpC (mnemônico para ácido mhidroxifenilpropiônico) de Escherichia coli codifica uma enzima que participa na degradação de ácido mhidroxifenilpropiônico (Ferrandez et al., Journal of Bacteriology 179(8), 2573-2581 (1997)). A enzima é uma hidrolase que atua sobre as ligações C-C e chamada 2- hidroxi-6-oxononatrienodioato hidrolase. O número EC é 3.7.1.14.

[0010] A sequência de nucleotídeos do cromossomo R de Corynebacterium glutamicum e sua análise também estão disponíveis sob o número de acesso NC_009342. Sob a designação locus_tag CGR_RS01990 e old_locus_tag cgR_0383 uma sequência de nucleotídeos que codifica uma alfa/beta hidrolase é dada.

[0011] S. Binder (Schriften des Forschungszentrums Jülich, Vol. 65, 2013; ISSN 1866-1875) observou uma troca de aminoácido A95V no polipeptídeo identificado por NCgl0292 após triagem por produtores de L-lisina melhorados de Corynebacterium glutamicum.

[0012] A sequência de aminoácidos do polipeptídeo identificado pelo locus_tag NCgl0292 (cepa ATCC13032) é > 97 % idêntica à sequência de aminoácidos do polipeptídeo identificado pelo locus_tag cg_0383 (cepa R).

[0013] Informações relativas aos sinais de transcrição em Corynebacterium glutamicum, por exemplo, a região -10 de um promotor, ou o sítio de iniciação da transcrição (TSS) do gene identificado por old_locus_tag cg0358 podem ser encontradas em Pfeifer-Sancar et al. (BMC Genomics 14:888 (2013)), Albersmeier et al. (Journal of Biotechnology 257 (2017) 99-109) ou Menz et al. (BMC Genomics 2013, 14:714).

[0014] SEQ ID NO: 1 mostra a sequência de nucleotídeos correspondente à NCgl0292. SEQ ID NO: 2 mostra a sequência de aminoácidos do polipeptídeo NCgl0292.

[0015] Com relação à função do polipeptídeo a técnica faz previsões de função relativas ao polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 2 ou o homólogo da cepa R como aciltransferase, hidrolase, alfa/beta hidrolase e pimeloil-ACP metil éster esterase.

[0016] Uma aciltransferase é um tipo de enzima transferase que atua como grupos acila. De acordo com as Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB [Recomendações do Comitê de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia molecular]) as aciltransferases são classificadas sob EC 2.3. Uma revisão sobre aciltransferase é dada por A. Rottig e A. Steinbüchel (Microbiology and Molecular Biology Reviews 77(2), 277-321, 2013) .

[0017] Uma hidrolase é um tipo de enzima que usa água para quebrar uma ligação química. De acordo com NC-IUBMB, as hidrolases são classificadas na EC 3. As ligações de ésteres que agem como hidrolases estão resumidas na classe de enzima EC 3.1.

[0018] O termo alfa/beta-hidrolase resume um grupo de enzimas hidrolíticas caracterizadas pela dobra de α/β-hidrolase no núcleo da enzima (Ollis et al., Protein Engineering 1992; 5(3) :197-211) . O dito núcleo é caracterizado por uma folha alfa/beta compreendendo oito folhas beta conectadas por hélices alfa.

[0019] A enzima pimoloil-ACP metil éster esterase (EC 3.1.1.85) de Escherichia coli catalisa a hidrólise da ligação de metil éster da pimeloil-ACP metil éster (ACP = proteína transportadora de acila) ou pimeloil-CoA metil éster (CoA = coenzima A) para dar pimeloil-ACP ou pimeloil-CoA. Estes compostos são intermediários na biossíntese de biotina. Em Escherichia coli, o dito polipeptídeo de pimeloil-ACP metil éster esterase é codificado por um gene chamado bioH.

[0020] Uma pesquisa de domínio conservado usando o algoritmo BLAST (ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico) fornecido pelo NCBI do polipeptídeo codificado por NCgl0292 (consulte também SEQ ID NO: 2) revela um único hit específico correspondente à família de domínio de proteína conservada MhpC (identificador COG0596). Essa família também é chamada de pimeloil ACP metil éster carboxil esterase no banco de dados.

[0021] Um resumo da rota de síntese de biotina em Escherichia coli foi apresentado por Lin et al. (Nature Chemical Biology 6, 682-688 (2010)). Um resumo das enzimas da biossíntese de biotina presente em Corynebacterium glutamicum é apresentado por L. Eggeling e M. Bott (Eds.) no Handbook of Corynebacterium glutamicum (CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, US, 2005) .

[0022] O objetivo da presente invenção consiste em fornecer medidas inovadoras para a produção fermentativa de L-lisina por bactérias da espécie Corynebacterium glutamicum.

[0023] Consequentemente, a presente invenção fornece uma bactéria da espécie Corynebacterium glutamicum, que tem a habilidade de excretar L-lisina, contendo em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 (ou seja, NCgl0292) , em que o aminoácido serina na posição 225 é substituído por um aminoácido proteinogênico diferente, de preferência, por cisteína ("NCgl0292 (S225C)").

[0024] A sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:2, em que o aminoácido serina na posição 225 é substituído por cisteína, é idêntico ao aminoácido mostrada na SEQ ID NO:4.

[0025] Verificou-se que as bactérias modificadas de acordo com a invenção, excretaram L-lisina em um meio adequado sob condições de fermentação adequadas de uma maneira aumentada em comparação com uma bactéria que não é modifica com relação à NCgl0292.

[0026] Em uma modalidade preferida, a bactéria de acordo com a invenção contém no seu cromossomo um polinucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeos das posições 328 a 1320 da SEQ ID NO:1 com as nucleobases da posição 1001 sendo guanina. A sequência de nucleotídeos das posições 328 a 1320 da SEQ ID NO: 1 com a nucleobase na posição 1001 sendo guanina é idêntica à sequência de nucleotídeos das posições 328 a 1320 da SEQ ID NO:3.

[0027] Em uma outra modalidade preferida, a bactéria de acordo com a invenção contém no seu cromossomo um polinucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeos das posições 328 a 1323 da SEQ ID NO:1 com as nucleobases da posição 1001 sendo guanina. A sequência de nucleotídeos das posições 328 a 1323 da SEQ ID NO: 1 com a nucleobase na posição 1001 sendo guanina é idêntica à sequência de nucleotídeos das posições 328 a 1323 da SEQ ID NO:3.

[0028] O termo L-lisina, quando mencionado no presente documento, em particular, no contexto de formação de produto, também compreende suas formas iônicas e sais, por exemplo, monocloridrato de L-lisina ou sulfato de L-lisina.

[0029] Para a prática da presente invenção, bactérias que excretam L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum são usadas. Cepas adequadas de Corynebacterium glutamicum são cepas que excretam L-lisina obtidas a partir de cepas selvagens dessa espécie, por exemplo, ATCC13032.

[0030] A cepa ATCC13032 (também disponível como DSM20300) é a cepa do tipo taxonômico da espécie Corynebacterium glutamicum. A cepa ATCC14067 (também disponível como DSM20411) também é conhecida sob a designação desatualizada Brevibacterium flavum. A cepa ATCC13869 (também disponível como DSM1412) também é conhecida sob a designação desatualizada Brevibacterium lactofermentum.

[0031] As cepas que excretam L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum contêm tipicamente um polinucleotídeo que codifica uma variante de polipeptídeo de aspartoquinase resistente à retroalimentação. Uma variante de polipeptídeo de aspartoquinase resistente à retroalimentação significa uma aspartoquinase que é menos sensível, ou dessensibilizada, respectivamente, à inibição por misturas de L-lisina e L-treonina, por exemplo, 10 mM cada, ou misturas do análogo de L-lisina S-(2-aminoetil)-L-cisteína e L-treonina, por exemplo, S-(2-aminoetil)-L-cisteína 50 mM e L-treonina 10 mM, em comparação à forma selvagem da enzima, que está contida em cepas selvagens como, por exemplo, ATCC13032, ATCC14067 e ATCC13869. O número EC para aspartoquinase é EC 2.7.2.4. Descrições de polinucleotídeos de Corynebacterium glutamicum que codificam uma variante de polipeptídeo de aspartoquinase resistente à retroalimentação são dadas, por exemplo, nos documentos US5688671, US6844176 e US6893848. Uma lista resumida pode ser encontrada, entre outros, no documento WO2009141330. O símbolo usado na técnica para um gene que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase é lysC. No caso de o gene codificar uma variante do polipeptídeo resistente à retroalimentação, a técnica usa tipicamente símbolos como lysCfbr com fbr indicando resistência à retroalimentação.

[0032] Consequentemente, as ditas cepas que excretam L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum usadas para as medidas da presente invenção contêm de preferência pelo menos uma cópia de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase resistente à retroalimentação.

[0033] A SEQ ID NO:5 mostra a sequência de nucleotídeos da sequência de codificação do polipeptídeo de aspartoquinase da cepa ATCC13032 e a SEQ ID NO:6 mostra a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado. Sabe-se, na técnica (consultar documento US6893848), que a troca do aminoácido Thr na posição 311 da SEQ ID NO :6 por Ile confere à enzima resistência à retroalimentação para inibição por misturas de L-lisina e L-treonina. Consequentemente, é preferencial que a sequência de aminoácidos do dito polipeptídeo de aspartocinase resistente à retroalimentação compreenda a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 contendo isoleucina na posição 311 em vez de treonina.

[0034] A dita troca de amino pode ser alcançada ao trocar a nucleobase citosina (c) na posição 932 da SEQ ID NO:5 para produzir timina (t). O códon acc para treonina é, então, alterado para o códon atc para isoleucina.

[0035] A troca do códon de iniciação gtg da sequência de codificação para o polipeptídeo de aspartoquinase por atg amplifica a expressão do polipeptídeo (consultar, por exemplo, documento EP2796555 A2) . Consequentemente, é preferível que a sequência que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase resistente à retroalimentação seja iniciada com um códon de iniciação atg.

[0036] As cepas excretoras de L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum são amplamente conhecidas na técnica e podem ser modificadas como descrito na presente invenção. Por exemplo, o documento US 7.338.790 B2 descreve a cepa DM1797. É depositada de acordo com o tratado de Budapeste no DSMZ sob o número de acesso DSM16833. DM1797 é um mutante resistente à aminoetilcisteína da cepa ATCC13032 obtida após a mutagênese da N'-metil-N-nitro-nitrosoguanidina. Por exemplo, Blombach et al. (Applied and Environmental Microbiology 75(2), 419-427, 2009) descrevem uma cepa DM1933, a qual está depositada sob número de acesso DSM25442 de acordo com o tratado de Budapeste. A cepa DM1933 foi obtida a partir de ATCC13032 por diversas etapas de desenvolvimento de cepa. Além disso, a cepa DM2031 de Corynebacterium glutamicum que excreta de L-lisina, depositada de acordo com o Tratado de Budapeste como DSM32514, pode ser usada. A cepa DM2031 é um derivado desenvolvido posteriormente a partir de DM1933 que tem habilidade melhorada de excreção de L-lisina. Outras cepas de Corynebacterium glutamicum que excretam L-lisina são descritas, por exemplo, nos documentos WO2008033001 e EP0841395.

[0037] O termo DSM denota o depositório Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen localizado em Braunschweig, Alemanha. O termo ATCC denota o centro depositório American Type Culture Collection [Coleção Americana de Culturas Celulares] localizado em Manasass, Virginia, EUA.

[0038] Ensinamentos e informações sobre o manuseio e o trabalho experimental com os polinucleotídeos podem ser encontrados, entre outros, no handbook de J. Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), no livro texto de C. R. Newton e A. Graham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, 19 94) e no handbook de D. Rickwood e B. D. Hames (Gel electrophoresis of nucleic acids, a practical approach, IRL Press, 1982) .

[0039] Durante o trabalho para a presente invenção, constatou-se que modificar bactérias excretoras de L-lisina da espécie Corynebacterium glutamicum ao trocar o aminoácido serina na posição 225 da sequência de aminoácidos codificada do polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO:2 por um proteinogênico diferente, de preferência cisteína, aumentou sua habilidade de excretar L-lisina em comparação à bactéria não modificada.

[0040] Uma bactéria mutante de acordo com a invenção pode ser obtida por mutagênese in vivo clássica, realizada com populações celulares de cepas de Corynebacterium glutamicum com o uso de substâncias mutagênicas, por exemplo, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, ou luz ultravioleta. A sequência de nucleotídeos que compreende o sítio de mutagênese no gene pode ser amplificada por PCR com o uso de iniciadores selecionados a partir da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:3. Sequenciando-se o produto de PCR, os mutantes desejados são identificados. Detalhes referentes a essa abordagem podem ser encontrados, entre outros, no documento US7754446.

[0041] Um método adicional de mutagênese é a edição de genoma assistida por CRISPR-Cpf1 descrita por Jiang et al. (Nature Communications, 2017 May 8,15179. DOI:10.1038/ncomms15179) ou a edição de genoma assistida CRISPR-Cas9 descrita por Cho et al. (Metabolic Engineering, 2017 Jul,-42:157-167. doi: 10.1016/j.ymben.2017.06.010.), Peng et al. (Microbial Cell Factories, 14 de novembro de 2017;16(1):201. doi: 10.1186/s12934-017-0814-6.) e Liu et al. (Microbial Cell Factories, 16 de novembro de 2017;16(1):205. doi: 10.1186/s12934-017-0815-5.).

[0042] Outro método comum de realizar mutação de genes de Corynebacterium glutamicum é o método de substituição de gene descrito por Schwarzer e Pühler (Bio/Technology 9, 8487 (1991)) e adicionalmente elaborado por Schafer et al. (Gene 145, 69-73 (1994)).

[0043] Peters-Wendisch et al. (Microbiology 144, 915-927 (1998) ) usou o método de substituição de gene para inativar o gene pyc de Corynebacterium glutamicum que codifica carboxilase piruvato. No documento US7585650 o método foi aplicado ao gene zwf para realizar uma troca de aminoácido na posição 321 da sequência de aminoácidos da subunidade Zwf de glicose 6-fosfato desidrogenase. No documento US7754446, o método foi aplicado ao gene rel para realizar uma troca de aminoácido na posição 38 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de GTP-pirofosfato quinase.

[0044] No método de substituição de gene, uma mutação, por exemplo, uma deleção, inserção ou substituição de pelo menos uma nucleobase, é fornecida por um polinucleotídeo isolado que compreende a sequência de nucleotídeos do gene em questão ou uma parte do mesmo que contém a mutação.

[0045] No contexto da presente invenção, a sequência de nucleotídeos do gene em questão é o gene identificado por locus_tag NCgl0292.

[0046] No contexto da presente invenção, a mutação é uma substituição de pelo menos uma nucleobase localizada no códon que especifica o aminoácido serina na posição 225 da sequência de aminoácidos codificada (consultar SEQ ID NO:1) do polipeptídeo NCgl0292.

[0047] Como consequência da dita mutação, o códon especifica um aminoácido proteinogênico diferente de serina, de preferência, cisteína. Os códons que especificam a cisteína são tgt ou tgc. O códon tgc é preferencial.

[0048] O códon para o aminoácido na posição 225 da sequência de aminoácidos tem a posição de 1000 a 1002 na SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3. A sequência de nucleotídeos da posição 1000 a 1002, em particular, o nucleotídeo na posição 1001, também pode ser denominada sítio de mutação.

[0049] A sequência de nucleotídeos que sofreu mutação do gene em questão ou uma parte do mesmo que contém a mutação compreende i) uma sequência de nucleotídeos na extremidade 5' do sítio de mutação, a qual também é denominada sequência flanqueadora 5' ou sequência a montante na técnica, ii) uma sequência de nucleotídeos na extremidade 3' do sítio de mutação, a qual também é denominada sequência flanqueadora 3' ou sequência a jusante na técnica, e iii) a sequência de nucleotídeos do sítio de mutação entre i) e ii).

[0050] A dita sequência flanqueadora 5' e a sequência flanqueadora 3' necessárias para recombinação homóloga têm tipicamente um comprimento de pelo menos 200 pb, pelo menos 400 pb, pelo menos 600 pb ou pelo menos 800 pb. O comprimento máximo é tipicamente 1000 pb, 1500 pb ou 2000 pb.

[0051] Um exemplo de um polinucleotídeo que compreende uma sequência de nucleotídeo mutada no contexto da presente invenção é mostrado na SEQ ID NO:7. A sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:7 das posições 24 a 1511 corresponde à SEQ ID NO:3 das posições 261 a 1748. O polinucleotídeo mostrado na SEQ ID NO: 7 contém nos seus sítios de reconhecimento de extremidade 5' e 3' para endonuclease de restrição úteis para fins de clonagem. A SEQ ID NO: 7 contém a sequência de codificação de uma variante do polipeptídeo NCgl0292 descrito nesta invenção. A sequência flanqueadora 5' consiste na sequência de nucleotídeos das posições 24 a 763 da SEQ ID NO:7. A sequência flanqueadora 3' consiste na sequência de nucleotídeos das posições 765 a 1511 da SEQ ID NO:7. O sítio de mutação está na posição 764 da SEQ ID NO:7.

[0052] A sequência de nucleotídeos que sofreu mutação fornecida é clonada em um vetor plasmidial, por exemplo, pK18mobsacB descrito por Schãfer et al. (Gene 145, 69-73 (1994)), que não é capaz de replicação autônoma em Corynebacterium glutamicum. O dito vetor de plasmídeo compreendendo a dita sequência de nucleotídeos mutada é subsequentemente transferido para a cepa desejada de Corynebacterium glutamicum pela transformação ou conjugação. Após dois eventos de recombinação homóloga que compreendem um evento de recombinação dentro da sequência flanqueadora 5' fornecido pelo vetor de plasmídeo com a sequência homóloga do cromossomo de Corynebacterium glutamicum e um evento de recombinação dentro da sequência flanqueadora 3' fornecida pelo vetor de plasmídeo com a sequência homóloga do cromossomo de Corynebacterium glutamicum, um realizando a integração e o outro realizando a excisão do dito vetor de plasmídeo, a mutação é incorporada no cromossomo de Corynebacterium glutamicum. Desse modo, a sequência de nucleotídeos do gene em questão contida no cromossomo da dita cepa desejada é substituída pela sequência de nucleotídeos que sofreu mutação. A presença da mutação na cepa desejada é então confirmada, por exemplo, por análise da sequência de nucleotídeos ou PCR em tempo real com o uso de FRET como descrito acima.

[0053] Um evento de recombinação homóloga também pode ser denominado permutação.

[0054] A invenção fornece, ainda, um processo fermentativo para produzir L-lisina, com o uso da Corynebacterium glutamicum da presente invenção.

[0055] Em um processo fermentativo de acordo com a invenção, uma Corynebacterium glutamicum modificada de acordo com a presente invenção e que tem a habilidade de excretar L-lisina é cultivada em um meio adequado sob condições adequadas. Devido à sua habilidade de excretar a dita L-lisina, a concentração de L-lisina aumenta e se acumula no meio durante o processo fermentativo e a L-lisina é, então, produzida.

[0056] O processo fermentativo pode ser um processo descontínuo, como um processo de batelada ou um processo de batelada alimentada, ou um processo contínuo. Um resumo referente à natureza geral de processos de fermentação está disponível no livro por H. Chmiel (Bioprozesstechnik, Spektrum Akademischer Verlag, 2011), no livro de C. Ratledge e B. Kristiansen (Basic Biotechnology, Cambridge University Press,2006) ou no livro de V.C. Hass e R. Portner (Praxis der Bioprozesstechnik Spektrum Akademischer Verlag, 2011).

[0057] Um meio adequado usado para a produção de L-lisina por um processo fermentativo contém uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo, íons inorgânicos e outros compostos orgânicos, conforme necessário.

[0058] As fontes de carbono adequadas incluem glicose, frutose, sacarose, bem como as matérias-primas correspondentes, como hidrolisado de amido, melaços ou xarope de milho com alto teor de frutose.

[0059] Como fonte de nitrogênio, compostos contendo nitrogênio orgânico, como peptonas, extrato de carne, hidrolisados de soja ou ureia, ou compostos inorgânicos, como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio, nitrato de amônio, gás de amônio ou amônia aquosa, podem ser usados.

[0060] Como fonte de fósforo, ácido fosfórico, di-hidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato de dipotássio ou os sais contendo sódio correspondentes podem ser usados.

[0061] Íons inorgânicos, como potássio, sódio, magnésio, cálcio, ferro e demais elementos-traço etc. são fornecidos como sais de ácido sulfúrico, ácido fosfórico ou ácido clorídrico.

[0062] Outros compostos orgânicos representam fatores de crescimento essenciais, como vitaminas, por exemplo, tiamina ou biotina ou L-aminoácidos, por exemplo, L-homosserina.

[0063] Os componentes de meio podem ser adicionados à cultura na forma de uma única batelada ou podem ser alimentados durante o cultivo de uma maneira adequada.

[0064] Durante o processo fermentativo, o pH da cultura pode ser controlado empregando-se compostos básicos, como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou amônia aquosa, ou compostos ácidos, como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico de uma maneira adequada. O pH é geralmente ajustado a um valor de 6,0 a 8,5, preferencialmente 6,5 a 8,0. Para controlar a formação de espuma, é possível empregar agentes antiespumantes, como, por exemplo, poliglicol ésteres de ácido graxo. Para manter a estabilidade de plasmídeos, é possível adicionar ao meio substâncias seletivas adequadas, como, por exemplo, antibióticos. O processo fermentativo é preferencialmente realizado sob condições aeróbicas. A fim de manter essas condições, oxigênio ou misturas de gás contendo oxigênio, como, por exemplo, ar, são introduzidos na cultura. O processo fermentativo é realizado, quando adequado, a uma pressão elevada, por exemplo, a uma pressão elevada de 0,03 a 0,2 MPa. A temperatura da cultura é normalmente de 25 °C a 40 °C, preferencialmente de 30 °C a 37 °C. Em um processo descontínuo, o cultivo é continuado até que uma quantidade da L-lisina suficiente para ser recuperada tenha sido formada. O cultivo é, então, concluído. Esse objetivo é normalmente alcançado em 10 horas a 160 horas. Em processos contínuos, períodos mais longos de cultivo são possíveis.

[0065] Então, o processo fermentativo resulta em um caldo de fermentação que contém a L-lisina desejada.

[0066] Consequentemente, um método para a produção fermentativa de L-lisina é fornecido, o qual compreende as etapas de

• a) cultivar uma Corynebacterium glutamicum da presente invenção em um meio adequado sob condições adequadas, e
• b) acumular a dita L-lisina no meio para produzir um caldo de fermentação contendo L-lisina.

[0067] Um produto contendo a L-lisina é, então, recuperado em líquido ou sólido do caldo de fermentação.

[0068] Um "caldo de fermentação" significa um meio em que um Corynebacterium glutamicum da invenção foi cultivado por um certo tempo e sob certas condições.

[0069] Quando o processo fermentativo é concluído, o caldo de fermentação resultante compreende consequentemente: A biomassa (massa da célula) da Corynebacterium glutamicum da invenção, a dita biomassa tendo sido produzida devido à propagação das células da dita Corynebacterium glutamicum, a L-lisina desejada acumulada durante o processo de fermentação, os subprodutos orgânico acumulados durante o processo de fermentação, e os componentes do meio empregado o qual não foi consumido no processo de fermentação.

[0070] Os subprodutos orgânicos incluem compostos que podem ser formados pela Corynebacterium glutamicum durante o processo fermentativo de acordo com a presente invenção além da produção da L-lisina.

[0071] O caldo de fermentação é removido do vaso de cultura ou tanque de fermentação, coletado em lugar adequado e usado para fornecer um produto contendo a L-lisina, em forma líquida ou sólida. A expressão "recuperar o produto contendo L-lisina" também é usada para tanto. No caso mais simples, o próprio caldo de fermentação contendo L-lisina, o qual foi removido do tanque de fermentação, constitui o produto recuperado.

[0072] O caldo de fermentação pode subsequentemente ser submetido à extração ou eliminação substancial de água do dito caldo de fermentação.

[0073] A remoção da biomassa pode ser alcançada, entre outros, por centrifugação, filtração ou decantação ou uma combinação desses.

[0074] A fabricação de um produto de L-lisina também pode compreender uma etapa de purificação, de preferência, selecionada do grupo que consiste em cromatografia de troca iônica, tratamento com carvão ativado ou cristalização.

[0075] Assim, por exemplo, um produto que contém L-Lisina x HCl, de preferência, contendo ≥ 80 % de L-Lisina x HCl, particularmente de preferência ≥ 90 % de L-Lisina x HCl ou ≥ 95 % de L-Lisina x HCl pode ser obtido.

[0076] A análise de L-lisina para determinar sua concentração em um ou mais períodos durante a fermentação pode ocorrer separando-se a L-lisina por meio de cromatografia de troca iônica, preferencialmente cromatografia de troca catiônica, com derivatização pós-coluna subsequente com o uso de ninidrina, como descrito por Spackman et al. (Analytical Chemistry 30: 1190-1206 (1958)). Também é possível empregar orto-ftalaldeído em vez de ninidrina para a derivatização pós-coluna. Um artigo de visão geral sobre cromatografia de troca iônica pode ser encontrado em Pickering (LC.GC (Magazine of Chromatographic Science 7(6):484-487 (1989)). É possível, do mesmo modo, realizar uma derivatização pré-coluna, por exemplo, com o uso de orto-ftalaldeído ou isotiocianato de fenila, e fracionar os derivados de aminoácido resultantes por cromatografia de fase reversa (RP), preferencialmente na forma de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Um método desse tipo é descrito, por exemplo, em Lindroth et al. (Analytical Chemistry 51:1167-1174 (1979)). A detecção é realizada fotometricamente (absorção, fluorescência). Uma resenha referente à análise de aminoácido pode ser encontrada, entre outros, no livro "Bioanalytik" por Lottspeich e Zorbas (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha 1998) .

SEÇÃO EXPERIMENTAL A) MATERIAIS e MÉTODOS

[0077] Os kits, iniciadores e produtos químicos de biologia molecular usados e alguns detalhes dos métodos aplicados são brevemente descritos no presente documento.
1. Antibióticos e produtos químicos

• a. Canamicina: Solução de canamicina de Streptomyces kanamyceticus adquirida junto à Sigma Aldrich (St. Louis, EUA, n° de Cat. K0254).
• b. Ácido nalidíxico: Sal de sódio de ácido nalidíxico disponível junto à Sigma Aldrich (St. Louis, EUA, n° de Cat. N4382).
• c. Se não for declarado de outro modo, todos os produtos químicos foram adquiridos analiticamente puros junto à Merck (Darmstadt, Alemanha), Sigma Aldrich (St. Louis, EUA) ou Carl-Roth (Karlsruhe, Alemanha).

2. Cultivo
Se não for declarado de outro modo, todos os procedimentos de cultivo/incubação foram realizados como a seguir:

• a. Caldo de LB (MILLER) da Merck (Darmstadt, Alemanha; n° de Cat. 110285) foi usado para cultivar cepas de E. coli em meio líquido. As culturas líquidas (10 ml de meio líquido por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foram incubadas no agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Einsbach, Alemanha) a 37 °C e 200 rpm.
• b. Ágar de LB (MILLER) da Merck (Darmstadt, Alemanha n° de Cat. 110283) foi usado para cultivo de cepas de E. coli em placas de ágar. As placas de ágar foram incubadas a 37 °C em uma mini-incubadora INCU-Line® da VWR (Radnor, EUA).
• c. Caldo de infusão cérebro-coração (BHI) da Merck (Darmstadt, Alemanha; n° de Cat. 110493) foi usado para cultivar cepas de C. glutamicum em meio líquido. As culturas líquidas (10 ml de meio líquido por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foram incubadas no agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Einsbach, Alemanha) a 33 °C e 200 rpm.
• d. Ágar cérebro-coração (ágar BHI) da Merck (Darmstadt, Alemanha; n° de Cat. 113825) foi usado para cultivo de cepas de C. glutamicum em placas de ágar. As placas de ágar foram incubadas a 33 °C em uma incubadora da Heraeus Instruments com controlador de temperatura Kelvitron® (Hanau, Alemanha).

3. Determinação de densidade óptica

• a. A densidade óptica de suspensões bacterianas em culturas de frasco de agitação foi determinada a 600 nm (OD600) com o uso do BioPhotometer da Eppendorf AG (Hamburgo, Alemanha).
• b. A densidade óptica de suspensões bacterianas produzidas no sistema de microfermentação Wouter Duetz (WDS) (Placas de 24 poços) foi determinada a 660 nm (OD660) com o leitor de placa GENios™ da Tecan Group AG (Männedorf, Suíça).

4. Centrifugação

• a. Centrífuga de bancada para tubos de reação com um volume de até 2 ml

[0078] As suspensões bacterianas com um volume máximo de 2 ml foram levadas à sedimentação com o uso de tubos de reação de 1 ml ou 2 ml (por exemplo, Eppendorf Tubes® 3810X) com o uso de uma centrífuga Eppendorf 5417 R (5 min a 13.000 rpm).
b. Centrífuga de bancada para tubos com um volume de até 50 ml

[0079] As suspensões bacterianas com um volume máximo de 50 ml foram levadas à sedimentação com o uso de tubos de centrífuga de 15 ml ou 50 ml (por exemplo, Tubos de Centrífuga Cônica de 50 ml FalconTM) com o uso de uma centrífuga Eppendorf 5810 R por 10 min a 4.000 rpm.

5. Detecção de mutações com o uso de FRET

[0080] A presença de uma dada mutação, por exemplo, uma troca de nucleobase, foi detectada por PCR em tempo real em combinação com sondas de hibridização de FRET. O termo FRET é a abreviatura de transferência de energia de ressonância de fluorescência. Como o instrumento de PCR em tempo real, um Lightcycler da Roche Diagnostics® foi usado (consultar abaixo).

[0081] Esse método foi, por exemplo, usado por M. J. Lay e C. T. Wittwer (Clinical Chemistry 42 (12), 2262-2267 (1997)) para a genotipagem de fator V de Leiden. Cyril DS Mamotte (The Clinical Biochemist Reviews 27, 63-75 (2006) revisa a genotipagem de substituições de nucleotídeo único com o uso desse método. Resumos referentes a esse método podem ser encontrados nos livros Lewin's Genes XII de Jocelyn E. Krebs, Elliott S. Goldstein e Stephan T. Kilpatrick (Jones e Bartlett Publishers, EUA, 2018), Molecular Diagnostics, 12 Tests that changed everything de W. Edward Highsmith (Humana Press, Springer, Nova York, 2014) ou em outras publicações da técnica.

[0082] A sonda doadora de hibridização de FRET foi identificada com o corante fluorescente fluoresceína e a sonda receptora com o corante fluorescente LC-Red640. Em essência, o método de detecção compreendia três etapas: PCR de colônia, hibridização por sonda e análise de curva de fusão subsequente. O método é simplesmente denominado PCR em tempo real no presente documento.

a. Iniciadores e Sondas

[0083] Os oligonucleotídeos usados foram sintetizados por Eurofins Genomics GmbH (Ebersberg, Alemanha).

b. Modelo

[0084] Como modelo de PCR, o DNA total contido em uma colônia foi usado. Foi preparado obtendo-se material celular com um palito de uma colônia em uma placa de ágar e colocando-se o material celular diretamente no tubo de reação de PCR. O material celular foi aquecido por 10 s com 800 W em um forno de micro-ondas do tipo Mikrowave & Grill da SEVERIN Elektrogeräte GmbH (Sundern, Alemanha) e, então, os reagentes de PCR foram adicionados ao modelo no tubo de reação de PCR.

b. Mistura de Reação

[0085] O kit de PCR de sonda Fast SNP Type-it® (Kit Type-it) da Qiagen (Hilden, Alemanha, n° de Cat. 206045) foi usado para detecção em tempo real das mutações. Portanto, 2,5 μl do Qiagen Fast SNP Puffer (2x) foram misturados com 0,5 μl de cada um dos Iniciadores de LC-PCR [10 μΜ] e 0,5 μl de cada uma das sondas receptora e doadora diluídas a 1:500 [100 pmol/μl] para obter a mistura principal para a PCR em tempo real.
Tabela 1: Condições de termociclização para PCR com o LightCycler® (etapas 1-3) e análise de curva de fusão (etapas 4-6).

c. Ciclador PCR

[0086] As reações foram realizadas em um Instrumento LightCycler® 2.0 e analisadas com o Software 4.1 LightCycler® da Roche Diagnostics (Rotkreuz, Suíça).

6. Transformação química de E. coli

[0087] A cepa S17-1 de E. coli K-12 foi usada como doadora para transferência conjugacional de plasmídeos baseados em pk18mobsacB de E. coli para C. glutamicum. A cepa S17-1 é descrita por Simon, R. et al. (Bio/Technology 1, 784-794, 1983). Está disponível junto à Coleção Americana de Culturas Celulares sob o número de acesso ATCC47055.

[0088] As células de E. coli S17-1 quimicamente competentes foram feitas como a seguir: Uma pré-cultura de 10 ml de meio de LB (10 ml de meio líquido por frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores) foi inoculada com 100 μl de suspensão bacteriana da cepa S17-1 e a cultura foi incubada de um dia para o outro por cerca de 18 h a 37 °C e 250 rpm. A cultura principal (70 ml de LB contidos em um frasco Erlenmeyer de 250 ml com 3 defletores) foi inoculada com 300 μl da pré-cultura e incubada até um OD600 de 0,5-0,8 a 37 °C. A cultura foi centrifugada por 6 min a 4 °C e 4000 rpm e o sobrenadante foi descartado. O pélete celular foi ressuspenso em 20 ml de solução estéril gelada de CaCl2 50 mM e incubado no gelo por 3 0 min. Após outra etapa de centrifugação, o pélete foi ressuspenso em 5 ml de solução gelada de CaCl2 50 mM e a suspensão foi incubada no gelo por 30 min. A suspensão celular foi, então, ajustada a uma concentração final de glicerol a 20 % (v/v) com glicerol estéril gelado a 85 %. A suspensão foi dividida em alíquotas de 50 μl e armazenada a -80 °C.

[0089] Para transformar células S17-1, o protocolo de acordo com Tang et al. (Nucleic Acids Res. 22(14), 28572858, 1994) com um choque térmico de 45 s foi usado.

7. Conjugação de C. glutamicum

[0090] O sistema de plasmídeo pK18mobsacB descrito por Schäfer et al. (Gene 145, 69 - 73, 1994) foi usado para integrar fragmentos de DNA desejado no cromossomo de C. glutamicum. Um método de conjugação modificada de Schãfer et al. (Journal of Bacteriology 172, 1663 - 1666, 1990) foi usado para a transferência do respectivo plasmídeo para a cepa recipiente de C. glutamicum desejada.

[0091] As culturas líquidas das cepas de C. glutamicum foram realizadas em meio de BHI a 33 °C. O choque térmico foi realizado a 48,5 °C por 9 min. Transconjugantes foram selecionados plaqueando-se a batelada de conjugação em ágar de EM8 (Tabela 2) , a qual foi suplementada com 25 mg/l de canamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. As placas de ágar de EM8 foram incubadas por 72 h a 33 °C.
Tabela 2: Composição do ágar de EM8

[0092] Palitos estéreis foram usados para a transferência dos transconjugantes para ágar de BHI, o qual foi suplementado com 25 mg/l de canamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. As placas de ágar foram incubadas por 20 h a 33 °C. As culturas dos respectivos transconjugantes produzidos dessa maneira foram, então, propagadas adicionalmente por 24 h a 33 °C em 10 ml de meio de BHI contido em frascos Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Uma alíquota foi obtida da cultura líquida, adequadamente diluída e plaqueada (tipicamente 100 a 200 μl) em ágar de BHI que foi suplementado com sacarose a 10 %. As placas de ágar foram incubadas por 48 h a 33 °C. As colônias em crescimento nas placas de ágar contendo sacarose foram, então, examinadas para o fenótipo de sensibilidade à canamicina. Para fazê-lo, um palito foi usado para remover material celular da colônia e transferi-lo para ágar de BHI contendo 25 mg/l de canamicina e para ágar de BHI contendo sacarose a 10 %. As placas de ágar foram incubadas por 60 h a 33 °C. Clones que se provaram sensíveis à canamicina e resistentes à sacarose foram examinados para integração do fragmento de DNA desejado por meio de PCR.

8. Estoques de glicerol de cepas de E.coli e C. glutamicum

[0093] Para um armazenamento de longo período de cepas de E.coli e C. glutamicum, estoque de glicerol foram preparados. Os clones de E. coli selecionados foram cultivados em 10 ml de meio de LB suplementado com 2 g/l de glicose. Os clones de C. glutamicum selecionados foram cultivados em meio de BHI concentrado duas vezes suplementado com 2 g/l de glicose. Culturas de cepas de E. coli contendo plasmídeo foram suplementadas com 50 mg/l de canamicina. Culturas de cepas de C. glutamicum contendo plasmídeo foram suplementadas com 25 mg/l de canamicina. O meio estava contido em frascos Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Foi inoculado com um laço de células obtido a partir de uma colônia e a cultura foi incubada por cerca de 18 h a 37 °C e 200 rpm no caso de E. coli e 33 °C e 200 rpm no caso de C. glutamicum. Após o dito período de incubação, 1,2 ml de glicerol estéril a 85 % (v/v) foram adicionados à cultura. A suspensão celular contendo glicerol obtida foi, então, dividida em alíquotas em porções de 2 ml e armazenada a -80 °C.

9. Sistema de cultivo de acordo com Wouter Duetz (WDS)

[0094] O sistema de cultivo de escala em mililitros de acordo com Duetz (Trends Microbiol. 2007; 15(10):469-75) foi usado para investigar o desempenho das cepas de C. glutamicum construídas. Para esse propósito, microplacas de 24 poços profundas (placas WDS de 24 poços) da EnzyScreen BV (Heemstede, Holanda; n° de Cat. CR1424) preenchidas com 2,5 ml de meio foram usadas.

[0095] Pré-culturas das cepas foram feitas em 10 ml de meio de BHI concentrado duas vezes. O meio estava contido em um frasco Erlenmeyer de 100 ml com 3 defletores. Foi inoculado com 100 μl de uma cultura de estoque de glicerol e a cultura foi incubada por 24 h a 33 °C e 200 rpm.

[0096] Após o dito período de incubação, as densidades ópticas OD600 das pré-culturas foram determinadas.

[0097] As culturas principais foram feitas inoculando-se os poços contendo 2,5 ml de meio da Placa de WDS de 24 poços com uma alíquota da pré-cultura para produzir uma densidade óptica OD600 de 0,1.

[0098] Como meio para a cultura principal, o meio de CGXII descrito por Keilhauer et al. (J. Bacteriol. 1993 Set; 175(17): 5595-5603) foi usado. Por conveniência, a composição do meio de CGXII é mostrada na tabela 3.
Tabela 3: Composição do meio de CGXII de Keilhauer.

[0099] Essas culturas principais foram incubadas por aproximadamente 45 h a 33 °C e 300 rpm em um agitador de incubadora padrão Infors HT Multitron da Infors GmbH (Bottmingen, Suíça) até o consumo completo de glicose.

[0100] A concentração de glicose na suspensão foi analisada com o medidor de glicose no sangue OneTouch Vita® da LifeScan (Johnson & Johnson Medical GmbH, Neuss, Alemanha).

[0101] Após o cultivo, as suspensões de cultura foram transferidas para uma microplaca de poço profundo. Uma parte da suspensão de cultura foi adequadamente diluída para medir o OD600. Outra parte da cultura foi centrifugada e a concentração de L-aminoácidos, em particular, L-lisina, e glicose residual foi analisada no sobrenadante.

10. Analisador de aminoácido

[0102] A concentração de L-lisina e outros L-aminoácidos, nos sobrenadantes de cultura foi determinada por cromatografia de troca iônica com o uso de um analisador de aminoácidos SYKAM S433 da SYKAM Vertriebs GmbH (Fürstenfeldbruck, Alemanha). Como fase sólida, uma coluna com trocador de cátion esférico à base de poliestireno (Peek LCA N04/Na, dimensão 150 x 4,6 mm) da SYKAM foi usada. Dependendo do L-aminoácido, a separação ocorre em um ciclo isocrático com o uso de uma mistura de tampões A e B para eluição ou por eluição de gradiente com o uso dos ditos tampões. Como tampão A, uma solução aquosa contendo, em 20 l, 263 g de citrato de trissódio, 120 g de ácido cítrico, 1100 ml de metanol, 100 ml de HCl a 37 % e 2 ml de ácido octanoico (pH final 3,5) foi usada. Como tampão B, uma solução aquosa contendo, em 20 l, 392 g de citrato de trissódio, 100 g de ácido bórico e 2 ml de ácido octanoico (pH final 10,2) foi usada. Esses aminoácidos livres foram coloridos com ninidrina através de derivatização pós-coluna e detectados fotometricamente a 570 nm.

[0103] 11. Determinação de glicose com sistema de fluxo contínuo (CFS)

[0104] Um analisador de fluxo contínuo multicanal SANplus da SKALAR Analytic GmbH (Erkelenz, Alemanha) foi usado para determinar a concentração de glicose no sobrenadante. A glicose foi detectada com um ensaio acoplado de enzima (Hexoquinase/ Glicose-6-Fosfato-Desidrogenase) por formação de NADH.

B) RESULTADOS EXPERIMENTAIS Exemplo 1 Sequência do gene NCgl0292 da cepa DM1933 de C. glutamicum

[0105] A cepa DM1933 é uma produtora de L-lisina descrita por Blombach et al. (Applied and Environmental Microbiology 75(2), 419-427, 2009). É depositada de acordo com o tratado de Budapeste no DSMZ sob o número de acesso DSM25442. C. glutamicum DM1933 tem as seguintes características (c.f. Blombach et al. (Applied and Environmental Microbiology 75(2), 419-427, 2009); Página 420, Tabela 1): Apck pyc(P458S) hom(V59A), 2 cópias de lysC(T311I), 2 cópias de asd, 2 cópias de dapA, 2 cópias de dapB, 2 cópias de ddh, 2 cópias de lysA, 2 cópias de lysE (derivadas da cepa do tipo selvagem de C. glutamicum ATCC 13032) .

[0106] A sequência de nucleotídeos do cromossomo da cepa DM1933 foi determinada por tecnologia de sequenciamento de genoma completo Illumina (Illumina Inc., San Diego, CA, EUA) . Consultar, por exemplo, Benjak et al. (2015) Whole-Genome Sequencing for Comparative Genomics e De Novo Genome Assembly. Em: Parish T., Roberts D. (eds) Mycobacteria Protocols. Methods in Molecular Biology, Vol 1285. Humana Press, NY, US) e Bennet, S. (Pharmacogenomics 5(4), 433-438, 2004). Constatou-se que a sequência de nucleotídeos da sequência de codificação de Ncgl0292 da cepa DM1933, incluindo a sequência de nucleotídeos a montante e a jusante da mesma, é idêntica àquela de ATCC13032 mostrada na SEQ ID NO:1.

[0107] DM1933 contém em seu cromossomo uma variante do gene de aspartoquinase (lysC) que codifica um polipeptídeo de aspartoquinase resistente à retroalimentação. O dito polipeptídeo de aspartoquinase resistente à retroalimentação tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 da listagem de sequências, em que o aminoácido treonina (Thr) na posição 311 da sequência de aminoácidos é substituído por isoleucina (Ile). No documento US 7.338.790, a abreviatura "lysC T311I" é usada para indicar a dita troca. Blombach et al. usam a abreviatura "lysC(T311I) " .

Exemplo 2 Construção do plasmídeo pK18mobsacB_NCgl0292_S225C

[0108] O plasmídeo pK18mobsacB_NCgl0292_S225C foi construído para possibilitar a incorporação da mutação que causa a troca de aminoácido S225C para a sequência de nucleotídeos da sequência codificadora NCGl0292 da cepa DM1933. O plasmídeo é baseado no vetor móvel pK18mobsacB descrito por Schãfer et al. (Gene 145, 69-73, 1994) . Para a construção do pK18mobsacB_NCgl0292_S225C a sequência NCgl0292_S225C de acordo com a SEQ ID NO:7 foi sintetizada e sub-clonada em pK18mobsacB por GeneArt (ThermoFisher Scientific (Waltham, EUA)).

[0109] O conjunto de plasmídeo pK18mobsacB_NCgl0292_S225C foi feito por GeneArt (ThermoFisher Scientific (Waltham, USA)) da seguinte forma: os dois polinucleotídeos, ou seja, o vetor pK18mobsacB cortado com SbfI and XmaI e o polinucleotídeo NCgl0292_S225C cortado com SbfI mais XmaI foram ligados e a mistura da ligação usada para transformar E.coli. O DNA do plasmídeo foi, então, isolado a partir do transformante.

Exemplo 3 Construção da cepa DM1933_NCgl0292_S225C

[0110] O plasmídeo pK18mobsacB_NCgl0292_S225C obtido no exemplo 2 foi usado para incorporar as mutações que levaram às trocas de aminoácido S225C (consultar as posições de nucleotídeos 764 da SEQ ID NO:7) no cromossomo da DM1933 produtora de L-lisina. Células quimicamente competentes da cepa S17-1 de E. coli foram transformadas com DNA plasmidial de pK18mobsacB_NCgl0292_S225C. O método de conjugação modificado de Schãfer et al. (Journal of Bacteriology 172, 1663 - 1666, 1990), como descrito em materiais e métodos, foi usado para transferência conjugada para a cepa DM1933 e para seleção de clones de transconjugantes em virtude de sua resistência à sacarose e fenótipo de sensibilidade à canamicina. Os clones transconjugantes foram analisados por PCR em tempo real com o uso do Kit Type-it e os iniciadores NCgl0292_fw e NCgl0292_rev para amplificação de PCR e NCgl0292_C como sonda de aceptor e NCgl02 92_A como sonda de doador para análise de curva de fusão (tabela 4). Os ditos iniciadores e sondas também são mostrados sob as SEQ ID NO's 9 a 12 da listagem de sequências.
Tabela 4: Lista de iniciadores e sondas usadas para PCR em tempo real.

1 sonda receptora identificada com LC-Red640 na extremidade 5' e fosforilada na extremidade 3'
2 sonda doadora identificada com fluoresceína na extremidade 3'

[0111] Um dos clones de transconjugante então caracterizado foi denominado DM1933_NCgl0292_S225C. A cultura de estoque de glicerol do clone de transconjugante foi preparada e usada como material de partida para investigações adicionais.

[0112] Então, o gene NCgl0292 da cepa DM1933 foi submetido à mutação com o efeito de que o aminoácido serina na posição 220 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo NCgl0292 codificado foi substituído por cisteína.

Exemplo 4 Produção de L-lisina pela cepa DM1933_NCgl0292_S225C

[0113] As cepas DM1933 (referência) e DM1933_NCgl0292_S225C obtidas no exemplo 3 foram analisadas quanto à sua habilidade de produzir L-lisina de glicose por cultivo de batelada com o uso de sistema de cultivo de acordo com Wouter Duetz.

[0114] Como meio, CGXII contendo 20 g/l de glicose como fonte de carbono foi usado. As culturas foram incubadas por cerca de 45 h até o consumo completo de glicose como confirmado por análise de glicose com o uso de medidor de glicose no sangue e as concentrações de L-lisina e a densidade óptica OD660 foram determinadas. O resultado do experimento é apresentado na tabela 5.
Tabela 5: Produção de L-lisina pela cepa DM1933_NCgl0292_S225C.

1 como L-lisina x HCl

[0115] O experimento mostra que a produção de L-lisina foi aumentada na cepa DM1933_NCgl0292_S225C em comparação à cepa principal DM1933.

Claims (9)

1. Bactéria caracterizada por ser da espécie Corynebacterium glutamicum, que tem a habilidade de excretar L-lisina, contendo em seu cromossomo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, em que o aminoácido serina na posição 225 é substituído por um aminoácido proteinogênico diferente.
2. Bactéria, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito aminoácido na posição 225 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 é cisteína.
3. Bactéria, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 328 a 1320 da SEQ ID NO:1, com a nucleobase na posição 1001 sendo guanina.
4. Bactéria, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo que codifica a dita sequência de aminoácidos compreende a sequência de nucleotídeos das posições 328 a 1323 da SEQ ID NO:1, com a nucleobase na posição 1001 sendo guanina.
5. Bactéria, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por conter pelo menos uma cópia de um polinucleotídeo que codifica um polinucleotídeo aspartoquinase resistente à retroalimentação.
6. Bactéria, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos do dito polipeptídeo aspartoquinase resistente à retroalimentação compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 contendo isoleucina na posição 311 em vez da treonina.
7. Método para a produção fermentativa de L-lisina caracterizado por compreender as etapas de a) cultivar a bactéria conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 em um meio adequado sob condições adequadas, e b) acumular L-lisina no meio para formar um caldo de fermentação contendo L-lisina.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por compreender adicionalmente a etapa de purificação de L-lisina.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a dita etapa de purificação é selecionada a partir do grupo que consiste em tratamento com carvão ativado, troca iônica e cristalização.