RU2733433C1

RU2733433C1 - Микроорганизм, обладающий улучшенным уровнем внутриклеточной энергии, и способ продуцирования L-аминокислоты с его помощью

Info

Publication number: RU2733433C1
Application number: RU2019128266A
Authority: RU
Inventors: Джуно ЧЖАН; Хе Мин ПАРК; Кван Хо ЛИ; Кын Чоль ЛИ; Хён Пё ХОН
Original assignee: СиДжей ЧеилДжеданг Корп.
Priority date: 2014-05-23
Filing date: 2015-04-14
Publication date: 2020-10-01
Also published as: EP3147351A4; JP2017516474A; KR20150134996A; CN107075454A; EP3147351A1; RU2700384C2; EP3147351B1; JP6810611B2; RU2016145258A3; RU2016145258A; ES2754355T3; US20170081633A1; BR112016027341B1; PL3147351T3; KR101599802B1; DK3147351T3; BR112016027341A2; JP2019106993A; WO2015178586A1; MY184391A

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение относится к микроорганизму из рода Escherichia, обладающему способностью продуцировать L-аминокислоты и повышенным уровнем внутриклеточного ATP по сравнению с немодифицированным штаммом, где виды активности одного или нескольких белков, выбранных из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, которые образуют систему поглощения железа, были инактивированы, и к способу продуцирования L-аминокислот, включающему культивирование микроорганизма из рода Escherichia по любому из пп. 1-5 в среде и извлечение L-аминокислот из культуральной среды или микроорганизма, где L-аминокислота представляет собой L-треонин или L-триптофан. Изобретение позволяет улучшить уровень внутриклеточного АТР. 2. н. и 5 з.п. ф-лы, 6 ил., 5 табл., 8 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящая заявка относится к рекомбинантному микроорганизму, обладающему улучшенным уровнем внутриклеточной энергии, и к способу продуцирования L-аминокислот с помощью микроорганизма.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Для продуцирования желаемого вещества с помощью микроорганизма применяли главным образом специфичные для желаемого вещества подходы, такие как усиление экспрессии генов, кодирующих ферменты, участвующие в продуцировании желаемого вещества, или удаление ненужных генов. Например, посредством повышения активности пути биосинтеза L-аминокислоты был разработан ряд применимых штаммов, включающих E. coli, способных к продуцированию желаемой L-аминокислоты с высоким выходом. Для продуцирования применимых желаемых веществ с высоким выходом с помощью микроорганизмов требуется образование и поддержание достаточного количества энергии.

Для биосинтеза веществ, таких как белки, нуклеиновые кислоты и т.п., in vivo используется энергия, запасаемая в форме NADH, NADPH и ATP (аденозин-5'-трифосфата). В частности, ATP представляет собой носитель энергии, который транспортирует химическую энергию, образующуюся в метаболических реакциях, для различных видов активности организмов.

ATP образуется главным образом в ходе метаболических процессов у микроорганизмов. Основными внутриклеточными путями образования ATP являются субстратное фосфорилирование, которое происходит путем гликолиза, или окислительное фосфорилирование, в ходе которого образуется ATP посредством электронтранспортной системы с использованием восстанавливающей способности, накапливаемой в NADH и т.п. путем гликолиза. Образованный ATP расходуется на такие виды активности in vivo, как биосинтез, движение, передача сигналов и деление клеток. Таким образом, промышленные микроорганизмы, применяемые для продуцирования применимых желаемых веществ, обычно характеризуются высоким потреблением ATP. Соответственно, проводили исследования для улучшения производительности путем повышения уровней внутриклеточной энергии при массовом продуцировании применимых желаемых веществ (Biotechnol Adv (2009) 27:94-101).

Железо является одним из элементов, существенных для поддержания гомеостаза микроорганизмов, и E. coli использует различные пути поглощения железа (Mol Microbiol (2006) 62:120-131). Одним из путей поглощения железа является поглощение железа посредством каналов комплекса FhuCDB, образованного белками FhuC, FhuD и FhuB. Недавно было выявлено, что в присутствии избытка L-триптофана в клетках белок TrpR, регулирующий экспрессию генов, участвующих в биосинтезе L-триптофана, образует комплекс с L-триптофаном, и этот комплекс, в свою очередь, связывается с регуляторной областью оперона fhuCDB, что позволяет предположить возможность существования корреляции между поглощением железа посредством белкового комплекса FhuCDB и биосинтезом L-триптофана. Однако, функция белкового комплекса FhuCDB в биосинтезе L-триптофана, а также его влияние на поглощение железа еще не были выяснены (Nat Chem Biol (2012) 8:65-71).

Авторы настоящего изобретения исследовали способы улучшения уровней ATP и повышения производительности в отношении применимых желаемых веществ, таких как L-аминокислоты, и они обнаружили, что уровни внутриклеточного ATP можно улучшить путем инактивации функции белкового комплекса FhuCDB посредством делеции гена fhuCDB, и в результате этого производительность в отношении желаемых веществ можно повысить, что тем самым довершает настоящую заявку.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ТЕХНИЧЕСКАЯ ЗАДАЧА

Целью настоящей заявки является обеспечение микроорганизма, обладающего улучшенным уровнем внутриклеточного ATP.

Другой целью настоящей заявки является обеспечение способа продуцирования желаемого вещества с помощью микроорганизма, обладающего улучшенным уровнем внутриклеточного ATP.

ТЕХНИЧЕСКОЕ РЕШЕНИЕ

В одном аспекте в настоящей заявке представлен микроорганизм, обладающий улучшенным уровнем внутриклеточного ATP.

В конкретном варианте осуществления настоящей заявки микроорганизм может представлять собой микроорганизм, в котором виды активности одного или нескольких из белка FhuC, белка FhuD и белка FhuB, образующих систему поглощения железа, были инактивированы, и, следовательно, который обладает повышенным уровнем внутриклеточного ATP по сравнению с немодифицированным штаммом.

Термин “FhuCDB”, используемый в данном документе, означает компонент системы поглощения железа (системы fhu), включающий в себя продукты экспрессии fhuA, fhuC, fhuD и fhuB, организованных в один оперон. fhuA кодирует многофункциональный OMP FhuA (79 кДа), действующий в качестве рецептора для комплекса феррихром-железо, фагов, бактериальных токсинов и антибиотиков. FhuA специфичен для комплекса Fe³⁺-феррихром и действует в качестве лиганд-специфичного управляемого канала (Protein Sci 7, 1636-1638). Другие белки системы fhu, а именно FhuD, FhuC и FhuB, также существенны для функций системы поглощения железа. Периплазматический белок FhuD и ассоциированные с цитоплазматической мембраной белки FhuC и FhuB образуют комплекс FhuCDB, функцией которого является транспорт феррихрома и других гидроксаматных соединений Fe³⁺ (комплексов Fe³⁺-аэробактин, Fe³⁺-копроген) через цитоплазматическую мембрану из периплазматического пространства в цитоплазму (J Bacteriol 169, 3844-3849). При поглощении железа посредством комплекса FhuCDB расходуется одна молекула ATP, и для этого процесса поглощения железа энергию предоставляет белковый комплекс TonB-ExbB-ExbD (FEBS Lett 274, 85-88).

FhuC кодирует ассоциированный с цитоплазматической мембраной белок размером 29 кДа и вместе с FhuD и FhuB образует канал для поглощения железа. FhuC может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и, в частности, FhuC может кодироваться нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.

FhuD кодирует ассоциированный с цитоплазматической мембраной белок размером 31 кДа и вместе с FhuC и FhuB образует канал для поглощения железа. FhuD может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и, в частности, FhuD может кодироваться нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2.

FhuB кодирует ассоциированный с цитоплазматической мембраной белок размером 41 кДа и вместе с FhuC и FhuB образует канал для поглощения железа. FhuB может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и, в частности, FhuB может кодироваться нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3.

Более конкретно, хотя белки обладают идентичными видами активности, между объектами существуют небольшие различия в аминокислотных последовательностях. Таким образом, FhuC, FhuD и FhuB могут соответственно иметь SEQ ID NO: 5, 6 и 7, но не ограничиваться ими. Иными словами, FhuC, FhuD и FhuB в настоящей заявке могут представлять собой варианты, имеющие аминокислотные последовательности с заменой, делецией, вставкой, добавлением или инверсией одной или более аминокислот в одном или более положениях аминокислотных последовательностей, и они могут иметь последовательности, обладающие 70% или более высокой, 80% или более высокой, 90% или более высокой или 95% или более высокой гомологией с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 5, 6 и 7 соответственно. Кроме того, в нуклеотидных последовательностях могут быть произведены различные модификации в кодирующей области при условии, что они не изменяют аминокислотные последовательности белков, экспрессируемых с кодирующей области, по причине вырожденности кодонов или с учетом предпочтительности кодонов для организма, в котором они подлежат экспрессии. Вышеописанная нуклеотидная последовательность приведена только в качестве примера различных нуклеотидных последовательностей, получаемых с помощью способа, хорошо известного специалистам в данной области, но не ограниченных ей.

Термин “гомология”, используемый в данном документе, относится к степени идентичности оснований или аминокислотных остатков после выравнивания обеих последовательностей для наилучшего совпадения определенных сравнимых областей в аминокислотной или нуклеотидной последовательности гена, кодирующего белок. Если гомология является достаточно высокой, то продукты экспрессии соответствующих генов могут обладать идентичной или сходной активностью. Процентное значение идентичности последовательностей можно определить с помощью известной программы для сравнения последовательностей, например, BLASTN (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlign™ (DNASTAR Inc) и т.п.

Термин “микроорганизм”, используемый в данном документе, относится к прокариотическому микроорганизму или эукариотическому микроорганизму, обладающему способностью к продуцированию применимого желаемого вещества, такого как L-аминокислоты. Например, микроорганизм, обладающий улучшенным уровнем внутриклеточного ATP, может принадлежать к роду Escherichia, роду Erwinia, роду Serratia, роду Providencia, роду Corynebacteria, роду Pseudomonas, роду Leptospira, роду Salmonellar, роду Brevibacteria, роду Hypomononas, роду Chromobacterium или роду Norcardia микроорганизмов, или грибов, или дрожжей. В частности, микроорганизм может принадлежать к роду микроорганизмов Escherichia, и более конкретно, микроорганизм может представлять собой E. coli.

“Немодифицированный штамм”, как используется в данном документе, относится к микроорганизму, который не является модифицированным с помощью методики молекулярной биологии, такой как мутация или рекомбинация. В частности, немодифицированный штамм относится к микроорганизму до повышения уровня внутриклеточного ATP, в котором уровень внутриклеточного ATP повышают путем инактивации одного или нескольких из FhuC, FhuD и FhuB, образующих систему поглощения железа, комплекс FhuCDB, тем самым снижая расход внутриклеточного ATP. Иными словами, немодифицированный штамм относится к исходному микроорганизму, от которого происходит рекомбинантный микроорганизм.

В конкретном варианте осуществления настоящей заявки микроорганизм может содержать один или несколько из FhuC, FhuD и FhuB в инактивированном состоянии, и комбинацию FhuC, FhuD и FhuB в инактивированном состоянии, и, в частности, все из FhuC, FhuD и FhuB в инактивированном состоянии.

Термин “инактивация”, используемый в данном документе, означает, что активность соответствующего белка устранена или ослаблена посредством мутации в результате делеции, замены или вставки части или всего гена, кодирующего соответствующий белок, посредством модификации последовательности, регулирующей экспрессию, для снижения экспрессии гена, посредством модификации последовательности хромосомного гена для ослабления или устранения активности белка или посредством их комбинаций.

В частности, делецию части или всего гена, кодирующего белок, можно осуществлять путем замены полинуклеотида, который кодирует эндогенный целевой белок, в хромосоме полинуклеотидом, в котором имеет место делеция частичной последовательности, либо маркерным геном посредством инсерционного вектора на основе бактериальной хромосомы. Кроме того, можно индуцировать мутацию с помощью мутагена, такого как химические вещества или UV-свет, получая таким образом мутанта, имеющего делецию соответствующего гена, но не ограничиваясь этим.

Термин “последовательность, регулирующая экспрессию”, используемый в данном документе, т.е. нуклеотидная последовательность, регулирующая экспрессию гена, относится к сегменту, способному к повышению или снижению экспрессии конкретного гена у субъекта, и может включать в себя промотор, сайт связывания фактора транскрипции, сайт связывания рибосом, последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции, но не ограничивается этим.

В частности, модификацию последовательности, регулирующей экспрессию, для того, чтобы вызвать снижение экспрессии гена, можно осуществлять путем индуцирования мутаций в последовательности, регулирующей экспрессию, посредством делеции, вставки, консервативной или неконсервативной замены в нуклеотидной последовательности или их комбинации для дополнительного ослабления активности последовательности, регулирующей экспрессию, или путем замены последовательности, регулирующей экспрессию, последовательностью, обладающей более слабой активностью, но не ограничиваясь этим.

В конкретном варианте осуществления настоящей заявки микроорганизм может представлять собой микроорганизм из рода Escherichia, обладающий улучшенной производительностью в отношении желаемого вещества по сравнению с немодифицированным штаммом. У микроорганизма из рода Escherichia согласно настоящей заявке один или несколько белков, образующих комплекс FhuCDB, инактивированы для инактивации пути поглощения железа, и, таким образом, при поглощении железа посредством данного пути снижается расход ATP. В результате этого микроорганизм из рода Escherichia имеет улучшенный уровень внутриклеточного ATP по сравнению с немодифицированным штаммом, и, следовательно, микроорганизм обладает улучшенной производительностью в отношении желаемого вещества.

Термин “микроорганизм, обладающий улучшенной производительностью” относится к микроорганизму, обладающему улучшенной производительностью в отношении желаемого вещества по сравнению с немодифицированным штаммом или исходной клеткой до модификации.

Термин “желаемое вещество”, используемый в данном документе, включает вещество, продуцируемое количество которого повышают путем повышения уровня внутриклеточного ATP у микроорганизма, без ограничения. Желаемое вещество может, в частности, представлять собой L-аминокислоту и, более конкретно, L-треонин или L-триптофан.

В конкретном варианте осуществления микроорганизм может представлять собой E. coli, обладающую улучшенной производительностью в отношении L-триптофана, где один или несколько из FhuC, FhuD и FhuB E. coli, обладающей производительностью в отношении L-триптофана, были инактивированы, и обладающую улучшенным уровнем внутриклеточного ATP по сравнению с немодифицированным штаммом. E. coli, обладающую производительностью в отношении L-триптофана, можно получить путем повышения экспрессии гена L-триптофанового оперона, устранения ингибирования по принципу обратной связи конечным продуктом L-триптофаном или устранения ингибирования и аттенюации гена L-триптофанового оперона на уровне транскрипции, но не ограничиваясь этим.

В конкретном варианте осуществления настоящей заявки микроорганизм может представлять собой E. coli, обладающую улучшенной производительностью в отношении L-треонина, где один или несколько из FhuC, FhuD и FhuB E. coli, обладающей производительностью в отношении L-треонина, были инактивированы, и обладающую улучшенным уровнем внутриклеточного ATP по сравнению с немодифицированным штаммом. E. coli, обладающую производительностью в отношении L-треонина, можно получить путем повышения экспрессии гена L-треонинового оперона, устранения ингибирования по принципу обратной связи конечным продуктом L-треонином или устранения ингибирования и аттенюации гена L-треонинового оперона на уровне транскрипции, но не ограничиваясь этим.

В другом аспекте в настоящей заявке обеспечивается способ продуцирования L-аминокислот, при этом способ включает культивирование микроорганизма из рода Escherichia, обладающего улучшенным уровнем внутриклеточного ATP, в среде и извлечение L-аминокислот из культуральной среды или микроорганизма.

Термин “микроорганизм из рода Escherichia, обладающий улучшенным уровнем внутриклеточного ATP”, используемый в данном документе, является таким же, как описанный выше.

В способе продуцирования L-аминокислот в соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящей заявки культивирование микроорганизма, обладающего производительностью в отношении L-аминокислот, можно осуществлять в соответствии с надлежащими условиями среды и культивирования, известными из уровня техники. Процедуры культивирования могут без труда корректироваться специалистами в данной области в соответствии с выбранным микроорганизмом. Примеры процедур культивирования включают периодический тип, непрерывный тип и тип культивирования с подпиткой, но не ограничиваются этим.

Среда, применяемая для культивирования, должна соответствовать требованиям для культивирования конкретного микроорганизма. Культуральные среды для различных микроорганизмов описаны в литературе (“Manual of Methods for General Bacteriology”, American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981). Эти среды содержат ряд источников углерода, источников азота и следовых элементов. Источники углерода включают углеводы, такие как глюкоза, лактоза, сахароза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; липиды, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол; а также органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти источники углерода можно использовать в отдельности или в комбинации, но не ограничиваясь этим. Источник азота включает органические источники азота, такие как пептон, дрожжевой экстракт, подлива, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт (CSL) и бобовая мука, а также неорганические источники азота, такие как мочевина, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Эти источники азота можно использовать в отдельности или в комбинации, но не ограничиваясь этим. В дополнение, среда может включать дигидрофосфат калия, гидрофосфат дикалия и их соответствующие натрийсодержащие соли в качестве источника фосфора, но не ограничиваться этим. Также среда может включать металл, такой как сульфат магния или сульфат железа. Кроме того, также можно добавлять аминокислоты, витамины и соответствующие предшественники.

Дополнительно, для поддержания культуры в аэробных условиях в культуру можно вводить кислород или кислородсодержащий газ (например, воздух). Температура культуры может обычно составлять 20°C-45°C и, в частности, 25°C-40°C. Культивирование можно продолжать, пока продуцирование L-аминокислот, таких как L-треонин или L-триптофан, не достигнет желаемого уровня, и, в частности, время культивирования может составлять от 10 часов до 100 часов.

Способ продуцирования L-аминокислот в соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящей заявки может дополнительно включать извлечение L-аминокислот из полученных таким образом культуральной среды или микроорганизма. Извлечение L-аминокислот можно осуществлять с помощью соответствующего способа, известного из уровня техники, в зависимости от способа культивирования микроорганизма согласно настоящей заявке, например, периодического типа, непрерывного типа или типа культивирования с подпиткой, для очистки или извлечения желаемых L-аминокислот из культуры микроорганизма, но не ограничиваясь этим.

ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с настоящей заявкой, в случае, когда применяют микроорганизм из рода Escherichia, обладающий улучшенным уровнем внутриклеточного ATP по сравнению с немодифицированным штаммом, и способ продуцирования желаемого вещества с его помощью, высокий уровень внутриклеточного ATP усиливает экспрессию генов, биосинтез, транспорт веществ и т.п., тем самым обеспечивая эффективное продуцирование применимых желаемых веществ, включающих белки, L-аминокислоты и т.п.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1 показаны уровни внутриклеточного ATP у E. coli в соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящей заявки по сравнению с немодифицированным штаммом;

на фиг. 2 показаны уровни внутриклеточного ATP у происходящей от дикого типа E. coli, обладающей производительностью в отношении L-триптофана, в соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящей заявки по сравнению с немодифицированным штаммом;

на фиг. 3 показаны уровни внутриклеточного ATP у E. coli, обладающей производительностью в отношении L-треонина, в соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящей заявки по сравнению с немодифицированным штаммом;

на фиг. 4 показаны уровни внутриклеточного ATP у E. coli, обладающей производительностью в отношении L-триптофана, в соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящей заявки по сравнению с немодифицированным штаммом;

на фиг. 5 показана производительность в отношении L-треонина у E. coli, обладающей производительностью в отношении L-треонина, в соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящей заявки по сравнению с немодифицированным штаммом; и

на фиг. 6 показана производительность в отношении L-триптофана у E. coli, обладающей производительностью в отношении L-триптофана, в соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящей заявки по сравнению с немодифицированным штаммом.

ПРИНЦИП ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее настоящая заявка будет описана более подробно со ссылками на примеры. Однако данные примеры приведены только в целях иллюстрации, и ограничение объема настоящей заявки данными примерами не подразумевается.

Пример 1. Получение E. coli W3110 дикого типа с инактивированными белками, кодируемыми генами fhuC , fhuD и fhuB

В этом примере гены fhuC, fhuD и fhuB E. coli W3110 дикого типа (ATCC® 39936™) соответственно подвергали делеции путем гомологичной рекомбинации.

Гены fhuC, fhuD и fhuB, подлежащие делеции, соответственно имеют нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1, 2 и 3, и эти гены существуют в форме оперона SEQ ID NO: 4.

Для делеции fhuC, fhuD и fhuB осуществляли одностадийную инактивацию с помощью рекомбиназы Red фага лямбда, разработанную Datsenko KA et al. (Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640-6645). В качестве маркера для подтверждения вставки в ген использовали ген устойчивости к хлорамфениколу из pUCprmfmloxC, который получали путем лигирования промотора rmf с pUC19 (New England Biolabs (USA)) и лигирования с ним мутантной кассеты loxP-CmR-loxP, полученной из pACYC184 (New England Biolab) (заявка на корейский патент № 2009-0075549).

Вначале осуществляли первичную полимеразную цепную реакцию (далее в данном документе называемую ‘ПЦР’) с применением pUCprmfmloxC в качестве матрицы и комбинаций праймеров с SEQ ID NO: 8 и 9, 10 и 11, 12 и 13, и 8 и 13 с частью генов fhuC и fhuB и частичной последовательностью гена устойчивости к хлорамфениколу в гене pUCprmfmloxC в условиях 30 циклов денатурации при 94°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и элонгации при 72°C в течение 1 минуты с получением таким образом продуктов ПЦР ΔfhuC1st, ΔfhuD1st, ΔfhuB1st и ΔfhuCDB1st размером приблизительно 1,2 т.п.о.

После этого продукты ПЦР ΔfhuC1st, ΔfhuD1st, ΔfhuB1st и ΔfhuCDB1st размером 1,2 т.п.о., полученные посредством ПЦР, подвергали электрофорезу в 0,8% агарозном геле, а затем элюировали и применяли в качестве матрицы для вторичной ПЦР. Вторичную ПЦР осуществляли с применением элюированных продуктов первичной ПЦР в качестве матриц и комбинаций праймеров с SEQ ID NO: 14 и 15, 16 и 17, 18 и 19, 14 и 19, содержащих нуклеотидные последовательности размером 20 п.о. в 5'- и 3'-концевых областях продуктов ПЦР, полученных в первичной ПЦР, в условиях 30 циклов денатурации при 94°C в течение 30 секунд, отжига при 55°C в течение 30 секунд и элонгации при 72°C в течение 1 минуты с получением таким образом продуктов ПЦР ΔfhuC, ΔfhuD, ΔfhuB и ΔfhuCDB размером приблизительно 1,3 т.п.о. Полученные таким образом продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 0,8% агарозном геле, а затем элюировали и применяли в рекомбинации.

E. coli W3110, который трансформировали вектором pKD46 в соответствии со способом одностадийной инактивации, разработанным Datsenko KA et al. (Proc Natl Acad Sci USA., (2000) 97:6640-6645), получали в виде компетентного штамма, и трансформацию осуществляли путем введения фрагмента гена размером 1,3 т.п.о., полученного посредством первичной и вторичной ПЦР. Штаммы культивировали в среде LB, дополненной хлорамфениколом, и отбирали трансформантов, обладающих устойчивостью к хлорамфениколу. Делецию любого или всех из fhuC, fhuD и fhuB подтверждали по продуктам ПЦР размером приблизительно 4,4 т.п.о., приблизительно 4,3 т.п.о., приблизительно 3,3 т.п.о. и приблизительно 1,6 т.п.о., которые амплифицировали посредством ПЦР с применением геномов, полученных из отобранных штаммов, в качестве матриц и праймеров с SEQ ID NO: 20 и 21.

После удаления pKD46 из полученных таким образом первичных рекомбинантных штаммов, обладающих устойчивостью к хлорамфениколу, в первичные рекомбинантные штаммы, обладающие устойчивостью к хлорамфениколу, вводили вектор pJW168 (Gene, (2000) 247,255-264) для удаления маркерного гена устойчивости к хлорамфениколу из штаммов (Gene, (2000) 247, 255-264). Осуществляли ПЦР с применением праймеров с SEQ ID NO: 20 и 21 с получением продуктов ПЦР размером приблизительно 3,4 т.п.о., приблизительно 3,3 т.п.о., приблизительно 2,2 т.п.о. и приблизительно 0,6 т.п.о., что указывает на то, что полученные в конечном счете штаммы имели делецию любого или всех из генов fhuC, fhuD и fhuB. Штаммы соответственно обозначали как E. coli W3110_ΔfhuC, W3110_ΔfhuD, W3110_ΔfhuB и W3110_ΔfhuCDB.

Пример 2. Измерение уровней внутриклеточного ATP у E. coli с делециями генов fhuC , fhuD и fhuB , происходящих от E. coli дикого типа

В этом примере на практике измеряли уровни внутриклеточного ATP у штаммов, полученных в примере 1.

Для этой цели использовали “эффективный способ количественного определения синтетической активности клеточного ATP”, разработанный Kiyotaka Y. Hara et al., в котором использовали люциферазу (J Biom Scre, (2006) Vol. 11, No.3, pp310-17). Вкратце, E. coli W3110, представляющий собой немодифицированный штамм, применяемый в примере 1, и E. coli W3110_ΔfhuCDB, полученный посредством делеции генов, соответственно культивировали в течение ночи в жидкой среде LB, содержащей глюкозу. После культивирования образцы надосадочной жидкости удаляли путем центрифугирования, полученные таким образом клетки промывали с помощью 100 мМ Tris-Cl (pH 7,5) и затем обрабатывали PB-буфером (проникающий буфер: 40% [об./об.] глюкозы, 0,8% [об./об.] Triton X-100) в течение 30 минут для высвобождения внутриклеточного ATP из клеток. Затем образцы надосадочной жидкости удаляли путем центрифугирования, и к клеткам добавляли люциферин в качестве субстрата для люциферазы. Клеткам позволяли прореагировать в течение 10 минут. Формирование цвета под действием люциферазы измеряли с помощью люминометра для количественного определения уровней ATP. Результаты приведены на фиг. 1. Результаты на фиг. 1 регистрировали как среднее значение для трех повторяемых экспериментов.

Как показано на фиг. 1, уровни внутриклеточного ATP у E. coli W3110_ΔfhuC, W3110_ΔfhuD, W3110_ΔfhuB и W3110_ΔfhuCDB, полученных в примере 1, у которых любой или все из fhuC, fhuD и fhuB, происходящих от E. coli дикого типа, были подвергнуты делеции, были повышены по сравнению с немодифицированным штаммом E. coli W3110.

Пример 3. Получение происходящего от дикого типа штамма, продуцирующего L-триптофан, с инактивированными белками, кодируемыми генами fhuC , fhuD и fhuB , и измерение уровней внутриклеточного ATP

В этом примере любой или все из генов fhuC, fhuD и fhuB происходящего от дикого типа штамма E. coli W3110 trpΔ2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA, продуцирующего L-триптофан (публикация корейского патента № 10-2013-0082121), подвергали делеции путем гомологичной рекомбинации, как в примере 1, с получением штаммов W3110 trpΔ2_ΔfhuC/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA, W3110 trpΔ2_ΔfhuD/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA, W3110 trpΔ2_ΔfhuB/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA и W3110 trpΔ2_ΔfhuCDB/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA. У этих штаммов, полученных таким образом, уровни внутриклеточного ATP измеряли таким же образом, как в примере 2, и результаты приведены на фиг. 2.

Как показано на фиг. 2, уровни внутриклеточного ATP у штаммов, которые получали посредством делеции любого или всех из генов fhuC, fhuD и fhuB штамма дикого типа, продуцирующего L-триптофан, были повышены по сравнению с немодифицированным штаммом и контрольным штаммом.

Пример 4. Изучение титра происходящего от дикого типа штамма, продуцирующего L-триптофан, с инактивированными белками, кодируемыми генами fhuC , fhuD и fhuB

Как описано в примере 3, происходящий от дикого типа штамм W3110 trpΔ2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA, продуцирующий L-триптофан, и штаммы с улучшенными уровнями внутриклеточного ATP, полученные посредством делеции любого или всех из генов fhuC, fhuD и fhuB, подвергали титрованию с применением глюкозы в качестве источника углерода.

Каждый из штаммов инокулировали платиновой петлей в твердую среду LB и культивировали в инкубаторе при 37°C в течение ночи, а затем инокулировали платиновой петлей в 25 мл глюкозосодержащей титрационной среды, имеющей состав из таблицы 1. Затем штаммы культивировали в инкубаторе при 37°C и при 200 об./мин. в течение 48 часов. Результаты приведены в таблице 2. Все результаты регистрировали как среднее значение для трех повторяемых экспериментов.

[Таблица 1]

Состав	Концентрация (на литр)
Глюкоза	60 г
K₂HPO₄	1 г
(NH₄)₂SO₄	15 г
NaCl	1 г
MgSO₄·H₂O	1 г
Цитрат натрия	5 г
Дрожжевой экстракт	2 г
CaCO₃	40 г
L-фенилаланин	0,15 г
L-тирозин	0,1 г
pH	6,8

[Таблица 2]

Штамм	Продуцируемое количество L-триптофана (мг/л)*
W3110 trpΔ2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA	562
W3110 trpΔ2_ΔfhuC/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA	781
W3110 trpΔ2_ΔfhuD/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA	816
W3110 trpΔ2_ΔfhuB/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA	779
W3110 trpΔ2_ΔhuCDB/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA	796

* измерено через 48 часов

Как показано в таблице 2, было продемонстрировано, что у штаммов с улучшенными уровнями внутриклеточного ATP, полученных в примере 3 посредством делеции любого или всех из генов fhuC, fhuD и fhuB штамма дикого типа W3110 trpΔ2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA, продуцирующего L-триптофан, продуцирование L-триптофана повысилось на величину до приблизительно 63% по сравнению с немодифицированным штаммом trpΔ2/pCL-Dtrp_att-trpEDCBA. С учетом уровней внутриклеточного ATP, подтвержденных на фиг. 2, эти результаты по повышенным уровням внутриклеточного ATP указывают на то, что значения производительности штаммов в отношении L-триптофана были повышены.

Пример 5. Получение штамма, продуцирующего L-треонин, и штамма, продуцирующего L-триптофан, с инактивированными белками, кодируемыми генами fhuC , fhuD и fhuB

В этом примере гены fhuC, fhuD и fhuB штамма KCCM10812P, продуцирующего L-триптофан (корейский патент № 0792095), и штамма KCCM10541, продуцирующего L-треонин (корейский патент № 0576342), соответственно подвергали делеции путем гомологичной рекомбинации, как в примере 1.

Немодифицированный штамм E. coli KCCM10812P, обладающий производительностью в отношении L-триптофана, представляет собой штамм, происходящий от варианта E. coli (KFCC 10066), обладающего производительностью в отношении L-фенилаланина, и представляет собой рекомбинантный штамм E. coli, обладающий производительностью в отношении L-триптофана, характеризующийся тем, что хромосомная ауксотрофность по триптофану была уменьшена или устранена, гены pheA, trpR, mtr и tnaAB были подвергнуты аттенюации, а гены aroG и trpE были модифицированы.

Также, немодифицированный штамм E. coli KCCM10541P, обладающий производительностью в отношении L-треонина, представляет собой штамм, происходящий от E. coli KFCC10718 (публикация корейского патента № 1992-0008365), и представляет собой E. coli, обладающую устойчивостью к аналогу L-метионина, фенотипом ауксотрофности по метионину, устойчивостью к аналогу L-треонина, "растекающимся" фенотипом ауксотрофности по изолейцину, устойчивостью к аналогу L-лизина и устойчивостью к α-аминомасляной кислоте, а также производительностью в отношении L-треонина.

Гены fhuC, fhuD и fhuB, подлежащие делеции, подвергали делеции у E. coli KCCM10812P и E. coli KCCM10541P таким же образом, как в примере 1, соответственно. В результате этого получали штамм KCCM10541_ΔfhuCDB, продуцирующий L-треонин, и штамм KCCM10812P_ΔfhuCDB, продуцирующий L-триптофан.

Пример 6. Измерение уровней ATP у штамма, продуцирующего L-треонин, и штамма, продуцирующего L-триптофан, с инактивированными белками, кодируемыми генами fhuC , fhuD и fhuB

В этом примере на практике измеряли уровни внутриклеточного ATP у штаммов, полученных в примере 5.

Уровни внутриклеточного ATP измеряли таким же образом, как в примере 2. Результаты приведены на фиг. 3 и 4. Результаты из фиг. 3 и 4 регистрировали как среднее значение для трех повторяемых экспериментов. В качестве контрольных групп использовали штамм, продуцирующий L-треонин (E. coli KCCM10541P_ΔysaΔydaS), и штамм, продуцирующий L-триптофан (E. coli KCCM10812P_ΔysaΔydaS), с делециями ysa и ydaS, которые, как известно, обладают более высокими уровнями внутриклеточного ATP, чем немодифицированные штаммы E. coli KCCM10812P и E. coli KCCM10541P, используемые в примере 3 (корейский патент № 1327093).

Как показано на фиг. 3 и 4, штаммы с делециями fhuC, fhuD и fhuB, полученные из штамма, продуцирующего L-треонин, и штамма, продуцирующего L-триптофан, в примере 3, продемонстрировали повышенные уровни внутриклеточного ATP по сравнению с немодифицированными штаммами и контрольными штаммами.

Пример 7. Изучение титра штамма, продуцирующего L-треонин, с инактивированными белками, кодируемыми генами fhuC , fhuD и fhuB

Как описано в примере 5, штаммы с улучшенными уровнями внутриклеточного ATP, которые получали посредством делеции генов fhuC, fhuD и fhuB у микроорганизма, продуцирующего L-треонин, E. coli KCCM10541P (корейский патент № 0576342), подвергали титрованию с применением глюкозы в качестве источника углерода. Штамм, продуцирующий L-треонин, с делециями ysa и ydaS (E. coli KCCM10541P_ΔysaΔydaS) применяли в качестве контрольной группы для сравнения результатов титрования.

Каждый из штаммов культивировали в твердой среде LB в инкубаторе при 33°C в течение ночи, а затем инокулировали платиновой петлей в 25 мл глюкозосодержащей титрационной среды, имеющей состав из таблицы 3. Затем штаммы культивировали в инкубаторе при 33°C и при 200 об./мин. в течение 50 часов. Результаты приведены в таблице 4 и на фиг. 5. Все результаты регистрировали как среднее значение для трех повторяемых экспериментов.

[Таблица 3]

Состав	Концентрация (на литр)
Глюкоза	70 г
KH₂PO₄	2 г
(NH₄)₂SO₄	25 г
MgSO₄·H₂O	1 г
FeSO₄·H₂O	5 мг
MnSO₄·H₂O	5 мг
Дрожжевой экстракт	2 г
CaCO₃	30 г

[Таблица 4]

Штамм	OD₅₆₂	Расход глюкозы (г/л)*	Продуцируемое количество L-треонина (г/л)*
KCCM10541P	22,8	41,0	28,0 ± 0,5
KCCM10541P_ΔysaAΔydaS	23,9	42,1	29,8 ± 0,9
KCCM10541P_ΔfhuCDB	23,1	41,8	30,5 ± 1

* измерено через 30 часов

** измерено через 50 часов

Как показано в таблице 4, было продемонстрировано, что рекомбинантный штамм E. coli, продуцирующий L-треонин, полученный в соответствии с настоящей заявкой, демонстрировал физиологическую активность, сходную с таковой у немодифицированного штамма, и характеризовался продуцированием L-треонина, повышенным на величину до приблизительно 9% по сравнению с немодифицированным штаммом. С учетом уровней внутриклеточного ATP, подтвержденных на фиг. 3, эти результаты по повышенным уровням внутриклеточного ATP указывают на то, что значения производительности штаммов в отношении L-треонина были повышены.

Пример 8. Изучение титра штамма, продуцирующего L-триптофан, с инактивированными белками, кодируемыми генами fhuC , fhuD и fhuB

Как описано в примере 5, штаммы с улучшенными уровнями внутриклеточного ATP, которые получали посредством делеции генов fhuC, fhuD и fhuB у микроорганизма, продуцирующего L-триптофан, KCCM10812P (корейский патент № 0792095), подвергали титрованию с применением глюкозы в качестве источника углерода. Штамм, продуцирующий L-триптофан, с делециями ysa и ydaS (E. coli KCCM10812P_ΔysaΔydaS) применяли в качестве контрольной группы для оценивания титра таким же образом, как в примере 4.

Результаты титрования приведены в таблице 5 и на фиг. 6. Все результаты регистрировали как среднее значение для трех повторяемых экспериментов.

[Таблица 5]

Штамм	OD₆₀₀	Расход глюкозы (г/л)*	Продуцируемое количество L-триптофана (г/л)**
KCCM10812P	18,2	45,7	5,5 ± 0,2
KCCM10812P_ΔysaAΔydaS	18,3	46,3	6,7 ± 0,1
KCCM10812P_ΔfhuCDB	17,9	47,4	7,1 ± 0,5

* измерено через 33 часа

** измерено через 48 часов

Как показано в таблице 5, было продемонстрировано, что рекомбинантный штамм E. coli, продуцирующий L-триптофан, полученный в соответствии с настоящей заявкой, демонстрировал физиологическую активность, сходную с таковой у немодифицированного штамма, и характеризовался продуцированием L-триптофана, повышенным на величину до приблизительно 30% по сравнению с немодифицированным штаммом. С учетом уровней внутриклеточного ATP, подтвержденных на фиг. 4, эти результаты по повышенным уровням внутриклеточного ATP указывают на то, что значения производительности штаммов в отношении L-триптофана были повышены.

Рекомбинантный штамм CA04-2801 (KCCM10812P_ΔfhuCDB) согласно настоящей заявке был депонирован в Корейском центре культур микроорганизмов, международном органе по депонированию, 15 ноября 2013 г. под № доступа KCCM11474P.

На основании вышеприведенного описания специалистам в данной области будет понятно, что настоящую заявку можно реализовать в другой конкретной форме без изменения ее технической сущности или существенных характеристик. Таким образом, следует понимать, что вышеописанный вариант осуществления не является ограничивающим, но является иллюстративным во всех аспектах. Объем настоящей заявки определен прилагаемой формулой изобретения, а не предшествующим ей описанием, и, следовательно, предполагается, что все изменения и модификации, которые находятся в пределах формулы изобретения, или эквиваленты таких пределов охватываются, таким образом, формулой изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CJ CHEILJEDANG CORP.

<120> МИКРООРГАНИЗМ, ОБЛАДАЮЩИЙ УЛУЧШЕННЫМ УРОВНЕМ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЭНЕРГИИ, И

СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ЕГО ПОМОЩЬЮ

<130> PX048855

<150> KR14/62593

<151> 2014-05-23

<160> 21

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 798

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 1

atgcaggaat acacgaatca ttccgatacc acttttgcac tgcgtaatat ctcctttcgt 60

gtgcccgggc gcacgctttt gcatccgctg tcgttaacct ttcctgccgg gaaagtgacc 120

ggtctgattg gtcacaacgg ttctggtaaa tccactctgc tcaaaatgct tggccgtcat 180

cagccgccgt cggaagggga gattcttctt gatgcccaac cgctggaaag ctggagcagc 240

aaagcgtttg cccgcaaagt ggcttatttg ccgcagcagc ttcctccggc agaagggatg 300

accgtgcgtg aactggtggc gattggtcgt tacccgtggc atggcgcgct ggggcgcttt 360

ggggcggcag atcgcgaaaa agtcgaggaa gctatctcgc tggttggctt aaaaccgctg 420

gcgcatcggc tggtcgatag tctctctggc ggcgaacgtc agcgggcgtg gatcgccatg 480

ctggtggcgc aggatagccg ttgtctgttg ctcgacgaac cgacctcggc gctggatatc 540

gcccaccagg ttgatgtgct gtcgctggtg caccgtttaa gtcaggagcg tggcctgacg 600

gtcattgccg tgttgcacga tatcaatatg gcggcacgct actgtgatta tctggtcgcc 660

ctgcgcggcg gtgaaatgat tgctcaggga acgcctgcgg aaattatgcg cggcgaaacc 720

ctcgaaatga tttatggcat cccgatgggt attttgccgc atccggcggg tgctgcacct 780

gtgagttttg tttattga 798

<210> 2

<211> 891

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 2

atgagcggct tacctcttat ttcgcgccgt cgactgttaa cggcgatggc gctttctccg 60

ttgttatggc agatgaatac cgcccacgcg gcggctattg atcccaatcg tattgtggcg 120

ctggagtggt tgccggtgga attactgctg gcgctcggca tcgtgcctta cggcgtggcg 180

gataccatca actatcgcct gtgggtcagc gaaccaccat tgccggactc agtgatcgac 240

gtcggtttgc gcacagaacc taaccttgaa ctgctgaccg aaatgaaacc atcgtttatg 300

gtctggtcgg caggatatgg cccttcacca gaaatgctgg ctcgtattgc gccgggtcgc 360

ggatttaact tcagtgacgg caaacagccg ttggcgatgg cgcgtaaatc gctgacggaa 420

atggcagatt tacttaacct gcaaagcgca gcggaaacgc atttagcgca atatgaagac 480

tttatccgca gcatgaaacc ccgctttgtg aagcgtggtg cgcgtccgtt attgctgacg 540

acgcttatcg atccgcgcca tatgctggtc ttcggtccaa acagcttgtt ccaggaaatt 600

cttgatgagt acggcatccc aaatgcctgg caaggggaaa ccaacttctg gggcagtacc 660

gccgtcagta tcgatcgtct ggcggcgtat aaagacgttg atgtgctctg ttttgatcac 720

gacaacagca aagacatgga tgcgctaatg gcaacgccgc tgtggcaggc catgccgttt 780

gtccgcgccg gacgctttca gcgcgtacct gcagtctggt tttatggtgc gacgctctcg 840

gcaatgcact ttgtgcgcgt tctggataac gccatcggag gtaaagcgtg a 891

<210> 3

<211> 1983

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 3

gtgagtaaac gaattgcgct tttcccggcg ttattgctgg cgctgttagt gattgtcgct 60

acggcgctca cctggatgaa cttctcgcag gcgctgccgc gtagccagtg ggcgcaggct 120

gcctggtcgc cggatattga cgtcatcgag cagatgattt ttcactacag cttgttgccg 180

cgtctggcga tttcgctgct ggtgggcgcg ggtctggggc tggtgggcgt gctgtttcag 240

caagtgctgc gtaacccgct ggcggagccg acgacgcttg gcgttgctac aggcgcgcaa 300

ctggggatta ccgtcactac gctctgggcg atccctggtg cgatggcgag ccagtttgct 360

gcgcaggcag gggcttgtgt tgttggctta attgtctttg gcgtcgcgtg ggggaaacgg 420

ctgtcgccgg taacgctgat tctcgcgggg ttggtagtga gcctttattg cggcgcaatc 480

aatcagttac tggttatctt ccatcatgac caactgcaaa gcatgtttct gtggagcact 540

ggaacgctga cgcaaaccga ctggggcggc gttgagcgtt tatggccgca gctgctgggc 600

ggtgtgatgc tgacgttgct gctacttcgt ccgttaaccc tgatggggct tgatgatggc 660

gtggcgcgca atctcgggct ggccttgtcg cttgcgcgtc tggcagcgct gtcgctggcg 720

attgtcatca gtgcgctgct ggtgaacgct gtggggatta tcggctttat cgggttgttc 780

gcgccgctgc tggcaaaaat gctgggggcg cggcgtctgc tgccacgact gatgctggcg 840

tcgttgattg gtgcgctgat cctctggctt tccgatcaaa tcatcctctg gctgactcgc 900

gtgtggatgg aagtgtccac cggttcggtc actgcgttga tcggtgcgcc gctgctactg 960

tggctgttgc cgcgtttacg cagcattagc gcgccggata tgaaggtcaa cgatcgtgtc 1020

gcggctgaac gccaacatgt gctggcgttt gccctcgcgg gcggcgtgct gctgttgatg 1080

gctgtggtgg tggcgctgtc gtttggtcgt gatgcgcacg gctggacgtg ggcgagcggg 1140

gcgttgctcg aggatttaat gccctggcgc tggccgcgaa ttatggcggc gctgtttgcg 1200

ggcgtcatgc tggcggtggc gggctgtatt attcagcgac tgaccggaaa cccgatggca 1260

agcccggaag tgctggggat tagctccggc gcggcgtttg gcgtggtgtt gatgctgttt 1320

ctggtgccgg gtaatgcctt tggctggctg ttacctgcag gcagtctcgg cgcggcggtg 1380

acgctgttga tcattatgat cgccgccggc cgcggtggat tttccccaca ccgtatgtta 1440

ctggcgggga tggcgttaag caccgcgttc accatgcttt tgatgatgtt gcaggcaagt 1500

ggtgacccgc gaatggcgca agtgctgacc tggatttccg gttcgaccta caacgcgacc 1560

gatgcgcagg tctggcgcac cggaattgtg atggtgattt tgctggcgat taccccgctg 1620

tgccgccgct ggctgaccat tttaccgctg ggtggtgata ccgcccgagc cgtaggaatg 1680

gcgctgacgc cgacgcgaat tgcgctgctg ctgttagcgg cttgcctgac ggcgaccgcg 1740

acgatgacta ttggaccgtt gagttttgtt ggtttaatgg caccgcatat tgcgcggatg 1800

atgggctttc gacggacgat gccacacatc gtaatttcgg cgctggtggg tggtttactg 1860

ctggtgttcg ctgactggtg tgggcggatg gtgctgtttc cattccagat cccggcgggg 1920

ctgctgtcaa cctttatcgg cgcgccatat tttatctatt tgttgagaaa gcagagccgt 1980

taa 1983

<210> 4

<211> 3667

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 4

atgcaggaat acacgaatca ttccgatacc acttttgcac tgcgtaatat ctcctttcgt 60

gtgcccgggc gcacgctttt gcatccgctg tcgttaacct ttcctgccgg gaaagtgacc 120

ggtctgattg gtcacaacgg ttctggtaaa tccactctgc tcaaaatgct tggccgtcat 180

cagccgccgt cggaagggga gattcttctt gatgcccaac cgctggaaag ctggagcagc 240

aaagcgtttg cccgcaaagt ggcttatttg ccgcagcagc ttcctccggc agaagggatg 300

accgtgcgtg aactggtggc gattggtcgt tacccgtggc atggcgcgct ggggcgcttt 360

ggggcggcag atcgcgaaaa agtcgaggaa gctatctcgc tggttggctt aaaaccgctg 420

gcgcatcggc tggtcgatag tctctctggc ggcgaacgtc agcgggcgtg gatcgccatg 480

ctggtggcgc aggatagccg ttgtctgttg ctcgacgaac cgacctcggc gctggatatc 540

gcccaccagg ttgatgtgct gtcgctggtg caccgtttaa gtcaggagcg tggcctgacg 600

gtcattgccg tgttgcacga tatcaatatg gcggcacgct actgtgatta tctggtcgcc 660

ctgcgcggcg gtgaaatgat tgctcaggga acgcctgcgg aaattatgcg cggcgaaacc 720

ctcgaaatga tttatggcat cccgatgggt attttgccgc atccggcggg tgctgcacct 780

gtgagttttg tttattgatg agcggcttac ctcttatttc gcgccgtcga ctgttaacgg 840

cgatggcgct ttctccgttg ttatggcaga tgaataccgc ccacgcggcg gctattgatc 900

ccaatcgtat tgtggcgctg gagtggttgc cggtggaatt actgctggcg ctcggcatcg 960

tgccttacgg cgtggcggat accatcaact atcgcctgtg ggtcagcgaa ccaccattgc 1020

cggactcagt gatcgacgtc ggtttgcgca cagaacctaa ccttgaactg ctgaccgaaa 1080

tgaaaccatc gtttatggtc tggtcggcag gatatggccc ttcaccagaa atgctggctc 1140

gtattgcgcc gggtcgcgga tttaacttca gtgacggcaa acagccgttg gcgatggcgc 1200

gtaaatcgct gacggaaatg gcagatttac ttaacctgca aagcgcagcg gaaacgcatt 1260

tagcgcaata tgaagacttt atccgcagca tgaaaccccg ctttgtgaag cgtggtgcgc 1320

gtccgttatt gctgacgacg cttatcgatc cgcgccatat gctggtcttc ggtccaaaca 1380

gcttgttcca ggaaattctt gatgagtacg gcatcccaaa tgcctggcaa ggggaaacca 1440

acttctgggg cagtaccgcc gtcagtatcg atcgtctggc ggcgtataaa gacgttgatg 1500

tgctctgttt tgatcacgac aacagcaaag acatggatgc gctaatggca acgccgctgt 1560

ggcaggccat gccgtttgtc cgcgccggac gctttcagcg cgtacctgca gtctggtttt 1620

atggtgcgac gctctcggca atgcactttg tgcgcgttct ggataacgcc atcggaggta 1680

aagcgtgagt aaacgaattg cgcttttccc ggcgttattg ctggcgctgt tagtgattgt 1740

cgctacggcg ctcacctgga tgaacttctc gcaggcgctg ccgcgtagcc agtgggcgca 1800

ggctgcctgg tcgccggata ttgacgtcat cgagcagatg atttttcact acagcttgtt 1860

gccgcgtctg gcgatttcgc tgctggtggg cgcgggtctg gggctggtgg gcgtgctgtt 1920

tcagcaagtg ctgcgtaacc cgctggcgga gccgacgacg cttggcgttg ctacaggcgc 1980

gcaactgggg attaccgtca ctacgctctg ggcgatccct ggtgcgatgg cgagccagtt 2040

tgctgcgcag gcaggggctt gtgttgttgg cttaattgtc tttggcgtcg cgtgggggaa 2100

acggctgtcg ccggtaacgc tgattctcgc ggggttggta gtgagccttt attgcggcgc 2160

aatcaatcag ttactggtta tcttccatca tgaccaactg caaagcatgt ttctgtggag 2220

cactggaacg ctgacgcaaa ccgactgggg cggcgttgag cgtttatggc cgcagctgct 2280

gggcggtgtg atgctgacgt tgctgctact tcgtccgtta accctgatgg ggcttgatga 2340

tggcgtggcg cgcaatctcg ggctggcctt gtcgcttgcg cgtctggcag cgctgtcgct 2400

ggcgattgtc atcagtgcgc tgctggtgaa cgctgtgggg attatcggct ttatcgggtt 2460

gttcgcgccg ctgctggcaa aaatgctggg ggcgcggcgt ctgctgccac gactgatgct 2520

ggcgtcgttg attggtgcgc tgatcctctg gctttccgat caaatcatcc tctggctgac 2580

tcgcgtgtgg atggaagtgt ccaccggttc ggtcactgcg ttgatcggtg cgccgctgct 2640

actgtggctg ttgccgcgtt tacgcagcat tagcgcgccg gatatgaagg tcaacgatcg 2700

tgtcgcggct gaacgccaac atgtgctggc gtttgccctc gcgggcggcg tgctgctgtt 2760

gatggctgtg gtggtggcgc tgtcgtttgg tcgtgatgcg cacggctgga cgtgggcgag 2820

cggggcgttg ctcgaggatt taatgccctg gcgctggccg cgaattatgg cggcgctgtt 2880

tgcgggcgtc atgctggcgg tggcgggctg tattattcag cgactgaccg gaaacccgat 2940

ggcaagcccg gaagtgctgg ggattagctc cggcgcggcg tttggcgtgg tgttgatgct 3000

gtttctggtg ccgggtaatg cctttggctg gctgttacct gcaggcagtc tcggcgcggc 3060

ggtgacgctg ttgatcatta tgatcgccgc cggccgcggt ggattttccc cacaccgtat 3120

gttactggcg gggatggcgt taagcaccgc gttcaccatg cttttgatga tgttgcaggc 3180

aagtggtgac ccgcgaatgg cgcaagtgct gacctggatt tccggttcga cctacaacgc 3240

gaccgatgcg caggtctggc gcaccggaat tgtgatggtg attttgctgg cgattacccc 3300

gctgtgccgc cgctggctga ccattttacc gctgggtggt gataccgccc gagccgtagg 3360

aatggcgctg acgccgacgc gaattgcgct gctgctgtta gcggcttgcc tgacggcgac 3420

cgcgacgatg actattggac cgttgagttt tgttggttta atggcaccgc atattgcgcg 3480

gatgatgggc tttcgacgga cgatgccaca catcgtaatt tcggcgctgg tgggtggttt 3540

actgctggtg ttcgctgact ggtgtgggcg gatggtgctg tttccattcc agatcccggc 3600

ggggctgctg tcaaccttta tcggcgcgcc atattttatc tatttgttga gaaagcagag 3660

ccgttaa 3667

<210> 5

<211> 265

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 5

Met Gln Glu Tyr Thr Asn His Ser Asp Thr Thr Phe Ala Leu Arg Asn

1 5 10 15

Ile Ser Phe Arg Val Pro Gly Arg Thr Leu Leu His Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Thr Phe Pro Ala Gly Lys Val Thr Gly Leu Ile Gly His Asn Gly Ser

35 40 45

Gly Lys Ser Thr Leu Leu Lys Met Leu Gly Arg His Gln Pro Pro Ser

50 55 60

Glu Gly Glu Ile Leu Leu Asp Ala Gln Pro Leu Glu Ser Trp Ser Ser

65 70 75 80

Lys Ala Phe Ala Arg Lys Val Ala Tyr Leu Pro Gln Gln Leu Pro Pro

85 90 95

Ala Glu Gly Met Thr Val Arg Glu Leu Val Ala Ile Gly Arg Tyr Pro

100 105 110

Trp His Gly Ala Leu Gly Arg Phe Gly Ala Ala Asp Arg Glu Lys Val

115 120 125

Glu Glu Ala Ile Ser Leu Val Gly Leu Lys Pro Leu Ala His Arg Leu

130 135 140

Val Asp Ser Leu Ser Gly Gly Glu Arg Gln Arg Ala Trp Ile Ala Met

145 150 155 160

Leu Val Ala Gln Asp Ser Arg Cys Leu Leu Leu Asp Glu Pro Thr Ser

165 170 175

Ala Leu Asp Ile Ala His Gln Val Asp Val Leu Ser Leu Val His Arg

180 185 190

Leu Ser Gln Glu Arg Gly Leu Thr Val Ile Ala Val Leu His Asp Ile

195 200 205

Asn Met Ala Ala Arg Tyr Cys Asp Tyr Leu Val Ala Leu Arg Gly Gly

210 215 220

Glu Met Ile Ala Gln Gly Thr Pro Ala Glu Ile Met Arg Gly Glu Thr

225 230 235 240

Leu Glu Met Ile Tyr Gly Ile Pro Met Gly Ile Leu Pro His Pro Ala

245 250 255

Gly Ala Ala Pro Val Ser Phe Val Tyr

260 265

<210> 6

<211> 296

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 6

Met Ser Gly Leu Pro Leu Ile Ser Arg Arg Arg Leu Leu Thr Ala Met

1 5 10 15

Ala Leu Ser Pro Leu Leu Trp Gln Met Asn Thr Ala His Ala Ala Ala

20 25 30

Ile Asp Pro Asn Arg Ile Val Ala Leu Glu Trp Leu Pro Val Glu Leu

35 40 45

Leu Leu Ala Leu Gly Ile Val Pro Tyr Gly Val Ala Asp Thr Ile Asn

50 55 60

Tyr Arg Leu Trp Val Ser Glu Pro Pro Leu Pro Asp Ser Val Ile Asp

65 70 75 80

Val Gly Leu Arg Thr Glu Pro Asn Leu Glu Leu Leu Thr Glu Met Lys

85 90 95

Pro Ser Phe Met Val Trp Ser Ala Gly Tyr Gly Pro Ser Pro Glu Met

100 105 110

Leu Ala Arg Ile Ala Pro Gly Arg Gly Phe Asn Phe Ser Asp Gly Lys

115 120 125

Gln Pro Leu Ala Met Ala Arg Lys Ser Leu Thr Glu Met Ala Asp Leu

130 135 140

Leu Asn Leu Gln Ser Ala Ala Glu Thr His Leu Ala Gln Tyr Glu Asp

145 150 155 160

Phe Ile Arg Ser Met Lys Pro Arg Phe Val Lys Arg Gly Ala Arg Pro

165 170 175

Leu Leu Leu Thr Thr Leu Ile Asp Pro Arg His Met Leu Val Phe Gly

180 185 190

Pro Asn Ser Leu Phe Gln Glu Ile Leu Asp Glu Tyr Gly Ile Pro Asn

195 200 205

Ala Trp Gln Gly Glu Thr Asn Phe Trp Gly Ser Thr Ala Val Ser Ile

210 215 220

Asp Arg Leu Ala Ala Tyr Lys Asp Val Asp Val Leu Cys Phe Asp His

225 230 235 240

Asp Asn Ser Lys Asp Met Asp Ala Leu Met Ala Thr Pro Leu Trp Gln

245 250 255

Ala Met Pro Phe Val Arg Ala Gly Arg Phe Gln Arg Val Pro Ala Val

260 265 270

Trp Phe Tyr Gly Ala Thr Leu Ser Ala Met His Phe Val Arg Val Leu

275 280 285

Asp Asn Ala Ile Gly Gly Lys Ala

290 295

<210> 7

<211> 660

<212> БЕЛОК

<213> Escherichia coli

<400> 7

Met Ser Lys Arg Ile Ala Leu Phe Pro Ala Leu Leu Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Val Ile Val Ala Thr Ala Leu Thr Trp Met Asn Phe Ser Gln Ala Leu

20 25 30

Pro Arg Ser Gln Trp Ala Gln Ala Ala Trp Ser Pro Asp Ile Asp Val

35 40 45

Ile Glu Gln Met Ile Phe His Tyr Ser Leu Leu Pro Arg Leu Ala Ile

50 55 60

Ser Leu Leu Val Gly Ala Gly Leu Gly Leu Val Gly Val Leu Phe Gln

65 70 75 80

Gln Val Leu Arg Asn Pro Leu Ala Glu Pro Thr Thr Leu Gly Val Ala

85 90 95

Thr Gly Ala Gln Leu Gly Ile Thr Val Thr Thr Leu Trp Ala Ile Pro

100 105 110

Gly Ala Met Ala Ser Gln Phe Ala Ala Gln Ala Gly Ala Cys Val Val

115 120 125

Gly Leu Ile Val Phe Gly Val Ala Trp Gly Lys Arg Leu Ser Pro Val

130 135 140

Thr Leu Ile Leu Ala Gly Leu Val Val Ser Leu Tyr Cys Gly Ala Ile

145 150 155 160

Asn Gln Leu Leu Val Ile Phe His His Asp Gln Leu Gln Ser Met Phe

165 170 175

Leu Trp Ser Thr Gly Thr Leu Thr Gln Thr Asp Trp Gly Gly Val Glu

180 185 190

Arg Leu Trp Pro Gln Leu Leu Gly Gly Val Met Leu Thr Leu Leu Leu

195 200 205

Leu Arg Pro Leu Thr Leu Met Gly Leu Asp Asp Gly Val Ala Arg Asn

210 215 220

Leu Gly Leu Ala Leu Ser Leu Ala Arg Leu Ala Ala Leu Ser Leu Ala

225 230 235 240

Ile Val Ile Ser Ala Leu Leu Val Asn Ala Val Gly Ile Ile Gly Phe

245 250 255

Ile Gly Leu Phe Ala Pro Leu Leu Ala Lys Met Leu Gly Ala Arg Arg

260 265 270

Leu Leu Pro Arg Leu Met Leu Ala Ser Leu Ile Gly Ala Leu Ile Leu

275 280 285

Trp Leu Ser Asp Gln Ile Ile Leu Trp Leu Thr Arg Val Trp Met Glu

290 295 300

Val Ser Thr Gly Ser Val Thr Ala Leu Ile Gly Ala Pro Leu Leu Leu

305 310 315 320

Trp Leu Leu Pro Arg Leu Arg Ser Ile Ser Ala Pro Asp Met Lys Val

325 330 335

Asn Asp Arg Val Ala Ala Glu Arg Gln His Val Leu Ala Phe Ala Leu

340 345 350

Ala Gly Gly Val Leu Leu Leu Met Ala Val Val Val Ala Leu Ser Phe

355 360 365

Gly Arg Asp Ala His Gly Trp Thr Trp Ala Ser Gly Ala Leu Leu Glu

370 375 380

Asp Leu Met Pro Trp Arg Trp Pro Arg Ile Met Ala Ala Leu Phe Ala

385 390 395 400

Gly Val Met Leu Ala Val Ala Gly Cys Ile Ile Gln Arg Leu Thr Gly

405 410 415

Asn Pro Met Ala Ser Pro Glu Val Leu Gly Ile Ser Ser Gly Ala Ala

420 425 430

Phe Gly Val Val Leu Met Leu Phe Leu Val Pro Gly Asn Ala Phe Gly

435 440 445

Trp Leu Leu Pro Ala Gly Ser Leu Gly Ala Ala Val Thr Leu Leu Ile

450 455 460

Ile Met Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Phe Ser Pro His Arg Met Leu

465 470 475 480

Leu Ala Gly Met Ala Leu Ser Thr Ala Phe Thr Met Leu Leu Met Met

485 490 495

Leu Gln Ala Ser Gly Asp Pro Arg Met Ala Gln Val Leu Thr Trp Ile

500 505 510

Ser Gly Ser Thr Tyr Asn Ala Thr Asp Ala Gln Val Trp Arg Thr Gly

515 520 525

Ile Val Met Val Ile Leu Leu Ala Ile Thr Pro Leu Cys Arg Arg Trp

530 535 540

Leu Thr Ile Leu Pro Leu Gly Gly Asp Thr Ala Arg Ala Val Gly Met

545 550 555 560

Ala Leu Thr Pro Thr Arg Ile Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Cys Leu

565 570 575

Thr Ala Thr Ala Thr Met Thr Ile Gly Pro Leu Ser Phe Val Gly Leu

580 585 590

Met Ala Pro His Ile Ala Arg Met Met Gly Phe Arg Arg Thr Met Pro

595 600 605

His Ile Val Ile Ser Ala Leu Val Gly Gly Leu Leu Leu Val Phe Ala

610 615 620

Asp Trp Cys Gly Arg Met Val Leu Phe Pro Phe Gln Ile Pro Ala Gly

625 630 635 640

Leu Leu Ser Thr Phe Ile Gly Ala Pro Tyr Phe Ile Tyr Leu Leu Arg

645 650 655

Lys Gln Ser Arg

660

<210> 8

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 1

<400> 8

ctcctttcgt gtgcccgggc gcacgctttt gcatccgctg tcgttaacct aggtgacact 60

atagaacgcg 70

<210> 9

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 2

<400> 9

caataaacaa aactcacagg tgcagcaccc gccggatgcg gcaaaatacc tagtggatct 60

gatgggtacc 70

<210> 10

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 3

<400> 10

cgactgttaa cggcgatggc gctttctccg ttgttatggc agatgaatac aggtgacact 60

atagaacgcg 70

<210> 11

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 4

<400> 11

tcacgcttta cctccgatgg cgttatccag aacgcgcaca aagtgcattg tagtggatct 60

gatgggtacc 70

<210> 12

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 5

<400> 12

gtgagtaaac gaattgcgct tttcccggcg ttattgctgg cgctgttagt aggtgacact 60

atagaacgcg 70

<210> 13

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 6

<400> 13

aggttgacag cagccccgcc gggatctgga atggaaacag caccatccgc tagtggatct 60

gatgggtacc 70

<210> 14

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 7

<400> 14

atgcaggaat acacgaatca ttccgatacc acttttgcac tgcgtaatat ctcctttcgt 60

gtgcccgggc 70

<210> 15

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 8

<400> 15

gccatcgccg ttaacagtcg acggcgcgaa ataagaggta agccgctcat caataaacaa 60

aactcacagg 70

<210> 16

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 9

<400> 16

cctgtgagtt ttgtttattg atgagcggct tacctcttat ttcgcgccgt cgactgttaa 60

cggcgatggc 70

<210> 17

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 10

<400> 17

aatcactaac agcgccagca ataacgccgg gaaaagcgca attcgtttac tcacgcttta 60

cctccgatgg 70

<210> 18

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 11

<400> 18

tcggcaatgc actttgtgcg cgttctggat aacgccatcg gaggtaaagc gtgagtaaac 60

gaattgcgct 70

<210> 19

<211> 70

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 12

<400> 19

ttaacggctc tgctttctca acaaatagat aaaatatggc gcgccgataa aggttgacag 60

cagccccgcc 70

<210> 20

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 13

<400> 20

gaatacgtcg ccagctgctt taacac 26

<210> 21

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер 14

<400> 21

tggtttgtcg gatgcggcgt gaac 24

<---

Claims

1. Микроорганизм из рода Escherichia, обладающий способностью продуцировать L-аминокислоты и повышенным уровнем внутриклеточного ATP по сравнению с немодифицированным штаммом, где виды активности одного или нескольких белков, выбранных из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 и аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, которые образуют систему поглощения железа, были инактивированы.

2. Микроорганизм из рода Escherichia по п. 1, где виды активности всех белков, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 5, 6 и 7, были инактивированы.

3. Микроорганизм из рода Escherichia по п. 1, где микроорганизм представляет собой E. coli.

4. Микроорганизм из рода Escherichia по п. 1, где микроорганизм из рода Escherichia обладает улучшенной способностью к продуцированию L-аминокислоты по сравнению с немодифицированным штаммом.

5. Микроорганизм из рода Escherichia по п. 4, где L-аминокислота представляет собой L-треонин или L-триптофан.

6. Способ продуцирования L-аминокислот, при этом способ включает:

культивирование микроорганизма из рода Escherichia по любому из пп. 1-5 в среде и

извлечение L-аминокислот из культуральной среды или микроорганизма.

7. Способ по п. 6, где L-аминокислота представляет собой L-треонин или L-триптофан.