CN112831451B - 产丙谷二肽的工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

产丙谷二肽的工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了丙谷二肽的工程菌及其构建方法与应用。本发明提供了一种产丙谷二肽的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：将L‑氨基酸‑α‑连接酶的编码基因和/或谷氨酰胺合成酶的编码基因导入受体菌，得到产丙谷二肽的基因工程菌。本发明通过全细胞催化合成丙谷二肽。本方案操作简单；无需氨基酸保护；反应条件温和；无需使用有毒试剂，环境友好；副产物少，大大降低了下游纯化成本。

Description

产丙谷二肽的工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于代谢工程领域，具体涉及丙谷二肽的工程菌及其构建方法与应用，更具体来说，所述工程菌以L-谷氨酸(或L-谷氨酸钠)和L-丙氨酸为底物合成丙谷二肽。
背景技术
丙谷二肽，别名力肽、L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，是一种白色或类白色结晶性粉末、微甜、无臭无味，热稳定性好，在水中易溶(586g/L，25℃)，在乙醇、丙酮或乙醚中不溶。英文全称为L-Alanyl-L-Glutamine，分子式为C8H15N3O4，Mr 217.22。
丙谷二肽作为一种二肽，在体内主要通过水解为谷氨酰胺和丙氨酸发挥药理作用，适用于补充谷氨酰胺肠外营养，包括处于分解代谢和高代谢状况的患者。丙谷二肽通过糖酵解刺激乳酸-苹果酸循环增加葡萄糖的使用。富含丙谷二肽的肠外营养可以提高危重患者的葡萄糖利用率，并降低严重创伤患者的胰岛素抵抗；减少感染并发症，提高危重患者代谢耐受性。脓毒血症患者应用丙谷二肽强化早期肠内营养治疗具有较好的临床疗效，可有效改善免疫功能、降低病死率。有研究表明，是丙谷二肽而非甘氨酸-谷氨酰胺作为谷氨酰胺替代物促进肠细胞的增殖。
丙谷二肽的生产目前主要采用化学合成法，化学合成丙谷二肽的方法主要有活化酯法、三苯基膦/六氯乙烷(Appel)缩合法。化学法合成丙谷二肽均存在一定步骤繁琐，耗时耗力、产率低、伴随副产物产生的问题，甚至可能存在立体异构体和有毒副产物的产生。现有生物方法中，通过过表达L-氨基酸-α-连接酶的大肠杆菌发酵合成丙谷二肽，该技术为日本技术所垄断，且该方法菌株生长受二肽积累的抑制；转化率低；存在副产物L-Ala-L-Ala的积累；发酵液成分复杂，不利于后期分离纯化。或者，通过过表达氨基酸酯酰基转移酶通过酶法合成丙谷二肽，该方法难以达到足够高的转化率，而且在缺乏L-Gln的情况下，丙谷二肽可被降解；同时丙氨酸甲酯盐酸盐价格昂贵，化学性质活跃，易水解；反应中伴随着Ala-Ala-Gln和D-Ala-Gln副产物的产生，因而难以应用于大规模生产。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何通过生物法大规模合成丙谷二肽。因此，本发明提供了丙谷二肽的工程菌及其构建方法与应用。所述工程菌以L-谷氨酸(或L-谷氨酸钠)和L-丙氨酸为底物合成丙谷二肽。
本发明提供了一种产丙谷二肽的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：将L-氨基酸-α-连接酶的编码基因和/或谷氨酰胺合成酶的编码基因导入受体菌(以提高受体菌中L-氨基酸-α-连接酶和/或谷氨酰胺合成酶的含量和/或活性)，得到产丙谷二肽的基因工程菌；
所述受体菌为下述S1至S4中的任一种：
S1、对大肠杆菌进行下述m1-m10的改造得到的重组菌：
m1)敲除基因组中谷氨酰胺酶A的编码基因；
m2)敲除基因组中谷氨酰胺酶B的编码基因；
m3)敲除基因组中谷氨酰胺合成酶去腺苷酸酶/谷氨酰胺合成酶腺苷酸转移酶双功能酶的编码基因；
m4)敲除基因组中氮调节蛋白PII-1的编码基因；
m5)敲除基因组中肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶的编码基因；
m6)敲除基因组中氨基肽酶A的编码基因；
m7)敲除基因组中氨基肽酶B的编码基因；
m8)敲除基因组中的氨基肽酶D的编码基因；
m9)敲除基因组中的氨基肽酶N的编码基因；
m10)敲除基因组中二肽转运蛋白体DppABCDF的编码基因簇；
S2、对大肠杆菌进行上述m1)-m5)的改造得到的重组菌；
S3、对大肠杆菌进行上述m1)-m2)的改造得到的重组菌；
S4、对大肠杆菌进行上述m6)-m10)的改造得到的重组菌。
谷氨酰胺酶A的编码基因(glsA)(Gene ID:946187,updated on 30-May-2019)。谷氨酰胺酶A的氨基酸序列的genebank号为NP_415018(提交日为11-OCT-2018)。氨基肽酶A的编码基因如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第511641-512573位核苷酸所示。
谷氨酰胺酶B的编码基因(glsB)(Gene ID:944973,updated on 30-May-2019)。谷氨酰胺酶B的氨基酸序列的genebank号为NP_416041(提交日为11-OCT-2018)。谷氨酰胺酶B的编码基因区如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第1612325-1613251位核苷酸所示。
谷氨酰胺合成酶去腺苷酸酶/谷氨酰胺合成酶腺苷酸转移酶双功能酶的编码基因(glnE)(Gene ID:947552,updated on 30-May-2019)。GlnE的氨基酸序列的genebank号为NP_417525(提交日为11-OCT-2018)。谷氨酰胺合成酶去腺苷酸酶/谷氨酰胺合成酶腺苷酸转移酶双功能酶的编码基因如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第3196801-3199641位核苷酸所示。
氮调节蛋白PII-1的编码基因(glnB)(Gene ID:947016,updated on 30-May-2019)。PII-1蛋白的氨基酸序列的genebank号为NP_417048(提交日为11-OCT-2018)。氮调节蛋白PII-1的编码基因如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第2687070-2687408位核苷酸所示。
肉豆蔻酰载体蛋白(ACP)依赖性酰基转移酶的编码基因(lpxM)(Gene ID:945143,updated on 30-May-2019)。肉豆蔻酰载体蛋白(ACP)依赖性酰基转移酶的氨基酸序列的genebank号为NP_416369(提交日为11-OCT-2018)。肉豆蔻酰载体蛋白(ACP)依赖性酰基转移酶的编码基因如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第1939222-1940193位核苷酸所示。
氨基肽酶A的编码基因(pepA)Gene ID:948791,updated on 30-May-2019)。氨基肽酶A的氨基酸序列的genebank号为NP_418681(提交日为11-OCT-2018)。氨基肽酶A的编码基因如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第4484440-4485951位核苷酸所示。
氨基肽酶B的编码基因(pepB)(Gene ID:948766,updated on 30-May-2019)。氨基肽酶B的氨基酸序列的genebank号为NP_417018(提交日为11-OCT-2018)。氨基肽酶B的编码基因如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第2655075-2656358位核苷酸所示。
氨基肽酶D的编码基因(pepD)(Gene ID:945013,updated on 30-May-2019)。氨基肽酶D的氨基酸序列的genebank号为NP_414772(提交日为11-OCT-2018)。氨基肽酶D的编码基因如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第254259-255716位核苷酸所示。
氨基肽酶N的编码基因(pepN)(Gene ID:947253,updated on 30-May-2019)。氨基肽酶N的氨基酸序列的genebank号为NP_414772(提交日为11-OCT-2018)。氨基肽酶N的编码基因如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第990622-993234位核苷酸所示。
二肽转运蛋白体DppABCDF的编码基因簇包括5个基因。dppA基因(Gene ID:948062,updated on 30-May-2019)。dppB基因(Gene ID:948063,updated on 30-May-2019)。dppC基因(Gene ID:948064,updated on 30-May-2019)。dppD基因(Gene ID:948065,updated on 30-May-2019)。dppF基因(Gene ID:948056,updated on 30-May-2019)。DppA蛋白的氨基酸序列的genebank号为NP_418001(提交日为11-OCT-2018)。DppB蛋白的氨基酸序列的genebank号为NP_418000(提交日为11-OCT-2018)。DppC蛋白的氨基酸序列的genebank号为NP_417999(提交日为11-OCT-2018)。DppD蛋白的氨基酸序列的genebank号为NP_417998(提交日为11-OCT-2018)。DppF蛋白的氨基酸序列的genebank号为NP_417997(提交日为11-OCT-2018)。从起始密码子至终止密码子的dppA基因编码区，如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第3706098-3707705位核苷酸所示。从起始密码子至终止密码子的dppB基因编码区，如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第3704771-3705790位核苷酸所示。从起始密码子至终止密码子的dppC基因编码区，如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第3703859-3704761位核苷酸所示。从起始密码子至终止密码子的dppD基因编码区，如GENBANK ACCESIIONNO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第3702865-3703848位核苷酸所示。从起始密码子至终止密码子的dppF基因编码区，如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第3701864-3702868位核苷酸所示。
所述谷氨酰胺合成酶为如下(a1)或(a2)：
(a1)由序列表的序列1所示的谷氨酰胺合成酶编码基因翻译得到的蛋白质；
(a2)将(a1)进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或添加和/或缺失得到的具有谷氨酰胺合成酶活性的的蛋白质。
所述L-氨基酸-α-连接酶为如下(b1)、(b2)、(b3)、(b4)、(b5)或(b6)：
(b1)由序列表的序列2所示的L-氨基酸-α-连接酶编码基因翻译得到的蛋白质；
(b2)将(b1)进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或添加和/或缺失得到的具有L-氨基酸-α-连接酶活性的的蛋白质；
(b3)由序列表的序列3所示的L-氨基酸-α-连接酶编码基因翻译得到的蛋白质；
(b4)将(b3)进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或添加和/或缺失得到的具有L-氨基酸-α-连接酶活性的的蛋白质；
(b5)由序列表的序列4所示的L-氨基酸-α-连接酶编码基因翻译得到的蛋白质；
(b6)将(b5)进行一个或几个氨基酸残基的取代和/或添加和/或缺失得到的具有L-氨基酸-α-连接酶活性的的蛋白质。
所述谷氨酰胺合成酶的编码基因为如下A1)或A2)或A3)：
A1)序列表的序列1所示的DNA分子；
A2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
A3)与A1)或A2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述谷氨酰胺合成酶的cDNA或基因组DNA。
所述L-氨基酸-α-连接酶的编码基因为如下B1)或B2)或B3)或B4)或B5)或B6)或B7)或B8)或B9)：
B1)序列表的序列2所示的DNA分子；
B2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
B3)与B1)或B2)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述L-氨基酸-α-连接酶的cDNA或基因组DNA；
B4)序列表的序列3所示的DNA分子；
B5)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
B6)与B4)或B5)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述L-氨基酸-α-连接酶的cDNA或基因组DNA；
B7)序列表的序列4所示的DNA分子；
B8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
B9)与B7)或B8)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述L-氨基酸-α-连接酶的cDNA或基因组DNA。
所述方法中，将L-氨基酸-α-连接酶的编码基因和/或谷氨酰胺合成酶的编码基因导入受体菌时，上调L-氨基酸-α-连接酶的编码基因上游的RBS翻译起始速率。上调L-氨基酸-α-连接酶的编码基因上游的RBS翻译起始速率的具体实现方式可为：采用如下RBS：aaatttaattaacaagtatataaggaggatatttt。上调L-氨基酸-α-连接酶的编码基因上游的RBS翻译起始速率的具体实现方式可为：采用如下RBS：aaaattaacaaaaccaagacattattataattaaggaggatattt。
所述方法中，将L-氨基酸-α-连接酶的编码基因和/或谷氨酰胺合成酶的编码基因导入受体菌时，采用复制能力不同的表达载体。复制能力不同，相应的在受体菌中的拷贝数也不同。
将L-氨基酸-α-连接酶的编码基因和/或谷氨酰胺合成酶的编码基因导入受体菌具体可为：将L-氨基酸-α-连接酶的编码基因导入受体菌。
将L-氨基酸-α-连接酶的编码基因和/或谷氨酰胺合成酶的编码基因导入受体菌具体可为：将L-氨基酸-α-连接酶的编码基因和谷氨酰胺合成酶的编码基因导入受体菌。将L-氨基酸-α-连接酶的编码基因和谷氨酰胺合成酶的编码基因导入受体菌时，两个基因可共用一个启动子。所述启动子具体可为ara启动子(如序列表的序列5第994-1266位所示)。L-氨基酸-α-连接酶的编码基因可位于谷氨酰胺合成酶的编码基因的上游。谷氨酰胺合成酶的编码基因可位于L-氨基酸-α-连接酶的编码基因的上游。
所述“同一性”是指与特定核酸序列的序列相似性。两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可用来评估相关序列之间的相似度。
更进一步的，所述产丙谷二肽的基因工程菌的构建方法具体为如下1)-8)中任一种：
1)提高大肠杆菌中L-氨基酸-α-连接酶和谷氨酰胺合成酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中谷氨酰胺酶A和/或谷氨酰胺酶B和/或GlnE蛋白和/或PII-1蛋白和/或肉豆蔻酰载体蛋白(ACP)依赖性酰基转移酶和/或氨基肽酶A和/或氨基肽酶B和/或氨基肽酶D和/或氨基肽酶N和/或二肽转运蛋白体DppABCDF的含量和/或活性；
2)提高大肠杆菌中L-氨基酸-α-连接酶和谷氨酰胺合成酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中氨基肽酶A和/或氨基肽酶B和/或氨基肽酶D和/或氨基肽酶N和/或二肽转运蛋白体DppABCDF的含量和/或活性；
3)提高大肠杆菌中L-氨基酸-α-连接酶和谷氨酰胺合成酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中谷氨酰胺酶A和/或谷氨酰胺酶B和/或GlnE蛋白和/或PII-1蛋白和/或肉豆蔻酰载体蛋白(ACP)依赖性酰基转移酶的含量和/或活性；
4)提高大肠杆菌中L-氨基酸-α-连接酶和谷氨酰胺合成酶的含量和/或活性；
5)提高大肠杆菌中L-氨基酸-α-连接酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中谷氨酰胺酶A和/或谷氨酰胺酶B和/或GlnE蛋白和/或PII-1蛋白和/或肉豆蔻酰载体蛋白(ACP)依赖性酰基转移酶和/或氨基肽酶A和/或氨基肽酶B和/或氨基肽酶D和/或氨基肽酶N和/或二肽转运蛋白体DppABCDF的含量和/或活性；
6)提高大肠杆菌中L-氨基酸-α-连接酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中氨基肽酶A和/或氨基肽酶B和/或氨基肽酶D和/或氨基肽酶N和/或二肽转运蛋白体DppABCDF的含量和/或活性；
7)提高大肠杆菌中L-氨基酸-α-连接酶的含量和/或活性，且降低所述大肠杆菌中谷氨酰胺酶A和/或谷氨酰胺酶B和/或GlnE蛋白和/或PII-1蛋白和/或肉豆蔻酰载体蛋白(ACP)依赖性酰基转移酶的含量和/或活性；
8)提高大肠杆菌中L-氨基酸-α-连接酶的含量和/或活性。
将L-氨基酸-α-连接酶的编码基因导入受体菌，具体可通过导入重组质粒实现；所述重组质粒可为将L-氨基酸-α-连接酶的编码基因插入表达载体得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为实施例中的重组质粒pYB1s-BabacD、重组质粒pYB1s-BvbacD或重组质粒pYB1s-VcbacD。
将L-氨基酸-α-连接酶的编码基因和谷氨酰胺合成酶的编码基因导入受体菌，具体可通过导入重组质粒实现；所述重组质粒可为将L-氨基酸-α-连接酶的编码基因和谷氨酰胺合成酶的编码基因插入表达载体得到的重组质粒。所述重组质粒具体可为实施例中的重组质粒yga(pYB1s-CgglnA-BabacD)、重组质粒yag(pYB1s-BabacD-CgglnA)、重组质粒yga58906(pYB1s-CgglnA-BabacDRBS58906)、重组质粒yga239621(pYB1s-CgglnA-BabacDRBS239621)或重组质粒lga239621(pLB1s-CgglnA-BabacDRBS239621)。
所述方法中，具体采用CRISPR-Cas9技术进行基因敲除。
所述表达载体具体可为pYB1s载体或pLB1s载体。
所述大肠杆菌可为大肠杆菌K12或大肠杆菌K12的衍生菌株。
所述大肠杆菌可为大肠杆菌BW25113。
所述受体菌具体可为实施例中的重组菌AQ10、重组菌AQ04、重组菌AQ06或重组菌AQ09。
以上任一所述的方法构建得到的产丙谷二肽的基因工程菌也属于本发明的保护范围。
产丙谷二肽的基因工程菌具体可为实施例中的重组菌pYB1s-BabacD/AQ10、重组菌pYB1s-BvbacD/AQ10、重组菌pYB1s-VcbacD/AQ10、重组菌YGA(pYB1s-CgglnA-BabacD/AQ10)、重组菌YAG(pYB1s-BabacD-CgglnA/AQ10)、重组菌yga/BW25113、重组菌yga/AQ04、重组菌yga/AQ06、重组菌yga/AQ09、重组菌YGA58906、重组菌YGA239621或重组菌LGA239621。
本发明还保护所述产丙谷二肽的基因工程菌在制备丙谷二肽或与其有相似合成途径的寡肽中的应用。上述应用中，以L-丙氨酸和特定物质为底物。所述特定物质为L-谷氨酸或L-谷氨酸盐或L-谷氨酰胺。
本发明还保护一种制备丙谷二肽的方法，包括如下步骤：将所述产丙谷二肽的基因工程菌进行阿拉伯糖诱导培养，用诱导培养后的菌体催化L-丙氨酸和特定物质反应，生成丙谷二肽；所述特定物质为L-谷氨酸或L-谷氨酸盐或L-谷氨酰胺。
所述方法中，阿拉伯糖诱导培养采用的阿拉伯糖浓度为0.18-0.22g/100ml。
所述方法中，阿拉伯糖诱导培养的温度为30℃。
所述方法中，阿拉伯糖诱导培养的时间为16h。
所述阿拉伯糖具体可为L-阿拉伯糖。
所述方法中，催化L-丙氨酸和特定物质反应的反应温度为30℃。
所述方法中，催化L-丙氨酸和特定物质反应的反应时间为6-18小时，具体可为18小时。
所述方法中，催化L-丙氨酸和特定物质反应，L-丙氨酸和特定物质等摩尔配比。
本发明公开了产丙谷二肽的工程菌及其构建方法与应用。本发明于大肠杆菌工程菌中共表达谷氨酰胺合成酶和L-氨基酸-α-连接酶，通过全细胞催化合成丙谷二肽。首先以谷氨酸或谷氨酸钠(味精)为底物，通过谷氨酰胺合成酶催化合成L-谷氨酰胺，进一步与L-丙氨酸通过L-氨基酸-α-连接酶酰胺化合成丙谷二肽，并通过工程菌株的代谢工程改造提高丙谷二肽产量。从成本核算的角度出发，目前谷氨酰胺的价格9万/吨，丙谷二肽约55万/吨，以谷氨酰胺作为底物合成丙谷二肽成本依旧很高，加之下游纯化成本和人力成本高，利润空间不大。目前味精的价格仅约为2.5万/吨，因而本方案合成成本有望进一步降低。此外，本方案操作简单；无需氨基酸保护；反应条件温和；无需使用有毒试剂，环境友好；副产物少，大大降低了下游纯化成本。
附图说明
图1为pYB1s载体图谱。
图2为氨基酸标准品及丙谷二肽标准品的混合物的HPLC图谱。
图3为同一批次试验中，三种重组菌得到的转化液1中的丙谷二肽浓度；Ba代表重组菌pYB1s-BabacD/AQ10，Bv代表重组菌pYB1s-BvbacD/AQ10，Vc代表重组菌pYB1s-VcbacD/AQ10。
图4为同一批次试验中，两种重组菌得到的转化液2中的丙谷二肽浓度和谷氨酰胺浓度；YGA代表重组菌YGA(pYB1s-CgglnA-BabacD/AQ10)，YAG代表重组菌YAG(pYB1s-BabacD-CgglnA/AQ10)。
图5为同一批次试验中，五种重组菌得到的转化液2中的丙谷二肽浓度和谷氨酰胺浓度；yga/BW代表重组菌yga/BW25113,yga/AQ10代表重组菌YGA(pYB1s-CgglnA-BabacD/AQ10)。
图6为同一批次试验中，三种重组菌得到的转化液2-1中的丙谷二肽浓度和谷氨酰胺浓度；YGA代表重组菌YGA(pYB1s-CgglnA-BabacD/AQ10)。
图7为同一批次试验中，两种重组菌自诱导培养后，测量OD600nm值的结果。
图8为同一批次试验中，两种重组菌得到的转化液2中的丙谷二肽浓度。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
质粒pTargetF(筛选标记为链霉素)和质粒pCas(筛选标记为卡那霉素)均记载于如下文献：Jiang Y,Chen B,Duan C,et al.Multigene Editing in the Escherichiacoli Genome via the CRISPR-Cas9 System[J].Applied and EnvironmentalMicrobiology,2015,81(7):2506-2514.。
pYB1s载体如序列表的序列5所示。pYB1s载体包括如下片段：(1)araC-araBAD-MCS片段(含阿拉伯糖诱导启动子、多克隆位点)；(2)MCS-TrrnB片段(含多克隆位点、终止子TrrnB)；(3)P15A复制起始位点片段；(4)链霉素抗性基因Str片段。pYB1s载体图谱见图1。
pLB1s载体如序列表的序列6所示。pLB1s载体包括如下片段：(1)araC-araBAD-MCS片段(含阿拉伯糖诱导启动子、多克隆位点)；(2)MCS-TrrnB片段(含多克隆位点、终止子TrrnB)；(3)R6k复制起始位点片段；(4)链霉素抗性基因Str片段。
实施例1、重组菌AQ04、重组菌AQ06、重组菌AQ10和重组菌AQ09的构建
一、重组菌BW△GlsA的制备
1、以质粒pTargetF为模板，采用GlsA-gF和GlsA-gR进行PCR扩增，得到质粒pTarget-glsA(约2100bp，环形质粒)。
2、以大肠杆菌BW25113的基因组DNA为模板，采用GlsA-upF和GlsA-upR组成的引物对进行PCR扩增(靶序列位于glsA基因上游约500bp)，回收PCR扩增产物(PCR扩增产物作为上游同源臂)；以大肠杆菌BW25113的基因组DNA为模板，采用GlsA-dF和GlsA-dR组成的引物对进行PCR扩增(靶序列位于glsA基因下游约500bp)，回收PCR扩增产物(PCR扩增产物作为下游同源臂)；同时将上游同源臂和下游同源臂作为模板，采用GlsA-upF和GlsA-dR组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物(PCR扩增产物作为打靶片段，约1000bp)。
3、将质粒pCas热激转化大肠杆菌BW25113感受态细胞，加入600μl LB液体培养基，30℃孵育1h，然后涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB培养基平板，30℃培养过夜；然后，挑取单克隆接种至含50μg/ml卡那霉素的液体LB培养基，30℃、220rpm培养至对数期；然后，将菌液接种至含50μg/ml卡那霉素的液体LB培养基，加入L-ara并使其在体系中的浓度为0.2g/L，30℃、220rpm培养至OD600nm值约为0.6，收集菌体，制备电转感受态细胞。
4、将质粒pTarget-glsA和打靶片段共同电击转化步骤3得到的电转感受态细胞，30℃孵育1h，然后涂布于含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml链霉素的LB培养基平板，30℃培养过夜；然后，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定(采用GlsA-dF和GlsA-dR组成的引物对，如果PCR扩增产物仅有一种且大小约为1000bp，则回收PCR扩增产物并进行测序验证，如果缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glsA基因编码区，该单克隆为阳性克隆)。
5、取步骤4得到的阳性克隆，接种至含50μg/ml卡那霉素和50μg/ml链霉素的液体LB培养基，30℃、220rpm培养至对数期；然后，将菌液接种至含50μg/ml卡那霉素的液体LB培养基，加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.5mM，30℃、220rpm培养过夜；然后，取菌液，划线接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基平板，30℃培养过夜。
6、完成步骤5后，挑取单克隆点接至含50μg/ml链霉素的LB培养基平板，如单克隆在平板上不能生长，说明质粒pTargetF已消除。
7、根据步骤6的结果，从步骤5的平板中挑取消除质粒pTarget-glsA的单克隆，接种至液体LB培养基，42℃、220rpm培养过夜；然后，将菌液划线接种至LB培养基平板，37℃培养过夜。
8、完成步骤7后，挑取单克隆点接至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基平板，如单克隆在平板上不能生长，说明质粒pCas已消除。
9、根据步骤8的结果，从步骤8的平板中挑取成功消除质粒pCas的单克隆，该单克隆即为同时消除质粒pCas和质粒pTargetF的单克隆，将其命名为重组菌BW△GlsA。
10、重组菌BW△GlsA的扩繁
重组菌BW△GlsA接种至液体LB培养基，37℃、220rpm培养至对数期，然后加入甘油至浓度为25％，保种。
二、重组菌AQ04的制备
用重组菌BW△GlsA代替大肠杆菌BW25113，用GlsB-gF代替GlsA-gF，用GlsB-gR代替GlsA-gR，用GlsB-upF代替GlsA-upF，用GlsB-upR代替GlsA-upR，用GlsB-dF代替GlsA-dF，用GlsB-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一。得到重组菌BW△GlsAB。
重组菌BW△GlsAB，已消除了质粒pCas和质粒pTargetF。
与大肠杆菌BW25113相比，重组菌BW△GlsAB的差异仅在于：缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glsA基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glsB基因编码区。重组菌BW△GlsAB，又称为重组菌AQ04。
三、重组菌AQ06的制备
用重组菌BW△GlsAB代替大肠杆菌BW25113，用GlnE-gF代替GlsA-gF，用GlnE-gR代替GlsA-gR，用GlnE-upF代替GlsA-upF，用GlnE-upR代替GlsA-upR，用GlnE-dF代替GlsA-dF，用GlnE-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一。得到重组菌BW△GlnE△GlsAB。
用重组菌BW△GlnE△GlsAB代替大肠杆菌BW25113，用GlnB-gF代替GlsA-gF，用GlnB-gR代替GlsA-gR，用GlnB-upF代替GlsA-upF，用GlnB-upR代替GlsA-upR，用GlnB-dF代替GlsA-dF，用GlnB-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一。得到重组菌BW△GlnEB△GlsAB。
用重组菌BW△GlnEB△GlsAB代替大肠杆菌BW25113，用LpxM-gF代替GlsA-gF，用LpxM-gR代替GlsA-gR，用LpxM-upF代替GlsA-upF，用LpxM-upR代替GlsA-upR，用LpxM-dF代替GlsA-dF，用LpxM-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一。得到重组菌BW△GlnEB△GlsAB△LpxM。
重组菌BW△GlnEB△GlsAB△LpxM，已消除了质粒pCas和质粒pTargetF。
与大肠杆菌BW25113相比，重组菌BW△GlnEB△GlsAB△LpxM的差异仅在于：缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glsA基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glsB基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glnE基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glnB基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的lpxM基因编码区。重组菌BW△GlnEB△GlsAB△LpxM，又称为重组菌AQ06。
四、重组菌AQ10的制备
用重组菌BW△GlnEB△GlsAB△LpxM代替大肠杆菌BW25113，用pepA-gF代替GlsA-gF，用pepA-gR代替GlsA-gR，用pepA-upF代替GlsA-upF，用pepA-upR代替GlsA-upR，用pepA-dF代替GlsA-dF，用pepA-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一。得到重组菌BW△GlnEB△GlsAB△pepA△LpxM。
用重组菌BW△GlnEB△GlsAB△pepA△LpxM代替大肠杆菌BW25113，用pepB-gF代替GlsA-gF，用pepB-gR代替GlsA-gR，用pepB-upF代替GlsA-upF，用pepB-upR代替GlsA-upR，用pepB-dF代替GlsA-dF，用pepB-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一。得到重组菌BW△GlnEB△GlsAB△pepAB△LpxM。
用重组菌BW△GlnEB△GlsAB△pepAB△LpxM代替大肠杆菌BW25113，用pepD-gF代替GlsA-gF，用pepD-gR代替GlsA-gR，用pepD-upF代替GlsA-upF，用pepD-upR代替GlsA-upR，用pepD-dF代替GlsA-dF，用pepD-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一。得到重组菌BW△GlnEB△GlsAB△pepABD△LpxM。
用重组菌BW△GlnEB△GlsAB△pepABD△LpxM代替大肠杆菌BW25113，用pepN-gF代替GlsA-gF，用pepN-gR代替GlsA-gR，用pepN-upF代替GlsA-upF，用pepN-upR代替GlsA-upR，用pepN-dF代替GlsA-dF，用pepN-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一。得到重组菌BW△GlnEB△GlsAB△pepABDN△LpxM。
用重组菌BW△GlnEB△GlsAB△pepABDN△LpxM代替大肠杆菌BW25113，用dpp-gF代替GlsA-gF，用dpp-gR代替GlsA-gR，用dpp-upF代替GlsA-upF，用dpp-upR代替GlsA-upR，用dpp-dF代替GlsA-dF，用dpp-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一。得到重组菌BW△GlnEB△GlsAB△pepABDN△dpp△LpxM。
重组菌BW△GlnEB△GlsAB△pepABDN△dpp△LpxM，已消除了质粒pCas和质粒pTargetF。
与大肠杆菌BW25113相比，重组菌BW△GlnEB△GlsAB△pepABDN△dpp△LpxM的差异仅在于：缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glsA基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glsB基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glnE基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的glnB基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的lpxM基因编码区,且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的pepA基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的pepB基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的pepD基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的pepN基因编码区，且缺失了整个dppABCDF基因簇。重组菌BW△GlnEB△GlsAB△pepABDN△dpp△LpxM，又称为重组菌AQ10。
五、重组菌AQ09的制备
用pepA-gF代替GlsA-gF，用pepA-gR代替GlsA-gR，用pepA-upF代替GlsA-upF，用pepA-upR代替GlsA-upR，用pepA-dF代替GlsA-dF，用pepA-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一。得到重组菌BW△pepA。
用重组菌BW△pepA代替大肠杆菌BW25113，用pepB-gF代替GlsA-gF，用pepB-gR代替GlsA-gR，用pepB-upF代替GlsA-upF，用pepB-upR代替GlsA-upR，用pepB-dF代替GlsA-dF，用pepB-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一。得到重组菌BW△pepAB。
用重组菌BW△pepAB代替大肠杆菌BW25113，用pepD-gF代替GlsA-gF，用pepD-gR代替GlsA-gR，用pepD-upF代替GlsA-upF，用pepD-upR代替GlsA-upR，用pepD-dF代替GlsA-dF，用pepD-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一。得到重组菌BW△pepABD。
用重组菌BW△pepABD代替大肠杆菌BW25113，用pepN-gF代替GlsA-gF，用pepN-gR代替GlsA-gR，用pepN-upF代替GlsA-upF，用pepN-upR代替GlsA-upR，用pepN-dF代替GlsA-dF，用pepN-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一。得到重组菌BW△pepABDN。
用重组菌BW△pepABDN代替大肠杆菌BW25113，用dpp-gF代替GlsA-gF，用dpp-gR代替GlsA-gR，用dpp-upF代替GlsA-upF，用dpp-upR代替GlsA-upR，用dpp-dF代替GlsA-dF，用dpp-dR代替GlsA-dR，其他同步骤一。得到重组菌BW△pepABDN△dpp。
重组菌BW△pepABDN△dpp，已消除了质粒pCas和质粒pTargetF。
与大肠杆菌BW25113相比，重组菌BW△pepABDN△dpp的差异仅在于：缺失了整个从起始密码子至终止密码子的pepA基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的pepB基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的pepD基因编码区，且缺失了整个从起始密码子至终止密码子的pepN基因编码区，且缺失了整个dppABCDF基因簇。重组菌BW△pepABDN△dpp，又称为重组菌AQ09。
谷氨酰胺酶A的编码基因(glsA)(Gene ID:946187,updated on 30-May-2019)。谷氨酰胺酶A的氨基酸序列的genebank号为NP_415018(提交日为11-OCT-2018)，310aa。从起始密码子至终止密码子的glsA基因编码区如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第511641-512573位核苷酸所示。
谷氨酰胺酶B的编码基因(glsB)(Gene ID:944973,updated on 30-May-2019)。谷氨酰胺酶B的氨基酸序列的genebank号为NP_416041(提交日为11-OCT-2018)，308aa。从起始密码子至终止密码子的glsB基因编码区如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第1612325-1613251位核苷酸所示。
谷氨酰胺合成酶去腺苷酸酶/谷氨酰胺合成酶腺苷酸转移酶双功能酶的编码基因(glnE)(Gene ID:947552,updated on 30-May-2019)。GlnE的氨基酸序列的genebank号为NP_417525(提交日为11-OCT-2018)，946aa。从起始密码子至终止密码子的glnE基因编码区如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第3196801-3199641位核苷酸所示。
氮调节蛋白PII-1的编码基因(glnB)(Gene ID:947016,updated on 30-May-2019)。PII-1蛋白的氨基酸序列的genebank号为NP_417048(提交日为11-OCT-2018)，112aa。从起始密码子至终止密码子的glnB基因编码区如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第2687070-2687408位核苷酸所示。
肉豆蔻酰载体蛋白(ACP)依赖性酰基转移酶的编码基因(lpxM)(Gene ID:945143,updated on 30-May-2019)。肉豆蔻酰载体蛋白(ACP)依赖性酰基转移酶的氨基酸序列的genebank号为NP_416369(提交日为11-OCT-2018)，323aa。从起始密码子至终止密码子的lpxM基因编码区如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第1939222-1940193位核苷酸所示。
氨基肽酶A的编码基因(pepA)Gene ID:948791,updated on 30-May-2019)。氨基肽酶A的氨基酸序列的genebank号为NP_418681(提交日为11-OCT-2018)，503aa。从起始密码子至终止密码子的pepA基因编码区如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第4484440-4485951位核苷酸所示。
氨基肽酶B的编码基因(pepB)(Gene ID:948766,updated on 30-May-2019)。氨基肽酶B的氨基酸序列的genebank号为NP_417018(提交日为11-OCT-2018)，427aa。从起始密码子至终止密码子的pepB基因编码区如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第2655075-2656358位核苷酸所示。
氨基肽酶D的编码基因(pepD)(Gene ID:945013,updated on 30-May-2019)。氨基肽酶D的氨基酸序列的genebank号为NP_414772(提交日为11-OCT-2018)，485aa。从起始密码子至终止密码子的pepD基因编码区如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第254259-255716位核苷酸所示。
氨基肽酶N的编码基因(pepN)(Gene ID:947253,updated on 30-May-2019)。氨基肽酶N的氨基酸序列的genebank号为NP_414772(提交日为11-OCT-2018)，870aa。从起始密码子至终止密码子的pepN基因编码区如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第990622-993234位核苷酸所示。
二肽转运蛋白体DppABCDF的编码基因簇包括5个基因。dppA基因(Gene ID:948062,updated on 30-May-2019)。dppB基因(Gene ID:948063,updated on 30-May-2019)。dppC基因(Gene ID:948064,updated on 30-May-2019)。dppD基因(Gene ID:948065,updated on 30-May-2019)。dppF基因(Gene ID:948056,updated on 30-May-2019)。DppA蛋白的氨基酸序列的genebank号为NP_418001(提交日为11-OCT-2018)，535aa。DppB蛋白的氨基酸序列的genebank号为NP_418000(提交日为11-OCT-2018)，339aa。DppC蛋白的氨基酸序列的genebank号为NP_417999(提交日为11-OCT-2018)，300aa。DppD蛋白的氨基酸序列的genebank号为NP_417998(提交日为11-OCT-2018)，327aa。DppF蛋白的氨基酸序列的genebank号为NP_417997(提交日为11-OCT-2018)，334aa。从起始密码子至终止密码子的dppA基因编码区，如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第3706098-3707705位核苷酸所示。从起始密码子至终止密码子的dppB基因编码区，如GENBANKACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第3704771-3705790位核苷酸所示。从起始密码子至终止密码子的dppC基因编码区，如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第3703859-3704761位核苷酸所示。从起始密码子至终止密码子的dppD基因编码区，如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第3702865-3703848位核苷酸所示。从起始密码子至终止密码子的dppF基因编码区，如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3(11-OCT-2018)中第3701864-3702868位核苷酸所示。
实施例1中用到的引物序列见表1，均为5’→3’方向。
表1
Figure BDA0002287011670000111
Figure BDA0002287011670000121
实施例2、各组重组质粒的构建
一、第一组质粒的构建
第一组质粒为过表达L-氨基酸-α-连接酶的重组质粒。
将pYB1s载体的XhoI和EcoR I酶切位点间的小片段替换为序列表的序列2所示的L-氨基酸-α-连接酶基因，得到重组质粒pYB1s-BabacD。已进行测序验证。序列2所示的L-氨基酸-α-连接酶基因编码的L-氨基酸-α-连接酶的氨基酸序列的genebank号为WP_012118706.1(提交日为01-MAY-2019)，472aa。
将pYB1s载体的XhoI和EcoR I酶切位点间的小片段替换为序列表的序列3所示的L-氨基酸-α-连接酶基因，得到重组质粒pYB1s-BvbacD。已进行测序验证。序列表的序列3所示的L-氨基酸-α-连接酶基因编码的L-氨基酸-α-连接酶的氨基酸序列的genebank号为WP_063636522.1(提交日为09-JUL-2017)，472aa。
将pYB1s载体的XhoI和EcoR I酶切位点间的小片段替换为序列表的序列4所示的L-氨基酸-α-连接酶基因，得到重组质粒pYB1s-VcbacD。已进行测序验证。序列表的序列4所示的L-氨基酸-α-连接酶基因编码的L-氨基酸-α-连接酶的氨基酸序列的genebank号为WP_047476938.1(提交日为11-JAN-2018)，389aa。
二、第二组质粒的构建
第二组质粒为共表达谷氨酰胺合成酶和L-氨基酸-α-连接酶的重组质粒。序列表的序列1所示的谷氨酰胺合成酶基因编码的谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列的genebank号为WP_003859638.1(提交日为19-JUN-2019)，477aa。
用限制性内切酶Nco I和EcoR I双酶切pYB1s载体，回收约3400bp的载体大片段。
以序列表的序列1所示的DNA分子为模板，采用P7和P8组成的引物对进行PCR扩增，获得的扩增产物，称为片段s1。以序列表的序列2所示的DNA分子为模板，采用P11和P12组成的引物对进行PCR扩增，获得的扩增产物，称为片段s3。将片段s1、片段s3和载体大片段依次连接，得到环形质粒，即为重组质粒yga(pYB1s-CgglnA-BabacD)。重组质粒yga(pYB1s-CgglnA-BabacD)中，序列表的序列2所示的基因前面的RBS序列为“AGGAGATATA”。
以序列表的序列2所示的DNA分子为模板，采用P13和P14组成的引物对进行PCR扩增，获得的扩增产物，称为片段s4。以序列表的序列1所示的DNA分子为模板，采用P9和P10组成的引物对进行PCR扩增，获得的扩增产物，称为片段s2。将片段s4、片段s2和载体大片段依次连接，得到环形质粒，即为重组质粒yag(pYB1s-BabacD-CgglnA)。
P7：5’-TGGGCTAACAGGAGGAATTAACCATGGCGTTCGAGACCCCGGAG-3’；
P8：5’-TACGCTCCATTATATCTCCTCTCGAGTTAGCAATCAAAATACAGTTCGAAC-3’；
P11：5’-CTCGAGAGGAGATATAATGGAGCGTAAGACCGTGCTG-3’；
P12：5’-AGCTGCAGACCGAGCTCACCGAATTCTTAAACCGGCAGCGCGTATTTC-3’。
P13：5’-TTGGGCTAACAGGAGGAATTAACCATGGAGCGTAAGACCGTGCTG-3’；
P14：5’-CGAACGCCATTATATCTCCTCTCGAGTTAAACCGGCAGCGCGTATTTCG-3’；
P9：5’-CTCGAGAGGAGATATAATGGCGTTCGAGACCCCGGAG-3’；
P10：5’-AGCTGCAGACCGAGCTCACCGAATTCTTAGCAATCAAAATACAGTTCG-3’。
重组质粒yga(pYB1s-CgglnA-BabacD)和重组质粒yag(pYB1s-BabacD-CgglnA)中，两个目的基因共用一个启动子，该启动子位于第一个目的基因上游，为ara启动子(如序列表的序列5第994-1266位所示)。
三、第三组质粒的构建
第三组质粒为共表达谷氨酰胺合成酶和L-氨基酸-α-连接酶的重组质粒，且通过RBS优化增强了L-氨基酸-α-连接酶的表达。
用限制性内切酶Nco I和EcoR I双酶切pYB1s载体，回收约3400bp的载体大片段。
以序列表的序列1所示的DNA分子为模板，采用P15和P16组成的引物对进行PCR扩增，获得的扩增产物，称为片段CgglnA58906。以序列表的序列2所示的DNA分子为模板，采用P17和P18组成的引物对进行PCR扩增，获得的扩增产物，称为片段BabacD58906。将片段CgglnA58906、片段BabacD58906和载体大片段依次连接，得到环形质粒，即为重组质粒yga58906(pYB1s-CgglnA-BabacDRBS58906)。重组质粒yga58906(pYB1s-CgglnA-BabacDRBS58906)中，序列表的序列2所示的基因前面的RBS序列为“aaatttaattaacaagtatataaggaggatatttt”。
以序列表的序列1所示的DNA分子为模板，采用P19和P20组成的引物对进行PCR扩增，获得的扩增产物，称为片段CgglnA239261。以序列表的序列2所示的DNA分子为模板，采用P21和P22组成的引物对进行PCR扩增，获得的扩增产物，称为片段BabacD239621。将片段CgglnA239261、片段BabacD239621和载体大片段依次连接，得到环形质粒，即为重组质粒yga239621(pYB1s-CgglnA-BabacDRBS239621)。重组质粒yga239621(pYB1s-CgglnA-BabacDRBS239621)中，序列表的序列2所示的基因前面的RBS序列为“aaaattaacaaaaccaagacattattataattaaggaggatattt”。
P15：5’-TGGGCTAACAGGAGGAATTAACCATGGCGTTCGAGACCCCGGAG-3’；
P16：5’-CTCCTTATATACTTGTTAATTAAATTTCTCGAGTTAGCAATCAAAATACAGTTC-3’；
P17：5’-ATTTAATTAACAAGTATATAAGGAGGATATTTTATGGAGCGTAAGACCGTGCTG-3’；
P18：5’-AGCTGCAGACCGAGCTCACCGAATTCTTAAACCGGCAGCGCGTATTTC-3’。
P19：5’-GCTAACAGGAGGAATTAACCATGGCGTTCGAGACCCCGGAG-3’；
P20：5’-CTTAATTATAATAATGTCTTGGTTTTGTTAATTTTCTCGAGTTAGCAATCAAAATACAGTTC-3’；
P21：5’-ACCAAGACATTATTATAATTAAGGAGGATATTTATGGAGCGTAAGACCGTGCTG-3’；
P22：5’-AGCTGCAGACCGAGCTCACCGAATTCTTAAACCGGCAGCGCGTATTTC-3’。
四、第四组质粒的构建
用限制性内切酶Nco I和EcoR I双酶切pLB1s载体，回收约4200bp的载体大片段。
将步骤三制备的片段CgglnA239261、步骤三制备的片段BabacD239621和载体大片段依次连接，得到环形质粒，即为重组质粒lga239621(pLB1s-CgglnA-BabacDRBS239621)。重组质粒lga239621(pLB1s-CgglnA-BabacDRBS239621)中，两个目的基因共用一个启动子，该启动子位于第一个目的基因上游，为ara启动子(如序列表的序列6第994-1266位所示)。
实施例3、生产丙谷二肽的基因工程菌的构建
一、第一组工程菌的构建
将重组质粒pYB1s-BabacD导入重组菌AQ10，得到的重组菌命名为重组菌pYB1s-BabacD/AQ10。将重组质粒pYB1s-BvbacD导入重组菌AQ10，得到的重组菌命名为重组菌pYB1s-BvbacD/AQ10。将重组质粒pYB1s-VcbacD导入重组菌AQ10，得到的重组菌命名为重组菌pYB1s-VcbacD/AQ10。上述三个重组菌，均可以L-谷氨酰胺和L-丙氨酸为底物全细胞催化合成丙谷二肽。
二、第二组工程菌的构建
将重组质粒yga(pYB1s-CgglnA-BabacD)导入重组菌AQ10，得到的重组菌命名为重组菌YGA(pYB1s-CgglnA-BabacD/AQ10)。将重组质粒yag(pYB1s-BabacD-CgglnA)导入重组菌AQ10，得到的重组菌命名为重组菌YAG(pYB1s-BabacD-CgglnA/AQ10)。
将重组质粒yga(pYB1s-CgglnA-BabacD)导入大肠杆菌BW25113，得到的重组菌命名为重组菌yga/BW25113。将重组质粒yga(pYB1s-CgglnA-BabacD)导入重组菌AQ04，得到的重组菌命名为重组菌yga/AQ04。将重组质粒yga(pYB1s-CgglnA-BabacD)导入重组菌AQ06，得到的重组菌命名为重组菌yga/AQ06。将重组质粒yga(pYB1s-CgglnA-BabacD)导入重组菌AQ09，得到的重组菌命名为重组菌yga/AQ09。
上述六个重组菌，均可以L-谷氨酸和L-丙氨酸为底物全细胞催化合成丙谷二肽。
三、第三组工程菌的构建
将重组质粒yga58906(pYB1s-CgglnA-BabacDRBS58906)导入重组菌AQ10，得到的重组菌命名为重组菌YGA58906。将重组质粒yga239621(pYB1s-CgglnA-BabacDRBS239621)导入重组菌AQ10，得到的重组菌命名为重组菌YGA239621。上述两个重组菌为提高BaBacD表达量的重组菌。
四、第四组工程菌的构建
将重组质粒lga239621(pLB1s-CgglnA-BabacDRBS239621)导入重组菌AQ10，得到的重组菌命名为重组菌LGA239621。在细胞中，pLB1s载体的拷贝数低于pYB1s载体的拷贝数。
各工程菌的信息见表2。
表2
基因工程菌名称 被导入的质粒 宿主菌
pYB1s-BabacD/AQ10 pYB1s-BabacD 重组菌AQ10
pYB1s-BvbacD/AQ10 pYB1s-BvbacD 重组菌AQ10
pYB1s-VcbacD/AQ10 pYB1s-VcbacD 重组菌AQ10
YGA(pYB1s-CgglnA-BabacD/AQ10) yga(pYB1s-CgglnA-BabacD) 重组菌AQ10
YAG(pYB1s-BabacD-CgglnA/AQ10) yag(pYB1s-BabacD-CgglnA) 重组菌AQ10
yga/BW25113 yga(pYB1s-CgglnA-BabacD) 大肠杆菌BW25113
yga/AQ04 yga(pYB1s-CgglnA-BabacD) 重组菌AQ04
yga/AQ06 yga(pYB1s-CgglnA-BabacD) 重组菌AQ06
yga/AQ09 yga(pYB1s-CgglnA-BabacD) 重组菌AQ09
YGA58906 yga58906(pYB1s-CgglnA-BabacD<sub>RBS58906</sub>) 重组菌AQ10
YGA239621 yga239621(pYB1s-CgglnA-BabacD<sub>RBS239621</sub>) 重组菌AQ10
LGA239621 lga239621(pLB1s-CgglnA-BabacD<sub>RBS239621</sub>) 重组菌AQ10
实施例4、菌株培养及全细胞催化
一、以L-谷氨酰胺和L-丙氨酸为底物全细胞催化生产丙谷二肽
供试菌分别为：重组菌pYB1s-BabacD/AQ10、重组菌pYB1s-BvbacD/AQ10或重组菌pYB1s-VcbacD/AQ10。
1、自诱导培养
自诱导培养条件如下：将供试菌划线至含50μg/mL链霉素的LB培养基平板，37℃培养12h；然后，挑取单克隆，接种至含50μg/mL链霉素的液体LB培养基，37℃、220rpm振荡培养10小时；然后，取菌液，以1％的接种量接种至含50μg/mL链霉素的自诱导培养基ZYM-5052，30℃、220rpm振荡培养16h。
自诱导培养基ZYM-5052的组成：100mL A溶液、2mL B溶液、2mL C溶液、200μL D溶液、100μL E溶液。A溶液即ZY溶液：含1g/100ml胰蛋白胨和0.5g/100ml酵母粉的水溶液。B溶液即50×M溶液：含1.25M Na2HPO4，1.25M KH2PO4，2.5M NH4Cl和0.25M Na2SO4的水溶液。C溶液即50×5052溶液：含25g/100ml甘油、2.5g/100ml葡萄糖和10g/100mlL-阿拉伯糖的水溶液。D溶液即500×MgSO4溶液：1M MgSO4水溶液。E溶液即1000×微量元素溶液：溶剂为水；含50mM FeCl3，20mM CaCl2，10mM MnCl2，10mM ZnSO4，CoCl2、NiCl2、Na2MoO4、Na2SeO3和H3BO3各2mM。
2、以L-谷氨酰胺和L-丙氨酸为底物全细胞催化生产丙谷二肽
完成步骤1后，4℃、4000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水(0.85％氯化钠水溶液)洗涤一次；然后，将菌体重悬于转化底物液1，使OD600nm值＝30，然后30℃、220rpm振荡培养6h，然后12000rpm离心2min，收集上清，即为转化液1。
转化底物液1：含50mM L-Gln、50mM L-Ala、10mM MgCl2、50mM glucose，余量为50mM MOPS buffer(pH7.0)；用0.22μm滤膜(MilLipore公司)过滤除菌。
二、以L-谷氨酸和L-丙氨酸为底物全细胞催化生产丙谷二肽
供试菌分别为：重组菌YGA(pYB1s-CgglnA-BabacD/AQ10)、重组菌YAG(pYB1s-BabacD-CgglnA/AQ10)、重组菌yga/BW25113、重组菌yga/AQ04、重组菌yga/AQ06、重组菌yga/AQ09、重组菌YGA58906、重组菌YGA239621或重组菌LGA239621。
1、自诱导培养
同步骤一的1。
2、以L-谷氨酸和L-丙氨酸为底物全细胞催化生产丙谷二肽
完成步骤1后，4℃、4000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水(0.85％氯化钠水溶液)洗涤一次；然后，将菌体重悬于转化底物液2，使OD600nm值＝30，然后30℃、220rpm振荡培养6h(分别于0h时刻、3h后加入glucose，对于每升体系来说，每次的加入量为10mmol)，然后12000rpm离心2min，收集上清，即为转化液2-1。
完成步骤1后，4℃、4000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水(0.85％氯化钠水溶液)洗涤一次；然后，将菌体重悬于转化底物液2，使OD600nm值＝30，然后30℃、220rpm振荡培养18h(分别于0h时刻、3h后、6h后、9h后、12h后加入glucose，对于每升体系来说，每次的加入量为10mmol)，然后12000rpm离心2min，收集上清，即为转化液2-2。
转化底物液2：含100mM L-Glu、100mM L-Ala、10mM MgCl2、200mM NH4Cl，余量为50mM MOPS buffer(pH9.0)；用0.22μm滤膜(MilLipore公司)过滤除菌。
实际应用中，也可用L-谷氨酸钠代替L-谷氨酸。
三、氨基酸及二肽的检测方法
将转化液1用蒸馏水稀释至10倍体积，然后用0.22μm滤膜过滤，然后采用HPLC检测丙谷二肽产量。将转化液2(转化液2-1或转化液2-2)用蒸馏水稀释释至20倍体积，然后用0.22μm滤膜过滤，然后采用HPLC检测丙谷二肽产量。
HPLC采用Agilent 1200高效液相色谱仪(配四元泵、DAD检测器和工作站)。衍生方法：于1.5mL EP管中加入350μl 50mM硼酸钠buffer(10.2)、100μl sample、50μl FMOC(5mg/ml，乙腈溶解)涡旋混匀，40℃衍生10min。色谱条件：Agilent Eclipse XDB-C18柱；柱温：40摄氏度；进样量10μL，DAD检测器检测。流动相由A液和B液组成，A液为乙腈，B液为50mM NaAc水溶液。洗脱过程(流动相流速为0.6mL/min)：0-20min，A液占流动相的体积分数由20％线性升高至60％；20-23min，A液占流动相的体积分数由60％线性降低至20％。以丙谷二肽标准品(Sigma公司)保留时间定性和采用标准曲线法(外标法)进行定量分析。
氨基酸标准品及丙谷二肽标准品的混合物的HPLC图谱见图2。L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、丙谷二肽、L-丙氨酸的保留时间依次为13.5min、14.8min、15.9min、17.4min。
四、检测结果和分析
1、同一批次试验中，三种重组菌得到的转化液1中的丙谷二肽浓度见图3。Ba代表重组菌pYB1s-BabacD/AQ10，Bv代表重组菌pYB1s-BvbacD/AQ10，Vc代表重组菌pYB1s-VcbacD/AQ10。全细胞催化反应6小时，重组菌pYB1s-BabacD/AQ10、重组菌pYB1s-BvbacD/AQ10、重组菌pYB1s-VcbacD/AQ10的丙谷二肽产量分别为19.2mM、2.9mM、1.8mM。
2、同一批次试验中，两种重组菌得到的转化液2中的丙谷二肽浓度和谷氨酰胺浓度见图4。图4中，YGA代表重组菌YGA(pYB1s-CgglnA-BabacD/AQ10)，YAG代表重组菌YAG(pYB1s-BabacD-CgglnA/AQ10)。全细胞催化反应18h,YGA(pYB1s-CgglnA-BabacD/AQ10)的丙谷二肽产量为9.6mM，YAG(pYB1s-BabacD-CgglnA/AQ10)的丙谷二肽产量为20.6mM。
3、同一批次试验中，五种重组菌得到的转化液2中的丙谷二肽浓度和谷氨酰胺浓度见图5。图5中，yga/BW代表重组菌yga/BW25113,yga/AQ10代表重组菌YGA(pYB1s-CgglnA-BabacD/AQ10)。
比较全细胞催化反应6h的丙谷二肽产量和谷氨酰胺积累量。与重组菌yga/BW25113相比，重组菌yga/AQ04的丙谷二肽产量和谷氨酰胺积累量都有近两倍的提高(说明通过glsAB的敲除，谷氨酰胺的降解减少，中间产物谷氨酰胺的积累也进一步促进了丙谷二肽的合成)，重组菌yga/AQ06的丙谷二肽的产量和谷氨酰胺的积累量进一步提高(说明在AQ04基础上进一步叠加敲除glnEB对提高丙谷二肽合成有效)。但由于胞内肽酶的存在，导致丙谷二肽在重组菌yga/BW25113、重组菌yga/AQ04和重组菌yga/AQ06中均无法实现大量积累，到反应后期丙谷二肽被降解。
全细胞催化反应6h后，与重组菌yga/BW25113相比，重组菌yga/AQ09的丙谷二肽产量实现了近6倍的提高，且在后期实现了积累。全细胞催化反应18h后，重组菌yga/AQ09的丙谷二肽产量达到3.3mM，说明通过二肽酶pepABDN和肽转运蛋白dpp的敲除，有效降低了丙谷二肽的降解。
全细胞催化反应18h后，重组菌YGA(pYB1s-CgglnA-BabacD/AQ10)的丙谷二肽的积累量达到了9.7mM，相较重组菌yga/AQ06和重组菌yga/AQ09均有大幅提高，同时谷氨酰胺的积累量也达到了17.5mM。说明在重组菌YGA(pYB1s-CgglnA-BabacD/AQ10)中丙谷二肽和谷氨酰胺的降解均得到了有效控制。
4、同一批次试验中，三种重组菌得到的转化液2-1中的丙谷二肽浓度和谷氨酰胺浓度见图6。图6中，YGA代表重组菌YGA(pYB1s-CgglnA-BabacD/AQ10)。全细胞催化反应6h,YGA58906的丙谷二肽产量达14.3mM，YGA239621的丙谷二肽产量达22.3mM。全细胞催化反应18h,重组菌YGA(pYB1s-CgglnA-BabacD/AQ10)的丙谷二肽产量达9.6mM，重组菌YGA58906的丙谷二肽产量达24.4mM，重组菌YGA239621的丙谷二肽产量达37.5mM。
5、同一批次试验中，两种重组菌自诱导培养后，测量OD600nm值，结果见图7。重组菌YGA239621生长缓慢。而重组菌LGA23962由于质粒拷贝数降低，缓解了细胞生长压力，菌浓度显著高于重组菌YGA239621。同一批次试验中，两种重组菌得到的转化液2中的丙谷二肽浓度见图8。全细胞催化反应18h后，重组菌LGA239621的丙谷二肽产量为23.5mM，重组菌YGA239621的丙谷二肽产量为37.5mM。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 产丙谷二肽的工程菌及其构建方法与应用
<130> GNCYX192466
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1434
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
atggcgttcg agaccccgga ggaaatcgtg aagtttatta aagacgagaa cgttgagttc 60
gtggacgttc gttttaccga tctgccgggc accgaacagc acttcagcat cccggcggcg 120
agctttgacg cggataccgt tgaggaaggc ctggcgttcg acggtagcag catccgtggc 180
tttaccacca ttgacgagag cgatatgaac ctgctgccgg acctgggcac cgcgaccctg 240
gatccgttcc gtaaggcgaa aaccctgaac gtgaagttct ttgttcacga cccgttcacc 300
cgtgaggcgt ttagccgtga tccgcgtaac gtggcgcgta aagcggaaca gtacctggcg 360
agcaccggta ttgcggacac ctgcaacttt ggtgcggagg cggagttcta cctgtttgat 420
agcgttcgtt atagcaccga gatgaacagc ggtttttatg aagtggacac cgaggaaggt 480
tggtggaacc gtggcaagga gaccaacctg gatggcaccc cgaacctggg cgcgaagaac 540
cgtgtgaaag gtggctactt cccggttgcg ccgtatgacc aaaccgtgga tgttcgtgac 600
gatatggttc gtaacctggc ggcgagcggt tttgcgctgg agcgttttca ccacgaagtg 660
ggtggcggtc agcaagaaat caactaccgt ttcaacacca tgctgcacgc ggcggacgat 720
atccagacct tcaagtacat catcaagaac accgcgcgtc tgcacggtaa agcggcgacc 780
ttcatgccga aaccgctggc gggtgacaac ggtagcggta tgcacgcgca ccaaagcctg 840
tggaaggacg gtaaaccgct gtttcacgat gaaagcggct acgcgggtct gagcgatatc 900
gcgcgttact atatcggcgg tattctgcac cacgcgggtg cggttctggc gttcaccaac 960
gcgaccctga acagctatca tcgtctggtg ccgggttttg aggcgccgat caacctggtt 1020
tatagccaac gtaaccgtag cgcggcggtg cgtatcccga ttaccggtag caacccgaag 1080
gcgaaacgta ttgagttccg tgcgccggac ccgagcggta acccgtacct gggctttgcg 1140
gcgatgatga tggcgggcct ggatggtatc aagaaccgta ttgaaccgca tgcgccggtg 1200
gacaaggacc tgtatgaact gccgccggag gaagcggcga gcatcccgca ggcgccgacc 1260
agcctggagg cgagcctgaa ggcgctgcaa gaggacaccg atttcctgac cgaaagcgac 1320
gtttttaccg aggatctgat cgaagcgtac atccagtaca agtacgacaa cgaaattagc 1380
ccggtgcgtc tgcgtccgac cccgcaagag ttcgaactgt attttgattg ctaa 1434
<210> 2
<211> 1419
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
atggagcgta agaccgtgct ggttattgcg gatctgggtg gctgcccgcc gcacatgttc 60
tacaagagcg cggcggagaa atataacctg gtgagcttca tcccgcgtcc gtttgcgatt 120
accgcgagcc acgcggcgct gatcgaaaag tacagcgtgg cggttatcaa ggataaggac 180
tacttcaaaa gcctggcgga ttttgaacac ccggacagca tctactgggc gcacgaggat 240
cacgacaagc cggaggaaga ggtggttgaa gagattgtga aagttgcggg catgttcgcg 300
gtggacgcga tcaccaccaa caacgaactg tttattgcgc cgatggcgaa agcgtgcgag 360
cgtctgggtc tgcgtggtgc gggcgttcaa gcggcggaaa acgcgcgtga taagaacaaa 420
atgcgtgcgg cgttcaaccg tgcgggtgtg aagagcatca aaaaccgtcg tgttaccacc 480
ctggaagact ttcgtgcggc gctgcaagag attggcaccc cgctgattct gaagccgacc 540
tacctggcga gcagcatcgg cgtgaccctg attaaagaac gtgagaccgc ggaagcggag 600
ttcaaccgtg ttaacgaata tctgaagagc atcaacgtgc cgaaagcggt taccttcgag 660
gcgccgttta ttgcggaaga gtttctgcaa ggcgaatacg acgattggta tgagaccagc 720
ggctacagcg attatatcag cattgaaggt atcatggcgg acggcgagta tttcccggtg 780
gcgatccacg ataagacccc gcagattggc tttaccgaaa ccagccacat caccccgagc 840
attctggacg atgacgcgaa gcgtaaaatt gttgaggcgg cgaagaaagc gaacgaaggt 900
ctgggcctgg agaactgcgc gacccacacc gaaatcaagc tgatgaaaaa ccgtgaagcg 960
ggtctgattg aaagcgcggc gcgttttgcg ggttggaaca tgatcccgaa cattaagaaa 1020
gtgtttggtg ttgatatggc gcaactgctg ctggacgtgc tgtgcttcgg taaagaggcg 1080
gacctgccga aaggcctgct ggaacaggag ccgtgctacg ttgcggattg ccacctgtat 1140
ccgcaacact tcaaggaaaa cggtcagctg ccggagaccg cggtggactt tgttatcgaa 1200
agcatcgata ttccggacgg tgtgctgaaa ggcgataccg aaattgttag cttcagcgcg 1260
gcggaggcgg gcaccagcgt ggacctgcgt ctgttcgaag cgtttaacag catcgcggcg 1320
tttgagctga agggtagcaa cagcggcgac gtggcggaga gcatcaaaca aattcagcaa 1380
caggcgaagc tgaccgcgaa atacgcgctg ccggtttaa 1419
<210> 3
<211> 1419
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
atggagagaa aaacagtatt ggttatcgct gaccttgggg gatgcccgcc gcatatgttt 60
tacaaaagcg cagccgaaaa atacaacctc gtcagcttta ttccgagacc ttttgcaatt 120
acagcctctc atgcagcttt gattgaaaaa tactcggtcg cggtcattaa agataaagac 180
tattttaaga gtctggctga ttttgagcat cccgattcga tttactgggc tcatgaagat 240
catgacaaac ctgaggaaga agtagtcgaa gaaatcgtca aggtggccgg catgttcgcg 300
gttgacgcca ttacgaccaa caatgaactg tttatcgctc cgatggcaaa agcgtgtgaa 360
cgtctcggcc tgcggggagc gggcgtacag gccgctgaaa atgccagaga taaaaacaaa 420
atgagagccg ccttcaaccg ggccggcgtc aaatccatca aaaacaaacg ggtgacgacg 480
ctggaagatt tccgcgccgc gcttcaggaa atcggaacgc cgctcattct gaagcctaca 540
tatctggcga gctccatcgg cgtgacgctt atcaaagaga tggaaacggc cgaagccgaa 600
tttaacagag tcaatgaata cctgaagtcg atcaacgtac cgaaagcggt cacgtttgaa 660
gcgccgttta tcgcggaaga atttttgcag ggcgagtatg acgactggta cgaaacaagc 720
ggttattccg actatatcag catagaaggc atcatggccg acggggaata cttccccgtc 780
gcgattcatg ataaaacacc gcaaatcgga ttcacggaga catcgcatat tacgccgtcc 840
atcttggatg atgacgcgaa gcggaaaatc gtcgaagcag ccaaaaaggc gaatgaagga 900
ctcggcctcg aaaactgcgc aacacataca gagattaaat taatgaaaaa ccgggaagcc 960
ggactgattg aatcagcggc acgatttgcg ggctggaaca tgattccgaa tattaaaaag 1020
gtcttcggcg tcgatatggc gcagctgtta ttggatgttc tctgtttcgg aaaagaagcc 1080
gatctgccga aagggttatt ggagcaggag ccatgctatg tcgccgactg ccacttgtat 1140
cctcagcatt tcaaagagaa cggccagctg cctgagacgg ccttcgattt cgtcattgaa 1200
agcattgaca ttcccgccgg cgtcttaaag ggagacaccg aaatcgtttc tttctcagcg 1260
gccgaggcgg gtacatccgt ggatctgcgg ctgttcgaag cgttcaacag cattgcggcg 1320
tttgagctga aaggaagcaa ttcgggtgac gtggccgaat caatcaaaca aattcagcag 1380
caggcgaagc tgactgcaaa gtatgcgtta ccggtatga 1419
<210> 4
<211> 1170
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
atgaaagtta tcagtattaa cacggcgaaa cgacacaacg cattatcggt agcattttta 60
aaagcaagaa aaattgtagt ttgtgttaaa gatgctgagt ttgccgagtt aagtgatgag 120
gtactggatc acgcctataa ggtgattacc tttagttccg cagaaggatt gatgagtacg 180
ctggtgactc tcgagttttt gaatgctgat gatcgtgttt tctcggcatc tgaagatttt 240
atgtacttag ctgcgcaaat aagagagcgc tttggtctta agggcatgac tgtgattgaa 300
acagcctact ttagggacaa gtgtttaatg aaagaaaaag ccttggccgc tggcgtaaat 360
gtgcctcgat atggcgcgta tcaatcaaac cttacgttct cagagattac ccagcacgtt 420
gggctgcctt ttgttctaaa accgaaggat tcggcagggg catttggtgt gcatgtgatt 480
agaagtcagc acgattatga tgatgtcatc aatacatcca atattggctt gggctatgag 540
tacgagacgt ttgttgaagg taagctctac catgtcgacc tattgattaa aaatggcgaa 600
gtttgcttcc aagcggcttg tgaatactcg ttcccaaacc ttgattttca attcggtaag 660
ccttgtcttt ctttggtttt ggaagaaagc catgaattgt atgcgcaatt gacgaatttt 720
gctgcgtttt ctgtgaaatc tctaggctta aaaaatggcc cttcacacgt cgaaatcttt 780
gtgaaagaga gcggtgagtt ggttttcctt gaagctgctt gtcgtacacc aggggcgatt 840
atggttccta tttatcaggc gcaatttgat atgaatatga ttgagatggc gctggatatt 900
gagtgtgggt tggatattgc agagatagtg aaaaatgact cttactgcat gggaggaatt 960
tttcctgcga aacaaggtcg agtaaataag atcaataagg tcaatttaca gtctgagttt 1020
gagcttaacc tcggttgtca ggtgggagac tactatgatg gtgtggatag cgtaaaaaac 1080
ttgtcgggat cgattgtagt aaaaggcaag agctacgcag aggtgctcgc tgattttgaa 1140
gtattgaaag ctctttctct tgttgaatag 1170
<210> 5
<211> 3456
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
aatgtgcctg tcaaatggac gaagcaggga ttctgcaaac cctatgctac tccgtcaagc 60
cgtcaattgt ctgattcgtt accaattatg acaacttgac ggctacatca ttcacttttt 120
cttcacaacc ggcacggaac tcgctcgggc tggccccggt gcatttttta aatacccgcg 180
agaaatagag ttgatcgtca aaaccaacat tgcgaccgac ggtggcgata ggcatccggg 240
tggtgctcaa aagcagcttc gcctggctga tacgttggtc ctcgcgccag cttaagacgc 300
taatccctaa ctgctggcgg aaaagatgtg acagacgcga cggcgacaag caaacatgct 360
gtgcgacgct ggcgatatca aaattgctgt ctgccaggtg atcgctgatg tactgacaag 420
cctcgcgtac ccgattatcc atcggtggat ggagcgactc gttaatcgct tccatgcgcc 480
gcagtaacaa ttgctcaagc agatttatcg ccagcagctc cgaatagcgc ccttcccctt 540
gcccggcgtt aatgatttgc ccaaacaggt cgctgaaatg cggctggtgc gcttcatccg 600
ggcgaaagaa ccccgtattg gcaaatattg acggccagtt aagccattca tgccagtagg 660
cgcgcggacg aaagtaaacc cactggtgat accattcgcg agcctccgga tgacgaccgt 720
agtgatgaat ctctcctggc gggaacagca aaatatcacc cggtcggcaa acaaattctc 780
gtccctgatt tttcaccacc ccctgaccgc gaatggtgag attgagaata taacctttca 840
ttcccagcgg tcggtcgata aaaaaatcga gataaccgtt ggcctcaatc ggcgttaaac 900
ccgccaccag atgggcatta aacgagtatc ccggcagcag gggatcattt tgcgcttcag 960
ccatactttt catactcccg ccattcagag aagaaaccaa ttgtccatat tgcatcagac 1020
attgccgtca ctgcgtcttt tactggctct tctcgctaac caaaccggta accccgctta 1080
ttaaaagcat tctgtaacaa agcgggacca aagccatgac aaaaacgcgt aacaaaagtg 1140
tctataatca cggcagaaaa gtccacattg attatttgca cggcgtcaca ctttgctatg 1200
ccatagcatt tttatccata agattagcgg atcctacctg acgcttttta tcgcaactct 1260
ctactgtttc tccatacccg ttttttgggc taacaggagg aattaaccat gggtacctct 1320
catcatcatc atcatcacag cagcggcctg gtgccgcgcg gcagcctcga gggtagatct 1380
ggtactagtg gtgaattcgg tgagctcggt ctgcagctgg tgccgcgcgg cagccaccac 1440
caccaccacc actaatacag attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt 1500
tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac 1560
gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat 1620
caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gtcgacgtgc gtcagcagaa 1680
tatgtgatac aggatatatt ccgcttcctc gctcactgac tcgctacgct cggtcgttcg 1740
actgcggcga gcggaaatgg cttacgaacg gggcggagat ttcctggaag atgccaggaa 1800
gatacttaac agggaagtga gagggccgcg gcaaagccgt ttttccatag gctccgcccc 1860
cctgacaagc atcacgaaat ctgacgctca aatcagtggt ggcgaaaccc gacaggacta 1920
taaagatacc aggcgtttcc ccctggcggc tccctcgtgc gctctcctgt tcctgccttt 1980
cggtttaccg gtgtcattcc gctgttatgg ccgcgtttgt ctcattccac gcctgacact 2040
cagttccggg taggcagttc gctccaagct ggactgtatg cacgaacccc ccgttcagtc 2100
cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggaaa gacatgcaaa 2160
agcaccactg gcagcagcca ctggtaattg atttagagga gttagtcttg aagtcatgcg 2220
ccggttaagg ctaaactgaa aggacaagtt ttggtgactg cgctcctcca agccagttac 2280
ctcggttcaa agagttggta gctcagagaa ccttcgaaaa actgccctgc aaggcggttt 2340
tttcgttttc agagcaagag attacgcgca gaccaaaacg atctcaagaa gatcatctta 2400
ttaatcagat aaaatatttc tagatttcag tgcaatttat ctcttcaaat gtagcacgcg 2460
gccgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga 2520
gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtatg agggaagcgg 2580
tgatcgccga agtatcgact caactatcag aggtagttgg cgtcatcgag cgccatctcg 2640
aaccgacgtt gctggccgta catttgtacg gctccgcagt ggatggcggc ctgaagccac 2700
acagtgatat tgatttgctg gttacggtga ccgtaaggct tgatgaaaca acgcggcgag 2760
ctttgatcaa cgaccttttg gaaacttcgg cttcccctgg agagagcgag attctccgcg 2820
ctgtagaagt caccattgtt gtgcacgacg acatcattcc gtggcgttat ccagctaagc 2880
gcgaactgca atttggagaa tggcagcgca atgacattct tgcaggtatc ttcgagccag 2940
ccacgatcga cattgatctg gctatcttgc tgacaaaagc aagagaacat agcgttgcct 3000
tggtaggtcc agcggcggag gaactctttg atccggttcc tgaacaggat ctatttgagg 3060
cgctaaatga aaccttaacg ctatggaact cgccgcccga ctgggctggc gatgagcgaa 3120
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agttggaaga atttgtccac tacgtgaaag gcgagatcac caaggtagtc ggcaaactgt 3360
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ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc gcatgc 3456
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<213> Artificial sequence
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cgtcaattgt ctgattcgtt accaattatg acaacttgac ggctacatca ttcacttttt 120
cttcacaacc ggcacggaac tcgctcgggc tggccccggt gcatttttta aatacccgcg 180
agaaatagag ttgatcgtca aaaccaacat tgcgaccgac ggtggcgata ggcatccggg 240
tggtgctcaa aagcagcttc gcctggctga tacgttggtc ctcgcgccag cttaagacgc 300
taatccctaa ctgctggcgg aaaagatgtg acagacgcga cggcgacaag caaacatgct 360
gtgcgacgct ggcgatatca aaattgctgt ctgccaggtg atcgctgatg tactgacaag 420
cctcgcgtac ccgattatcc atcggtggat ggagcgactc gttaatcgct tccatgcgcc 480
gcagtaacaa ttgctcaagc agatttatcg ccagcagctc cgaatagcgc ccttcccctt 540
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ttcccagcgg tcggtcgata aaaaaatcga gataaccgtt ggcctcaatc ggcgttaaac 900
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tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 3300
aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgaggga agcggtgatc gccgaagtat 3360
cgactcaact atcagaggta gttggcgtca tcgagcgcca tctcgaaccg acgttgctgg 3420
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ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga gcgagattct ccgcgctgta gaagtcacca 3600
ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc gttatccagc taagcgcgaa ctgcaatttg 3660
gagaatggca gcgcaatgac attcttgcag gtatcttcga gccagccacg atcgacattg 3720
atctggctat cttgctgaca aaagcaagag aacatagcgt tgccttggta ggtccagcgg 3780
cggaggaact ctttgatccg gttcctgaac aggatctatt tgaggcgcta aatgaaacct 3840
taacgctatg gaactcgccg cccgactggg ctggcgatga gcgaaatgta gtgcttacgt 3900
tgtcccgcat ttggtacagc gcagtaaccg gcaaaatcgc gccgaaggat gtcgctgccg 3960
actgggcaat ggagcgcctg ccggcccagt atcagcccgt catacttgaa gctagacagg 4020
cttatcttgg acaagaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 4080
tccactacgt gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa actgtcagac caagtttact 4140
catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 4200
tcctttttga taatcgcatg c 4221

Claims (8)

1.一种产丙谷二肽的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：将L-氨基酸-α-连接酶的编码基因和谷氨酰胺合成酶的编码基因导入受体菌，得到产丙谷二肽的基因工程菌；
所述受体菌为对大肠杆菌进行下述m1-m10的改造得到的重组菌：
m1）敲除基因组中谷氨酰胺酶A的编码基因；
m2）敲除基因组中谷氨酰胺酶B的编码基因；
m3）敲除基因组中谷氨酰胺合成酶去腺苷酸酶/谷氨酰胺合成酶腺苷酸转移酶双功能酶的编码基因；
m4）敲除基因组中氮调节蛋白PII-1的编码基因；
m5）敲除基因组中肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶的编码基因；
m6) 敲除基因组中氨基肽酶A的编码基因；
m7) 敲除基因组中氨基肽酶B的编码基因；
m8) 敲除基因组中的氨基肽酶D的编码基因；
m9) 敲除基因组中的氨基肽酶N的编码基因；
m10) 敲除基因组中二肽转运蛋白体DppABCDF的编码基因簇；
谷氨酰胺酶A的编码基因如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3中第511641-512573位核苷酸所示；
谷氨酰胺酶B的编码基因区如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3中第1612325-1613251位核苷酸所示；
谷氨酰胺合成酶去腺苷酸酶/谷氨酰胺合成酶腺苷酸转移酶双功能酶的编码基因如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3中第3196801-3199641位核苷酸所示；
氮调节蛋白PII-1的编码基因如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3中第2687070-2687408位核苷酸所示；
肉豆蔻酰载体蛋白依赖性酰基转移酶的编码基因如GENBANK ACCESIION NO. NC_000913.3中第1939222-1940193位核苷酸所示；
氨基肽酶A的编码基因如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3中第4484440-4485951位核苷酸所示；
氨基肽酶B的编码基因如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3中第2655075-2656358位核苷酸所示；
氨基肽酶D的编码基因如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3中第254259-255716位核苷酸所示；
氨基肽酶N的编码基因如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3中第990622-993234位核苷酸所示；
二肽转运蛋白体DppABCDF的编码基因簇包括如下5个基因：dppA基因、dppB基因、dppC基因、dppD基因和dppF基因；从起始密码子至终止密码子的dppA基因编码区如GENBANKACCESIION NO. NC_000913.3中第3706098-3707705位核苷酸所示；从起始密码子至终止密码子的dppB基因编码区如GENBANK ACCESIION NO. NC_000913.3中第3704771-3705790位核苷酸所示；从起始密码子至终止密码子的dppC基因编码区如GENBANK ACCESIION NO.NC_000913.3中第3703859-3704761位核苷酸所示；从起始密码子至终止密码子的dppD基因编码区如GENBANK ACCESIION NO. NC_000913.3中第3702865-3703848位核苷酸所示；从起始密码子至终止密码子的dppF基因编码区如GENBANK ACCESIION NO. NC_000913.3中第3701864-3702868位核苷酸所示；
所述谷氨酰胺合成酶为由序列表的序列1所示的谷氨酰胺合成酶编码基因翻译得到的蛋白质；
所述L-氨基酸-α-连接酶为由序列表的序列2所示的L-氨基酸-α-连接酶编码基因翻译得到的蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述谷氨酰胺合成酶的编码基因为序列表的序列1所示的DNA分子。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述L-氨基酸-α-连接酶的编码基因为序列表的序列2所示的DNA分子。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，将L-氨基酸-α-连接酶的编码基因和谷氨酰胺合成酶的编码基因导入受体菌时，上调L-氨基酸-α-连接酶的编码基因上游的RBS翻译起始速率。
5.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，将L-氨基酸-α-连接酶的编码基因和谷氨酰胺合成酶的编码基因导入受体菌时，采用表达载体。
6.由权利要求1至5中任一所述的方法构建得到的产丙谷二肽的基因工程菌。
7.权利要求6所述的产丙谷二肽的基因工程菌在制备丙谷二肽中的应用。
8.一种制备丙谷二肽的方法，包括如下步骤：将权利要求6所述的产丙谷二肽的基因工程菌进行阿拉伯糖诱导培养，用诱导培养后的菌体催化L-丙氨酸和特定物质反应，生成丙谷二肽；所述特定物质为L-谷氨酸或L-谷氨酸盐或L-谷氨酰胺。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104603264A (zh) * 2012-07-11 2015-05-06 味之素株式会社 编码细菌L-氨基酸α-连接酶的DNA以及其在生产二肽中的应用
CN106754985A (zh) * 2016-12-30 2017-05-31 大连医诺生物有限公司 编码丙谷二肽生物合成酶的基因及其应用
CN110382705A (zh) * 2018-09-26 2019-10-25 邦泰生物工程(深圳)有限公司 丙谷二肽的制备方法、丙谷二肽制备用酶及应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE474847T1 (de) * 2004-06-25 2010-08-15 Kyowa Hakko Bio Co Ltd Verfahren zur herstellung von dipeptiden

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104603264A (zh) * 2012-07-11 2015-05-06 味之素株式会社 编码细菌L-氨基酸α-连接酶的DNA以及其在生产二肽中的应用
CN106754985A (zh) * 2016-12-30 2017-05-31 大连医诺生物有限公司 编码丙谷二肽生物合成酶的基因及其应用
CN110382705A (zh) * 2018-09-26 2019-10-25 邦泰生物工程(深圳)有限公司 丙谷二肽的制备方法、丙谷二肽制备用酶及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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二肽的生物合成及应用研究进展;范晓光等;《发酵科技通讯》;20161125(第04期);第201页第3部分 *

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