CN117887652A - 一种乳清酸生产菌株及其定向改造方法与应用 - Google Patents
一种乳清酸生产菌株及其定向改造方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种乳清酸生产菌株及其定向改造方法与应用，所述菌株利用CRIPSR/Cas9基因编辑技术通过敲除了purR、pepA、argR基因，解除了阻遏因子PurR、PepA、ArgR对氨基甲酰磷酸编码基因操纵子的抑制；通过过表达碳酸酐酶基因cynT和氰酸盐转运蛋白编码基因cynX，并异源引入氨甲酰磷酸合成酶基因pyrAA和pyrAB，协同加强乳清酸重要前体物氨基甲酰磷酸的合成与积累，有效促进了乳清酸的生物合成效率；所述菌株以葡萄糖为底物从头高效合成乳清酸，经过48h分批补料发酵，乳清酸产量可高达182.5 g/L，糖酸转化率达到58%，具有极高的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及代谢工程及基因工程技术生产领域，尤其是一种乳清酸生产菌株及其定向改造方法与应用。
背景技术
乳清酸存在于各类哺乳动物的乳汁中，又称VB13。其广泛应用于医药、保健品及化妆品等领域。现如今，随着人们对乳清酸生理功能研究的逐渐深入，其市场需求还在不断扩大。
当前工业化生产乳清酸的方式主要是化学法和微生物发酵法，但化学法制备乳清酸的工艺存在使用危险试剂，操作繁琐和原料成本高等不足，而微生物发酵则具有污染程度低、生产效率高、成本低的特点。再加上合成生物学的迅速发展，越来越多研究者已经通过构建微生物细胞工厂发酵生产许多天然产物和化学品来逐渐代替化学法。在ZL202210417923.1中已构建出一株产酸效率高、遗传稳定性好的乳清酸生产菌种E.coliOra6，但仍有进一步提高其产酸效率和生产强度的需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种乳清酸生产菌株。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述乳清酸生产菌株的定向改造方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述乳清酸生产菌株的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种乳清酸生产菌株，为菌株E.coliOra12，是利用定向改造方法在出发菌株E.coliOra6的基础上进行进一步改造获得的，具体为：在E.coliOra6基因组上敲除了purR基因、pepA基因和argR基因，过表达碳酸酐酶基因cynT和氰酸盐转运蛋白编码基因cynX，并异源引入枯草芽孢杆菌B.subtilis168的氨甲酰磷酸合成酶基因pyrAA和pyrAB。
优选的，上述乳清酸生产菌株，所述定向改造方法是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术完全在目的菌株染色体基因组上进行改造。
优选的，上述乳清酸生产菌株，所述出发菌株E.coliOra6为ZL 202210417923.1（一种生产乳清酸的基因工程菌及其构建方法与应用）实施例1中所述菌株E.coliOra6。
优选的，上述乳清酸生产菌株，所述purR基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；pepA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；argR基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
优选的，上述乳清酸生产菌株，在ylbE位点上整合碳酸酐酶基因cynT，并用启动子PBBa_J23108调控；所述碳酸酐酶基因cynT的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；所述启动子PBBa_J23108的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示。
优选的，上述乳清酸生产菌株，在ilvG位点上整合氰酸盐转运蛋白编码基因cynX，并用启动子PBBa_J23111调控；所述氰酸盐转运蛋白编码基因cynX的核苷酸序列如序列表SEQID NO.6所示；所述启动子PBBa_J23111的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示。
优选的，上述乳清酸生产菌株，在yeeP位点上串联整合野生型枯草芽孢杆菌B.subtilis168氨甲酰磷酸合成酶基因pyrAA和pyrAB，并用启动子Ptrc调控；串联的所述氨甲酰磷酸合成酶基因pyrAA和pyrAB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示，所述启动子Ptrc的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示。
上述乳清酸生产菌株的定向改造方法，具体步骤如下：
（1）在E.coliOra6基因组上先后敲除purR基因（NCBI-Gene ID: 945226）、pepA基因（NCBI-Gene ID: 948791）和argR基因（NCBI-Gene ID: 947861）；
（2）在ylbE位点上整合碳酸酐酶基因cynT（NCBI-Gene ID: 946548），并用启动子PBBa_J23108调控，过表达碳酸酐酶基因cynT；
（3）在ilvG位点上整合氰酸盐转运蛋白编码基因cynX（NCBI-Gene ID: 946770），并用启动子PBBa_J23111调控，过表达氰酸盐转运蛋白编码基因cynX；
（4）在yeeP位点上串联整合野生型枯草芽孢杆菌B.subtilis168氨甲酰磷酸合成酶基因pyrAA（NCBI-Gene ID: 937368）和pyrAB（NCBI-Gene ID: 936608），并用启动子Ptrc调控，异源引入枯草芽孢杆菌B.subtilis168的氨甲酰磷酸合成酶基因pyrAA和pyrAB。
上述乳清酸生产菌株在发酵生产乳清酸方面的应用。
优选的，上述乳清酸生产菌株的应用，使用发酵罐发酵生产乳清酸，具体步骤如下：
（1）种子活化：菌种均匀涂布于活化斜面，37℃培养12 h，转接茄形瓶继续培养12h；
（2）种子培养：将菌悬液接入种子培养基中，pH7.0，温度恒定在36℃，溶氧在30%-60%，培养6.5-7h；
（3）发酵培养：等待种子菌体量OD600至20-25，按照20%接种量接入发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH 7.1，温度36℃，溶氧在30%-60%；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80%的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-1 g/L。
优选的，上述乳清酸生产菌株的应用，所述种子活化中采用的斜面培养基为：葡萄糖2 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，氯化钠2.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.2 g/L，琼脂粉25%（体积百分比），其余为水，pH7.0-7.2。
优选的，上述乳清酸生产菌株的应用，所述种子培养中采用的种子培养基为：葡萄糖30 g/L（分消），酵母粉8 g/L，蛋白胨2.0 g/L，(NH4)2SO42.0 g/L, KH2PO43.0 g/L，VB1 、VB3、VB5、VB12各2 mg/L，VH1 mg/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，钼酸铵0.32 mg/L，硼酸4.5 mg/L，CoCl2·6H2O 1.6 mg/L，其余为水。
优选的，上述乳清酸生产菌株的应用，所述发酵培养中采用的发酵培养基：葡萄糖10 g/L（分消），谷氨酸2 g/L，酵母粉6 g/L,(NH4)2SO42.0 g/L, KH2PO46.0 g/L，VB1 1 mg/L，VB3 1 mg/L，VB51 mg/L，VB12 1 mg/L，VH0.1 mg/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，FeSO4·7H2O 40 mg/L，钼酸铵0.32 mg/L，硼酸4.5 mg/L，CoCl2·6H2O 1.6 mg/L，其余为水。
上述培养基均可采用标准方法制备获得。
有益效果：
上述乳清酸生产菌株，利用CRIPSR/Cas9基因编辑技术通过敲除了purR、pepA、argR基因，解除了阻遏因子PurR、PepA、ArgR对氨基甲酰磷酸编码基因操纵子的抑制；通过过表达碳酸酐酶基因cynT和氰酸盐转运蛋白编码基因cynX，并异源引入枯草芽孢杆菌B.subtilis 168的氨甲酰磷酸合成酶基因pyrAA和pyrAB，协同加强乳清酸重要前体物氨基甲酰磷酸的合成与积累，有效促进了乳清酸的生物合成效率，所获得的菌株不含质粒，无需诱导，具有遗传稳定性好、发酵产率高等优势，是可稳定生产乳清酸的优良菌株，生产过程中无需添加抗生素和诱导剂，有效降低生产成本；所述菌株以廉价碳源葡萄糖为底物从头高效合成乳清酸，经过48h分批补料发酵，乳清酸产量可高达182.5 g/L，糖酸转化率达到58%，具有极高的工业应用前景。
附图说明
图1为乳清酸生产菌株的定向改造方法图解。
图2为基因工程菌株E.coliOra12发酵过程曲线图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，指体积百分比；溶液的百分比“%（m/v）”指100 ml溶液中含有溶质的克数。
实施例中所用的出发菌株为乳清酸高产菌株E.coliOra6（ZL 202210417923.1中菌株）；枯草芽孢杆菌B. subtilis168，保藏号ATCC 23857；相应启动子和基因等见序列表。
采用的基因编辑方法参照文献（Li Y,LinZ,HuangC,et al. Metabolicengineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genome editing.Metabolic Engineering,2015,31：13-21.），该方法涉及的工程质粒pGRB是以pUC18为骨架，包括启动子J23100、gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列以及氨节青霉素抗性（工作浓度：100 mg/L）。下列实施例中涉及到的基因整合、构建质粒等专业名词均可在该文章中解释。菌株构建过程中用到的引物见表1，构建方法参照ZL202210417923.1（一种生产乳清酸的基因工程菌及其构建方法与应用）。
表1菌株构建过程中所涉及的引物
| 引物 | 序列（5’端至3’端） | 序列号 |
| purR-QC-1 | TAAGGTCGGTGCTCATCAAGTTT | SEQ ID NO.10 |
| purR-QC-2 | CAATAGACTGCGGTTCTTCACGGGCGTTGCGCGTTTCTT | SEQ ID NO.11 |
| purR-QC-3 | AAGAAACGCGCAACGCCCGTGAAGAACCGCAGTCTATTG | SEQ ID NO.12 |
| purR-QC-4 | ACCTCGCGAACGCTACCTAA | SEQ ID NO.13 |
| pGRB-purR-S | AGTCCTAGGTATAATACTAGTACACTACTCCCCTAGCGCGGGTTTTAGAGCTAGAA | SEQ ID NO.14 |
| pGRB-purR-A | TTCTAGCTCTAAAACCCGCGCTAGGGGAGTAGTGTACTAGTATTATACCTAGGACT | SEQ ID NO.15 |
| pepA-QC-1 | GTTCTGACGTGCCAATGCC | SEQ ID NO.16 |
| pepA-QC-2 | CCTTTTGCTTTACCAGAACGCCAGCGCTCATCCAGCTCACGT | SEQ ID NO.17 |
| pepA-QC-3 | ACGTGAGCTGGATGAGCGCTGGCGTTCTGGTAAAGCAAAAGG | SEQ ID NO.18 |
| pepA-QC-4 | TTCATCCAGCCGGTAAGCCTG | SEQ ID NO.19 |
| pGRB-pepA-S | AGTCCTAGGTATAATACTAGTCAACTACTGGAAAGTGCGTCGTTTTAGAGCTAGAA | SEQ ID NO.20 |
| pGRB-pepA-A | TTCTAGCTCTAAAACGACGCACTTTCCAGTAGTTGACTAGTATTATACCTAGGACT | SEQ ID NO.21 |
| argR-QC-1 | TGTGTAGTCACGCAAGTTTAGCG | SEQ ID NO.22 |
| argR-QC-2 | GCTCTAAAATCGCTTCGTACAGGTCATCCGCGAGACTTTAGACTGAT | SEQ ID NO.23 |
| argR-QC-3 | ATCAGTCTAAAGTCTCGCGGATGACCTGTACGAAGCGATTTTAGAGC | SEQ ID NO.24 |
| argR-QC-4 | CGCTTAATGCAGCAACAGTGG | SEQ ID NO.25 |
| pGRB-argR-S | AGTCCTAGGTATAATACTAGTACGTACACGCAATGCCAAAAGTTTTAGAGCTAGAA | SEQ ID NO.26 |
| pGRB-argR-A | TTCTAGCTCTAAAACTTTTGGCATTGCGTGTACGTACTAGTATTATACCTAGGACT | SEQ ID NO.27 |
| ylbE-1 | ACCCAACCTTACGCAACCAG | SEQ ID NO.28 |
| ylbE-J23108-2 | GGTATATCTCCTTGCTAGCATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTGTCAGTTGTTCGATAACCGCAGCAT | SEQ ID NO.29 |
| ylbE-3 | AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCGCTGGCGTGCTTTGAA | SEQ ID NO.30 |
| ylbE-4 | GGCGTAACTCAGCAGGCAG | SEQ ID NO.31 |
| pGRB-ylbE-S | AGTCCTAGGTATAATACTAGTACACTGGCTGGATGTGCAACGTTTTAGAGCTAGAA | SEQ ID NO.32 |
| pGRB-ylbE-A | TTCTAGCTCTAAAACGTTGCACATCCAGCCAGTGTACTAGTATTATACCTAGGACT | SEQ ID NO.33 |
| cynT-S | CTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGCAAGGAGATATACCGTGAAAGAGATTATTGATGGATTCC | SEQ ID NO.34 |
| cynT-A | CACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACGCTGCGGTCGGTT | SEQ ID NO.35 |
| cynX-S | TTGACGGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAGTGCTAGCAAGGAGATATACCATGCTGCTGGTACTGGTGCT | SEQ ID NO.36 |
| cynX-A | CACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTCATGCCTCTTTGACCCACA | SEQ ID NO.37 |
| ilvG-1 | ACCGAGGAGCAGACAATGAATAA | SEQ ID NO.38 |
| ilvG-J23111-2 | GGTATATCTCCTTGCTAGCACTATACCTAGGACTGAGCTAGCCGTCAAGGTGATGGCAACAACAGGGA | SEQ ID NO.39 |
| ilvG-3 | AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCTATCTACGCGCCGTTGTTGT | SEQ ID NO.40 |
| ilvG-4 | GCGCTGGCTAACATGAGGAA | SEQ ID NO.41 |
| pGRB-ilvG-S | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGGAAGAGTTGCCGCGCATCAGTTTTAGAGCTAGAA | SEQ ID NO.42 |
| pGRB-ilvG-A | TTCTAGCTCTAAAACTGATGCGCGGCAACTCTTCCACTAGTATTATACCTAGGACT | SEQ ID NO.43 |
| yeeP-1 | GGTCAGGAGGTAACTTATCAGCG | SEQ ID NO.44 |
| yeeP-trc-2 | CCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAATGGCAGGGCTCCGTTTT | SEQ ID NO.45 |
| yeeP-4#-3 | ATGCACAGGAGACTTTCTGATGCGCTGGTTGATTTCTTCTAGGGTCATAGTAATCCAGCAACTGAACTGGATTTTCTTCTGAACCTGT | SEQ ID NO.46 |
| yeeP-trc-3 | TTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGAACTGGATTTTCTTCTGAACCTGT | SEQ ID NO.47 |
| yeeP-4 | ACGATGTCAGCAGCCAGCA | SEQ ID NO.48 |
| pGRB-yeeP-S | AGTCCTAGGTATAATACTAGTACAGAATATTCGCGAAAAAACGGGTTTTAGAGCTAGAA | SEQ ID NO.49 |
| pGRB-yeeP-A | TTCTAGCTCTAAAACCCGTTTTTTCGCGAATATTCTGTACTAGTATTATACCTAGGACT | SEQ ID NO.50 |
| pyr-①-S | TCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAAGAGACGATTAGTACTGGAAAACG | SEQ ID NO.51 |
| pyr-①-4#-A | AGTTGCTGGATTACTATGACCCTAGAAGAAATCAACCAGCGCATCAGAAAGTCTCCTGTGCATGCGACAACAATACTGTCTCCAGTATG | SEQ ID NO.52 |
| pyr-②-S | CCGGTACACCAATGTCTGCTTG | SEQ ID NO.53 |
| pyr-②-A | CACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGCATACTGGAGACAGTATTGTTGTCGC | SEQ ID NO.54 |
实施例1
如图1所示，基因工程菌株构建的具体过程如下：
1.1基因purR的敲除
以提取并稀释至可用浓度的大肠杆菌W3110基因组为模板，用引物purR-QC-1和purR-QC-2，purR-QC-3和purR-QC-4分别进行PCR扩增，得到上游同源臂purR-QC-UP和下游同源臂purR-QC-DW，以回收的上下游同源臂为模板，用引物purR-QC-1和purR-QC-4进行重叠PCR，得到敲除基因purR所需的回补片段ΔpurR。之后，将引物pGRB-purR-S和pGRB-purR-A退火制得的DNA片段与质粒pGRB线载连接，构建pGRB-purR。最后将pGRB-purR质粒与重叠片段ΔpurR电转至E.coliOra6/pRed-Cas9的电转感受态细胞中；再以purR-QC-1和purR-QC-4为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株E.coliOra7。
1.2基因pepA的敲除
以可用浓度的大肠杆菌W3110基因组为模板，用引物pepA-QC-1和pepA-QC-2，pepA-QC-3和pepA-QC-4分别进行PCR扩增，得到上游同源臂pepA-QC-UP和下游同源臂pepA-QC-DW，以回收的上下游同源臂为模板，用引物pepA-QC-1和pepA-QC-4进行重叠PCR，得到敲除基因pepA所需的回补片段ΔpepA。之后，将引物pGRB-pepA-S和pGRB-pepA-A退火制得的DNA片段与质粒pGRB线载连接，构建pGRB-pepA。最后将pGRB-pepA质粒与重叠片段ΔpepA电转至E.coli Ora7/pRed-Cas9的电转感受态细胞中；再以pepA-QC-1和pepA-QC-4为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株E.coliOra8。
1.3基因argR的敲除
以可用浓度的大肠杆菌W3110基因组为模板，用引物argR-QC-1和argR-QC-2，argR-QC-3和argR-QC-4分别进行PCR扩增，得到上游同源臂argR-QC-UP和下游同源臂argR-QC-DW，以回收的上下游同源臂为模板，用引物argR-QC-1和argR-QC-4进行重叠PCR，得到敲除基因argR所需的回补片段ΔargR。之后，将引物pGRB-argR-S和pGRB-argR-A退火制得的DNA片段与质粒pGRB线载连接，构建pGRB-argR。最后将pGRB-argR质粒与重叠片段ΔargR电转至E.coliOra8/pRed-Cas9的电转感受态细胞中；再以argR-QC-1和argR-QC-4为鉴定引物，筛选阳性转化子，获得菌株E.coliOra9。
1.4基因cynT的整合（ylbE::PJ23108-cynT的整合）
以大肠杆菌W3110为模板，用引物ylbE-1和ylbE-J23108-2，ylbE-3和ylbE-4；cynT-S和cynT-A进行PCR扩增，得到上同源臂ylbE-J23108-UP，下同源臂ylbE-DW和中间目的片段cynT，以回收的上下游同源臂和中间目的片段为模板，用引物ylbE-1和ylbE-4经重叠PCR得到整合需要的目的片段PJ23108-cynT，之后，将引物pGRB-ylbE-S和pGRB-ylbE-A退火制得的DNA片段与质粒pGRB线载连接，构建pGRB-ylbE质粒。最后，将纯化后的PJ23108-cynT整合片段和质粒pGRB-ylbE同时经电转化方式转入E.coli Ora9/pRed-Cas9的感受态细胞中，再以引物ylbE-1和ylbE-4为鉴定引物筛选阳性转化子，最终获得菌株E.coliOra10。
1.5基因cynX的整合（ilvG::PJ23111-cynX的整合）
以大肠杆菌W3110为模板，用引物ilvG-1和ilvG-J23111-2，ilvG-3和ilvG-4；cynX-S和cynX-A进行PCR扩增，得到上同源臂ilvG-J23108-UP，下同源臂ilvG-DW和中间目的片段cynX，以回收的上下游同源臂和中间目的片段为模板，用引物ilvG-1和ilvG-4经重叠PCR得到整合需要的目的片段PJ23111-cynX，之后，将引物pGRB-ilvG-S和pGRB-ilvG-A退火制得的DNA片段与质粒pGRB线载连接，构建pGRB-ilvG质粒。最后，将纯化后的PJ23111-cynX整合片段和质粒pGRB-ilvG同时经电转化方式转入E.coliOra10/pRed-Cas9的感受态细胞中，再以引物ilvG-1和ilvG-4为鉴定引物筛选阳性转化子，最终获得菌株E.coliOra11。
1.6基因pyrAA/AB的分段整合（yeeP::Ptrc-pyrAA/pyrAB整合）
以大肠杆菌W3110为模板，用引物yeeP-1和yeeP-trc-2，yeeP-4和yeeP-trc-3，yeeP-4和yeeP-4#-3；再以枯草芽孢杆菌B.subtilis168基因组为模板，用引物pyr-①-S和pyr-①-4#-A，pyr-②-S和pyr-②-A进行PCR扩增，先后得到上同源臂yeeP-UP，下同源臂yeeP-trc-DW及yeeP-4#-DW和中间目的片段pyr-①和pyr-②，以回收的上同源臂yeeP-UP、下游同源臂yeeP-4#-DW和中间目的片段pyr-①为模板，用引物yeeP-1和yeeP-4经重叠PCR得到整合需要的目的片段Ptrc-pyr-①，之后，将引物pGRB-yeeP-S和pGRB-yeeP-A退火制得的DNA片段与质粒pGRB线载连接，构建pGRB-yeeP质粒。将纯化后的Ptrc-pyr-①整合片段和质粒pGRB-yeeP同时经电转化方式转入菌株E.coliOra11/pRed-Cas9的感受态细胞中，以引物yeeP-1和yeeP-4为鉴定引物，挑选验证正确的菌株，继续消除质粒pGRB-yeeP，获得菌株E.coliOra11-①/pRed-Cas9。再以pyr-②和yeeP-trc-DW为模板，用引物pyr-②-S和yeeP-4经重叠PCR得到整合需要的目的片段Ptrc- pyr-②，之后，将引物pGRB-4#-S和pGRB-4#-A退火制得的DNA片段与质粒pGRB线载连接，构建pGRB-4#质粒。将纯化后的Ptrc-pyr-②整合片段和质粒pGRB-4#同时经电转化方式转入菌株E.coliOra11-①/pRed-Cas9的感受态细胞中，再以引物yeeP-1和yeeP-4为鉴定引物筛选阳性转化子，最终获得菌株E.coliOra12。
上述构建过程中涉及的菌株见表2。
表2涉及的菌株
| 菌株名称 | 基因型 |
| E.coliOra7 | E.coliOra6,ΔpurR |
| E.coliOra8 | E.coliOra7,ΔpepA |
| E.coliOra9 | E.coliOra8,ΔargR |
| E.coliOra10 | E.coliOra9,ylbE::PJ23108-cynT |
| E.coliOra11 | E.coliOra10,ilvG::PJ23111-cynX |
| E.coliOra12 | E.coliOra11,yeeP::Ptrc-pyrAA/AB (bsu) |
实施例2
利用实施例1所述乳清酸生产菌株E.coliOra12在5L发酵罐发酵生产乳清酸。
2.1培养基
2.1.1斜面培养基
葡萄糖2 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，氯化钠2.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.2 g/L，琼脂粉25%，用水溶解后用氢氧化钠调pH至7.0-7.2，定容至500ml，分装至试管（9ml/管）和茄形瓶（45 ml/瓶）中，于121℃高压蒸汽锅灭菌20 min。
2.1.2种子培养基
葡萄糖30 g/L（分消），酵母粉8 g/L，蛋白胨2.0 g/L，(NH4)2SO42.0g/L, KH2PO43.0g/L，VB1 、VB3、VB5、VB12各2 mg/L，VH1 mg/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，钼酸铵0.32 mg/L，硼酸4.5 mg/L，CoCl2·6H2O 1.6 mg/L，其余为水。
2.1.3发酵培养基
葡萄糖10 g/L（分消），谷氨酸2 g/L，酵母粉6 g/L,(NH4)2SO42.0 g/L, KH2PO46.0g/L，VB1 1 mg/L，VB31 mg/L，VB5 1 mg/L，VB12 1 mg/L，VH0.1 mg/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，FeSO4·7H2O 40 mg/L，钼酸铵0.32 mg/L，硼酸4.5 mg/L，CoCl2·6H2O 1.6 mg/L，其余为水。
2.2培养方法
2.2.1斜面活化培养
从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养12 h，转接茄形瓶继续培养12 h；
2.2.2种子培养
取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在36℃，溶氧在30%-60%之间，培养6.5-7h；
2.2.3发酵培养
等待种子菌体量OD600至20-25左右，按照20%接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.1左右，温度维持在36℃，溶氧在30%-60%之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80%的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-1g/L；发酵周期48 h。发酵过程中不添加抗生素或诱导剂。
如图2所示，5 L发酵罐发酵48h后乳清酸的产量达到了185.2 g/L，转化率达到58%。
综上，乳清酸生产菌株E.coliOra12中，cynT基因编码碳酸酐酶，其催化CO2和H2O反应合成HCO3 -，cynX基因编码氰酸盐转运蛋白，该蛋白可将氰酸盐转运出胞外以减轻对氨甲酰磷酸合成酶的抑制，cynT及cynX基因表达强度的增强对乳清酸生产具有重要影响。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种乳清酸生产菌株，其特征在于：是利用定向改造方法在出发菌株E.coli Ora6的基础上进行进一步改造获得的，具体为：在E.coli Ora6基因组上敲除了purR基因、pepA基因和argR基因，过表达碳酸酐酶基因cynT和氰酸盐转运蛋白编码基因cynX，并异源引入氨甲酰磷酸合成酶基因pyrAA和pyrAB。
2.根据权利要求1所述的乳清酸生产菌株，其特征在于：所述定向改造方法是利用CRISPR/Cas9基因编辑技术完全在目的菌株染色体基因组上进行改造。
3.根据权利要求1所述的乳清酸生产菌株，其特征在于：所述purR基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；pepA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；argR基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的乳清酸生产菌株，其特征在于：在ylbE位点上整合碳酸酐酶基因cynT，并用启动子PBBa_J23108调控；所述碳酸酐酶基因cynT的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.4所示；所述启动子PBBa_J23108的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示。
5.根据权利要求1所述的乳清酸生产菌株，其特征在于：在ilvG位点上整合氰酸盐转运蛋白编码基因cynX，并用启动子PBBa_J23111调控；所述氰酸盐转运蛋白编码基因cynX的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；所述启动子PBBa_J23111的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.7所示。
6.根据权利要求1所述的乳清酸生产菌株，其特征在于：在yeeP位点上串联整合野生型枯草芽孢杆菌B.subtilis168氨甲酰磷酸合成酶基因pyrAA和pyrAB，并用启动子Ptrc调控；串联的所述氨甲酰磷酸合成酶基因pyrAA和pyrAB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示，所述启动子Ptrc的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示。
7.权利要求1-6之一所述乳清酸生产菌株的定向改造方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）在E.coli Ora6基因组上先后敲除purR基因、pepA基因和argR基因；
（2）在ylbE位点上整合碳酸酐酶基因cynT，并用启动子PBBa_J23108调控，过表达碳酸酐酶基因cynT；
（3）在ilvG位点上整合氰酸盐转运蛋白编码基因cynX，并用启动子PBBa_J23111调控，过表达氰酸盐转运蛋白编码基因cynX；
（4）在yeeP位点上串联整合野生型枯草芽孢杆菌B.subtilis168氨甲酰磷酸合成酶基因pyrAA和pyrAB，并用启动子Ptrc调控，异源引入枯草芽孢杆菌B.subtilis 168的氨甲酰磷酸合成酶基因pyrAA和pyrAB。
8.权利要求1-6之一所述乳清酸生产菌株在发酵生产乳清酸方面的应用。
9.根据权利要求8所述的乳清酸生产菌株的应用，其特征在于：使用发酵罐发酵生产乳清酸，具体步骤如下：
（1）种子活化：菌种均匀涂布于活化斜面，37℃培养12 h，转接茄形瓶继续培养12 h；
（2）种子培养：将菌悬液接入种子培养基中，pH7.0，温度恒定在36℃，溶氧在30%-60%，培养6.5-7h；
（3）发酵培养：等待种子菌体量OD600至20-25，按照20%接种量接入发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH 7.1，温度36℃，溶氧在30%-60%；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80%的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-1 g/L。
10.根据权利要求9所述的乳清酸生产菌株的应用，其特征在于：所述种子活化中采用的斜面培养基为：葡萄糖2 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸出粉5 g/L，氯化钠2.5 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4 0.2 g/L，琼脂粉25%，其余为水， pH 7.0-7.2；所述种子培养中采用的种子培养基为：葡萄糖30 g/L，酵母粉8 g/L，蛋白胨2.0 g/L，(NH4)2SO4 2.0 g/L, KH2PO43.0 g/L，VB1 、VB3、VB5、VB12各2 mg/L，VH1 mg/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，钼酸铵0.32 mg/L，硼酸4.5mg/L，CoCl2·6H2O 1.6 mg/L，其余为水；所述发酵培养中采用的发酵培养基：葡萄糖10 g/L，谷氨酸2 g/L，酵母粉6 g/L,(NH4)2SO4 2.0 g/L, KH2PO4 6.0 g/L，VB1 1 mg/L，VB3 1 mg/L，VB5 1 mg/L，VB12 1 mg/L，VH 0.1 mg/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，FeSO4·7H2O 40 mg/L，钼酸铵0.32 mg/L，硼酸4.5 mg/L，CoCl2·6H2O 1.6 mg/L，其余为水。
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Non-Patent Citations (1)
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| 李长庚等: "B族维生素对大肠杆菌发酵生产乳清酸的影响", 《食品与发酵工业》, vol. 49, no. 13, 12 October 2022 (2022-10-12), pages 56 - 63 * |
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