KR101873541B1

KR101873541B1 - 고정화 담체와 라이신 디카르복실라아제 과발현 재조합 대장균을 이용한 연속 공정을 통한 카다베린의 연속 생산 방법

Info

Publication number: KR101873541B1
Application number: KR1020160010850A
Authority: KR
Inventors: 양영헌; 서형민; 김정호; 사시아나라야난 가네산; 박성희; 이주희; 송헌석; 이보람; 사시 칸트 바티아; 전종민; 김현중
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2016-01-28
Filing date: 2016-01-28
Publication date: 2018-07-04
Also published as: KR20170090560A

Abstract

본 발명은 대장균(Escherichia coli) 유래의 라이신 디카르복실라아제(lysine decarboxylase) 유전자를 도입한 재조합 대장균을 고정화 담체와 소형 연속 반응기에서의 연속 공정을 이용하여 장시간 동안 연속으로 고농도 카다베린(cadaverine)을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 기존의 전세포만을 이용한 카다베린 생산시 문제점이었던 전세포 회수 및 안정성과 대량 반응시 부피가 큰 반응기가 필요하다는 것을 해결하여, 전세포를 고정화한 담체를 이용하여 소형 연속 반응기로도 장시간 동안 고농도 카다베린을 생산할 수 있어 시간 절약 및 비용 절감의 효과를 기대할 수 있다.

Description

고정화 담체와 라이신 디카르복실라아제 과발현 재조합 대장균을 이용한 연속 공정을 통한 카다베린의 연속 생산 방법{A Method for continuedly production of large volume cadaverine using immobilized carrier and lysine decarboxylase―overexpressing recombinant E．coli}

본 발명은 나일론 전구체로 사용되는 카다베린(cadaverine) 생산에 사용되는 전세포의 고정화와 연속 공정을 이용해 카다베린의 대량생산에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 대장균(Escherichia coli) 유래의 라이신 탈탄산화 효소(lysine decarboxylase, cadA) 유전자를 도입한 재조합 대장균 균주를 담체에 고정화하고, 연속 반응기를 도입하여 장시간 동안 고농도 카다베린을 생전환하는 방법에 관한 것이다.

석유 유래의 플라스틱의 대체를 목적으로 생산되는 바이오 기반 플라스틱 생산을 위한 산업 균주 개발이 많이 연구되어 왔다. 이와 관련하여, 카다베린(cadverine), 퓨트레신(putrescine)과 같은 나일론 단량체를 대장균(Escherichia coli)이나 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)과 같은 산업 균주에 대사공학적인 방법을 적용하여 포도당이나 자일로스로부터 발효(fermentation)하는 연구들이 진행되어 왔다(유럽 특허공개번호 제 2540836호; Qian ZG, et al., Biotechnol Bioeng . 2009 Nov 1, 104(4):651-62; 및 Qian ZG, et al., Biotechnol Bioeng . 2011 Jan, 108(1):93-103). 하지만, 이와 같은 방법을 이용할 경우 생산성이나 농도에 있어서 상대적으로 효율이 떨어지기 때문에 산업적으로 활용하는데 어려움이 있었다.

최근 이를 극복하기 위해, 여러 회사에서 대량 생산되고 있는 전구체인 라이신(L-lysine)으로부터 전세포 반응을 통해 고농도의 카다베린(cadaverine) 생산을 한 사례가 보고되었다(Ma W, et al., Biotechnol Lett . 2015 Apr, 37(4):799-806). 그러나 이러한 방법은 활성이 좋고 고농도 반응을 진행할 수는 있지만, 효소의 활성이 쉽게 잃어버리게 되는 경향이 있기 때문에 효소를 재사용해야 하는데 있어서 문제점이 있었다.

한편, 고농도 반응에서 디카르복실라아제(lysine decarboxylase) 과발현 대장균 전세포가 한두 번의 반응으로 인하여 활성이 저해되는 현상이 있으며, 이를 극복하기 위하여 디카르복실라아제(lysine decarboxylase) 과발현 대장균 전세포를 여러 번 활용할 수 있는 시스템을 만들어야 하며, 이를 위하여 고정화 방법을 사용할 수 있다.

이에, 본 발명자들은 지속적으로 대용량의 고농도 카다베린 생산을 목적으로 소규모의 연속 반응기를 통하여 고농도의 기질을 이용하여 오랜 시간 동안 안정된 반응을 하고 효율적인 효소의 재사용과 결과물의 회수가 용이한 방법을 적용하고자 하였고, 연속 공정을 통하여 안정적인 생산시스템을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 기존의 전세포 반응을 통해 카다베린 생산 방법의 효소 활성이 떨어지는 점과 효소 재사용이 어려운 점을 극복하기 위해, 담체에 고정화시킨 디카르복실라아제(lysine decarboxylase) 과발현 대장균 전세포를 이용한 시스템을 기반으로 효율적인 효소 회수 및 산물 회수, 분리가 가능한 연속 반응기에서 장시간 동안 지속적으로 고농도의 카다베린을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

라이신(lysine) 및 효소 보조인자를 공급하는 공급부로서, 상기 공급부는 하나로 구성되어 라이신 및 효소 보조인자를 함께 공급하거나 두 개의 공급부로 구성되어 별도로 공급하는 것을 특징으로 하는 공급부;

라이신 및 효소 보조인자의 공급량 및 속도를 조절하는 정량유속펌프(peristaltic pump)부로서, 상기 정량유속펌프는 공급부와 관으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 정량유속펌프부;

고정화 담체에 고정화된 라이신 디카르복실라아제(lysine decarboxylase, cadA) 과발현 재조합 대장균을 포함하는 반응부로서, 상기 반응부는 공급부 및 정량유속펌프부로부터 라이신 및 효소 보조인자가 주입되는 관이 하부에 연결되고, 생성된 카다베린 용액이 배출되는 관이 상부에 연결되며, 상부에 CO₂ 배출구를 포함하는 것을 특징으로 하는 반응부; 및

생성된 카다베린 용액을 회수하는 회수부로서, 상기 회수부는 상기 반응부의 상부로부터 관으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 회수부;를 포함하는,

카다베린 생산을 위한 연속 공정(Continuous process) 시스템을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 라이신(lysine) 및 효소 보조인자를 정량유속펌프를 이용하여 일정 유속으로 공급하는 단계로서, 이때 라이신 및 효소 보조인자는 하나의 혼합물로 공급하거나 별도로 공급하는 것을 특징으로 하는 단계;

2) 고정화 담체에 의한 고정화한 라이신 디카르복실라아제(lysine decarboxylase, cadA) 과발현 재조합 대장균이 포함된 반응기에서 공급된 라이신 및 효소 보조인자와 재조합 대장균이 반응하여 카다베린을 생성하는 단계로서, 이때 상기 반응기는 위로 이산화탄소를 배출하고, 라이신을 하부로 공급하고 카다베린을 상부로 배출하는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 단계; 및

3) 생성된 카다베린 용액을 회수하는 단계;를 포함하는,

연속 공정(Continuous process)을 통한 카다베린의 연속 생산 방법을 제공한다.

본 발명을 통하여 기존의 재조합 대장균 전세포를 이용한 카다베린 (cadaverine) 생산의 한계점인 대용량 반응 시 큰 부피의 반응기가 필요하다는 것과 재사용의 문제점, 효소와 반응 산물과의 분리 등을 개선할 수 있으며, 소량의 효소로 120시간 이상의 고농도 반응을 지속하여 대량의 카다베린을 지속적으로 생산할 수 있다.

도 1은 연속 반응 공정 시스템 전체 개략도이다.
도 2는 연속 반응 공정 시스템에 대해 실제로 실험실내에서 소규모로 구축된 사진이다.
도 3은 라이신 디카르복실라아제(lysine decarbpxylase)가 과발현된 재조합 대장균(Escherichia coli) 전세포를 BaCl₂ 로 고정화한 담체를 직접 제작한 반응기에 넣어 아래에서 1 M 라이신(lysine)을 흘려주어 생성된 카다베린(cadaverine)이 위로 빠져나가는 형태를 보여주는 사진이다.
도 4는 전세포의 농도별(5.5 mg cell/mL, 11 mg cell/mL, 16.5 mg cell/mL, 및 22 mg cell/mL)로 담체에 고정화한 것으로 시간(0, 50분, 100분, 150분, 200분, 및 250분)에 따른 카다베린(cadaverine) 생성량(mM)을 확인함으로써, 최적 전세포 농도를 보여주는 그래프이다.
도 5는 연속 반응 공정 시스템에서의 1M 라이신(lysine)을 흘려주는 정량이송펌프(peristaltic pump)의 유속(flow rate)을 다양하게 하였을 때(0.50 ml/min, 0.75 ml/min, 1.00 ml/min, 1.25 ml/min,, 1.50 ml/min, 1.75 ml/min, 및 2.00 ml/min), 카다베린(cadaverine)이 생성되는 수율(%)을 비교한 그래프이다.
도 6은 연속 반응 공정 시스템을 이용하여 1M 라이신(lysine)을 흘려주었을 때, 시간(0. 20분, 40분, 60분, 80분, 100분, 120분 및 140분)에 따른 카다베린(cadaverine)이 생성되는 수율(%)을 확인함으로써, 약 130시간 동안 1M 라이신을 흘려주어도 안정되게 카다베린이 생성되는 것을 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

상기 연속 공정 시스템은 도 1과 같은 구조를 갖는 것이 바람직하다.

상기 재조합 대장균은 라이신 디카르복실라아제를 암호화하는 유전자(cadA 유전자)가 도입된 벡터로 숙주 대장균에 형질전환시켜 제조된 균주인 것이 바람직하다.

상기 cadA 유전자는 대장균(Escherichia coli)에서 유래된 유전자인 것이 바람직하다.

상기 cadA 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 상기 서열번호 1에서 하나 또는 둘 이상의 유전자가 추가, 결실 또는 치환된 염기서열로 구성될 수 있다.

상기 숙주 대장균은 E. coli BL21인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며 대장균 종은 모두 가능하다.

상기 효소 보조인자는 피리독살인산(pyridoxal phosphate, PLP)인 것이 바람직하다.

상기 고정화시 사용되는 고정화 담체는 바륨-알지네이트(Barium-alginate) 또는 상기 바륨-알지네이트를 포함하는 다양한 금속과 담체 물질 조성물인 것이 바람직하다.

상기 바륨-알지네이트 담체의 농도는 0.1 또는 0.2 M인 것이 바람직하다.

상기 고정화시 사용되는, 바륨-알지네이트 담체의 크기는 직경 1 내지 5 mm인 것이 바람직하고, 2 mm인 것이 더욱 바람직하다.

상기 고정화 방법은 재조합 대장균을 배양하여 라이신 디카르복실라아제를 발현시킨 후, 세포를 희석한 세포 용액과 알긴산나트륨 용액을 혼합한 다음, 고정화 담체인 BaCl₂을 첨가시키는 것으로 수행될 수 있다.

상기 금속은 BaCl₂인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며 여러 고정화용 금속이 모두 가능하다.

상기 반응기는 유리 또는 플라스틱에 한정되지 않으며, 기본적인 구조는 위로는 이산화탄소를 제거하는 배출구를 가지고, 반응시간과 이산화탄소로 인한 담체가 불균일하게 되는 것을 막기 위해서 라이신을 아래 부위로 보내고 카다베린을 위부위에서 회수하는 구조를 가지는 것이 바람직하다.

상기 반응기에 라이신 및 효소 보조인자를 0.50 내지 1.00 ml/min 유속으로 공급하는 것이 바람직하고, 0.50 내지 0.75 ml/min 유속으로 공급하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 반응부는 재조합 대장균을 11 mg/cell/ml 이상의 농도로 포함하는 것이 바람직하고, 11 내지 22 mg/cell/ml 농도로 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 한가지 실시예에서는 바륨-알지네이트 담체에 고정화된 재조합 대장균의 가장 효율적인 농도를 알아보기 위해, 본 발명에 따른 연속 공정 시스템에서 다양한 농도의 고정화된 재조합 대장균을 이용하여 카다베린 생성 정도를 분석해 본 결과, 180분까지 11 ~ 22 mg cell/ml 거의 비슷한 경향으로 약 0.8 M의 카다베린이 생성되는 것을 확인하였다.

본 발명의 한가지 실시예에서는 라이신 공급량의 가장 효율적인 유속을 알아보기 위해, 본 발명에 따른 연속 공정 시스템에서 정량유속펌프를 이용하여 다양한 유속에 따른 카다베린 생성 정도를 분석해 본 결과, 유속이 빠를수록 낮은 카다베린 전환율(약 50 ~ 70%)을 보였고, 0.5와 0.75 ml/min 유속에서 가장 좋은 약 90%의 전환율을 보이는 것을 확인하였다.

본 발명의 한가지 실시예에서는 본 발명에 따른 연속 공정으로 카다베린을 얼마나 오랫 동안 생산할 수 있는지 시간별로 카다베린 수율을 분석한 결과, 약 130시간 동안 1M 라이신을 흘려주어도 안정되게 카다베린이 생성되는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명은

2) 고정화 담체에 의한 고정화한 라이신 디카르복실라아제(lysine decarboxylase, cadA) 과발현 재조합 대장균이 포함된 반응기에서 공급된 라이신 및 효소 보조인자와 재조합 대장균이 발현한 라이신 디카르복실라아제가 반응하여 카다베린을 생성하는 단계로서, 이때 상기 반응기는 위로 이산화탄소를 배출하고, 라이신을 하부로 공급하고 카다베린을 상부로 배출하는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 단계; 및

3) 생성된 카다베린 용액을 회수하는 단계;를 포함하는,

상기 연속 생산 방법은 본 발명에 따른 상기 연속 공정 시스템을 이용하는 것이 바람직하다.

상기 연속 생산 방법은 일정 속도의 기질을 공급하여 결과물인 카다베린을 일정 속도로 회수하는 공정이며, 간헐적 방법도 큰 범주 내에서의 연속 생산 방법에 포함된다고 할 수 있다.

본 발명에 따른 고정화 담체와 라이신 디카르복실라아제 과발현 재조합 대장균을 이용한 연속 공정 시스템 및 연속 생산 방법은 기존의 재조합 대장균 전세포를 이용한 카다베린 생산의 한계점인 대용량 반응시 큰 부피의 반응기가 필요하다는 것과 재사용의 문제점, 효소와 반응 산물과의 분리 등을 개선할 수 있으며, 소량의 효소로 약 120시간 이상의 고농도 반응을 지속하여 대량의 카다베린을 지속적으로 생산할 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다.

그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있을 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

라이신 디카르복실라아제(lysine decarboxylase ) 과발현 재조합 대장균의 제조

<1-1> 형질전환체의 제조

Echerichia coli K12 MG1655 (KCCM 41310)에서 게놈(genome)을 분리한 후, 라이신 디카르복실라아제(lysine decarboxylase, cadA)를 암호화하는 유전자를 분리 및 정제하였다. 이때, 상기 유전자는 다음과 같은 염기서열로 구성되었다.

ATGAACGTTATTGCAATATTGAATCACATGGGGGTTTATTTTAAAGAAGAACCCATCCGT

GAACTTCATCGCGCGCTTGAACGTCTGAACTTCCAGATTGTTTACCCGAACGACCGTGAC

GACTTATTAAAACTGATCGAAAACAATGCGCGTCTGTGCGGCGTTATTTTTGACTGGGAT

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GCGTTCGCTAATACGTATTCCACTCTCGATGTAAGCCTGAATGACCTGCGTTTACAGATT

AGCTTCTTTGAATATGCGCTGGGTGCTGCTGAAGATATTGCTAATAAGATCAAGCAGACC

ACTGACGAATATATCAACACTATTCTGCCTCCGCTGACTAAAGCACTGTTTAAATATGTT

CGTGAAGGTAAATATACTTTCTGTACTCCTGGTCACATGGGCGGTACTGCATTCCAGAAA

AGCCCGGTAGGTAGCCTGTTCTATGATTTCTTTGGTCCGAATACCATGAAATCTGATATT

TCCATTTCAGTATCTGAACTGGGTTCTCTGCTGGATCACAGTGGTCCACACAAAGAAGCA

GAACAGTATATCGCTCGCGTCTTTAACGCAGACCGCAGCTACATGGTGACCAACGGTACT

TCCACTGCGAACAAAATTGTTGGTATGTACTCTGCTCCAGCAGGCAGCACCATTCTGATT

GACCGTAACTGCCACAAATCGCTGACCCACCTGATGATGATGAGCGATGTTACGCCAATC

TATTTCCGCCCGACCCGTAACGCTTACGGTATTCTTGGTGGTATCCCACAGAGTGAATTC

CAGCACGCTACCATTGCTAAGCGCGTGAAAGAAACACCAAACGCAACCTGGCCGGTACAT

GCTGTAATTACCAACTCTACCTATGATGGTCTGCTGTACAACACCGACTTCATCAAGAAA

ACACTGGATGTGAAATCCATCCACTTTGACTCCGCGTGGGTGCCTTACACCAACTTCTCA

CCGATTTACGAAGGTAAATGCGGTATGAGCGGTGGCCGTGTAGAAGGGAAAGTGATTTAC

GAAACCCAGTCCACTCACAAACTGCTGGCGGCGTTCTCTCAGGCTTCCATGATCCACGTT

AAAGGTGACGTAAACGAAGAAACCTTTAACGAAGCCTACATGATGCACACCACCACTTCT

CCGCACTACGGTATCGTGGCGTCCACTGAAACCGCTGCGGCGATGATGAAAGGCAATGCA

GGTAAGCGTCTGATCAACGGTTCTATTGAACGTGCGATCAAATTCCGTAAAGAGATCAAA

CGTCTGAGAACGGAATCTGATGGCTGGTTCTTTGATGTATGGCAGCCGGATCATATCGAT

ACGACTGAATGCTGGCCGCTGCGTTCTGACAGCACCTGGCACGGCTTCAAAAACATCGAT

AACGAGCACATGTATCTTGACCCGATCAAAGTCACCCTGCTGACTCCGGGGATGGAAAAA

GACGGCACCATGAGCGACTTTGGTATTCCGGCCAGCATCGTGGCGAAATACCTCGACGAA

CATGGCATCGTTGTTGAGAAAACCGGTCCGTATAACCTGCTGTTCCTGTTCAGCATCGGT

ATCGATAAGACCAAAGCACTGAGCCTGCTGCGTGCTCTGACTGACTTTAAACGTGCGTTC

GACCTGAACCTGCGTGTGAAAAACATGCTGCCGTCTCTGTATCGTGAAGATCCTGAATTC

TATGAAAACATGCGTATTCAGGAACTGGCTCAGAATATCCACAAACTGATTGTTCACCAC

AATCTGCCGGATCTGATGTATCGCGCATTTGAAGTGCTGCCGACGATGGTAATGACTCCG

TATGCTGCATTCCAGAAAGAGCTGCACGGTATGACCGAAGAAGTTTACCTCGACGAAATG

GTAGGTCGTATTAACGCCAATATGATCCTTCCGTACCCGCCGGGAGTTCCTCTGGTAATG

CCGGGTGAAATGATCACCGAAGAAAGCCGTCCGGTTCTGGAGTTCCTGCAGATGCTGTGT

GAAATCGGCGCTCACTATCCGGGCTTTGAAACCGATATTCACGGTGCATACCGTCAGGCT

GATGGCCGCTATACCGTTAAGGTATTGAAAGAAGAAAGCAAAAAATAA(서열번호: 1)

그런 다음, 상기 정제한 cadA 유전자를 pET-24ma 플라스미드 (히로시 사카모토, 파리)에 클로닝하였다. 그런 다음, 상기 클로닝된 pET-24ma 플라스미드를 E.coli BL21(λDE3) (Novagen®)에 형질전환시켰다.

<1-2> 라이신 디카르복실라아제의 발현 확인

상기 형질전환된 E.coli를 LB 플레이트(plate)에 스트리킹하였다. 그런 다음, 24시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 배양한 후 단일 콜로니(single colony)를 획득하여 LB 배지 5 ml에 전배양하였다(호기성 조건, 37℃, 200 rpm, 24시간 배양). 그런 다음, 카나마이신(50μl/ml)이 들어 있는 LB 50ml에 전배양액 500μl를 접종한 후, 30℃, 200rpm에서 균체량이 OD600nm 0.6일 때, IPTG의 최종 농도가 0.1 mM이 되게끔 IPTG를 첨가한 후, 30℃, 200rpm에서 오버 나잇으로 본배양을 하였다. 그런 다음, 24시간 후 세포를 1 ml 채취하여, 13000 g에서 원심분리 후 상등액을 버린 후에, 100 μl Bugbuster(Novagen®)를 처리한 후, 37℃에 1시간 배양하였다.

세포 용해액을 13000g에서 원심분리한 후, 상등액 16 μl과 5x SDS-PAGE 로딩 버퍼 4 μl를 섞어준 후, 100℃에서 5분간 끓여 주어 시료 전처리를 하였다. 상기 전처리 된 시료를 12% SDS-PAGE에 로딩하여 120V 700mA의 전류를 2시간 동안 흘려 주어 전개를 한 후, SDS-PAGE 겔을 염색 용액(0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% 메탄올 및 10% 빙초산(glacial acetic acid)에 1시간 동안 염색시켰다.

그 후 염색된 SDS-PAGE 겔을 탈색(50% 메탄올 및 10% 빙초산 용액에 2시간 동안 탈색을 하여 80 kDa 세포 용해액을 13000g에서 원심분리한 후, 상등액 16μl과 5x SDS-PAGE 로딩 버퍼 4 μl를 섞어준 후, 100℃에서 5분간 끓여 주어 시료 전처리를 하였다. 상기 전처리된 시료를 12% SDS-PAGE에 로딩하여 120V 700mA의 전류를 2시간 동안 흘려 주어 전개를 한 후, SDS-PAGE 겔을 염색 용액(0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250, 50% 메탄올 및 10% 빙초산(glacial acetic acid)에 1시간 동안 염색시켰다.

그 후 염색된 SDS-PAGE 겔을 탈색(50% 메탄올 및 10% 빙초산 용액에 2시간 동안 탈색을 하여 80 kDa 부근에서 단백질 밴드를 확인하여 상기 균주가 라이신 디카르복실라아제를 과발현하는 것을 확인하였다.

바륨 알지네이트 담체를 이용한 고정화 및 반응기의 제작

상기 <실시예 1>에서 제조된 형질전환된 E. coli를 LB 플레이트(plate)에 스트리킹하였다. 그런 다음, 24시간 동안 37℃의 인큐베이터에서 배양한 후 단일 콜로니(single colony)를 획득하여 LB 배지 5 ml에 전배양하였다(호기성 조건, 37 ℃, 200 rpm, 24시간 배양). 그런 다음, 전배양한 세포를 LB 배지 50 ml에 0.5 ml 접종한 후 배양하여 단백질을 발현시켰다(호기성 조건, 30℃, 200 rpm, 24시간 배양, 초기접종 3시간 후 0.1 M IPTG 5 μl 첨가). 세포를 증류수로 2번 배지를 세척한 후, 세포의 농도가 11 mg cell/mL이 되게끔 희석하였다. 그런 다음 2.5%의 알긴산나트륨(sodium alginate) 용액이 되게끔, 세포 용액과 5% 알긴산나트륨 용액을 1:1(v/v)의 비율로 혼합하였다. 그런 다음 고정화 담체의 형성을 위해 0.2 M의 BaCl₂에 한 방울씩 떨어뜨려 주었다.

그리고 반응기는 지름 약 2cm, 높이 약 15cm의 자체 제작한 유리관으로, 위아래에 관을 연결하여 용액이 흘러갈 수 있도록 구멍을 내었고 도 3과 같이 고정화한 담체를 담아서 사용하였다(도 3 참조).

바륨 알지네이트 담체에 고정화하는 재조합 대장균의 최적 농도 확인 및 연속 공정 시스템의 확립

바륨-알지네이트(Barium-alginate) 담체에 고정화하는 재조합 대장균의 가장 효율적인 농도를 알아보기 위해 상기 <실시예 2>의 고정화시 넣는 재조합 대장균의 농도를 다양하게 하여 만들었다(최종 농도가 5.5, 11, 16.5, 22 mg cell/ml). 각각 같은 수의 담체에 최종 농도 1 M 라이신(lysine), 효소 보조인자인 0.2 mM PLP(Pyridoxal 5'-phosphate)을 넣어 240분 동안 시간별로 샘플링한 반응액의 카다베린(cadaverine) 농도를 측정하였다. 카다베린(cadaverine) 측정방법은 DEEMM(diethyl ethoxymethylenemalonate) 시약을 이용해 70℃에서 2시간 반응으로 유도체화하여 고성능액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)로 측정하였다. HPLC(YL9100 system, 영린기기, Korea)는 다음과 같은 조건으로 분석을 수행하였다. 컬럼은 Capcell Pack　(5μ C18 UG 120, 4.6 x 250 mm; Shiseido Co.,Ltd., Japan)을 사용하였고, 컬럼의 온도는 35℃로, 유속은 1 ml/min 조건으로 셋팅하였으며, 다양한 유기용매들 중에서 극성도가 가장 낮은 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용함과 동시에, 25 mM 소듐 아세테이트(sodium acetate)를 완충 용액으로 사용하였고, 초산을 이용하여 pH를 4.8로 조절하였다.

그 결과, 카다베린 생성량은 180분까지 11 ~ 22 mg cell/ml 거의 비슷한 경향으로 약 0.8 M의 카다베린이 생성되었다. 이를 토대로 재조합 대장균의 농도가 11 mg cell/ml 이상은 크게 효율적이지 않기 때문에, 연속공정시 이용하는 담체의 재조합 대장균의 농도는 11 mg cell/ml을 선택하여 제조하였다(도 4 참조).

자체 제작한 유리 반응기에 재조합 대장균을 고정화한 담체를 넣고 도 2와 같이 반응 모델을 만들었다. 정량유속펌프(peristaltic pump)를 이용하여 1 M 라이신(lysine)과 효소 보조인자인 0.2 mM 피리독살인산(pyridoxal phosphate, PLP) 혼합용액을 일정 유속으로 유리 반응기의 아래로 흘려주어서 용액이 담체를 통과하면 카다베린이 생성된다. 생성된 카다베린 용액은 유리 반응기 위의 관을 통해서 회수한다(도 1 내지 도 2 참조).

카다베린 활성 측정을 위한 분석 방법 확립

고정화된 전세포의 활성을 비교하기 위해서, 디아민(diamine) 또는 아미노산 분석에 활용이 가능한 DEEMM(diethyl ethoxy methyl malonate) 유도체화를 수행하였다. 디에틸에톡시메틸말론산 3 ㎕를 1.7 ml 마이크로 튜브(Axygen, USA)로 옮긴 후, 메탄올 100 ㎕, 50 mM pH9의 보레이트 버퍼(borate buffer) 300 ㎕, 증류수 47 ㎕를 혼합한 후, 10 mM의 디아민 또는 아미노산 표준용액 50 ㎕를 혼합물이 들어 있는 1.7 ml 마이크로 튜브(Axygen, USA)로 옮긴 후, 70℃에서 두 시간 동안 반응시켰다.

시료 분리 및 검출의 향상을 위하여, 다음과 같은 HPLC(YL9100 system, 영린기기, Korea) 조건으로 분석을 수행하였다. 컬럼은 Capcell Pack®(5μ C18 UG 120, 4.6 x 250 mm; Shiseido Co.,Ltd., Japan)을 사용하였고, 컬럼의 온도는 35℃로, 유속은 1 ml/min 조건으로 셋팅하였으며, 다양한 유기용매들 중에서 극성도가 가장 낮은 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용함과 동시에, 25 mM 소듐 아세테이트(sodium acetate)를 완충 용액으로 사용하였고, 초산을 이용하여 pH를 4.8로 조절하였다.

폴리아마이드계 나일론 단량체인 디아민의 성분들의 피크들이 겹치지 않고, 최적으로 분리될 수 있는 조건을 고정상과 이동상 및 성분들의 극성 차이를 고려하여 하기 [표 1]과 같이 설정하였다.

시간 (분)	아세토니트릴 (%)	25 mM 소디움 아세테이트 (%)
0	20	80
2	25	75
32	60	40
35	20	80

고정화한 바륨- 알지네이트 (Barium-alginate) 담체를 이용해 유속 최적화 및 연속 공정으로 카다베린( cadaverine ) 생산

연속 공정 시스템에서 사용된 정량유속펌프(peristaltic pump) 유속을 다양하게 하여 카다베린 생성량을 비교하였다. 아래에서 흘려주는 1 M 라이신과 0.2 mM PLP 혼합용액의 유속을 각각 0.5, 0.75, 1.00. 1.50, 2.00 ml/min으로 하여 일정시간 동안 회수한 카다베린의 생성량을 비교하였다.

그 결과, 유속이 빠를수록 낮은 카다베린 전환율(약 50 ~ 70%)을 보였고, 0.5와 0.75 ml/min 유속에서 가장 좋은 약 90%의 전환율을 보였다. 이 두 가지 유속 중에서 0.75 ml/min을 선택하여 더 많은 양의 카다베린을 빠르게 회수할 있는 것을 선택하였다(도 5 참조).

또한, 상기 <실시예 4> 및 <실시예 5>에서 확립한 최적의 조건(도 4 및 도 5 참조)을 이용해 연속공정(continuous process)으로 카다베린을 얼마나 오랫동안 생산할 수 있는지 140분 동안 시간별로 카다베린 수율을 측정하여 확인하였다.

그 결과, 약 130시간 동안 1M 라이신을 흘려주어도 안정되게 카다베린이 생성되는 것을 확인하였다(도 6 참조).

본 발명에 의해 생산한 라이신 디카르복실라아제(lysine decarboxylase)의 경우 향후 라이신(L-lysine)으로부터 나일론 단량체인 카다베린(cadaverine) 전환에 적용시킬 수 있으며, 재조합 대장균 전세포만을 이용하였던 기존의 방법의 한계점인 전세포의 안정성, 회수, 카다베린 정제 및 대용량 반응기의 필요가 있지만, 본 발명을 통해 소형 연속 반응기에 고정화한 재조합 대장균 전세포 담체를 이용하여 대용량의 카다베린을 생산할 수 있게 해준다.

또한, 고정화한 담체를 이용하기 때문에 오랜 시간 동안 가동하여도 효소활성을 일정 수준으로 유지할 수 있고, 회수한 카다베린 용액은 전세포와 같은 불순물이 거의 없는 상태이기 때문에 정제 비용 절감에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> A Method for continuedly production of large volume cadaverine using immobilized carrier and lysine decarboxylase-overexpressing recombinant E.coli <130> NP16-1103 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 2148 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60 gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120 gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180 aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240 gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300 agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360 actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420 cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480 agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540 tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600 gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660 tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720 gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780 tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840 cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900 gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960 acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020 ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080 gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140 aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200 ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260 ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320 cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380 acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440 aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500 gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560 catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620 atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680 gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740 tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800 aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860 tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920 gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980 ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040 gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100 gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148

Claims

라이신(lysine) 및 효소 보조인자를 공급하는 공급부로서, 상기 공급부는 하나로 구성되어 라이신 및 효소 보조인자를 함께 공급하거나 두 개의 공급부로 구성되어 별도로 공급하는 것을 특징으로 하는 공급부;
라이신 및 효소 보조인자의 공급량 및 속도를 조절하는 정량유속펌프(peristaltic pump)부로서, 상기 정량유속펌프는 공급부와 관으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 정량유속펌프부;
고정화 담체로서 바륨-알지네이트(Barium-alginate)에 고정화된 라이신 디카르복실라아제(lysine decarboxylase, cadA) 과발현 재조합 대장균을 포함하는 반응부로서, 상기 반응부는 공급부 및 정량유속펌프부로부터 라이신 및 효소 보조인자가 주입되는 관이 하부에 연결되고, 생성된 카다베린 용액이 배출되는 관이 상부에 연결되며, 상부에 CO₂ 배출구를 포함하는 것을 특징으로 하는 반응부; 및
생성된 카다베린 용액을 회수하는 회수부로서, 상기 회수부는 상기 반응부의 상부로부터 관으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 회수부;를 포함하고,
여기서
상기 정량유속펌프부는 라이신 및 효소 보조인자를 0.5 내지 0.75 ml/min 유속으로 공급하고,
상기 반응부는 재조합 대장균을 11 내지 22 mg/cell/ml 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는,
카다베린 생산을 위한 연속 공정(Continuous process) 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 라이신 디카르복실라아제(lysine decarboxylase, cadA) 과발현 재조합 대장균은,
대장균(Escherichia coli)에서 유래된 라이신 디카르복실라아제(lysine decarboxylase, cadA) 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조한 후, 상기 발현벡터를 대장균에 형질전환시키는 것을 포함하는 방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생산을 위한 연속 공정 시스템.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 고정화 방법은,
상기 재조합 대장균을 배양하여 라이신 디카르복실라아제를 발현시킨 후, 세포를 희석한 세포 용액과 알긴산나트륨 용액을 혼합한 다음, 고정화 담체인 BaCl₂을 첨가시키는 단계로 수행되는 것을 특징으로 하는 카다베린 생산을 위한 연속 공정 시스템.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 반응부는 위로는 이산화탄소를 제거하고, 반응시간과 이산화탄소로 인한 담체가 불균일하게 되는 것을 막기 위해서 라이신을 아래로 보내고 카다베린을 위에서 회수하는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 카다베린 생산을 위한 연속 공정 시스템.
제 1항에 있어서, 상기 효소 보조인자는 피리독살인산(pyridoxal phosphate, PLP)인 것을 특징으로 하는 카다베린 생산을 위한 연속 공정 시스템.
1) 라이신(lysine) 및 효소 보조인자를 정량유속펌프를 이용하여 0.5 내지 0.75 ml/min의 일정 유속으로 공급하는 단계로서, 이때 라이신 및 효소 보조인자는 하나의 혼합물로 공급하거나 별도로 공급하는 것을 특징으로 하는 단계;
2) 고정화 담체로서 바륨-알지네이트(Barium-alginate)에 고정화한 라이신 디카르복실라아제(lysine decarboxylase, cadA) 과발현 재조합 대장균이 11 내지 22 mg/cell/ml 농도로 포함된 반응기에서 공급된 라이신 및 효소 보조인자와 재조합 대장균이 발현한 라이신 디카르복실라아제가 반응하여 카다베린을 생성하는 단계로서, 이때 상기 반응기는 위로 이산화탄소를 배출하고, 라이신을 하부로 공급하고 카다베린을 상부로 배출하는 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 단계; 및
3) 생성된 카다베린 용액을 회수하는 단계;를 포함하는,
연속 공정(Continuous process)을 통한 카다베린의 연속 생산 방법.
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제 9항에 있어서, 상기 단계 1)의 효소 보조인자는 피리독살인산(pyridoxal phosphate, PLP)인 것을 특징으로 하는 연속 공정을 통한 카다베린의 연속 생산 방법.
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