JP2009028045A - ポリアミド原料用カダベリン - Google Patents

Abstract

【課題】より高反応収率、高精製収率、高濃度、高生産速度および高純度でカダベリンを製造する。
【解決手段】本発明の課題は、高濃度のＬ−リジン一塩酸塩に、Ｎ末端アミノ酸配列に６個のヒスチジンを付与したＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子を導入した大腸菌の細胞破砕液もしくはＬ−リジン脱炭酸酵素を細胞表面に局在化させた大腸菌を接触させることにより解決される。更には、Ｌ−リジン一塩酸塩にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることによりｐＨを制御する必要がなく、カダベリンを高濃度、高反応収率、高生産速度で生成させ、この反応液をｐＨ１３以上にし、極性有機溶媒で抽出し、蒸留することによりカダベリンを採取し、Ｌ−リジン一塩酸塩からカダベリンを製造することによって解決される。
【選択図】なし

Description

本発明は、カダベリンの製造法に関するものである。カダベリンは医薬中間体などの合成原料やポリマー原料として期待され、需要が高まりつつある。

従来、Ｌ−リジンを微量のテトラリン過酸化物を含むシクロヘキサノール中で煮沸することによりカダベリンが得られることが知られている（非特許文献１参照。）。しかしながら高温反応であるために大量のエネルギーおよび有機溶媒が必要であるうえに、反応収率が非常に低い（３６％）。

また、２−シクロヘキセン−１−オンなどのビニルケトン類を触媒としてリジンから合成する方法（非特許文献２、特許文献１参照。）等が知られている。

また、この方法によって得られるカダベリンには不純物として、トリ−ｎ−ブチルアミンや２，３，４，５−テトラヒドロピリジンといった塩基性化合物が含有されている。

また一般的に、酵素反応進行時にｐＨが変化する際には、ｐＨを制御するために酸もしくはアルカリが適宜加えられ生成物の濃度が低下し、精製工程において濃縮操作が必要となり効率が悪くなるといった問題点がある。さらには、加えられた酸、アルカリにより酵素が変性失活してしまう。
また、カダベリンは生体内に普遍的に存在する生体アミンであり、その生合成系が解明されつつある（非特許文献３参照。）。また、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子が知られている（非特許文献４参照。）。

一方、細胞表面にタンパク質を局在化させる研究は、多くの細菌において行われている。大腸菌について細胞表面にタンパク質を局在化させる研究が活発に行われている（非特許文献５参照）。

しかしながら、カダベリンの製造について実際的な製造技術は確立されておらず、効率よく、より温和な条件下で高濃度かつ高純度のカダベリンを製造する方法の開発が望まれている。
特公平４−１０４５２号公報 須山正，金尾清造；アミノ酸の脱炭酸（第４報）薬学雑誌，ｖｏｌ．８５（６），Ｐ．５３１−５３３（１９６５）） Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｌｅｔｔｅｒｓ，８９３（１９８６） Ｃｅｌｉａ ｗｈｉｔｅ ｔａｂｏｒ ａｎｄ Ｈｅｒｂｅｒｔ ｔａｂｏｒ；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，ｖｏｌ．４９，Ｐ．８１−９９（１９８５） Ｓｈｉ−ｙｕａｎｍｅｎｇ ａｎｄ Ｇｅｏｒｇｅ Ｎ． Ｂｅｎｎｅｔｔ；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１７４，Ｐ．２６５９−２６６９（１９９２） Ｇｅｏｒｇｅ Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，Ｈｅａｔｈｅｒ Ｌ．Ｐｏｅｔｓｃｈｋｅ，Ｃｈｒｉｓｓｔｏｓ Ｓｔａｔｈｏｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ Ｊｏｓｅｐｈ Ａ． Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；ＴＩＢＴＥＣＨ，ｖｏｌ．１１，Ｐ．６−１０（１９９３）

トリ−ｎ−ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンが多く含有されているカダベリンをポリマーの原料とする場合、たとえば、カダベリンを含む原料からポリアミドを加熱重縮合で合成する際には、反応温度が高温であるため、カダベリンに含まれるトリ−ｎ−ブチルアミンや２，３，４，５−テトラヒドロピリジンなどの塩基性化合物がポリアミドの分解反応を起こし得られたポリアミドに耐熱性が不足するといった問題点がある。

さらに、トリ−ｎ−ブチルアミンは、水性生物に有毒で、魚類に対する致死量は２０−４０ｍｇ／Ｌであるといった問題点もある。

本発明の課題は、このような不純物の少ないカダベリンの高反応収率、高精製収率、高生産速度、高濃度および高純度での工業的製造方法およびカダベリンの単離方法を提供することである。

上記問題点を解決するために、本発明者らは、効率がよく、より温和な条件下で高濃度かつ高純度のカダベリンの製造方法について鋭意研究を行った結果、Ｌ−リジン塩水溶液にＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることによりカダベリンを高反応収率かつ高濃度で得られることを見出した。

すなわち、本発明は、「（１）Ｌ−リジン塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させ、反応液からカダベリンを単離することを特徴とするカダベリンの製造方法。
（２）２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のカダベリン。
（３）トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６ｗｔ％以下のカダベリン。
（４）上記（１）の方法で得られたカダベリンまたは上記（２）あるいは（３）記載のカダベリンを原料として含有するポリアミド。」である。

本発明によれば、高反応収率、高精製収率、高生産速度、高濃度および高純度でのカダベリンの工業的製造方法およびカダベリンの単離方法が提供される。

カダベリンとは１，５−ペンタンジアミンのことであり、ポリマー原料、医薬中間体の合成原料などとして有用な化合物である。

Ｌ−リジン脱炭酸酵素は、Ｌ−リジンをカダベリンに転換させる酵素であり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株をはじめとするエシェリシア属微生物のみならず、多くの生物に存在することが知られている。

本発明において使用されるＬ−リジン脱炭酸酵素に特に制限はないが、例えば、バシラス・ハロドゥランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、セレノモナス・ルミナンチウム（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・コエリカーラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・ピロサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｉｌｏｓｕｓ）、エイケネラ・コロデンス（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、イユバクテリウム・アシダミノフィルム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄａｍｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）、ナイセリア・メニンギチデス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、テルモプラズマ・アシドフィルム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、ピロコッカス・アビシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ａｂｙｓｓｉ）またはコリネバクテリウム・グルタミカス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のものが好ましく用いられる。さらに好ましくは安全性の認められているエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のものである。

本発明における生成物は、アルカリ性の化合物であるカダベリンであるために、反応が進行するにつれ、反応液のｐＨはアルカリ側に変化していく。しかし、Ｌ−リジン塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させれば、反応液のｐＨを制御する必要がなく効率よくカダベリンを生産できる。用いるＬ−リジン塩については特に制限はない。好ましくは塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、硝酸塩、炭酸塩である。さらに好ましくはＬ−リジン一塩酸塩である。

Ｌ−リジン脱炭酸酵素は本来ビタミンＢ６と結合し存在するが、Ｌ−リジン塩水溶液にビタミンＢ６を添加することにより、生産速度および反応収率を向上させることができる。ビタミンＢ６を添加する方法には特に制限はない。反応中に適宜添加しても良い。好ましくはＬ−リジン脱炭酸酵素が溶液状態であれば、酵素溶液中に添加することが好ましい。反応液中でのビタミンＢ６の濃度については特に制限はなく。好ましくは反応液に０．０５ｍＭのビタミンＢ６濃度となるように加えればよい。用いるビタミンＢ６に特に制限はない。好ましくは、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサルおよびピリドキサルリン酸から選ばれる少なくとも１種である。さらに好ましくはピリドキサルリン酸である。

また、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させた後、Ｌ−リジン塩が仕込み濃度の２０％以下にまでになった反応液からカダベリンを単離することにより、高精製収率でカダベリンが単離できる。２０％以下にまでになったことを確認する手段には特に制限はない。好ましくはＨＰＬＣ法によって確認することができる。さらに好ましくはｐＨの変化を経時的に測定し、Ｌ−リジン塩の濃度と関連づけて反応の終点を確認する方法が採用できる。

本発明において使用されるＬ−リジン脱炭酸酵素を得る方法に特に制限はないが、例えば、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞内で高発現した組換え細胞（細胞内発現組み換え細胞）などを適当な培地で培養し、増殖した細胞を回収し、当該細胞を破砕すればよい。

また、別の方法として、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面で局在化した組み換え細胞（細胞表面発現組み換え細胞）などを適当な培地で培養し、増殖した細胞を回収すればよい。

Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面で局在化した組み換え細胞とは、少なくともＬ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化している状態であり、細胞内に同時にＬ−リジン脱炭酸酵素が存在していても良い。

一方、細胞表面にＬ−リジン脱炭酸酵素を局在化させる具体的な方法としては、例えば、分泌シグナル配列の一部、細胞表面局在タンパク質の一部をコードする遺伝子配列、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の構造遺伝子配列をこの順で有するＤＮＡを大腸菌に導入すればよい。

分泌シグナル配列の一部に制限はない。宿主においてタンパク質を分泌するために必要な配列であればよい。大腸菌においては、例えばリポプロテインの配列の一部であり、具体的には、アミノ酸配列としてＭＫＡＴＫＬＶＬＧＡＶＩＬＧＳＴＬＬＡＧＣＳＳＮＡＫＩＤＱ（アミノ酸の一文字表記）と翻訳される遺伝子配列であることが好ましい。

細胞表面局在タンパク質の一部をコードする遺伝子配列に特に制限はない。大腸菌においては、例えば外膜結合タンパク質の配列の一部であり、具体的にはＯｍｐＡ（外膜結合タンパク質）の４６番目のアミノ酸から１５９番目のアミノ酸までの配列の一部であることが好ましい。

Ｌ−リジン脱炭酸酵素遺伝子、リポプロテイン遺伝子およびＯｍｐＡ遺伝子をクローニングする方法に特に制限はない。既知の遺伝子情報に基づき、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法を用いて必要な遺伝領域を増幅取得する方法、既知の遺伝子情報に基づきゲノムライブラリーやｃＤＮＡライブラリーより相同性や酵素活性を指標としてクローニングする方法などが挙げられる。本発明においては、これらの遺伝子は、遺伝的多形性などによる変異型も含む。なお、遺伝的多形性とは、遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものをいう。例えばＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株の染色体ＤＮＡよりＰＣＲ法を用いてＬ−リジン脱炭酸酵素をコードする遺伝子であるｃａｄＡ遺伝子またはｌｄｃ遺伝子をクローニングする。この際使用する染色体ＤＮＡはＥ．ｃｏｌｉ由来であればどの菌株由来でもよい。

Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化していることの確認は、例えばＬ−リジン脱炭酸酵素を抗原として作製した抗体により、細胞表面発現組み換え細胞を免疫反応後、包埋、薄切りし、電子顕微鏡（免疫電顕法）により観察することで確認できる。

本発明では、Ｌ−リジン脱炭酸酵素は、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の細胞内もしくは細胞表面での活性が上昇した組換え細胞から調製されたものが好ましく使用できる。細胞内もしくは細胞表面でＬ−リジン脱炭酸酵素の活性を上昇させる方法に特に制限はない。具体的には、例えば、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の酵素量を増加させる方法、もしくは酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、酵素そのものの比活性を上昇させることなどが挙げられる。

細胞内もしくは細胞表面の酵素量を増加させる手段としては、遺伝子の転写調節領域の改良、遺伝子のコピー数の増加、蛋白への翻訳の効率化などが挙げられる。

転写調節領域の改良とは、遺伝子の転写量を増加させる改変を加えることをいう。例えば、プロモーターに変異を導入することによってプロモーター強化を行い、下流にある遺伝子の転写量を増加させることができる。プロモーターに変異を導入する以外にも、宿主内で強力に発現するプロモーターを導入しても良い。例えば大腸菌においては、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐなどのプロモーターが挙げられる。また、エンハンサーを新たに導入することによって遺伝子の転写量を増加させることができる。染色体ＤＮＡのプロモーター等の遺伝子導入については、例えば特開平１−２１５２８０号公報に記載されている。

遺伝子のコピー数の上昇は、具体的には、遺伝子を多コピー型のベクターに接続して組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを宿主細胞に保持させることにより達成することができる。ここでベクターとは、プラスミドやファージ等広く用いられているものを含むが、これら以外にも、トランソポゾン（Ｂｅｒｇ，Ｄ．Ｅ ａｎｄ Ｂｅｒｇ．Ｃ．Ｍ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．１，Ｐ．４１７（１９８３））やＭｕファージ（特開平２−１０９９８５号公報）も含む。遺伝子を相同組換え用プラスミド等を用いた方法で染色体に組み込んでコピー数を上昇させることも可能である。

蛋白の翻訳効率を上昇させる方法としては、例えば原核生物においてはＳＤ配列（Ｓｈｉｎｅ，Ｊ．ａｎｄ Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７１，１３４２−１３４６ （１９７４））、真核生物では Ｋｏｚａｋのコンセンサス配列（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１５，ｐ．８１２５−８１４８（１９８７））を導入、改変することや、使用コドンの最適化（特開昭５９−１２５８９５）などが挙げられる。

Ｌ−リシン脱炭酸酵素の細胞内もしくは細胞表面での活性を上昇させる手段としては、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の構造遺伝子自体に変異を導入して、Ｌ−リジン脱炭酸酵素そのものの活性を上昇させることも挙げられる。

遺伝子に変異を生じさせるには、部位特異的変異法（Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ． ａｎｄ ｆｒｉｔａ，Ｈ．Ｊ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１５４，Ｐ．３５０（１９８７））リコンビナントＰＣＲ法（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特定の部分のＤＮＡを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロキシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸などの化学薬剤で処理する方法がある。

組換え細胞としては、微生物、動物、植物、または昆虫由来のものが好ましく使用できる。例えば動物を用いる場合、マウス、ラットやそれらの培養細胞などが用いられる。植物を用いる場合、例えばシロイヌナズナ、タバコやそれらの培養細胞が用いられる。また、昆虫を用いる場合、例えばカイコやその培養細胞などが用いられる。また、微生物を用いる場合、例えば、大腸菌などが用いられる。

また、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を複数種組み合わせて使用しても良い。

Ｌ−リジン脱炭酸酵素を得るために、組換え細胞を培養する方法に特に制限はないが、例えば微生物を培養する場合、使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオンおよび必要に応じその他有機成分を含有する培地が用いられる。例えば、大腸菌の場合しばしばＬＢ培地が用いられる。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉の加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトールやソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマール酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養素としては、各種アミノ酸、ビタミンＢ１等のビタミン類、ＲＮＡ等の核酸類などの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。それらの他に、必要に応じて、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。

培養条件にも特に制限はなく、例えば大腸菌の場合、好気条件下で１６〜７２時間程度実施するのが良く、培養温度は３０℃〜４５℃に、特に好ましくは３７℃に、培養ｐＨは５〜８に、特に好ましくはｐＨ７に制御するのがよい。なおｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニアガス等を使用することができる。

増殖した細胞内発現組み換え細胞は、遠心分離等により培養液から回収することができる。回収した細胞内発現組み換え細胞から細胞破砕液を調整するには、通常の方法が用いられる。すなわち、細胞内発現組み換え細胞を超音波処理、ダイノミル、フレンチプレス等の方法にて破砕し、遠心分離により細胞残渣を除去することにより細胞破砕液が得られる。

細胞破砕液からＬ−リジン脱炭酸酵素を精製するには、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点沈殿、熱処理、ｐＨ処理など酵素の精製に通常用いられる手法が適宜組み合わされて用いられる。

一般的な工業化される酵素反応は休止細胞を用いるが、本発明においては作用させるＬ−リジン脱炭酸酵素は、Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性を有する休止細胞、その細胞破砕液などが使用できるが、細胞破砕液が好ましい。細胞破砕液を用いるとより高生産速度でカダベリンが得られる。

さらに、部分的に精製したＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることによりＬ−リジンの分解およびカダベリンの分解を抑制することができ、より高収率かつ高純度のカダベリンが得られる。部分的な精製とは、工業的に容易な処理のみ行うことであり例えば熱処理、ｐＨ処理等が挙げられる。好ましくは熱処理である。さらに好ましくは単離精製したＬ−リジン脱炭酸酵素を作用させることである。Ｌ−リジン脱炭酸酵素を部分的に精製、または単離精製することで、Ｌ−リジンの分解やカダベリンの分解を引き起こす酵素を取り除くことができる。

さらに、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化している細胞を作用させれば、Ｌ−リジンの分解およびカダベリンの分解を抑制することができ、より高収率かつ高純度、高生産速度でカダベリンが得られる。さらにはその細胞を回収することで繰り返し酵素反応に利用することができる。しかも酵素の調整が非常に簡便である。

一般的に酵素というものは本来あるべきアミノ酸配列で自然界に存在するため、人工的にアミノ酸配列を付与もしくは欠如させると酵素の活性を失うことが多い。しかし本発明において細胞内にＬ−リジン脱炭酸酵素を発現させる場合、Ｌ−リジン脱炭酸酵素のＮ末端アミノ酸配列に１から３０個のアミノ酸配列を付与したＬ−リジン脱炭酸酵素が好ましく使用できる。ここで、Ｎ末端に付与するものは６から１０個のヒスチジン残基が好ましい。このように、Ｎ末端アミノ酸配列にアミノ酸を付与することで、Ｌ−リジン脱炭酸酵素の精製を簡便にできるようにすることができる。Ｎ末端アミノ酸配列に１から３０個のアミノ酸を付与する方法に特に制限はない。例えばＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子に付与したいアミノ酸配列に相当する塩基配列を遺伝子工学的手法を用い、組み換えればよい。用いる遺伝子工学的手法に特に制限はないが。好ましくはＰＣＲ法やＤＮＡ断片同士の連結による方法がある。

Ｌ−リジン脱炭酸酵素によるＬ−リジン塩水溶液からカダベリンへの変換は、上記のようにして得られるＬ−リジン脱炭酸酵素を、Ｌ−リジン塩水溶液に接触させることによって行うことができる。

用いるＬ−リジン脱炭酸酵素の量に特に制限はない。Ｌ−リジン塩水溶液をカダベリンに変換する反応を触媒するのに十分な量であればよい。好ましくは反応液中の酵素濃度が２５から７０ｍｇ／Ｌである。好ましくは５０ｍｇ／Ｌである。一方、休止細胞を使用する際は、反応液中の細胞濃度が５から１５ｇ／Ｌである。好ましくは１０ｇ／Ｌである。

反応温度は、通常、２８〜５５℃、好ましくは４５℃前後である。

反応液の状態に特に制限はない。好ましくは静置または攪拌状態である。攪拌状態にする方法には特に制限はない。好ましくは攪拌翼により攪拌する方法である。

本発明で使用するＬ−リジン脱炭酸酵素は、固定化することで繰り返しカダベリン合成反応に使用することができ、酵素の調製に必要なコストを低減させることができる。固定化方法としては、アクリルアミドなどの合成高分子に包括する方法、セファロースやスチレン樹脂を骨格とするイオン交換性担体や疎水性担体に吸着させる方法、または、ガラス担体に共有結合で結合させる方法などが挙げられる。

反応時間は、使用する酵素活性、Ｌ−リジン塩濃度などの条件によって異なるが、通常、１〜７２時間である。また、反応は、Ｌ−リジン塩を供給しながら連続的に行ってもよい。

このように生成したカダベリンを反応終了後、反応液から採取する方法としては、反応終了液をアルカリでｐＨ１２から１４にし、極性有機溶媒で抽出すれば良い。

用いるアルカリに特に制限はない。好ましくは水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムを用いることができる。

用いる極性有機溶媒に特に制限はない。好ましくはアニリン、シクロヘキサノン、１−オクタノール、イソブチルアルコール、シクロヘキサノール、クロロホルムを用いることができる。

このようにして得られたカダベリンは、トリ−ｎ−ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンなどの不純物が少ない。本発明の方法で製造することで、以下の方法で分析した場合に、トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が、０．００６ｗｔ％以下のカタベリンが得られる。さらに、以下の方法で分析した場合に、２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のものが得られる。さらに、トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が、０．００６ｗｔ％以下であり、かつ、２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のものが得られる。

トリ−ｎ−ブチルアミンおよび２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの分析は、ＧＣ−ＭＳ法によって以下の条件で行う。

ＧＣ／ＭＳ：ＨＰ６９８０／ＨＰ５９７３Ａ
Ｃｏｌｕｍｎ：ＮＵＫＯＬ ３０ｍ×０．２４ｍｍＩ．Ｄ． ０．２μｍ Ｆｉｌｍ
Ｏｖｅｎ：１２０℃（一定）
ＩｎＪ：２００℃（Ｓｐｌｉｔ １０：１）
Ｆｌｏｗ：Ｈｅ ２．４ｍｌ／ｍｉｎ （ｃｏｎｓｔ．Ｆｌｏｗ）
ＭＳ：２３０℃（ＳＣＡＮ ｍ／ｚ＝３０〜４００）
このようにして得られたカダベリンは、ポリアミドの原料として有用である。

ポリアミドの製造方法としては、カダベリンとジカルボン酸の塩、および水の混合物を、加熱して脱水反応を進行させる加熱重縮合法が用いられる。また、加熱重縮合後、固相重合することによって、分子量を上昇させることも可能である。固相重合は、１００℃〜融点の温度範囲で、真空中、あるいは不活性ガス中で加熱することにより進行し、加熱重縮合では分子量が不十分なポリアミドを高分子量化することができる。

用いるジカルボン酸に特に制限はなく。例えばアジピン酸が好ましい。

本発明で得られるカダベリンをポリアミドの原料とすることで、耐熱性の高いポリアミドが得られる。

以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。

［Ｌ−リジン濃度およびカダベリン濃度のＨＰＬＣによる分析方法］
使用カラム：ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫ Ｃ１８（資生堂）
移動相：０．１％（ｗ／ｗ）Ｈ３ＰＯ４：アセトニトリル＝４．５：５．５
検出：ＵＶ ３６０ｎｍ
サンプル前処理：分析サンプル２５μｌに内標として０．０３Ｍ １，４−ジアミノブタンを２５μｌ、０．０７５Ｍ 炭酸水素ナトリウムを１５０μｌおよび０．２Ｍ ２，４−ジニトロフルオロベンゼンのエタノール溶液を添加混合し３７℃で１時間保温する。上記反応溶液５０μｌを１ｍｌアセトニトリルに溶解後、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心した後の１０μｌをＨＰＬＣ分析した。

参考例１（Ｌ−リジン脱炭酸酵素の調整）
（１）Ｌ−リジン脱炭酸酵素遺伝子のクローニングおよび細胞内発現ベクターの作製
Ｌ−リジン脱炭酸酵素を用いてＬ−リジン塩からカダベリンに変換させるために、Ｅ．ｃｏｌｉのＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）のクローニングを行った。

データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ７６４１１）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５−ａｔｇａａｃｇｔｔａｔｔｇｃａａｔａｔｔｇ−３’（配列番号：１）、５’−ｇｃｔｇａｔｇｇｇｔｇａｇａｔａｇａａｔｇ−３’（配列番号：２）を合成した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株（ＡＴＣＣ１０７９８）から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として０．２ｍｌのミクロ遠心チューブに０．２μｌづつ取り、各プライマーを２０ｐｍｏｌ、２０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１００μｇ／ｍｌゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、２単位 ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）となるように各試薬を加え、全量を５０μｌとした。ＤＮＡの変性条件を９４℃、３０秒、プライマーのアニーリング条件を５５℃、３０秒、ＤＮＡプライマーの伸長反応条件を７２℃、３分の各条件でＢｉｏＲａｄ社のサーマルサイクラーを用い、３０サイクル反応させた（ポリメラーゼ連鎖反応：以後、ＰＣＲ法と記す）。尚、本実施例におけるＰＣＲ法は特に断らない限り、本条件にて行った。このＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、ｃａｄＡ遺伝子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴ７−ｃａｄＡと命名した。

このｐＴ７−ｃａｄＡを増幅鋳型として、オリゴヌクレオチド５’−ｃｇｃｃａｔｇｇｇｃｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔｃａｔａｔｇａａｃｇｔｔａｔｔｇｃａａｔａｔｔｇ−３’（配列番号：３）、５’−ｃｇｃｇｇａｔｃｃｇｃｔｇａｔｇｇｇｔｇａｇａｔａｇａａｔｇ−３’（配列番号：４）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。ここで得られる産物は、オリゴヌクレオチド（配列番号：３）由来の塩基配列と、（配列番号：４）由来の塩基配列が、それぞれｃａｄＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片の５’末端、および３’末端に付加されている。この産物を１％アガロースにて電気泳動し、約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴ７−ｃａｄＡ１と命名した。

このｐＴ７−ｃａｄＡ１をＮｃｏＩ、及びＢａｍＨＩで消化し、得られた２．１ｋｂのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を、予めＮｃｏＩ、及びＢａｍＨＩで消化しておいたｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造製）のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＬＤＣ１と命名した（図１）。このプラスミドを導入した大腸菌を培養することで、Ｌ−リジン脱炭酸酵素のＮ末端アミノ酸配列に６個のヒスジチン残基が付加された分子量約８０ｋＤａの組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を生産することができる。

（２）組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素の産生
ｐＬＤＣ１でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株をアンピシリン耐性に形質転換し、得られた形質転換体をＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株と命名した。

次にＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株で組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を産生させた。まず、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含んだ滅菌ＬＢ培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．ｅｔ．ａｌ、２００１、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ３ｒｄ．ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ）（ＬＢ−ａｍｐ培地）５ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で２４時間振とうして前培養を行った。

この前培養液をＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌに全量植菌し、３７℃、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で３時間培養した後に１ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−１−ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）添加し、更に４時間培養した。対照実験として、ＪＭ１０９株をｐＴＶ１１８Ｎで形質転換した形質転換体（以後、ＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ株とする）を用い同様の培養を行った。こうして得られた菌体を集め、５ｍｌのＴＢＳ緩衝液（宝酒造製）に再懸濁後、超音波破砕および遠心分離により細胞破砕液を調製した。これらのＬ−リジン脱炭酸酵素活性の測定を単位時間当たりに生成するカダベリンの濃度を測定することにより行った。その結果、対照実験であるＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ株由来の細胞破砕液に対して、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株においてはＬ−リジン脱炭酸酵素活性は約１００倍に上昇していた。また、この細胞破砕液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分画し、Ｐｅｎｔａ−Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ抗体（ＱＩＡＧＥＮ社製）でウエスタンブロッティングを行った結果、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株由来の細胞破砕液のみから、分子量約８０ｋＤａの組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を検出した。

（３）組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素の精製
この組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素は、Ｎ末端アミノ酸配列に６個のヒスチジン残基があることから、ニッケルイオンとの相互作用を利用した精製を行った。まず、１０ｍｌのキレーティング セファロース ファースト フロー（Ｃｈｉｌａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）担体（アマシャム バイオサイエンス社製）を充填したカラムシステムを構築した。このカラムに５０ｍｌの５０ｍＭ 硫酸ニッケル水溶液、５０ｍｌのＴＢＳ緩衝液の順で流した後、（２）と同様の方法で得られたＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株の５００ｍＬ培養液由来の５０ｍｌ細胞破砕液を流した。その後、１００ｍｌの５ｍＭ イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液、１００ｍｌの５０ｍＭ イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液をこの順序で流した。更に５０ｍｌの６００ｍＭ イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液を流した。カラムに流した各々の緩衝液のＬ−リジン脱炭酸酵素活性を（２）と同様の方法で測定したところ、６００ｍＭ イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液のみに活性があった。また、カラムに流した各々の緩衝液をＳＤＳ−ＰＡＧＥし、クマシーブリリアントブルーで染色したところ、６００ｍＭ イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液から、約８０ｋＤａの単一バンドを検出した。また、カラムに流した各々の緩衝液を（２）と同様の方法でウエスタンブロッティングを行ったところ、６００ｍＭ イミダゾールを含むＴＢＳ緩衝液のみに約８０ｋＤａタンパク質を検出し、この精製タンパク質はＬ−リジン脱炭酸酵素活性を有する組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素であることを確認した。

（４）Ｌ−リジン脱炭酸酵素の細胞表面発現ベクターの作製
まず、リポプロテインの配列の一部および外膜結合タンパク質（ＯｍｐＡ）の４６番目のアミノ酸から１５９番目のアミノ酸までの配列を一つのカセットとしてクローニングした。

データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されている外膜結合タンパク質（ｏｍｐＡ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿０００９１３）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５−ａｔａａａｇｃｔｔａｔｇａａａｇｃｔａｃｔａａａｃｔｇｇ−３’（配列番号：５）、５’−ａｔａｇｔｃｇａｃｇｔｔｇｔｃｃｇｇａｃｇａｇｔｇｃｃｇ−３’（配列番号：６）、５’−ａｔａａａｇｃｔｔａｔｇａａａｇｃｔａｃｔａａａｃｔｇｇｔａｃｔｇｇｇｃｇｃｇｇｔａａｔｃｃｔｇｇｇｔｔｃｔａｃｔｃｔｇｃｔｇｇｃａｇｇｔｔｇｃｔｃｃａｇｃａａｃｇｃｔａａａａｔｃｇａｔｃａｇａａｃｃｃｇｔａ−３’（配列番号：７）を合成した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株（ＡＴＣＣ１０７９８）から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として（配列番号：５）（配列番号：６）（配列番号：７）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。このＰＣＲ法により得られた産物を２％アガロースにて電気泳動し、ｏｍｐＡ遺伝子を含む約０．４ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ７と命名した。

このｐＴＭ７をＨｉｎｄＩＩＩ、及びＳａｌＩで消化し、得られた約０．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ ＳａｌＩ断片を、予めＨｉｎｄＩＩＩ、及びＳａｌＩで消化しておいたｐＵＣ１９（宝酒造製）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１４と命名した。

次に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株（ＡＴＣＣ１０７９８）のＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）のクローニングを行った。

データベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に登録されているＬ−リジン脱炭酸酵素遺伝子（ｃａｄＡ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ７６４１１）の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマー５−ｔａｔｇｔｃｇａｃａｔｇａａｃｇｔｔａｔｔｇｃａａｔａｔ −３’（配列番号：８）、５’−ｇｇａｇａｇｃｔｃｔｔａｔｔｔｔｔｔｇｃｔｔｔｃｔｔｃｔｔｔ−３’（配列番号：９）を合成した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株（ＡＴＣＣ１０７９８）から常法に従い調整したゲノムＤＮＡの溶液を増幅鋳型として（配列番号：８）（配列番号：９）をプライマーセットとしたＰＣＲ法を行った。

このＰＣＲ法により得られた産物を１％アガロースにて電気泳動し、ｃａｄＡ遺伝子を含む約２．１ｋｂのＤＮＡ断片を常法に従い調整した。この断片を、プラスミドベクターｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）のＥｃｏＲＶ部位の３’−末端にＴ塩基が付加された間隙に、常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１５と命名した。

これら調整したｐＴＭ１５をＳａｌＩ、及びＳａｃＩで消化し、得られた約２．１ｋｂのＳａｌＩ ＳａｃＩ断片を、予めＳａｌＩ、及びＳａｃＩで消化しておいたｐＴＭ１４のＳａｌＩ／ＳａｃＩ間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをｐＴＭ１６（図２）と命名した。

このプラスミドを導入した大腸菌を培養することで、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化され、その大腸菌を回収するだけでＬ−リジン脱炭酸酵素を調整することができるようになる。

（５）Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化した細胞の調整
ｐＴＭ１６でＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株をアンピシリン耐性に形質転換し、得られた形質転換体をＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株と命名した。

次にＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株で組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を産生させた。まず、ＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株をそれぞれ５０μｇ／ｍｌのアンピシリンナトリウムを含んだ滅菌ＬＢ培地（ＬＢ−ａｍｐ培地）５ｍｌに１白金耳植菌し、３７℃で２４時間振とうして前培養を行った。

この前培養液をＬＢ−ａｍｐ培地５０ｍｌに全量植菌し、３７℃、振幅３０ｃｍで、１８０ｒｐｍの条件下で３時間培養した後に１ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、更に４時間培養した。こうして得られた菌体を遠心回収し、１０ｍｌのＴＢＳ緩衝液（宝酒造製）で３回洗浄後、遠心し菌体を回収した。

実施例１，２ 比較例１（Ｌ−リジンの種類の効果）
１０００ｍｌのフラスコに、表１に示すＬ−リジンまたはＬ−リジン塩を終濃度１．３５Ｍになるように各種Ｌ−リジンを加え調整した水溶液５００ｍｌを加えた。その後、終濃度５０ｍｇ／Ｌになるように参考例１（３）で得た精製した組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を加え作用させた。４５℃で４８時間反応した後の反応液中に含まれるカダベリンの濃度を測定した。その結果を表１に示す。

原料として、Ｌ−リジン塩水溶液を用いると、より高濃度かつ高反応収率でカダベリンが得られた。

実施例３〜７（ビタミンＢ６の添加の効果）
１０００ｍｌのフラスコに、Ｌ−リジン一塩酸塩を終濃度１．３５Ｍになるように調整した水溶液５００ｍｌを加えた。次に表２に示す各種ビタミンＢ６を終濃度０．０５ｍＭになるように添加した。最後に終濃度５０ｍｇ／Ｌになるように参考例１（３）で得た精製した組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を加え作用させた。４５℃で４８時間反応した後の反応液中に含まれるカダベリンの濃度を測定した。その結果を表２に示す。

この結果、ビタミンＢ６をＬ−リジン塩水溶液に添加することにより、より高収率でカダベリンを得られた。

実施例８〜１１（反応停止の条件の効果）
１０００ｍｌのフラスコに、終濃度１．３５ＭになるようにＬ−リジン一塩酸塩を加え調整した水溶液５００ｍｌを加えた。次にピリドキサルリン酸一水和物を終濃度０．０５ｍＭになるように添加した。最後に、終濃度５０ｍｇ／Ｌになるように参考例１（３）で得た精製した組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を加え、４５℃において作用させた。残存Ｌ−リジン濃度をＨＰＬＣにより常に測定し、表３に示す残存Ｌ−リジン濃度に達した際に反応溶液を８０℃に加熱し反応を停止した。これら反応液に水酸化ナトリウムを添加し、反応液のｐＨを１３以上にした。次にクロロホルムを反応液と等量加え、クロロホルム相にカダベリンを抽出した。最後にこのクロロホルム相を、減圧蒸留（３０ｍｍＨｇ、８０℃）することによりカダベリンを単離した。この単離操作における精製収率を表３にまとめる。

この結果、反応停止条件としてＬ−リジン塩濃度が仕込み濃度の２０％以下になった反応液からカダベリンを単離することにより、高精製収率でカダベリンが得られた。

実施例１２〜１６（得られたＬ−リジン脱炭酸酵素の精製状態の効果）
参考例１に示す方法により得られたＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１株を培養し表４に示すような精製処理をおこなった。また、Ｌ−リジン脱炭酸酵素が細胞表面に局在化したＪＭ１０９／ｐＴＭ１６株の培養も行った。比較例として参考例１に示す方法により得られたＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ株の培養も行った。

１０００ｍｌのフラスコに、終濃度１．３５ＭになるようにＬ−リジン一塩酸塩を加え調整した水溶液５００ｍｌを加えた。次にピリドキサルリン酸一水和物を終濃度０．０５ｍＭになるように添加した。最後に、ＪＭ１０９／ｐＴＶ１１８Ｎ菌体（比較例２）、ＪＭ１０９／ｐＬＤＣ１菌体（実施例１２）およびＪＭ１０９／ｐＴＭ１６菌体（実施例１６）は２７０ｍｌの培養液から得られた菌体（Ｌ−リジン脱炭酸酵素濃度を終濃度５０ｍｇ／Ｌ添加することに相当する菌体量）を、また表４に示す各精製状態の組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素（実施例１３，１４，１５）は終濃度５０ｍｇ／Ｌになるように加え、４５℃において作用させた。経時的にカダベリンの濃度を測定した結果を図３に示す。また、反応が進行しなくなった時間におけるカダベリン収率およびカダベリンの生産速度を求め、表５および図３に示す。

この結果、組み換えＬ−リジン脱炭酸酵素を精製することで、高生産速度、高収率でカダベリンが得られた。また、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を細胞表面に局在化させることで高生産速度、高収率でカダベリンが得られた。

参考例２（既存の化学合成法によるカダベリンの調製）
Ｌ−リジン一塩酸塩２０ｇ（Ｆｌｕｋａ社製）シクロヘキサノール１００ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）に懸濁し、次いで２８％ナトリウムメトキシド／メタノール溶液（シグマアルドリッチジャパン製）２１．２ｍｌ、２−シクロヘキセン−１−オン１ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）を加え、１５５℃で３時間加熱撹拌した。反応終了後、反応混合物に塩化水素４ｇ（シグマアルドリッチジャパン製）を含むイソプロパノール溶液２０ｍｌ（シグマアルドリッチジャパン製）を加え、析出した生成物を回収し、乾燥することによりカダベリン二塩酸塩を得た（特公平４−１０４５２の実施例３記載の方法）。この水溶液に、水酸化ナトリウム水溶液を添加することによってカダベリン二塩酸塩をカダベリンに変換し、クロロホルムで抽出して、減圧蒸留（３０ｍｍＨｇ、８０℃）することにより、カダベリンを得た。

実施例１７〜２１ 比較例３（不純物の同定）
実施例１２〜１６で得られた各反応液を実施例８〜１１に示した精製方法によりカダベリンを単離した。不純物の分析を、下記に示す条件でＧＣ−ＭＳ法により行い、参考例２で調製したカダベリン（比較例３）の不純物分析と比較した結果を表６に示す。
ＧＣ／ＭＳ：ＨＰ６９８０／ＨＰ５９７３Ａ
Ｃｏｌｕｍｎ：ＮＵＫＯＬ ３０ｍ×０．２４ｍｍＩ．Ｄ． ０．２μｍ Ｆｉｌｍ
Ｏｖｅｎ：１２０℃（一定）
ＩｎＪ：２００℃（Ｓｐｌｉｔ １０：１）
Ｆｌｏｗ：Ｈｅ ２．４ｍｌ／ｍｉｎ （ｃｏｎｓｔ．Ｆｌｏｗ）
ＭＳ：２３０℃（ＳＣＡＮ ｍ／ｚ＝３０〜４００）

この結果、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を用い生成したカダベリンを精製することにより、水性生物に有毒で、また酸と接触すると反応してしまうトリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６ｗｔ％以下かつ２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下の高純度カダベリンが得られた。

参考例３（カダベリンとアジピン酸の塩の調製）
実施例１５のカダベリン１０．３ｇを、水２５ｇ中に溶解した水溶液を、４０℃のウォーターバスに浸して撹拌しているところに、アジピン酸（カーク製）を約１ｇずつ、中和点付近では約０．２ｇずつ添加していき、アジピン酸添加量に対する水溶液のｐＨ変化を調べ、中和点を求めると、ｐＨ８．６６であった。ｐＨが８．６６になるように、カダベリンとアジピン酸の等モル塩の５０ｗｔ％水溶液を調製した。

参考例４（カダベリンとアジピン酸の塩の調整）
参考例２のカダベリン１０．３ｇを、水２５ｇ中に溶解した水溶液を、４０℃のウォーターバスに浸して撹拌しているところに、アジピン酸（カーク製）を約１ｇずつ、中和点付近では約０．２ｇずつ添加していき、アジピン酸添加量に対する水溶液のｐＨ変化を調べ、中和点を求めると、ｐＨ８．７２であった。ｐＨが８．７２になるようにカダベリンとアジピン酸の等モル塩の５０ｗｔ％水溶液を調製した。

実施例２２（ポリアミドの合成）
参考例３で調製したカダベリンとアジピン酸の等モル塩の５０ｗｔ％水溶液５０．０ｇを試験管に仕込み、オートクレーブに入れて、密閉し、窒素置換した。ジャケット温度を２６５℃に設定し、加熱を開始した。缶内圧力が１７．５ｋｇ／ｃｍ２に到達した後、缶内圧力を１７．５ｋｇ／ｃｍ２で３時間保持した。その後、ジャケット温度を２７５℃に設定し、２時間かけて缶内圧力を常圧に放圧した。その後、缶内温度が２４５℃に到達した時点で、加熱を停止した。室温に放冷後、試験管をオートクレーブから取り出し、ポリアミドを得た。

比較例４
参考例４で調製したカダベリンとアジピン酸の等モル塩の５０ｗｔ％水溶液５０．０ｇを用いる以外は、実施例２２と全く同様の方法でポリアミドを得た。

実施例２３（ポリアミドの評価）
実施例２２で得られたポリアミドおよび比較例４で得られたポリアミドを下記に示す方法で比較評価した。その結果を表７に示す。

［ポリアミド中の２，３，４，５−テトラヒドロピリジン、およびトリ−ｎ−ブチルアミンの定量（ＧＣ−ＭＳ）］
ポリアミド約１５ｇを精秤して、メタノールでソックスレー抽出し、その抽出液を、下記条件でＧＣ−ＭＳ分析して、ポリアミド中に含まれる２，３，４，５−テトラヒドロピリジン、およびトリ−ｎ−ブチルアミンを定量した。
装置：ヒューレットパッカード製 ＨＰ５８９０質量検出器
カラム：５％−ジフェニル−９５％−ジメチルポリシロキサン
カラム温度：Ｉｎｉｔｉａｌ １００℃
Ｆｉｎａｌ ２５０℃
昇温速度：１０℃／ｍｉｎ
注入口温度：２３０℃
検出器温度：２８０℃
キャリアガス：ヘリウム
注入口圧力：５０ｋｇ／ｃｍ^２
試料注入量：１μｌ。

［ＤＳＣ（示差走査熱量測定）］
セイコー電子工業製ロボットＤＳＣＲＤＣ２２０を用い、窒素雰囲気下、ポリアミドを約５ｍｇを採取し、次の条件で測定した。融点＋２５℃に昇温して３分間保持し、ポリアミドを完全に融解させた後、２０℃／分の降温速度で、３０℃まで降温し、３分間保持した後、３０℃から融点＋２５℃まで２０℃／分の昇温速度で昇温したときに観測される吸熱ピークの温度、および熱量を求めた。

［相対粘度（ηｒ）］
９８％硫酸中、０．０１ｇ／ｍｌ濃度、２５℃でオストワルド式粘度計を用いて測定を行った。

［溶融滞留試験］
試験管にポリアミド約５ｇを仕込み、窒素雰囲気下、融点＋２０℃の温度のシリコンバスに浸漬し、ポリアミドが完全に溶融してから３０分間放置した後、ポリアミドを回収して相対粘度測定を行った。

その結果、本発明の方法によって得られた高純度カダベリンを使用することにより、相対粘度（ηｒ）の保持率の高い（耐熱性の高い）ポリアミドが得られた。

Ｌ−リジン脱炭酸酵素細胞内発現ベクターｐＬＤＣ１のフィジカルマップを示す図である。 Ｌ−リジン脱炭酸酵素細胞表面発現ベクターｐＴＭ１６のフィジカルマップを示す図である。 実施例１２〜１６および比較例２における時間とカダベリン生産量の関係を示す図である。

Claims (20)

1. Ｌ−リジン塩水溶液に、Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させ、反応液からカダベリンを単離することを特徴とするカダベリンの製造方法。
2. Ｌ−リジン塩が、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、硝酸塩、炭酸塩のいずれかであることを特徴とする請求項１に記載のカダベリンの製造方法。
3. Ｌ−リジン塩が、一塩酸塩であることを特徴とする請求項１に記載のカダベリンの製造方法。
4. ビタミンＢ６を添加することを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
5. ビタミンＢ６が、ピリドキサルリン酸であることを特徴とする請求項４に記載のカダベリンの製造方法。
6. Ｌ−リジン脱炭酸酵素を作用させた後、Ｌ−リジン塩の濃度が仕込み濃度の２０％以下になった反応液からカダベリンを単離することを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
7. Ｌ−リジン脱炭酸酵素が、エシェリシア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属由来であることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
8. Ｌ−リジン脱炭酸酵素が、Ｌ−リジン脱炭酸酵素活性を有する細胞の破砕液に含まれるＬ−リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
9. Ｌ−リジン脱炭酸酵素が、部分的に精製されたＬ−リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
10. Ｌ−リジン脱炭酸酵素が、単離精製されたＬ−リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
11. Ｌ−リジン脱炭酸酵素が、細胞表面に局在化しているＬ−リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
12. Ｌ−リジン脱炭酸酵素が、Ｎ末端アミノ酸配列に１から３０個のアミノ酸を付与した組換えＬ−リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする請求項１から１１のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
13. Ｌ−リジン脱炭酸酵素が、Ｎ末端アミノ酸配列に６から１０個のヒスチジン残基を付与した組換えＬ−リジン脱炭酸酵素であることを特徴とする請求項１２に記載のカダベリンの製造方法。
14. 反応後の反応液をアルカリでｐＨ１２から１４にし、極性有機溶媒でカダベリンを抽出することを特徴とする請求項１から１３のいずれかに記載のカダベリンの製造方法。
15. アルカリが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウムのいずれかであることを特徴とする請求項１４に記載のカダベリンの製造方法。
16. 極性有機溶媒がアニリン、シクロヘキサノン、１−オクタノール、イソブチルアルコール、シクロヘキサノール、クロロホルムのいずれかであることを特徴とする請求項１４に記載のカダベリンの製造方法。
17. ２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下のカダベリン。
18. トリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６ｗｔ％以下のカダベリン。
19. ２，３，４，５−テトラヒドロピリジンの含有量が１．４ｗｔ％以下かつトリ−ｎ−ブチルアミンの含有量が０．００６％以下のカダベリン。
20. 請求項１から１６のいずれか１項記載の方法で得られるカダベリンもしくは請求項１７から１９のいずれか１項記載のカダベリンを原料として含有するポリアミド。

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