JP2002223771A - カダベリンの製造方法 - Google Patents
カダベリンの製造方法Info
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- JP2002223771A JP2002223771A JP2001025489A JP2001025489A JP2002223771A JP 2002223771 A JP2002223771 A JP 2002223771A JP 2001025489 A JP2001025489 A JP 2001025489A JP 2001025489 A JP2001025489 A JP 2001025489A JP 2002223771 A JP2002223771 A JP 2002223771A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 より経済的にカダベリンを生産する。
【解決手段】 本発明の課題は、リジンに、大腸菌にリ
ジン脱炭酸酵素遺伝子を組み込み高発現させた組み換え
微生物より粗精製したリジン脱炭酸酵素を作用させてカ
ダベリンを生成させ、生成したカダベリンを採取するこ
とにより、リジンからカダベリンを製造することによっ
て解決される。
ジン脱炭酸酵素遺伝子を組み込み高発現させた組み換え
微生物より粗精製したリジン脱炭酸酵素を作用させてカ
ダベリンを生成させ、生成したカダベリンを採取するこ
とにより、リジンからカダベリンを製造することによっ
て解決される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、カダベリンの製造
法に関するものである。カダベリンは医薬中間体などの
合成原料や高分子原材料として期待され、需要が高まり
つつある。
法に関するものである。カダベリンは医薬中間体などの
合成原料や高分子原材料として期待され、需要が高まり
つつある。
【０００２】
【従来の技術】従来、リジンを微量のテトラリン過酸化
物を含むシクロヘキサノール中で煮沸することによりカ
ダベリンが得られることが知られている（須山正,金尾
清造;アミノ酸の脱炭酸（第４報）薬学雑誌,vol.85(6),
P.531-533(1965)）。しかしながら大量のエネルギーお
よび有機溶媒が必要であるうえに、生成効率が非常に低
い（36%）。また、カダベリンは生体内に普遍的に存在
する生体アミンであり、その生合成系が解明されつつあ
る（Celia white tabor and Herbert tabor;Microbiolo
gical Reviews,vol.49,P.81-99(1985)）。また、エシェ
リシア・コリ(Escherichia coli)由来のリジン脱炭酸酵
素遺伝子が知られている（Shi-yuanmeng andGeorge N.
Bennett;Journal of Bacteriology,vol.174,P.2659-266
9(1992)）。しかしながら、カダベリンの製造について
実際的な製造技術は確立されておらず、効率よく、より
温和な条件下でカダベリンを製造する方法の開発が望ま
れている。
物を含むシクロヘキサノール中で煮沸することによりカ
ダベリンが得られることが知られている（須山正,金尾
清造;アミノ酸の脱炭酸（第４報）薬学雑誌,vol.85(6),
P.531-533(1965)）。しかしながら大量のエネルギーお
よび有機溶媒が必要であるうえに、生成効率が非常に低
い（36%）。また、カダベリンは生体内に普遍的に存在
する生体アミンであり、その生合成系が解明されつつあ
る（Celia white tabor and Herbert tabor;Microbiolo
gical Reviews,vol.49,P.81-99(1985)）。また、エシェ
リシア・コリ(Escherichia coli)由来のリジン脱炭酸酵
素遺伝子が知られている（Shi-yuanmeng andGeorge N.
Bennett;Journal of Bacteriology,vol.174,P.2659-266
9(1992)）。しかしながら、カダベリンの製造について
実際的な製造技術は確立されておらず、効率よく、より
温和な条件下でカダベリンを製造する方法の開発が望ま
れている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、高効
率、高収率で、エネルギー消費が少なく、有機溶媒を必
要としないカダベリンの工業的製造方法を提供すること
である。
率、高収率で、エネルギー消費が少なく、有機溶媒を必
要としないカダベリンの工業的製造方法を提供すること
である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】上記問題点を解決するた
めに、本発明者らは、生産効率が高く、より温和な条件
下でのカダベリンの製造方法について鋭意研究を行った
結果、エシェリシア・コリ(Escherichia coli)由来のリ
ジン脱炭酸酵素遺伝子（cadA）を遺伝子工学技術により
E.coliで高発現させた。その粗精製リジン脱炭酸酵素溶
液および精製酵素溶液を、リジン高濃度含有水溶液に作
用させ、さらに反応溶液のpHを5.5〜6.5に維持すること
によりカダベリンの生産効率が著しく向上することを見
出し、本発明に到達した。
めに、本発明者らは、生産効率が高く、より温和な条件
下でのカダベリンの製造方法について鋭意研究を行った
結果、エシェリシア・コリ(Escherichia coli)由来のリ
ジン脱炭酸酵素遺伝子（cadA）を遺伝子工学技術により
E.coliで高発現させた。その粗精製リジン脱炭酸酵素溶
液および精製酵素溶液を、リジン高濃度含有水溶液に作
用させ、さらに反応溶液のpHを5.5〜6.5に維持すること
によりカダベリンの生産効率が著しく向上することを見
出し、本発明に到達した。
【０００５】すなわち、本発明は、リジンに、リジン脱
炭酸酵素の細胞内での活性が上昇した組換え細胞由来の
リジン脱炭酸酵素を作用させることを特徴とするカダベ
リンの製造方法である。
炭酸酵素の細胞内での活性が上昇した組換え細胞由来の
リジン脱炭酸酵素を作用させることを特徴とするカダベ
リンの製造方法である。
【０００６】
【発明の実施の形態】リジン脱炭酸酵素は、リジンをカ
ダベリンに転換させる酵素であり、Escherichia coli K
12株をはじめとするエシェリシア属微生物のみならず、
多くの生物に存在することが知られている。
ダベリンに転換させる酵素であり、Escherichia coli K
12株をはじめとするエシェリシア属微生物のみならず、
多くの生物に存在することが知られている。
【０００７】本発明において使用されるリジン脱炭酸酵
素は、リジン脱炭酸酵素の細胞内での活性が上昇した組
換え細胞由来のものであれば、特に制限はない。
素は、リジン脱炭酸酵素の細胞内での活性が上昇した組
換え細胞由来のものであれば、特に制限はない。
【０００８】組換え細胞としては、微生物、動物、植
物、または昆虫由来のものが好ましく使用できる。例え
ば動物を用いる場合、マウス、ラットやそれらの培養細
胞などが用いられる。植物を用いる場合、例えばシロイ
ヌナズナ、タバコやそれらの培養細胞が用いられる。ま
た、昆虫を用いる場合、例えばカイコやその培養細胞な
どが用いられる。また、微生物を用いる場合、例えば、
大腸菌などが用いられる。
物、または昆虫由来のものが好ましく使用できる。例え
ば動物を用いる場合、マウス、ラットやそれらの培養細
胞などが用いられる。植物を用いる場合、例えばシロイ
ヌナズナ、タバコやそれらの培養細胞が用いられる。ま
た、昆虫を用いる場合、例えばカイコやその培養細胞な
どが用いられる。また、微生物を用いる場合、例えば、
大腸菌などが用いられる。
【０００９】また、リジン脱炭酸酵素を複数種組み合わ
せて使用しても良い。
せて使用しても良い。
【００１０】このようなリジン脱炭酸酵素を持つ微生物
としては、バシラス・ハロドゥランス（Bacillus halod
urans）、バシラス・サブチリス（Bacillus subtili
s）、エシェリシア・コリ(Escherichia coli)、セレノ
モナス・ルミナンチウム（Selenomonas ruminantiu
m）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）、ビブリオ
・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、
ストレプトマイセス・コエリカーラ（Streptomyces coe
licolor）、ストレプトマイセス・ピロサス（Streptomy
ces pilosus）、エイケネラ・コロデンス（Eikenella c
orrodens）、イユバクテリウム・アシダミノフィルム
（Eubacterium acidaminophilum）、サルモネラ・ティ
フィムリウム（Salmonella typhimurium）、ハフニア・
アルベイ(Hafnia alvei)、ナイセリア・メニンギチデス
（Neisseria meningitidis）、テルモプラズマ・アシド
フィルム（Thermoplasma acidophilum）、ピロコッカス
・アビシ（Pyrococcus abyssi）またはコリネバクテリ
ウム・グルタミカス（Corynebacteriumglutamicum）等
が挙げられる。
としては、バシラス・ハロドゥランス（Bacillus halod
urans）、バシラス・サブチリス（Bacillus subtili
s）、エシェリシア・コリ(Escherichia coli)、セレノ
モナス・ルミナンチウム（Selenomonas ruminantiu
m）、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）、ビブリオ
・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、
ストレプトマイセス・コエリカーラ（Streptomyces coe
licolor）、ストレプトマイセス・ピロサス（Streptomy
ces pilosus）、エイケネラ・コロデンス（Eikenella c
orrodens）、イユバクテリウム・アシダミノフィルム
（Eubacterium acidaminophilum）、サルモネラ・ティ
フィムリウム（Salmonella typhimurium）、ハフニア・
アルベイ(Hafnia alvei)、ナイセリア・メニンギチデス
（Neisseria meningitidis）、テルモプラズマ・アシド
フィルム（Thermoplasma acidophilum）、ピロコッカス
・アビシ（Pyrococcus abyssi）またはコリネバクテリ
ウム・グルタミカス（Corynebacteriumglutamicum）等
が挙げられる。
【００１１】リジン脱炭酸酵素を得る方法に特に制限は
ないが、例えば、リジン脱炭酸酵素の細胞内での活性が
上昇した組換え細胞などを適当な培地で培養し、増殖し
た菌体を回収し、休止菌体として用いることも可能であ
り、また当該菌体を破砕して無細胞抽出液を調製して用
いることも可能であり、また必要に応じて精製して用い
ることも可能である。
ないが、例えば、リジン脱炭酸酵素の細胞内での活性が
上昇した組換え細胞などを適当な培地で培養し、増殖し
た菌体を回収し、休止菌体として用いることも可能であ
り、また当該菌体を破砕して無細胞抽出液を調製して用
いることも可能であり、また必要に応じて精製して用い
ることも可能である。
【００１２】リジン脱炭酸酵素を抽出するために、組換
え細胞を培養する方法に特に制限はないが、例えば微生
物を培養する場合、使用する培地は、炭素源、窒素源、
無機イオンおよび必要に応じその他有機成分を含有する
培地が用いられる。例えば、E.coliの場合しばしばLB培
地が用いられる。炭素源としては、グルコース、ラクト
ース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マ
ルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉
の加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトール
やソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマ
ール酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いること
ができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム
塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、
アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養素
としては、各種アミノ酸、ビタミンB1等のビタミン類、
RNA等の核酸類などの要求物質または酵母エキス等を適
量含有させることが望ましい。それらの他に、必要に応
じて、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、鉄イオン、
マンガンイオン等が少量添加される。
え細胞を培養する方法に特に制限はないが、例えば微生
物を培養する場合、使用する培地は、炭素源、窒素源、
無機イオンおよび必要に応じその他有機成分を含有する
培地が用いられる。例えば、E.coliの場合しばしばLB培
地が用いられる。炭素源としては、グルコース、ラクト
ース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マ
ルトース、キシロース、トレハロース、リボースや澱粉
の加水分解物などの糖類、グリセロール、マンニトール
やソルビトールなどのアルコール類、グルコン酸、フマ
ール酸、クエン酸やコハク酸等の有機酸類を用いること
ができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム
塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、
アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養素
としては、各種アミノ酸、ビタミンB1等のビタミン類、
RNA等の核酸類などの要求物質または酵母エキス等を適
量含有させることが望ましい。それらの他に、必要に応
じて、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、鉄イオン、
マンガンイオン等が少量添加される。
【００１３】培養条件にも特に制限はなく、例えばE.co
liの場合、好気条件下で１６〜７２時間程度実施するの
が良く、培養温度は３０℃〜４５℃に、特に好ましくは
３７℃に、培養pHは５〜８に、特に好ましくはpH７に制
御するのがよい。なおpH調整には無機あるいは有機の酸
性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニアガス等を
使用することができる。
liの場合、好気条件下で１６〜７２時間程度実施するの
が良く、培養温度は３０℃〜４５℃に、特に好ましくは
３７℃に、培養pHは５〜８に、特に好ましくはpH７に制
御するのがよい。なおpH調整には無機あるいは有機の酸
性あるいはアルカリ性物質、さらにアンモニアガス等を
使用することができる。
【００１４】増殖した組換え細胞は、遠心分離等により
培養液から回収することができる。回収した組換え細胞
から無細胞抽出液を調整するには、通常の方法が用いら
れる。すなわち、組換え細胞を超音波処理、ダイノミ
ル、フレンチプレス等の方法にて破砕し、遠心分離によ
り菌体残渣を除去することにより無細胞抽出液が得られ
る。
培養液から回収することができる。回収した組換え細胞
から無細胞抽出液を調整するには、通常の方法が用いら
れる。すなわち、組換え細胞を超音波処理、ダイノミ
ル、フレンチプレス等の方法にて破砕し、遠心分離によ
り菌体残渣を除去することにより無細胞抽出液が得られ
る。
【００１５】無細胞抽出液からリジン脱炭酸酵素を精製
するには、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点沈殿、熱
処理、pH処理等酵素の精製に通常用いられる手法が適宜
組み合わされて用いられる。精製は、完全精製である必
要は必ずしもなく、基質のリジンの分解に関与する酵
素、生成物であるカダベリンの分解酵素等の夾雑物が除
去できればよい。
するには、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、等電点沈殿、熱
処理、pH処理等酵素の精製に通常用いられる手法が適宜
組み合わされて用いられる。精製は、完全精製である必
要は必ずしもなく、基質のリジンの分解に関与する酵
素、生成物であるカダベリンの分解酵素等の夾雑物が除
去できればよい。
【００１６】リジン脱炭酸酵素によるリジンからカダベ
リンへの変換は、上記のようにして得られるリジン脱炭
酸酵素を、リジンに接触させることによって行うことが
できる。
リンへの変換は、上記のようにして得られるリジン脱炭
酸酵素を、リジンに接触させることによって行うことが
できる。
【００１７】反応溶液中のリジンの濃度については、特
に制限はない。
に制限はない。
【００１８】リジン脱炭酸酵素の量は、リジンをカダベ
リンに変換する反応を触媒するのに十分な量であればよ
い。
リンに変換する反応を触媒するのに十分な量であればよ
い。
【００１９】反応温度は、通常、２８〜５５℃、好まし
くは４０℃前後である。
くは４０℃前後である。
【００２０】反応pHは、通常、５〜８、好ましくは、約
６である。カダベリンが生成するにつれ、反応溶液はア
ルカリ性へ変わるので、反応pHを維持するために無機あ
るいは有機の酸性物質を添加することが好ましい。好ま
しくは塩酸を使用することができる。
６である。カダベリンが生成するにつれ、反応溶液はア
ルカリ性へ変わるので、反応pHを維持するために無機あ
るいは有機の酸性物質を添加することが好ましい。好ま
しくは塩酸を使用することができる。
【００２１】反応には静置または攪拌のいずれの方法も
採用し得る。
採用し得る。
【００２２】リジン脱炭酸酵素は固定化されていてもよ
い。
い。
【００２３】反応時間は、使用する酵素活性、基質濃度
などの条件によって異なるが、通常、１〜７２時間であ
る。また、反応は、リジンを供給しながら連続的に行っ
てもよい。
などの条件によって異なるが、通常、１〜７２時間であ
る。また、反応は、リジンを供給しながら連続的に行っ
てもよい。
【００２４】このように生成したカダベリンを反応終了
後、反応液から採取する方法としては、イオン交換樹脂
を用いる方法や沈殿剤を用いる方法、その他通常の採取
分離方法が採用できる。
後、反応液から採取する方法としては、イオン交換樹脂
を用いる方法や沈殿剤を用いる方法、その他通常の採取
分離方法が採用できる。
【００２５】本発明では、リジン脱炭酸酵素は、リジン
脱炭酸酵素の細胞内での活性が上昇した組換え細胞から
調製される。細胞内でリジン脱炭酸酵素の活性を上昇さ
せる方法に特に制限はない。具体的には、例えば、リジ
ン脱炭酸酵素の酵素量を増加させる方法、もしくは酵素
の構造遺伝子自体に変異を導入して、酵素そのものの比
活性を上昇させることなどが挙げられる。
脱炭酸酵素の細胞内での活性が上昇した組換え細胞から
調製される。細胞内でリジン脱炭酸酵素の活性を上昇さ
せる方法に特に制限はない。具体的には、例えば、リジ
ン脱炭酸酵素の酵素量を増加させる方法、もしくは酵素
の構造遺伝子自体に変異を導入して、酵素そのものの比
活性を上昇させることなどが挙げられる。
【００２６】細胞内の酵素量を増加させる手段として
は、遺伝子の転写調節領域の改良、遺伝子のコピー数の
増加、蛋白への翻訳の効率化などが挙げられる。
は、遺伝子の転写調節領域の改良、遺伝子のコピー数の
増加、蛋白への翻訳の効率化などが挙げられる。
【００２７】転写調節領域の改良とは、遺伝子の転写量
を増加させる改変を加えることをいう。例えば、プロモ
ーターに変異を導入することによってプロモーター強化
を行い、下流にある遺伝子の転写量を増加させることが
できる。プロモーターに変異を導入する以外にも、宿主
内で強力に発現するプロモーターを導入しても良い。例
えば大腸菌においては、lac、tac、trpなどのプロモー
ターが挙げられる。また、エンハンサーを新たに導入す
ることによって遺伝子の転写量を増加させることができ
る。染色体DNAのプロモーター等の遺伝子導入について
は、例えば特開平1-215280号公報に記載されている。
を増加させる改変を加えることをいう。例えば、プロモ
ーターに変異を導入することによってプロモーター強化
を行い、下流にある遺伝子の転写量を増加させることが
できる。プロモーターに変異を導入する以外にも、宿主
内で強力に発現するプロモーターを導入しても良い。例
えば大腸菌においては、lac、tac、trpなどのプロモー
ターが挙げられる。また、エンハンサーを新たに導入す
ることによって遺伝子の転写量を増加させることができ
る。染色体DNAのプロモーター等の遺伝子導入について
は、例えば特開平1-215280号公報に記載されている。
【００２８】遺伝子のコピー数の上昇は、具体的には、
遺伝子を多コピー型のベクターに接続して組換えDNAを
作製し、該組換えDNAを宿主細胞に保持させることによ
り達成することができる。ここでベクターとは、プラス
ミドやファージ等広く用いられているものを含むが、こ
れら以外にも、トランソポゾン（Berg,D.E and Berg.C.
M., Bio/Technol.,vol.1,P.417(1983)）やMuファージ
（特開平2-109985号公報）も含む。遺伝子を相同組換え
用プラスミド等を用いた方法で染色体に組み込んでコピ
ー数を上昇させることも可能である。
遺伝子を多コピー型のベクターに接続して組換えDNAを
作製し、該組換えDNAを宿主細胞に保持させることによ
り達成することができる。ここでベクターとは、プラス
ミドやファージ等広く用いられているものを含むが、こ
れら以外にも、トランソポゾン（Berg,D.E and Berg.C.
M., Bio/Technol.,vol.1,P.417(1983)）やMuファージ
（特開平2-109985号公報）も含む。遺伝子を相同組換え
用プラスミド等を用いた方法で染色体に組み込んでコピ
ー数を上昇させることも可能である。
【００２９】蛋白の翻訳効率を上昇させる方法として
は、例えば原核生物においてはSD配列（Shine, J. and
Dalgarno, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 1342
-1346(1974)）、真核生物では Kozak のコンセンサス配
列（Kozak, M., Nuc. Acids Res., Vol.15，p.8125-814
8(1987)）を導入、改変することや、使用コドンの最適
化（特開昭59-125895）などが挙げられる。
は、例えば原核生物においてはSD配列（Shine, J. and
Dalgarno, L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71, 1342
-1346(1974)）、真核生物では Kozak のコンセンサス配
列（Kozak, M., Nuc. Acids Res., Vol.15，p.8125-814
8(1987)）を導入、改変することや、使用コドンの最適
化（特開昭59-125895）などが挙げられる。
【００３０】リジン脱炭酸酵素遺伝子をクローニングす
る方法に特に制限はない。既知の遺伝子情報に基づき、
PCR(polymerase chain reaction)法を用いて必要な遺伝
領域を増幅取得する方法、既知の遺伝子情報に基づきゲ
ノムライブラリーやcDNAライブラリーより相同性や酵素
活性を指標としてクローニングする方法などが挙げられ
る。本発明においては、これらの遺伝子は、遺伝的多形
性などによる変異型も含む。なお、遺伝的多形性とは、
遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部
変化しているものをいう。例えばE.coli K12株の染色体
DNAよりPCR法を用いてリジン脱炭酸酵素をコードする遺
伝子であるcadA遺伝子またはldc遺伝子をクローニング
する。この際使用する染色体DNAはE.coli由来であれば
どの菌株由来でもよい。
る方法に特に制限はない。既知の遺伝子情報に基づき、
PCR(polymerase chain reaction)法を用いて必要な遺伝
領域を増幅取得する方法、既知の遺伝子情報に基づきゲ
ノムライブラリーやcDNAライブラリーより相同性や酵素
活性を指標としてクローニングする方法などが挙げられ
る。本発明においては、これらの遺伝子は、遺伝的多形
性などによる変異型も含む。なお、遺伝的多形性とは、
遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部
変化しているものをいう。例えばE.coli K12株の染色体
DNAよりPCR法を用いてリジン脱炭酸酵素をコードする遺
伝子であるcadA遺伝子またはldc遺伝子をクローニング
する。この際使用する染色体DNAはE.coli由来であれば
どの菌株由来でもよい。
【００３１】リシン脱炭酸酵素の細胞内での活性を上昇
させる手段としては、酵素の構造遺伝子自体に変異を導
入して、酵素そのものの活性を上昇させることも挙げら
れる。
させる手段としては、酵素の構造遺伝子自体に変異を導
入して、酵素そのものの活性を上昇させることも挙げら
れる。
【００３２】遺伝子に変異を生じさせるには、部位特異
的変異法（Kramer,W. and frita,H.J., Methods in Enz
ymology,vol.154,P.350(1987)）リコンビナントPCR法
（PCRTechnology,Stockton Press(1989）、特定の部分
のDNAを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロ
キシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を
紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸
などの化学薬剤で処理する方法がある。
的変異法（Kramer,W. and frita,H.J., Methods in Enz
ymology,vol.154,P.350(1987)）リコンビナントPCR法
（PCRTechnology,Stockton Press(1989）、特定の部分
のDNAを化学合成する方法、または当該遺伝子をヒドロ
キシアミン処理する方法や当該遺伝子を保有する菌株を
紫外線照射処理、もしくはニトロソグアニジンや亜硝酸
などの化学薬剤で処理する方法がある。
【００３３】上記の方法を用い、リジン脱炭酸酵素の細
胞内での活性が上昇した組換え細胞の培養およびそれか
らのリジン脱炭酸酵素の調製法は、上記にリジン脱炭酸
酵素の取得について説明したようにして行うことができ
る。リジン脱炭酸酵素の細胞内での活性が上昇した組換
え細胞を用いることによって、容易かつ有利にリジン脱
炭酸酵素を調製することができる。
胞内での活性が上昇した組換え細胞の培養およびそれか
らのリジン脱炭酸酵素の調製法は、上記にリジン脱炭酸
酵素の取得について説明したようにして行うことができ
る。リジン脱炭酸酵素の細胞内での活性が上昇した組換
え細胞を用いることによって、容易かつ有利にリジン脱
炭酸酵素を調製することができる。
【００３４】
【実施例】（１）リジン脱炭酸酵素遺伝子のクローニン
グおよび発現ベクターの作製 リジン脱炭酸酵素を用いてリジンからカダベリンを産生
させるために、E.coliのリジン脱炭酸酵素遺伝子（cad
A）のクローニングを行った。
グおよび発現ベクターの作製 リジン脱炭酸酵素を用いてリジンからカダベリンを産生
させるために、E.coliのリジン脱炭酸酵素遺伝子（cad
A）のクローニングを行った。
【００３５】データベース(GenBank)に登録されている
リジン脱炭酸酵素遺伝子（cadA）（Accession No.M7641
1）の塩基配列を元に、PCR用プライマーを設計した。そ
の塩基配列を配列表１、配列表２に示した。PCR用プラ
イマーにはHindIII切断部位とXbaI切断部位がそれぞれ
付加されている。
リジン脱炭酸酵素遺伝子（cadA）（Accession No.M7641
1）の塩基配列を元に、PCR用プライマーを設計した。そ
の塩基配列を配列表１、配列表２に示した。PCR用プラ
イマーにはHindIII切断部位とXbaI切断部位がそれぞれ
付加されている。
【００３６】これらのプライマーを用い、Escherichia
coli K12株（ATCC10798）のゲノムDNAを鋳型としてPCR
を行い、2,182塩基対の増幅断片を得た。この増幅断片
をHindIIIおよびXbaIにより切断後、pUC19（宝酒造社
製）のHindIII／XbaI切断部位に導入し、リジン脱炭酸
酵素発現ベクターpLDC1を作製した（図）。またクロ
ーン化したcadA遺伝子は、pUC19が持つlacプロモーター
の支配下に発現され、リジン脱炭酸酵素に翻訳される。
coli K12株（ATCC10798）のゲノムDNAを鋳型としてPCR
を行い、2,182塩基対の増幅断片を得た。この増幅断片
をHindIIIおよびXbaIにより切断後、pUC19（宝酒造社
製）のHindIII／XbaI切断部位に導入し、リジン脱炭酸
酵素発現ベクターpLDC1を作製した（図）。またクロ
ーン化したcadA遺伝子は、pUC19が持つlacプロモーター
の支配下に発現され、リジン脱炭酸酵素に翻訳される。
【００３７】（２）宿主への発現ベクターの導入 （１）で作製した発現ベクターpLDC1をEscherichia col
i JM109株に導入した。導入後、組換え大腸菌の選択は
抗生物質であるアンピシリン耐性を指標に行い、形質転
換体を得た。
i JM109株に導入した。導入後、組換え大腸菌の選択は
抗生物質であるアンピシリン耐性を指標に行い、形質転
換体を得た。
【００３８】E.coli JM109株およびこの形質転換株の培
養は以下のように行った。まず、これらの菌株を各々Ｌ
Ｂ培地５ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振と
うして前培養を行った。
養は以下のように行った。まず、これらの菌株を各々Ｌ
Ｂ培地５ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で２４時間振と
うして前培養を行った。
【００３９】次に、ＬＢ培地５０ｍｌを５００ｍｌの三
角フラスコに入れ、予め１１５℃、１０分間蒸気滅菌し
た。この培地に前培養した上記菌株を植え継ぎ、振幅３
０cmで、１８０rpmの条件下で４時間培養した後に1mM I
PTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside)添加し更に２
０時間培養した。こうして得られた菌体を集め、超音波
破砕および遠心分離により無細胞抽出液を調製した。こ
れらのリジン脱炭酸酵素活性の測定を定法に従って行っ
た（左右田健次,味園春雄,生化学実験講座,vol.11上,P.
179-191(1976)）。その結果、親株であるJM109株に対し
て、形質転換株においてはリジン脱炭酸酵素活性は約４
倍に上昇していた。
角フラスコに入れ、予め１１５℃、１０分間蒸気滅菌し
た。この培地に前培養した上記菌株を植え継ぎ、振幅３
０cmで、１８０rpmの条件下で４時間培養した後に1mM I
PTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside)添加し更に２
０時間培養した。こうして得られた菌体を集め、超音波
破砕および遠心分離により無細胞抽出液を調製した。こ
れらのリジン脱炭酸酵素活性の測定を定法に従って行っ
た（左右田健次,味園春雄,生化学実験講座,vol.11上,P.
179-191(1976)）。その結果、親株であるJM109株に対し
て、形質転換株においてはリジン脱炭酸酵素活性は約４
倍に上昇していた。
【００４０】（３）リジン脱炭酸酵素によるリジンから
カダベリンの生成評価 リジンを基質とした場合、本来の主経路と考えられるリ
ジンモノオキシゲナーゼ、リジンオキシダーゼおよびリ
ジンムターゼによる転換が起こり得るので、この反応系
を遮断する目的で７５℃で５分間、形質転換株の無細胞
抽出液を加熱した。さらにこの無細胞抽出液を４０％飽
和および５５％飽和硫酸アンモニウムにより分画した。
こうして得られた粗精製リジン脱炭酸酵素溶液のリジン
モノオキシゲナーゼ活性およびリジンオキシダーゼ活性
を（Takeda,H. and Hayaishi,O.,J.Biol.Chem.,vol.24
1,P.2733-2736,81966)）、リジンムターゼ活性を（Chir
pich,T.P. and Barker,H.A.,Meth.Enzymol.,vol.17B,P.
215-222(1971)）を測定したところ、これらの酵素活性
は測定されなかった。
カダベリンの生成評価 リジンを基質とした場合、本来の主経路と考えられるリ
ジンモノオキシゲナーゼ、リジンオキシダーゼおよびリ
ジンムターゼによる転換が起こり得るので、この反応系
を遮断する目的で７５℃で５分間、形質転換株の無細胞
抽出液を加熱した。さらにこの無細胞抽出液を４０％飽
和および５５％飽和硫酸アンモニウムにより分画した。
こうして得られた粗精製リジン脱炭酸酵素溶液のリジン
モノオキシゲナーゼ活性およびリジンオキシダーゼ活性
を（Takeda,H. and Hayaishi,O.,J.Biol.Chem.,vol.24
1,P.2733-2736,81966)）、リジンムターゼ活性を（Chir
pich,T.P. and Barker,H.A.,Meth.Enzymol.,vol.17B,P.
215-222(1971)）を測定したところ、これらの酵素活性
は測定されなかった。
【００４１】よってリジンを基質とした場合の本来の主
経路と考えられるリジンモノオキシゲナーゼ活性、リジ
ンオキシダーゼ活性およびリジンムターゼ活性を取り除
くことができたため、リジンからカダベリンへの反応を
検討する上で、無細胞抽出液の熱処理および硫安分画は
有効な手段であると判断した。そこで以下の反応条件
で、無細胞抽出液および形質転換株で高発現された粗精
製リジン脱炭酸酵素溶液を用いて、リジンからカダベリ
ンの生成を検討した。
経路と考えられるリジンモノオキシゲナーゼ活性、リジ
ンオキシダーゼ活性およびリジンムターゼ活性を取り除
くことができたため、リジンからカダベリンへの反応を
検討する上で、無細胞抽出液の熱処理および硫安分画は
有効な手段であると判断した。そこで以下の反応条件
で、無細胞抽出液および形質転換株で高発現された粗精
製リジン脱炭酸酵素溶液を用いて、リジンからカダベリ
ンの生成を検討した。
【００４２】反応溶液5ml（50mM Sodium phosphate buf
fer, (pH5.7)、50mM Lysine monohydrochloride、0.1mM
Pyridoxal-5'-phosphate、無細胞抽出液もしくは粗精
製リジン脱炭酸酵素溶液）を、pHを5.5〜6.5に維持しな
がら、45℃で3時間反応させた。反応終了後、HPLCで反
応溶液中のカダベリン濃度を測定した。その結果を以下
に示した。
fer, (pH5.7)、50mM Lysine monohydrochloride、0.1mM
Pyridoxal-5'-phosphate、無細胞抽出液もしくは粗精
製リジン脱炭酸酵素溶液）を、pHを5.5〜6.5に維持しな
がら、45℃で3時間反応させた。反応終了後、HPLCで反
応溶液中のカダベリン濃度を測定した。その結果を以下
に示した。
【００４３】 この結果、50mMリジンを基質として30mMのカダベリンの
生成（転換収率60%）が認められた。
生成（転換収率60%）が認められた。
【００４４】
【発明の効果】本発明によれば、高効率、高収率で、エ
ネルギー消費が少なく、有機溶媒を必要としないカダベ
リンの製造方法が提供される。
ネルギー消費が少なく、有機溶媒を必要としないカダベ
リンの製造方法が提供される。
【００４５】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TORAY <120> The method to produce Cadaverine <130> 51E15820 <160> 2 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> PCR primer to obtain lysine decarboxylase from Escherichia coli <400> cctggagataagcttatgaacgttattgcaatattg <210> 2 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> PCR primer to obtain lysine decarboxylase from Escherichia coli <400> cttcccttgttctagataattattttttgctttct
【図１】 リジン脱炭酸酵素発現ベクターpLDC1のフィ
ジカルマップを示す図である。
ジカルマップを示す図である。
Claims (5)
- 【請求項１】 リジンに、リジン脱炭酸酵素の細胞内で
の活性が上昇した組換え細胞由来のリジン脱炭酸酵素を
作用させることを特徴とするカダベリンの製造方法。 - 【請求項２】 リジン脱炭酸酵素の細胞内での活性が上
昇した組換え細胞が、リジン脱炭酸酵素をコードする遺
伝子を組み込んだ細胞であることを特徴とする請求項１
記載のカダベリンの製造方法。 - 【請求項３】 リジン脱炭酸酵素の細胞内での活性が上
昇した組換え細胞が、微生物、動物、植物または昆虫の
いずれかであることを特徴とする請求項２に記載のカダ
ベリンの製造方法。 - 【請求項４】 リジン脱炭酸酵素が、バシラス・ハロド
ゥランス（Bacillushalodurans）、バシラス・サブチリ
ス（Bacillus subtilis）、エシェリシア・コリ(Escher
ichia coli)、セレノモナス・ルミナンチウム（Selenom
onas ruminantium）、ビブリオ・コレラ（Vibrio chole
rae）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio paraha
emolyticus）、ストレプトマイセス・コエリカーラ（St
reptomyces coelicolor）、ストレプトマイセス・ピロ
サス（Streptomyces pilosus）、エイケネラ・コロデン
ス（Eikenella corrodens）、イユバクテリウム・アシ
ダミノフィルム（Eubacterium acidaminophilum）、サ
ルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimuriu
m）、ハフニア・アルベイ(Hafnia alvei)、ナイセリア
・メニンギチデス（Neisseria meningitidis）、テルモ
プラズマ・アシドフィルム（Thermoplasma acidophilu
m）、ピロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi）また
はコリネバクテリウム・グルタミカス（Corynebacteriu
m glutamicum）のいずれか由来であることを特徴とする
請求項３に記載のカダベリンの製造方法。 - 【請求項５】 リジン脱炭酸酵素を作用させる際、反応
溶液のpHを4.5から8に維持しながら作用させることを特
徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のカダベリンの
製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001025489A JP2002223771A (ja) | 2001-02-01 | 2001-02-01 | カダベリンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001025489A JP2002223771A (ja) | 2001-02-01 | 2001-02-01 | カダベリンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002223771A true JP2002223771A (ja) | 2002-08-13 |
Family
ID=18890469
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001025489A Pending JP2002223771A (ja) | 2001-02-01 | 2001-02-01 | カダベリンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002223771A (ja) |
Cited By (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1482055A1 (en) * | 2003-05-26 | 2004-12-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing cadaverine dicarboxylate and its use for the production of nylon |
| JP2005006650A (ja) * | 2003-05-26 | 2005-01-13 | Ajinomoto Co Inc | カダベリン・ジカルボン酸塩の製造法 |
| WO2006123778A1 (ja) * | 2005-05-19 | 2006-11-23 | Ajinomoto Co., Inc. | カダベリン炭酸塩の製造法、及びそれを利用したポリアミドの製造法 |
| DE102007005072A1 (de) | 2007-02-01 | 2008-08-07 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cadaverin |
| JP2009207495A (ja) * | 2009-06-15 | 2009-09-17 | Toray Ind Inc | カダベリン・脂肪族ジカルボン酸塩 |
| WO2009119302A1 (ja) | 2008-03-26 | 2009-10-01 | 東レ株式会社 | ポリアミド５６フィラメント、およびそれを含有する繊維構造体、ならびにエアバッグ用基布 |
| EP2418198A1 (de) | 2006-08-01 | 2012-02-15 | Basf Se | Pentamethylen-1,5-diisocyanat |
| CN102424811A (zh) * | 2011-12-13 | 2012-04-25 | 天津科技大学 | 一种产尸胺工程菌 |
| WO2013129371A1 (ja) | 2012-02-29 | 2013-09-06 | 東レ株式会社 | 色調に優れたポリアミド樹脂組成物 |
| US8906653B2 (en) | 2008-01-23 | 2014-12-09 | Basf Se | Method for fermentatively producing 1,5-diaminopentane |
| CN106715384A (zh) * | 2014-09-19 | 2017-05-24 | 科思创德国股份有限公司 | 在气相中制备1,5‑戊二异氰酸酯的方法 |
| US10619148B2 (en) | 2015-02-03 | 2020-04-14 | Cathay Biotech Inc. | Immobilized cell and preparation method thereof |
-
2001
- 2001-02-01 JP JP2001025489A patent/JP2002223771A/ja active Pending
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US7189543B2 (en) | 2003-05-26 | 2007-03-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing cadaverine dicarboxylate |
| EP1482055A1 (en) * | 2003-05-26 | 2004-12-01 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing cadaverine dicarboxylate and its use for the production of nylon |
| WO2006123778A1 (ja) * | 2005-05-19 | 2006-11-23 | Ajinomoto Co., Inc. | カダベリン炭酸塩の製造法、及びそれを利用したポリアミドの製造法 |
| EP2418198A1 (de) | 2006-08-01 | 2012-02-15 | Basf Se | Pentamethylen-1,5-diisocyanat |
| DE102007005072A1 (de) | 2007-02-01 | 2008-08-07 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur fermentativen Herstellung von Cadaverin |
| US8906653B2 (en) | 2008-01-23 | 2014-12-09 | Basf Se | Method for fermentatively producing 1,5-diaminopentane |
| WO2009119302A1 (ja) | 2008-03-26 | 2009-10-01 | 東レ株式会社 | ポリアミド５６フィラメント、およびそれを含有する繊維構造体、ならびにエアバッグ用基布 |
| JP2009207495A (ja) * | 2009-06-15 | 2009-09-17 | Toray Ind Inc | カダベリン・脂肪族ジカルボン酸塩 |
| CN102424811A (zh) * | 2011-12-13 | 2012-04-25 | 天津科技大学 | 一种产尸胺工程菌 |
| WO2013129371A1 (ja) | 2012-02-29 | 2013-09-06 | 東レ株式会社 | 色調に優れたポリアミド樹脂組成物 |
| US9221950B2 (en) | 2012-02-29 | 2015-12-29 | Toray Industries, Inc. | Polyamide resin composition with excellent color tone |
| CN106715384A (zh) * | 2014-09-19 | 2017-05-24 | 科思创德国股份有限公司 | 在气相中制备1,5‑戊二异氰酸酯的方法 |
| CN106715384B (zh) * | 2014-09-19 | 2022-07-08 | 科思创德国股份有限公司 | 在气相中制备1,5-戊二异氰酸酯的方法 |
| US10619148B2 (en) | 2015-02-03 | 2020-04-14 | Cathay Biotech Inc. | Immobilized cell and preparation method thereof |
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