CN113046283A

CN113046283A - 一株通过还原tca途径生产己二酸的工程菌株及其构建方法

Info

Publication number: CN113046283A
Application number: CN202110226378.3A
Authority: CN
Inventors: 邓禹; 周胜虎; 郝婷婷; 毛银; 李国辉; 赵运英
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-03-01
Filing date: 2021-03-01
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2041-03-01
Also published as: CN113046283B

Abstract

本发明公开了一株通过还原TCA途径生产己二酸的工程菌株及其构建方法，属于代谢工程领域。本发明以还原TCA途径和逆己二酸降解途径为基础，通过过表达相关基因进行途径强化以及基因表达水平层面的优化，从而获得了一株具有较大潜力的己二酸生产菌株。本发明对于提高己二酸的产率具有强有力的理论依据，提高了碳源的利用率，减少了二氧化碳的排放，己二酸产量达到0.3g/L，所述方法为其他高附加值有机酸生产菌株的代谢重组提供了方法借鉴。

Description

一株通过还原TCA途径生产己二酸的工程菌株及其构建方法

技术领域

本发明涉及一株通过还原TCA途径生产己二酸的工程菌株及其构建方法，属于代谢工程领域。

背景技术

三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle,TCAcycle)是生物体内最活跃的代谢途径，是脂肪，糖类，氨基酸三大类营养素的代谢枢纽。有氧条件下，生物体主要通过正向的氧化TCA循环完成一系列的酶促反应，在厌氧条件下，逆向的还原TCA途径会被激活来合成细胞所需要的重要原料。相比于氧化TCA循环存在的两步会造成碳原子流失的脱羧步骤，还原TCA循环由于其关联的固碳步骤，碳原子的利用率得到了显著提高。还原TCA途径凭借其较高的理论产率已被大量应用于生产苹果酸，富马酸，琥珀酸等有机酸。

己二酸是一种重要的六碳二元羧酸，已被广泛地用于生产尼龙6,6等工业用品。通过化学法生产己二酸面临严峻的能源匮乏及环境污染等问题，因此寻求绿色的可持续发展的生物合成方法迫在眉睫。半生物法合成己二酸主要包括生物法合成己二酸前体物质以及前体物质通过化学催化转换为己二酸这两个步骤，然而化学催化过程贵金属铂的使用大大增加了生产成本，所以此方法很难适用于大规模的工业化。随着合成生物学及代谢工程的发展，全生物法合成己二酸的策略被大量地报道与应用，例如逆β氧化途径，脂肪酸的ω-氧化，α-酮酸途径等，然而，这些途径大都由于产率低很难得到进一步的放大生产。值得关注的是，目前，通过来源于Thermobifidafusca的逆己二酸降解途径全生物合成己二酸实现了大肠杆菌中己二酸的最高报道产量。

逆己二酸降解途径合成己二酸的两个主要前体物质为琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A，其中，琥珀酰辅酶A作为TCA循环的代谢中间产物既可以由氧化TCA途径产生，也可以由还原TCA途径产生。当琥珀酰辅酶A通过氧化TCA途径产生时，由于异柠檬酸转化为α-酮戊二酸和α-酮戊二酸转化为琥珀酰辅酶A均为脱羧步骤，碳原子以二氧化碳形式的排放导致当以葡萄糖为底物进行生物合成己二酸时，己二酸的理论产率仅为54.07％。所以，虽然已有的报道己二酸的实际产率已经达到了理论产率的93％，但较低的理论产率限制了己二酸产量的进一步提高。因此，依赖于生物代谢网络，开发一种致力于提高碳源利用率的工程代谢途径，对于获得己二酸高产菌株具有重要的现实意义。

发明内容

技术问题：

目前通过氧化TCA途径偶联逆己二酸降解途径生产己二酸的理论产率最高仅为54.07％，限制了己二酸产量的进一步提高；合成代谢途径碳源不能被完全利用。

技术方案：

本发明第一个目的是提供一种通过还原TCA途径偶联逆己二酸降解途径生产己二酸的工程菌株。

在一种实施方式中，以大肠杆菌为出发菌株，过表达编码琥珀酰辅酶A合成酶α亚基的基因sucD，富马酸还原酶的基因frdABCD。

在一种实施方式中，所述工程菌株还过表达了编码丙酮酸羧化酶的基因pyc。

在一种实施方式中，所述基因sucD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因frdABCD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述基因pyc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coli Mad1415。

在一种实施方式中，所述工程菌株是以pACM4G质粒为载体。

在一种实施方式中，所述pACM4G质粒是以pACM4为模板，进行全质粒PCR，将CmR基因替换为GmR基因。

在一种实施方式中，所述pACM4G质粒上还含有编码如SEQ ID NO.6所示启动子P_ffs的核苷酸序列、编码核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示所的启动子P_fnrF8、编码如SEQ ID NO.7所示启动子P_c的核苷酸序列、编码如SEQ ID NO.5所示FNR基因的核苷酸序列和编码如SEQID NO.9所示抗性基因GmR的核苷酸序列；所述P_ffs调控FNR的表达；所述P_fnrF8上整合FNR基因结合位点的序列，并调控下游目的基因的表达；所述启动子P_ffs和启动子P_fnrF8转录方向相反。

在一种实施方式中，所述过表达的基因sucD和frdABCD在pACM4G质粒的Nde I/XhoI位点以单顺反子结构进行组合串联表达。

在一种实施方式中，所述过表达的基因pyc、sucD和frdABCD在pACM4G质粒的NdeI/Xho I位点以单顺反子结构进行组合串联表达。

本发明的第二目的是提供一种生产己二酸的方法，是将所述工程菌株进行发酵。

在一种实施方式中，所述具体步骤如下：将所述工程菌过夜活化得到种子液，以2％接种量接种于含SOB培养基的橡胶塞瓶中，添加葡萄糖，前期以透气封口膜封口发酵，待葡萄糖耗尽，以橡胶塞封口进行厌氧发酵，并补充葡萄糖。

在一种实施方式中，所述葡萄糖的添加量为3～5g/L。

在一种实施方式中，所述发酵的培养条件为35～39℃，230～270rpm。

本发明还保护所述工程菌株在己二酸合成中的应用。

有益效果：本发明获得了一种通过还原TCA途径偶联逆己二酸降解途径生产己二酸的工程菌株Mad1415-F8NAspf，其关键在于重新布线了一条合成己二酸前体物质琥珀酰辅酶A的还原TCA途径，在基因组合过表达强化及操纵子结构优化策略下，己二酸的生物合成有效可行且效果显著。此菌株是以首次建立的还原TCA途径偶联逆己二酸降解途径进行代谢，从而完成己二酸的生物合成。与现有技术相比，本菌株代谢的最大的优势是避开了脱羧步骤，引入了固碳步骤，实现了无碳流失，使碳源得到了最大化有效利用。因此本发明使得以葡萄糖为底物生物合成己二酸的理论产率相比提高了50％，此外，此菌株代谢途径的重新布线也为其他高附加值有机酸的生物合成提供了一定的借鉴。

附图说明

图1还原TCA途径偶联逆己二酸降解途径合成己二酸的理论分析及布线设计。

图2不同过表达基因组合对于己二酸生物合成的影响。

图3不同操纵子结构对于己二酸生物合成的影响。

图4单顺反子结构不同基因组合质粒构建示意图。

图5不同操纵子结构组合质粒构建示意图。A：假操纵子结构sucD-pyc-frdABCD基因组合质粒构建示意图；B:经典操纵子结构sucD-pyc-frdABCD基因组合质粒构建示意图。

具体实施方式

限制性内切酶和DNA聚合酶分别购自赛默飞和Takara公司。紫外分光光度计(UV-1800,321AOE instruments,Shanghai)用于检测细胞密度，高效液相色谱(HPLC；Agilent，USA)用于检测发酵液中代谢产物含量。

大肠杆菌K12 MG1655重组菌株Mad1415用于蛋白质表达和己二酸合成：见文章：doi:10.1016/j.jbiotec.2020.03.011。

Corynebacterium crenatum用于基因pyc扩增：见文章：doi:10.3969/j.issn.1673-1689.2019.03.012。

质粒pACM4：见文章：doi:10.1021/sb300016b。

质粒pACM4G的构建：以质粒pACM4为模板，进行全质粒PCR，将CmR基因替换为GmR基因。

己二酸双相发酵：LB培养基中35-39℃，220-270rpm过夜活化的实验菌株种子液，2％(v/v)接种量接种至含有200ml SOB培养基的250ml丁基橡胶塞血清瓶中，初始葡萄糖添加量为4g/L，前期使用透气封口膜进行好氧条件培养，此阶段用于富集细胞收集能量，待葡萄糖耗尽后(约12h)血清瓶加塞转为厌氧进行发酵，同时补加4g/L葡萄糖。37℃，250rpm培养。按要求分别加入氨苄青霉素(100μg/mL)、庆大霉素(50μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)。在培养基中加入等摩尔有机酸盐进行特定目的发酵。

下述实施例中所涉及的所有菌体活化都利用LB培养基，培养条件为37℃、250rpm。己二酸发酵利用SOB培养基，发酵条件为37℃、250rpm。

实施例1菌株构建

(1)氧气响应型生物传感器的构建

传感器质粒主要由3个部分组成：1)富马酸硝酸盐还原蛋白FNR基因及其上游的的启动子P_ffs；2)厌氧诱导型启动子P_fnrF8及其下游诱导表达的目的基因；3)GmR抗性基因及其上游启动子P_c。

厌氧诱导型启动子P_fnrF8位于质粒pACM4G酶切位点Avr II和Xba I之间；启动子P_fnrF8诱导下游目的基因的表达；启动子P_ffs位于质粒pACM4G酶切位点Avr II上游，诱导下游FNR基因的表达；GmR抗性基因位于FNR基因的下游，由上游P_c启动子诱导表达。

以大肠杆菌K12 MG1655基因组为模板，使用引物FNR-F/FNR-R进行PCR扩增出FNR片段；以质粒pGRT-ffs为模板，使用引物P_ffs-F/P_ffs-R进行PCR扩增出启动子P_ffs用于启动FNR蛋白的转录；通过合成互补单链退火得到厌氧诱导型启动子P_fnrF8；以pACM4G质粒为骨架，通过多片段融合PCR，无缝克隆组装得到氧气响应型生物传感器质粒pACM4G-F8。

(2)过表达质粒的构建

从大肠杆菌K12 MG1655的基因组DNA中分别扩增出sucD、frdABCD和mdh基因，所用引物见表1；从Corynebacterium crenatum的基因组DNA中扩增出pyc基因，分别将其克隆至步骤(1)中构建获得的重组质粒pACM4G-F8的Nde I/Xho I位点。以含有sucD基因的重组质粒pACM4G-F8s质粒为基础，根据质粒骨架的ePathBrick载体的原理迭代基因的表达，当NheI和Avr II两个同尾酶分别与HindIII酶切作用，得到的两个酶切产物进行交互连接，构建具有单顺反子结构的不同基因组合的重组质粒，分别是pACM4G-F8NAsp、pACM4G-F8NAsm、pACM4G-F8NAsf、pACM4G-F8NAspf、pACM4G-F8NAsmf和pACM4G-F8NAsmfp，质粒构建方法及示意图可见图4所示。当Spe I和Avr II两个同尾酶分别与HindIII酶切作用，得到的两个酶切产物进行交互连接，构建具有假操纵子结构的不同基因组合的重组质粒pACM4G-F8SAspf，质粒构建方法及示意图如图5A所示。当Spe I和Xba I两个同尾酶分别与HindIII酶切作用，得到的两个酶切产物进行交互连接，构建具有经典操纵子结构的不同基因组合的重组质粒pACM4G-F8SXspf，质粒构建方法及示意图如图5B所示。

表1引物序列表

名称	序列(5’-3’)
		FNR-F	TCAGGCAACGTTACGCGTATG
FNR-R	ATGATCCCGGAAAAGCGAATTATACG
		P<sub>ffs</sub>-F	ATTGAGAGCGTTGAGAACCAACG
P<sub>ffs</sub>-R	ATAGCCTTCGGGAATAGCGGC
		sucD-F	GGGAATTCCATATGATGTCCATTTTAATCGATAAAAACACCAAGG
sucD-R	CCGCTCGAGTTATTTCAGAACAGTTTTCAGTGCTTCACCG
		frdABCD-F	GGGAATTCCATATGGTGCAAACCTTTCAAGCCGATCT
frdABCD-R	CCGCTCGAGTTAGATTGTAACGACACCAATCAGCGT
		mdh-F	GGGAATTCCATATGATGAAAGTCGCAGTCCTCGG
mdh-R	CCGCTCGAGTTACTTATTAACGAACTCTTCGCCCAGG
		pyc-F	GGGAATTCCATATGGTGTCGACTCACACATCTTCAACG
pyc-R	CCGCTCGAGTTAGGAAACGACGACGATCAAGTCGC

实施例2以葡萄糖全生物合成己二酸的理论分析及设计

以葡萄糖为底物，经糖酵解及还原TCA途径，进而通过逆己二酸降解途径全生物合成己二酸，其中涉及到丙酮酸至草酰乙酸的固碳步骤，整个代谢反应计量式分析如下表2，可见，此途径没有任何碳流失，1mol葡萄糖经代谢可转化为1mol己二酸，即己二酸理论产率为0.81g/g葡萄糖。与之前通过氧化TCA途径获得己二酸合成前体进而合成己二酸的研究相比，己二酸的理论产率提高了50％(81.11％vs 54.07％)。整个代谢途径的布线设计见图1。

表2以葡萄糖为底物合成己二酸的代谢途径化学计量分析

实施例3不同过表达基因组合对己二酸生物合成的影响

将实施例1构建得到的质粒pACM4G-F8s、pACM4G-F8NAsp、pACM4G-F8NAsm、pACM4G-F8NAsf、pACM4G-F8NAspf、pACM4G-F8NAsmf和pACM4G-F8NAsmfp分别导入大肠杆菌K12MG1655重组菌株Mad1415，获得重组菌株Mad1415-F8s、Mad1415-F8NAsp、Mad1415-F8NAsm、Mad1415-F8NAsf、Mad1415-F8NAspf、Mad1415-F8NAsmf和Mad1415-F8NAsmfp。以过表达了sucD的Mad1415-F8s为对照，以分别过表达编码丙酮酸羧化酶的基因pyc，编码苹果酸脱氢酶的基因mdh，编码富马酸还原酶的基因frdABCD的对应菌株Mad1415-F8NAsp，Mad1415-F8NAsm，Mad1415-F8NAsf进行双相摇瓶发酵，以己二酸滴度作为评价指标。其中，基因sucD和基因frdABCD的过表达菌株Mad1415-F8NAsf己二酸产量显著提高，滴度为0.27g/L，是Mad1415-F8s的17.50倍(图2)。在Mad1415-F8NAsf的基础上进一步以单顺反子结构叠加基因的表达，pyc的过表达使得菌株Mad1415-F8NAspf的己二酸产量进一步提高，滴度为0.30g/L，是sucD和frdABCD基因过表达菌株Mad1415-F8NAsf的1.13倍(图2)。然而，mdh在Mad1415-F8NAsf中的进一步过表达促进了细胞的生长，但不利于己二酸的进一步提高(图2)。

对比例1

基于实施例3的基础上，得到基因sucD-pyc-frdABCD组合为有利于己二酸生产的最佳基因组合。当多个基因进行串联表达时，不同操纵子结构对于基因的共表达效果有不同的影响，已知的操纵子结构有以下三种，第一种为经典的操纵子结构，即所有的基因共同由一个启动子和一个终止子进行调控，但每个基因独有一个核糖体结合位点；第二种结构为假操纵子结构，即每个基因分别由独有的启动子进行调控，但所有基因共用一个终止子；第三种结构为单顺反子结构，即每个基因分别由独有的启动子和独有的终止子进行调控(图5)。将实施例1获得的具有这三种操纵子结构的sucD-pyc-frdABCD组合重组质粒分别导入肠杆菌K12MG1655重组菌株Mad1415，并通过双相摇瓶发酵，以己二酸的积累量作为评价标准。结果显示，单顺反子结构最有利于己二酸的生物合成，经典操纵子结构及假操纵子结构下菌株的生长具有一定的优势，但己二酸的积累没有得到有效的提高，仅是菌株Mad1415-F8NAspf产己二酸产量的68.2％、82.4％(图3)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株通过还原TCA途径生产己二酸的工程菌株及其构建方法

<130> BAA210164A

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtccattt taatcgataa aaacaccaag gttatctgcc agggctttac cggtagccag 60

gggactttcc actcagaaca ggccattgca tacggcacta aaatggttgg cggcgtaacc 120

ccaggtaaag gcggcaccac ccacctcggc ctgccggtgt tcaacaccgt gcgtgaagcc 180

gttgctgcca ctggcgctac cgcttctgtt atctacgtac cagcaccgtt ctgcaaagac 240

tccattctgg aagccatcga cgcaggcatc aaactgatta tcaccatcac tgaaggcatc 300

ccgacgctgg atatgctgac cgtgaaagtg aagctggatg aagcaggcgt tcgtatgatc 360

ggcccgaact gcccaggcgt tatcactccg ggtgaatgca aaatcggtat ccagcctggt 420

cacattcaca aaccgggtaa agtgggtatc gtttcccgtt ccggtacact gacctatgaa 480

gcggttaaac agaccacgga ttacggtttc ggtcagtcga cctgtgtcgg tatcggcggt 540

gacccgatcc cgggctctaa ctttatcgac attctcgaaa tgttcgaaaa agatccgcag 600

accgaagcga tcgtgatgat cggtgagatc ggcggtagcg ctgaagaaga agcagctgcg 660

tacatcaaag agcacgttac caagccagtt gtgggttaca tcgctggtgt gactgcgccg 720

aaaggcaaac gtatgggcca cgcgggtgcc atcattgccg gtgggaaagg gactgcggat 780

gagaaattcg ctgctctgga agccgcaggc gtgaaaaccg ttcgcagcct ggcggatatc 840

ggtgaagcac tgaaaactgt tctgaaataa 870

<210> 2

<211> 3312

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtgcaaacct ttcaagccga tcttgccatt gtaggcgccg gtggcgcggg attacgtgct 60

gcaattgctg ccgcgcaggc aaatccgaat gcaaaaatcg cactaatctc aaaagtatac 120

ccgatgcgta gccataccgt tgctgcagaa gggggctccg ccgctgtcgc gcaggatcat 180

gacagcttcg aatatcactt tcacgataca gtagcgggtg gcgactggtt gtgtgagcag 240

gatgtcgtgg attatttcgt ccaccactgc ccaaccgaaa tgacccaact ggaactgtgg 300

ggatgcccat ggagccgtcg cccggatggt agcgtcaacg tacgtcgctt cggcggcatg 360

aaaatcgagc gcacctggtt cgccgccgat aagaccggct tccatatgct gcacacgctg 420

ttccagacct ctctgcaatt cccgcagatc cagcgttttg acgaacattt cgtgctggat 480

attctggttg atgatggtca tgttcgcggc ctggtagcaa tgaacatgat ggaaggcacg 540

ctggtgcaga tccgtgctaa cgcggtcgtt atggctactg gcggtgcggg tcgcgtttat 600

cgttacaaca ccaacggcgg catcgttacc ggtgacggta tgggtatggc gctaagccac 660

ggcgttccgc tgcgtgacat ggaattcgtt cagtatcacc caaccggtct gccaggttcc 720

ggtatcctga tgaccgaagg ttgccgcggt gaaggcggta ttctggtcaa caaaaatggc 780

taccgttatc tgcaagatta cggcatgggc ccggaaactc cgctgggcga gccgaaaaac 840

aaatatatgg aactgggtcc acgcgacaaa gtctctcagg ccttctggca cgaatggcgt 900

aaaggcaaca ccatctccac gccgcgtggc gatgtggttt atctcgactt gcgtcacctc 960

ggcgagaaaa aactgcatga acgtctgccg ttcatctgcg aactggcgaa agcgtacgtt 1020

ggcgtcgatc cggttaaaga accgattccg gtacgtccga ccgcacacta caccatgggc 1080

ggtatcgaaa ccgatcagaa ctgtgaaacc cgcattaaag gtctgttcgc cgtgggtgaa 1140

tgttcctctg ttggtctgca cggtgcaaac cgtctgggtt ctaactccct ggcggaactg 1200

gtggtcttcg gccgtctggc cggtgaacaa gcgacagagc gtgcagcaac tgccggtaat 1260

ggcaacgaag cggcaattga agcgcaggca gctggcgttg aacaacgtct gaaagatctg 1320

gttaaccagg atggcggcga aaactgggcg aagatccgcg acgaaatggg cctggctatg 1380

gaagaaggct gcggtatcta ccgtacgccg gaactgatgc agaaaaccat cgacaagctg 1440

gcagagctgc aggaacgctt caagcgcgtg cgcatcaccg acacttccag cgtgttcaac 1500

accgacctgc tctacaccat tgaactgggc cacggtctga acgttgctga atgtatggcg 1560

cactccgcaa tggcacgtaa agagtcccgc ggcgcgcacc agcgtctgga cgaaggttgc 1620

accgagcgtg acgacgtcaa cttcctcaaa cacaccctcg ccttccgcga tgctgatggc 1680

acgactcgcc tggagtacag cgacgtgaag attactacgc tgccgccagc taaacgcgtt 1740

tacggtggcg aagcggatgc agccgataag gcggaagcag ccaataagaa ggagaaggcg 1800

aatggctgag atgaaaaacc tgaaaattga ggtggtgcgc tataacccgg aagtcgatac 1860

cgcaccgcat agcgcattct atgaagtgcc ttatgacgca actacctcat tactggatgc 1920

gctgggctac atcaaagaca acctggcacc ggacctgagc taccgctggt cctgccgtat 1980

ggcgatttgt ggttcctgcg gcatgatggt taacaacgtg ccaaaactgg catgtaaaac 2040

cttcctgcgt gattacaccg acggtatgaa ggttgaagcg ttagctaact tcccgattga 2100

acgcgatctg gtggtcgata tgacccactt catcgaaagt ctggaagcga tcaaaccgta 2160

catcatcggc aactcccgca ccgcggatca gggtactaac atccagaccc cggcgcagat 2220

ggcgaagtat caccagttct ccggttgcat caactgtggt ttgtgctacg ccgcgtgccc 2280

gcagtttggc ctgaacccag agttcatcgg tccggctgcc attacgctgg cgcatcgtta 2340

taacgaagat agccgcgacc acggtaagaa ggagcgtatg gcgcagttga acagccagaa 2400

cggcgtatgg agctgtactt tcgtgggcta ctgctccgaa gtctgcccga aacacgtcga 2460

tccggctgcg gccattcagc agggcaaagt agaaagttcg aaagactttc ttatcgcgac 2520

cctgaaacca cgctaaggag tgcaacatga cgactaaacg taaaccgtat gtacggccaa 2580

tgacgtccac ctggtggaaa aaattgccgt tttatcgctt ttacatgctg cgcgaaggca 2640

cggcggttcc ggctgtgtgg ttcagcattg aactgatttt cgggctgttt gccctgaaaa 2700

atggcccgga agcctgggcg ggattcgtcg actttttaca aaacccggtt atcgtgatca 2760

ttaacctgat cactctggcg gcagctctgc tgcacaccaa aacctggttt gaactggcac 2820

cgaaagcggc caatatcatt gtaaaagacg aaaaaatggg accagagcca attatcaaaa 2880

gtctctgggc ggtaactgtg gttgccacca tcgtaatcct gtttgttgcc ctgtactggt 2940

aaggagcctg agatgattaa tccaaatcca aagcgttctg acgaaccggt attctggggc 3000

ctcttcgggg ccggtggtat gtggagcgcc atcattgcgc cggtgatgat cctgctggtg 3060

ggtattctgc tgccactggg gttgtttccg ggtgatgcgc tgagctacga gcgcgttctg 3120

gcgttcgcgc agagcttcat tggtcgcgta ttcctgttcc tgatgatcgt tctgccgctg 3180

tggtgtggtt tacaccgtat gcaccacgcg atgcacgatc tgaaaatcca cgtacctgcg 3240

ggcaaatggg ttttctacgg tctggctgct atcctgacag ttgtcacgct gattggtgtc 3300

gttacaatct aa 3312

<210> 3

<211> 3423

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60

ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120

atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180

attggtactg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240

gctaaaaaag ttaaagcaga tgctatttac ccgggatatg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300

cagcttgccc gcgagtgcgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360

cttgatctca ccggtgataa gtctcgtgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420

gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaca tcgttaaaag cgctgaaggc 480

cagacttacc ccatctttgt aaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgcttt 540

gtttcttcac ctgatgagct ccgcaaattg gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600

gcattcggcg acggttcggt atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccccca gcacattgaa 660

gtgcagatcc ttggcgatcg cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca 720

ctgcagcgtc gtcaccaaaa agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa 780

ctgcgtgatc gcatttgtgc ggatgcagca aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc 840

gcgggaaccg tggaattctt ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac 900

ccacgtatcc aggttgagca caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag 960

gcgcagatgc gcttggctgc tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag 1020

atcaagaccc acggtgcagc actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc 1080

ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt 1140

cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg 1200

aaaatgacct gccgtggttc cgattttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg 1260

gctgagttca ccgtgtctgg tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgt 1320

gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattta tcggcgatca cccgcacctc 1380

ctccaggctc cacctgcgga tgatgagcag ggacgcatcc tggattactt ggcagatgtc 1440

accgtgaaca agcctcatgg tgtgcgtcca aaggatgttg cagcaccaat cgataagctg 1500

cccaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttgga 1560

ccagcagcgt ttgcccgcga tctccgtgag caggacgcac tggcagttac tgataccacc 1620

ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct 1680

gcggcagagg ccgtcgcaaa gctgactcct gagcttctgt ccgtggaggc ctggggcggt 1740

gcgacctacg atgtggcgat gcgtttcctc tttgaggatc cgtgggacag gctcgacgag 1800

ctgcgcgagg cgatgccgaa tgtgaacatt cagatgctgc ttcgcggccg caacaccgtg 1860

ggatacaccc catacccaga ctccgtctgt cgcgcgtttg ttaaggaagc tgccacctcc 1920

ggcgtggaca tcttccgcat cttcgacgcg cttaacgacg tctcccagat gcgtccagca 1980

atcgacgcag tcctggagac caacaccgcg gtcgctgaag tggctatggc ttattctggt 2040

ggtctttccg atccgaatga aaagctctac accctggatt actacctgaa gatggcagag 2100

gagatcgtca agtctggcgc tcacattctg gctattaagg atatggctgg tctgcttcgc 2160

ccagctgcag ccaccaagct ggtcaccgca ctgcgccgtg aatttgatct gccagtgcac 2220

gtgcacaccc acgacactgc gggtggccag ctggcaacct actttgctgc agctcaagct 2280

ggtgcagatg ctgttgacgg tgcttccgca ccactgtctg gcaccacctc ccagccatcc 2340

ctgtctgcca ttgttgctgc attcgcgcac acccgtcgcg ataccggttt gagcctcgag 2400

gctgtttctg acctcgagcc atactgggaa gcagtgcgcg gactgtacct gccatttgag 2460

tctggaaccc caggcccaac cggtcgcgtc taccgccacg aaatcccagg cggacagttg 2520

tccaacctgc gtgcacaggc caccgcactg ggccttgcgg atcgtttcga actcatcgaa 2580

gacaactacg cggcagttaa tgagatgctg ggacgcccaa ccaaggtcac cccatcctcc 2640

aaggttgttg gcgacctcgc actccacctc gttggtgcgg gtgtggatcc agcagacttt 2700

gctgctgatc cacaaaagta cgacatccca gactctgtca tcgcgttcct gcgcggcgag 2760

cttggtaacc ctccaggtgg ctggccagag ccactgcgca cccgcgcact ggaaggccgc 2820

tccgaaggca aagcaccttt gacggaagtt cctgaggaag agcaggcgca cctcgacgct 2880

gatgattcca aggaacgtcg caacagcctc aaccgcctgc tgttcccgaa gccaactgaa 2940

gagttcctcg agcaccgtcg ccgcttcggc aacacctctg cgctggatga tcgtgaattc 3000

ttctacggcc tggtcgaagg ccgcgagact ttgatccgcc tgccagatgt gcgcacccca 3060

ctgcttgttc gcctggatgc gatctctgag ccagacgata agggtatgcg caatgttgtg 3120

gctaacgtca acggccagat ccgcccaatg cgtgtgcgtg accgctccgt tgagtctgtc 3180

accgcaaccg cagaaaaggc agattcctcc aacaagggcc atgttgctgc accattcgct 3240

ggtgttgtca ctgtgactgt tgctgaaggt gatgaggtca aggctggaga tgcagtcgca 3300

atcatcgagg ctatgaagat ggaagcaaca atcactgctt ctgttgacgg caaaatcgat 3360

cgcgttgtgg ttcctgctgc aacgaaggtg gaaggtggcg acttgatcgt cgtcgtttcc 3420

taa 3423

<210> 4

<211> 939

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaaagtcg cagtcctcgg cgctgctggc ggtattggcc aggcgcttgc actactgtta 60

aaaacccaac tgccttcagg ttcagaactc tctctgtatg atatcgctcc agtgactccc 120

ggtgtggctg tcgatctgag ccatatccct actgctgtga aaatcaaagg tttttctggt 180

gaagatgcga ctccggcgct ggaaggcgca gatgtcgttc ttatctctgc aggcgtagcg 240

cgtaaaccgg gtatggatcg ttccgacctg tttaacgtta acgccggcat cgtgaaaaac 300

ctggtacagc aagttgcgaa aacctgcccg aaagcgtgca ttggtattat cactaacccg 360

gttaacacca cagttgcaat tgctgctgaa gtgctgaaaa aagccggtgt ttatgacaaa 420

aacaaactgt tcggcgttac cacgctggat atcattcgtt ccaacacctt tgttgcggaa 480

ctgaaaggca aacagccagg cgaagttgaa gtgccggtta ttggcggtca ctctggtgtt 540

accattctgc cgctgctgtc acaggttcct ggcgttagtt ttaccgagca ggaagtggct 600

gatctgacca aacgcatcca gaacgcgggt actgaagtgg ttgaagcgaa ggccggtggc 660

gggtctgcaa ccctgtctat gggccaggca gctgcacgtt ttggtctgtc tctggttcgt 720

gcactgcagg gcgaacaagg cgttgtcgaa tgtgcctacg ttgaaggcga cggtcagtac 780

gcccgtttct tctctcaacc gctgctgctg ggtaaaaacg gcgtggaaga gcgtaaatct 840

atcggtaccc tgagcgcatt tgaacagaac gcgctggaag gtatgctgga tacgctgaag 900

aaagatatcg ccctgggcga agagttcgtt aataagtaa 939

<210> 5

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgatcccgg aaaagcgaat tatacggcgc attcagtctg gcggttgtgc tatccattgc 60

caggattgca gcatcagcca gctttgcatc ccgttcacac tcaacgaaca tgagcttgat 120

cagcttgata atatcattga gcggaagaag cctattcaga aaggccagac gctgtttaag 180

gctggtgatg aacttaaatc gctttatgcc atccgctccg gtacgattaa aagttatacc 240

atcactgagc aaggcgacga gcaaatcact ggtttccatt tagcaggcga cctggtggga 300

tttgacgcca tcggcagcgg ccatcacccg agcttcgcgc aggcgctgga aacctcgatg 360

gtatgtgaaa tcccgttcga aacgctggac gatttgtccg gtaaaatgcc gaatctgcgt 420

cagcagatga tgcgtctgat gagcggtgaa atcaaaggcg atcaggacat gatcctgctg 480

ttgtcgaaga aaaatgccga ggaacgtctg gctgcattca tctacaacct gtcccgtcgt 540

tttgcccaac gcggcttctc ccctcgtgaa ttccgcctga cgatgactcg tggcgatatc 600

ggtaactatc tgggcctgac ggtagaaacc atcagccgtc tgctgggtcg cttccagaaa 660

agcggcatgc tggcagtcaa aggtaaatac atcaccatcg aaaataacga tgcgctggcc 720

cagcttgctg gtcatacgcg taacgttgcc tga 753

<210> 6

<211> 220

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atagccttcg ggaatagcgg cgacgatttg ccagacgcgt tggggaaatg aatcttcttt 60

ttccatcttt tcttcctgag gtaatttttc agcataatct ggaaaaacgc ccgagtgaag 120

tcgcattgcg caagaaacca gcatctggca cgcgatgggt tgcaattagc cggggcagca 180

gtgataatgc gcctgcgcgt tggttctcaa cgctctcaat 220

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttgacataag cctgttcggt tcgtaaact 29

<210> 8

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tttgatttac atcaattacg gctaggtcag tcctcggtat tatgctagtt a 51

<210> 9

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atgttacgca gcagcaacga tgttacgcag cagggcagtc gccctaaaac aaagttaggt 60

ggctcaagta tgggcatcat tcgcacatgt aggctcggcc ctgaccaagt caaatccatg 120

cgggctgctc ttgatctttt cggtcgtgag ttcggagacg tagccaccta ctcccaacat 180

cagccggact ccgattacct cgggaacttg ctccgtagta agacattcat cgcgcttgct 240

gccttcgacc aagaagcggt tgttggcgct ctcgcggctt acgttctgcc caggtttgag 300

cagccgcgta gtgagatcta tatctatgat ctcgcagtct ccggcgagca ccggaggcag 360

ggcattgcca ccgcgctcat caatctcctc aagcatgagg ccaacgcgct tggtgcttat 420

gtgatctacg tgcaagcaga ttacggtgac gatcccgcag tggctctcta tacaaagttg 480

ggcatacggg aagaagtgat gcactttgat atcgacccaa gtaccgccac ctaa 534

Claims

1.一株产己二酸的工程菌株，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株，过表达编码琥珀酰辅酶A合成酶α亚基的基因sucD，编码富马酸还原酶的基因frdABCD。

2.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，还过表达了编码丙酮酸羧化酶的基因pyc。

3.根据权利要求2所述的菌株，其特征在于，所述基因sucD的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述基因frdABCD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述基因pyc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述大肠杆菌为E.coli Mad1415。

5.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于，所述工程菌株是以pACM4G质粒为载体；所述pACM4G载体是以质粒pACM4为模板，将氯霉素抗性基因CmR替换为庆大霉素抗性基因GmR。

6.根据权利要求5所述的菌株，其特征在于，所述pACM4G质粒上还含有编码如SEQ IDNO.6所示启动子P_ffs的核苷酸序列、编码核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示所的启动子P_fnrF8、编码如SEQ ID NO.7所示启动子P_c的核苷酸序列、编码如SEQ ID NO.5所示FNR基因的核苷酸序列。

7.根据权利要求1～6任一所述的菌株，其特征在于，所述过表达的基因sucD、frdABCD在pACM4G质粒的Nde I/Xho I位点以单顺反子结构进行组合串联表达；

或所述过表达的基因sucD、frdABCD和pyc在pACM4G质粒的Nde I/Xho I位点以单顺反子结构进行组合串联表达。

8.一种生产己二酸的方法，其特征在于，应用权利要求1-7任一所述的工程菌株进行发酵。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，是将权利要求1-7任一所述的工程菌进行发酵，初始添加葡萄糖，前期好氧发酵，待葡萄糖耗尽，进行厌氧发酵，并补充葡萄糖。

10.权利要求1～7任一所述工程菌株或权利要求8或9所述方法在己二酸合成中的应用。