CN115141856B - 一种重组梭菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种重组梭菌及其构建方法与应用。本发明首次公开了通过提高梭菌中二级醇脱氢酶的含量和/或活性，从而提高梭菌的碳源利用率、促进梭菌中丁醇的生成、促进梭菌中乙醇的生成、将丙酮转化为异丙醇，从而降低梭菌中丙酮的含量以及促进梭菌中异丙醇的生成，提供了一种通过改造菌株(提高梭菌中二级醇脱氢酶的含量和/或活性)消除副产物、生产混合醇燃料的方法，该方法不但将发酵产物中混合醇在总溶剂中的比例显著提高，同时也能有效降低分离纯化的成本，提升运输储存与底物利用的效率。

Description

一种重组梭菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组梭菌及其构建方法与应用。

背景技术

产溶剂梭菌的ABE发酵过程是一种传统的微生物发酵丁醇的方法，但因其原子经济性差 (糖转化为醇的转化率低、副产品多)、溶剂产量和产率低，以及产品回收纯化过程复杂且能耗高等使其工业化过程缺乏市场竞争力。其中，丙酮的产量及占比高，有时可达溶剂总质量的30％，因丙酮的能量密度低、具有高腐蚀性、闪点低、运输和高储存风险而被认为是最不受欢迎的ABE发酵主要副产物。尽管有部分研究尝试通过敲除丙酮合成过程的关键酶——乙酰乙酸脱羧酶基因(adc)来抑制其产生过程，但实验结果显示抑制adc基因的表达虽然能减少部分丙酮的生成，但该过程容易引起乙酸、丁酸或乙醇的累积，进一步导致丁醇的产量也有所下降。

异丙醇作为另一种简单仲醇，其能量密度略高于丙酮，可以部分替代汽油，从而增加燃料的辛烷值。由于混合醇燃料的发明和广泛应用，通过将ABE发酵过程中的副产物丙酮进一步转化成更有价值可作为燃料的异丙醇则成为一个新的研究思路，而利用产溶剂梭菌的异丙醇-丁醇-乙醇(IBE)发酵过程则成为了同时生产可再生丁醇和异丙醇这类混合醇燃料的首选微生物转化途径。与传统ABE发酵相比，IBE发酵的最终产物可直接作为一种绿色燃料直接应用于火花点火(SI)发动机中，该燃料比ABE混合物具有更低的污染物排放和更好的发动机性能。因此，在产溶剂梭菌中探索将丙酮转化为异丙醇的过程，在可以使混合醇的含量在总溶剂中的比例显著提高，有效减少发酵液中的副产物，从而降低丁醇分离纯化的成本的同时，也能降低运输储存以及提升底物利用效率。但是，传统产溶剂梭菌的ABE发酵过程中存在的副产物丙酮产量及占比高，产物能效较低，提升效能则需增加分离成本；发酵过程中菌株对碳源底物利用不完全，混合醇产量及转化率较低、发酵时间较长。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供二级醇脱氢酶的应用。

本发明第二方面的目的，在于提供与二级醇脱氢酶相关的生物材料的应用。

本发明第三方面的目的，在于提供靶向上调二级醇脱氢酶的表达量和/或增强二级醇脱氢酶活性的试剂的应用。

本发明第四方面的目的，在于提供一种重组菌的构建方法。

本发明第五方面的目的，在于提供一种重组菌。

本发明第六方面的目的，在于提供本发明第五方面的重组菌在制备丁醇和/或异丙醇和/ 或乙醇中的应用。

本发明第七方面的目的，在于提供一种方法。

本发明第八方面的目的，在于提供一种制备溶剂的方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供二级醇脱氢酶(次级醇脱氢酶)在(a1)～(a10)中至少一种中的应用；

(a1)提高梭菌的碳源利用率；

(a2)促进梭菌中丁醇的生成；

(a3)促进梭菌中异丙醇的生成；

(a4)促进梭菌中乙醇的生成；

(a5)降低梭菌中丙酮的含量；

(a6)制备提高梭菌的碳源利用率的产品；

(a7)制备促进梭菌中丁醇的生成的产品；

(a8)制备促进梭菌中异丙醇的生成的产品；

(a9)制备促进梭菌中乙醇的生成的产品；

(a10)制备降低梭菌中丙酮的含量的产品。

优选地，所述梭菌包含产溶剂梭菌；进一步优选地，所述梭菌包含Clostridiumsp.WK。

优选地，所述碳源包含乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖中的至少一种；进一步优选地，所述碳源包含半乳糖和葡萄糖中的至少一种；更进一步优选地，所述碳源包含半乳糖或葡萄糖。

优选地，所述二级醇脱氢酶为异源二级醇脱氢酶。

优选地，所述二级醇脱氢酶为c1)～c3)中任一种；

c1)氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的二级醇脱氢酶；

c2)将SEQ ID NO.11经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.11具有相同功能的二级醇脱氢酶；

c3)与SEQ ID NO.11具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％或92％的同源性且与SEQ ID NO.11具有相同功能的二级醇脱氢酶。

本发明的第二个方面，提供与二级醇脱氢酶相关的生物材料在(a1)～(a10)中至少一种中的应用；

(a1)提高梭菌的碳源利用率；

(a2)促进梭菌中丁醇的生成；

(a3)促进梭菌中异丙醇的生成；

(a4)促进梭菌中乙醇的生成；

(a5)降低梭菌中丙酮的含量；

(a6)制备提高梭菌的碳源利用率的产品；

(a7)制备促进梭菌中丁醇的生成的产品；

(a8)制备促进梭菌中异丙醇的生成的产品；

(a9)制备促进梭菌中乙醇的生成的产品；

(a10)制备降低梭菌中丙酮的含量的产品；

所述与二级醇脱氢酶相关的生物材料包含b1)～b12)中的至少一种：

b1)编码二级醇脱氢酶的核酸分子；

b2)含有b1)所述核酸分子的表达盒；

b3)含有b1)所述核酸分子的重组载体；

b4)含有b2)所述表达盒的重组载体；

b5)含有b1)所述核酸分子的重组细胞；

b6)含有b2)所述表达盒的重组细胞；

b7)含有b3)所述重组载体的重组细胞；

b8)含有b4)所述重组载体的重组细胞；

b9)含有b1)所述核酸分子的重组微生物；

b10)含有b2)所述表达盒的重组微生物；

b11)含有b3)所述重组载体的重组微生物；

b12)含有b4)所述重组载体的重组微生物。

优选地，所述梭菌包含产溶剂梭菌；进一步优选地，所述梭菌包含Clostridiumsp.WK。

优选地，所述碳源包含乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖中的至少一种；进一步优选地，所述碳源包含半乳糖和葡萄糖中的至少一种；更进一步优选地，所述碳源包含半乳糖或葡萄糖。

优选地，所述二级醇脱氢酶为异源二级醇脱氢酶。

优选地，所述二级醇脱氢酶为c1)～c3)中任一种；

c1)氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的二级醇脱氢酶；

c2)将SEQ ID NO.11经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.11具有相同功能的二级醇脱氢酶；

c3)与SEQ ID NO.11具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％或92％的同源性且与SEQ ID NO.11具有相同功能的二级醇脱氢酶。

本发明的第三个方面，提供靶向上调二级醇脱氢酶的表达量和/或增强二级醇脱氢酶活性的试剂在(a1)～(a10)中至少一种中的应用；

(a1)提高梭菌的碳源利用率；

(a2)促进梭菌中丁醇的生成；

(a3)促进梭菌中异丙醇的生成；

(a4)促进梭菌中乙醇的生成；

(a5)降低梭菌中丙酮的含量；

(a6)制备提高梭菌的碳源利用率的产品；

(a7)制备促进梭菌中丁醇的生成的产品；

(a8)制备促进梭菌中异丙醇的生成的产品；

(a9)制备促进梭菌中乙醇的生成的产品；

(a10)制备降低梭菌中丙酮的含量的产品。

优选地，所述梭菌包含产溶剂梭菌；进一步优选地，所述梭菌包含Clostridiumsp.WK。

优选地，所述碳源包含乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖中的至少一种；进一步优选地，所述碳源包含半乳糖和葡萄糖中的至少一种；更进一步优选地，所述碳源包含半乳糖或葡萄糖。

优选地，所述二级醇脱氢酶为异源二级醇脱氢酶。

优选地，所述二级醇脱氢酶为c1)～c3)中任一种；

c1)氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的二级醇脱氢酶；

c2)将SEQ ID NO.11经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.11具有相同功能的二级醇脱氢酶；

c3)与SEQ ID NO.11具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％或92％的同源性且与SEQ ID NO.11具有相同功能的二级醇脱氢酶。

本发明的第四个方面，提供一种重组菌的构建方法，包括如下步骤：提高梭菌中二级醇脱氢酶的含量和/或活性。

优选地，所述提高梭菌中二级醇脱氢酶的含量和/或活性的方法为在梭菌中过表达二级醇脱氢酶。

优选地，所述提高梭菌中二级醇脱氢酶的含量和/或活性的方法为将二级醇脱氢酶的编码基因导入梭菌中。

优选地，所述二级醇脱氢酶的编码基因通过重组载体导入梭菌中；所述重组载体为将所述二级醇脱氢酶的编码基因插入表达载体的多克隆位点后得到的载体。

优选地，所述表达载体可为现有技术中常见的表达载体，例如：pMTL80000系列梭菌特异性表达载体，包括：pMTL83353、pMTL84422、pMTL85141、pMTL82151、pMTL83151、pMTL84151、pMTL85151等。

优选地，所述表达载体包含pMTL83353。

优选地，所述梭菌包含产溶剂梭菌；进一步优选地，所述梭菌包含Clostridiumsp.WK。

优选地，所述二级醇脱氢酶为异源二级醇脱氢酶。

优选地，所述二级醇脱氢酶为c1)～c3)中任一种；

c1)氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示的二级醇脱氢酶；

c2)将SEQ ID NO.11经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.11具有相同功能的二级醇脱氢酶；

c3)与SEQ ID NO.11具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％或92％的同源性且与SEQ ID NO.11具有相同功能的二级醇脱氢酶。

优选地，所述二级醇脱氢酶的编码基因的序列为d1)～d3)中任一种：

d1)如SEQ ID NO.1所示；

d2)将SEQ ID NO.1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与SEQID NO.1 具有相同功能的核甘酸序列；

d3)与SEQ ID NO.1具有99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％或92％的同源性且与SEQ ID NO.1具有相同功能的核苷酸序列。

优选地，所述重组载体为pMTL-adh，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第五个方面，提供一种重组梭菌，通过本发明的第四个方面的构建方法得到。

本发明的第六个方面，提供本发明第五个方面的重组梭菌在制备溶剂中的应用，所述溶剂包含丁醇、异丙醇、乙醇中的至少一种。

优选地，所述溶剂包含异丙醇、丁醇中的至少一种。

本发明的第七个方面，提供一种方法，为e1)～e5)中任一种：

e1)一种提高梭菌碳源消耗量的方法，将梭菌接种至厌氧培养基，发酵；所述厌氧培养基包含铁盐；

e2)一种促进梭菌生长的方法，将梭菌接种至厌氧培养基，发酵；所述厌氧培养基包含铁盐；

e3)一种促进梭菌中丁醇生成的方法，将梭菌接种至厌氧培养基，发酵；所述厌氧培养基包含铁盐；

e4)一种促进梭菌中已醇生成的方法，将梭菌接种至厌氧培养基，发酵；所述厌氧培养基包含铁盐；

e5)一种促进梭菌中异丙醇生成的方法，将梭菌接种至厌氧培养基，发酵；所述厌氧培养基包含铁盐。

优选地，所述铁盐在所述厌氧培养基中的浓度为10～30mM，进一步为15～25mM。

优选地，所述铁盐包含FeCl₃、Fe₂(SO₄)₃中的至少一种；进一步为FeCl₃。

优选地，所述厌氧培养基包含碳源。

优选地，所述碳源包含乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖中的至少一种；进一步优选地，所述碳源包含半乳糖和葡萄糖中的至少一种；更进一步优选地，所述碳源包含半乳糖或葡萄糖。

优选地，所述厌氧培养基中包含：酵母提取物、NaHCO₃、2-(N-吗啉基)乙磺酸、无机盐、微量元素、除氧还原剂中的至少一种；进一步优选地，所述厌氧培养基中包含：酵母提取物、 NaHCO₃、2-(N-吗啉基)乙磺酸、无机盐、微量元素和除氧还原剂。

优选地，所述无机盐包含：NaCl、MgCl₂、KH₂PO₄、NH₄Cl、KCl、CaCl₂中的至少一种；进一步优选地，所述无机盐包含：NaCl、MgCl₂、KH₂PO₄、NH₄Cl、KCl和CaCl₂。

优选地，所述微量元素包含：FeCl₂、CoCl₂、MnCl₂、ZnCl₂、H₃BO₃、Na₂MoO₄、NiCl₂、CuCl₂中的至少一种；进一步优选地，所述微量元素包含：FeCl₂、CoCl₂、MnCl₂、ZnCl₂、H₃BO₃、Na₂MoO₄、NiCl₂和CuCl₂。

优选地，所述除氧还原剂包含：二硫苏糖醇、L-半胱氨酸、Na₂S中的至少一种；进一步优选地，所述除氧还原剂包含：二硫苏糖醇、L-半胱氨酸和Na₂S。

优选地，所述厌氧培养基中包含：厌氧指示剂。

优选地，所述厌氧指示剂包含刃天青。

优选地，所述厌氧培养基中含有抗生素。

优选地，所述抗生素包含壮观霉素、青霉素、链霉素、庆大霉素中的至少一种；进一步包含壮观霉素。

优选地，所述发酵的条件为25～35℃、100～200rpm下发酵40～102h。

优选地，所述发酵为厌氧发酵。

优选地，所述梭菌包含产溶剂梭菌；进一步包含Clostridium sp.WK或本发明第五个方面的重组梭菌。

本发明的第八个方面，提供一种制备溶剂的方法，将本发明第五个方面的重组梭菌接种至厌氧培养基，发酵；所述溶剂包含丁醇、异丙醇、乙醇中的至少一种。

优选地，所述溶剂包含异丙醇、丁醇中的至少一种。

优选地，所述厌氧培养基包含铁盐。

优选地，所述铁盐在所述厌氧培养基中的浓度为10～30mM，进一步为15～25mM。

优选地，所述铁盐包含FeCl₃、Fe₂(SO₄)₃中的至少一种；进一步包含FeCl₃。

优选地，所述厌氧培养基包含碳源。

优选地，所述碳源包含乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖中的至少一种；进一步优选地，所述碳源包含半乳糖和葡萄糖中的至少一种；更进一步优选地，所述碳源包含半乳糖或葡萄糖。

优选地，所述厌氧培养基中包含：酵母提取物、NaHCO₃、2-(N-吗啉基)乙磺酸、无机盐、微量元素、除氧还原剂中的至少一种；进一步优选地，所述厌氧培养基中包含：酵母提取物、 NaHCO₃、2-(N-吗啉基)乙磺酸、无机盐、微量元素和除氧还原剂。

优选地，所述无机盐包含：NaCl、MgCl₂、KH₂PO₄、NH₄Cl、KCl、CaCl₂中的至少一种；进一步优选地，所述无机盐包含：NaCl、MgCl₂、KH₂PO₄、NH₄Cl、KCl和CaCl₂。

优选地，所述微量元素包含：FeCl₂、CoCl₂、MnCl₂、ZnCl₂、H₃BO₃、Na₂MoO₄、NiCl₂、CuCl₂中的至少一种；进一步优选地，所述微量元素包含：FeCl₂、CoCl₂、MnCl₂、ZnCl₂、H₃BO₃、Na₂MoO₄、NiCl₂和CuCl₂。

优选地，所述除氧还原剂包含：二硫苏糖醇、L-半胱氨酸、Na₂S中的至少一种；进一步优选地，所述除氧还原剂包含：二硫苏糖醇、L-半胱氨酸和Na₂S。

优选地，所述厌氧培养基中包含：厌氧指示剂。

优选地，所述厌氧指示剂包含刃天青。

优选地，所述厌氧培养基中含有抗生素。

优选地，所述抗生素包含壮观霉素、青霉素、链霉素、庆大霉素中的至少一种；进一步包含壮观霉素。

优选地，所述发酵的条件为25～35℃、100～200rpm下发酵40～102h。

优选地，所述发酵为厌氧发酵。

本发明的有益效果是：

本发明首次公开了通过提高梭菌中二级醇脱氢酶的含量和/或活性，从而提高梭菌的碳源利用率、促进梭菌中丁醇的生成、促进梭菌中乙醇的生成、将丙酮转化为异丙醇，从而降低梭菌中丙酮的含量以及促进梭菌中异丙醇的生成，提供了一种通过改造菌株(提高梭菌中二级醇脱氢酶的含量和/或活性)消除副产物、生产混合醇燃料的方法，该方法不但将发酵产物中混合醇在总溶剂中的比例显著提高，同时也能有效降低分离纯化的成本，提升运输储存与底物利用的效率。

进一步地，本发明通过在梭菌培养过程中添加铁盐，进一步提高利用底物转化混合醇的能力(提高梭菌碳源消耗量、促进梭菌生长、促进梭菌中丁醇、乙醇、异丙醇的生成)，并缩短量发酵时间(低至48小时)，提高了混合醇的生产速率，明显节约发酵成本。

附图说明

图1是本发明实施例1中构建成功的pMTL-adh质粒图谱。

图2是本发明实施例1中重组梭菌株WK::adh PCR鉴定分析过程图：其中泳道1～3为引物16s-F/16s-R分别以菌株WK、WK::adh1、WK::adh2基因组作模板扩增的条带；泳道4～5为引物Primer1-F/Primer1-R与Primer2-F/Primer2-R分别以菌株WK基因组为模板扩增的条带；泳道6～7为引物Primer1-F/Primer1-R与Primer2-F/Primer2-R分别以质粒pMTL-adh为模板扩增的条带；泳道8～9分别为2对引物Primer1-F/Primer1-R与Primer2-F/Primer2-R以菌株WK::adh1基因组为模板扩增的条带；泳道10～11分别为2对引物Primer1-F/Primer1-R与 Primer2-F/Primer2-R以菌株WK::adh2基因组为模板扩增的条带。

图3是本发明实施例2中重组梭菌株WK::adh发酵过程中菌株生长曲线、葡萄糖消耗与发酵产物合成情况图。

图4是本发明实施例2中野生型菌株WK发酵过程中菌株生长曲线、葡萄糖消耗与发酵产物合成情况图。

图5是本发明实施例3中重组梭菌株WK::adh发酵过程中菌株生长曲线、半乳糖消耗与发酵产物合成情况图。

图6是本发明实施例3中野生型菌株WK发酵过程中菌株生长曲线、半乳糖消耗与发酵产物合成情况图。

图7是本发明实施例4中重组梭菌株WK::adh发酵过程中菌株生长曲线、葡萄糖情况与发酵产物合成情况图。

图8是本发明实施例4中野生型菌株WK发酵过程中菌株生长曲线、葡萄糖消耗与发酵产物合成情况图。

图9是本发明实施例5中重组梭菌株WK::adh发酵过程中菌株生长曲线、半乳糖消耗与发酵产物合成情况图。

图10是本发明实施例5中野生型菌株WK发酵过程中菌株生长曲线、半乳糖消耗与发酵产物合成情况图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

1.菌种及载体

(1)编码二级醇脱氢酶(次级醇脱氢酶)基因adh的基因序列来自于菌株C.beijerinckii NRRL B-593基因组，序列如SEQ ID NO.1所示，由金斯瑞生物科技有限公司合成，二级醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；

(2)穿梭质粒pMTL83353为市售产品，由汕头大学合成生物学与生物化工实验室无偿赠予，现由北京态创生物科技有限公司保存；

(3)大肠杆菌Top10感受态细胞购买自生工生物工程(上海)股份有限公司；

(4)野生型菌株为Clostridium sp.WK(已在专利文献CN112961799A中公开，保藏编号为GDMCCNo:61493)，由汕头大学合成生物学与生物化工实验室无偿赠予，现由北京态创生物科技有限公司保存；

(5)重组梭菌为Clostridium sp.WK::adh，其是在野生型菌株WK的基础上过表达二级醇脱氢酶基因adh，现由北京态创生物科技有限公司保存。

2.培养基的配制

(1)厌氧培养基(ACM)，其中每升含：酵母提取物，10g；NaHCO₃，2.52g；2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)，2.132g；100×盐溶液10mL(其中每升含NaCl，1.0g；MgCl₂·6H₂O， 0.5g；KH₂PO₄，0.2g；NH₄Cl，0.3g；KCl，0.3g；CaCl₂·2H₂O，0.015g)；1000×微量元素溶液1mL(其中每升含FeCl₂·4H₂O，1.5g；CoCl₂·6H₂O，0.19g；MnCl₂·4H₂O，0.1 g；ZnCl₂，0.07g；H₃BO₃，0.006g；Na₂MoO₄·2H₂O，0.036g；NiCl₂·6H₂O，0.024g；CuCl₂·2H₂O， 0.002g)；以纯水配置，加入1mL厌氧指示剂(1000×刃天青)；最后加入除氧还原剂(二硫苏糖醇DTT，0.077g；L-半胱氨酸L-Cys，0.0242g；1000×Na₂S溶液，1mL)，调节pH至6.0，并向培养基中持续通入N₂除氧，随后分装到厌氧培养的血清瓶中，用丁基胶塞和铝盖封口，于121℃灭菌20min。该培养基用于菌株的活化及发酵。

(2)碳源底物母液：碳源选择葡萄糖或半乳糖，将葡萄糖或半乳糖配置成50％(w/v)的母液，分装至血清瓶中，并向其中持续通入N₂除氧，115℃灭菌15min备用。

(3)LB培养基，其中每升含：NaCl，10g；胰蛋白胨，10g；酵母提取物，5g；以纯水配制，固体培养基需在添加1.5％(w/v)的琼脂，于121℃灭菌20min。该培养基用于含有目标质粒的大肠杆菌菌株的培养。

(4)电转缓冲液(10％甘油)：取10mL甘油溶于90mL ddH₂O中，连续通入N₂至氧气除尽，用丁基胶塞和铝盖封口后，121℃，20min灭菌，4℃保存。

(5)梭菌增强培养基(RCM)，其中每升含RCM培养基粉末(购自美国BD公司，货号：CNL17-B0061，批号：9183138)38g，以纯水配制完全溶解后，固体培养基需加入1.5％琼脂，121℃灭菌20min，4℃保存。

(6)梭菌复苏培养基，其中每升含：酵母提取物，10g；NaCl，5g；蛋白胨，16g；完全溶解后加入1mL厌氧指示剂，搅拌均匀后定容到950mL；定容后依次加入DTT 0.077g、L-Cys0.0242g、1000×Na₂S溶液1mL，并调节pH于6.0～7.0；连续通入N₂至培养基完全除氧后，在通入N₂的条件下按照所需量分装到100或20mL血清瓶中，并用丁基胶塞和铝盖封口后， 121℃灭菌20min。该培养基用于目标阳性工程菌株的复苏与培养。

(7)无氧壮观霉素溶液：壮观霉素粉末250mg/mL，溶于纯水中，0.22μm尼龙膜过滤，持续通入N₂至氧气除尽，用丁基胶塞和铝盖封口，4℃保存。

(8)蛋白酶K溶液：准确称取32mg蛋白酶K，溶于80mL pH 8.0的1×TE buffer溶液中， 4℃保存。

(9)无氧FeCl₃溶液：将FeCl₃溶液配置成50g/L母液，过滤除菌，连续通入N₂至氧气除尽，用丁基胶塞和铝盖封口。

实施例1重组梭菌的构建

1.设计构建基于梭菌的异源表达体系，使二级醇脱氢酶基因adh在菌株内表达以实现将丙酮进一步转化为异丙醇的目的。具体方法如下：

(1)设计含有相应酶切位点的特异性PCR引物：

adh-F:5’-TCGGTACCCGGGATGAAAGGTTT-3’(SEQ ID NO.2，下划线部分为XmaI酶切位点)；

adh-R:5’-CTGCAGGTCGACTTATAATATAACTACTGCTTTAATT-3’(SEQ ID NO.3，下划线部分为SalI酶切位点)。

(2)使用高保真酶从合成基因质粒中扩增获取目的片段，其反应体系设置为25μL体系，其中包括DNA模板(50ng)1μL、正反向引物(adh-F、adh-R，10μM)各1μL、dNTP 2μL、5 ×高保真酶反应缓冲液5μL、高保真DNA聚合酶0.5μL；其反应程序为：95℃预变性5min， 95℃30s，63℃30s，72℃1min，30个循环，最后72℃延伸10min；

(3)将扩增得到的adh基因片段通过琼脂糖凝胶电泳检测，并使用快速纯化试剂盒对基因片段进行纯化回收并计算基因浓度；

(4)采用限制性内切酶分别对adh基因和穿梭载体pMTL83353进行双酶切，酶切体系设置为50μL，其中包括目的adh基因片段/pMTL83353(1μg)、10×酶切通用缓冲液5μL、上下游DNA限制性内切酶(XmaI，10000U/mL；SalI，20000U/mL)各1μL，于37℃条件下反应12h，并使用DNA回收试剂盒回收双酶切产物；

(5)将酶切后的目的DNA片段和线性化载体pMTL83353进行连接反应，体系设置为10 μL，其中包括载体片段0.03pmol、目的DNA片段0.3pmol、T4 DNA连接酶1μL、10×T4 DNA反应缓冲液1μL，置于16℃反应30min后转化到大肠杆菌Top10菌株，采用含250 mg/mL壮观霉素抗性的LB固体培养基筛选阳性克隆子，经PCR与测序验证获得含有adh基因异源表达质粒(pMTL-adh)(序列如SEQ ID NO.4，图谱如图1所示)。

2.将野生型菌株WK种子液按照培养基总体积4％接入含10g/L葡萄糖的厌氧培养基(ACM)中，于37℃和150rpm的条件下厌氧培养18小时进行活化，使菌液OD_600nm达0.8。采用已优化的梭菌电转化体系，在以10％甘油作电转缓冲液，通过2mm电击杯和3.4ms的电转时间，电压1.5kV的条件下，将质粒pMTL-adh(5μg)导入菌株WK细胞中后进行复苏。将复苏后的菌液涂布于含有250mg/mL壮观霉素的RCM-琼脂平板上培养48小时，待克隆子长出后挑选菌落于梭菌恢复培养基中进行培养(WK::adh1、WK::adh2为选择两个克隆子，其发酵性状比较相似，统一命名为WK::adh，后续发酵实验选用WK::adh1)，待菌液长到一定数量后使用蛋白酶K预处理，进行菌液PCR，以验证质粒是否成功导入梭菌。

本过程中共用了3对引物来进行验证，其中包括：

16s-F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.5)；

16s-R:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.6)；

Primer1-F:5’-GGGATGTGGAATGGCTCA-3’(SEQ ID NO.7)；

Primer1-R:5’-GTTGGGTAACGCCAGGGT-3’(SEQ ID NO.8)；

Primer2-F:5’-TATGGACACGGGTAA-3’(SEQ ID NO.9)；

Primer2-R:5’-GTGCGAATAAGGGAC-3’(SEQ ID NO.10)。

同时以菌株WK的基因组为模板作为阴性对照，以质粒pMTL-adh为模板作阳性对照，验证结果如图2所示，最终获取重组梭菌株WK::adh。

实施例2重组梭菌WK::adh以葡萄糖为底物的IBE发酵

将实施例1获得的重组梭菌株WK::adh保存液按培养基总体积的4％接种到含250mg/mL壮观霉素、10g/L葡萄糖的ACM培养基中，于37℃、150rpm的条件下厌氧培养12 小时获得种子液。向新的45mL ACM培养基中添加葡萄糖母液使其初始浓度为60g/L，同时加入250mg/mL壮观霉素，并将种子液按4％接种量转接至培养基中于30℃和150rpm条件下厌氧发酵96小时(以野生型菌株WK为对照组，对照组除不需要添加壮观霉素溶液外，其余条件均一致，重组梭菌WK::adh与野生型菌株WK的种子液的菌浓度相等)；在整个发酵过程中，每间隔12或24小时进行取样，分别测定菌株生长曲线、葡萄糖消耗与发酵产物 (丙酮、丁醇、乙醇、异丙醇、丁酸、乙酸等)生成情况。

实验结果如图3、4所示，在发酵结束时野生型菌株WK共消耗40.99g/L的葡萄糖，最大生物量达到11.36(OD_600nm)，丙酮、乙醇和丁醇产量分别为4.39、0.67和9.63g/L，总溶剂(丙酮、乙醇、丁醇、丁酸、乙酸)产量达到15.32g/L。同样条件下，重组梭菌株WK::adh 的葡萄糖消耗量和最大生物量分别为42.03g/L和11.11(OD_600nm)，最终发酵产生的丙酮、异丙醇、乙醇和丁醇分别为0.22、4.45、0.91和11.89g/L，总溶剂(丙酮、异丙醇、乙醇、丁醇、丁酸、乙酸)产量达18.22g/L，实现将94.99％的丙酮转化为异丙醇，同时乙醇及丁醇产量分别提升35.82％和23.47％，总溶剂产量提高了18.93％。

实施例3重组梭菌WK::adh以半乳糖为底物的IBE发酵

将实施例1获得的重组梭菌株WK::adh保存液按培养基总体积的4％接种到含250mg/mL壮观霉素、10g/L半乳糖的ACM培养基中，于37℃、150rpm的条件下厌氧培养12 小时获得种子液。向新的45mL ACM培养基中添加半乳糖母液使其初始浓度为50g/L，同时加入250mg/mL壮观霉素，并将种子液按4％接种量转接至培养基中于30℃和150rpm条件下厌氧发酵96小时(以野生型菌株WK为对照组，对照组除不需要添加壮观霉素溶液外，其余条件均一致，重组梭菌WK::adh与野生型菌株WK的种子液的菌浓度相等)；在整个发酵过程中，每间隔12或24小时进行取样，分别测定菌株生长曲线、半乳糖消耗与发酵产物 (丙酮、丁醇、乙醇、异丙醇、丁酸、乙酸等)生成情况。

实验结果如图5、6所示，在发酵结束时野生型菌株WK共消耗25.6g/L的半乳糖，最大生物量达到8.8(OD_600nm)，丙酮、乙醇和丁醇产量分别为2.81、0.33和6.38g/L，总溶剂(丙酮、乙醇、丁醇、丁酸、乙酸)产量达到10.05g/L。同样条件下，工程菌株WK::adh的半乳糖消耗量和最大生物量分别为28.9g/L和8.67(OD_600nm)，最终发酵产生的丙酮、异丙醇、乙醇和丁醇分别为0.12、2.31、0.53和7.99g/L，总溶剂(丙酮、异丙醇、乙醇、丁醇、丁酸、乙酸)产量达12.36g/L，实现将94.74％的丙酮转化为异丙醇，同时乙醇及丁醇产量分别提高了61％和25％，总溶剂产量也提高了22.99％。

实施例4重组梭菌WK::adh以葡萄糖为底物，添加20mM FeCl₃的IBE发酵

将实施例1获得的重组梭菌株WK::adh保存液按培养基总体积的4％接种到含250mg/mL壮观霉素、10g/L葡萄糖的ACM培养基中，于37℃、150rpm的条件下厌氧培养12 小时获得种子液。向新的40mL ACM培养基中添加葡萄糖母液使其初始浓度为60g/L，添加 50g/L无氧FeCl₃溶液使Fe³⁺的起始浓度为20mM，同时加入250mg/mL壮观霉素，并用无氧的4M NaOH调节培养基至初始pH值为6.7±0.3；然后将种子液按4％接种量转接至培养基中于30℃和150rpm条件下厌氧发酵96小时(以野生型菌株WK为对照组，对照组除不需要添加壮观霉素溶液外，其余条件均一致，重组梭菌WK::adh与野生型菌株WK的种子液的菌浓度相等)；在整个发酵过程中，每间隔12或24小时进行取样，分别测定菌株生长曲线、葡萄糖消耗与发酵产物(丙酮、丁醇、乙醇、异丙醇、丁酸、乙酸等)生成情况。

实验结果如图7、8所示，在发酵结束时野生型菌株WK共消耗53.1g/L的葡萄糖，最大生物量达到14.3(OD_600nm)，丙酮、乙醇和丁醇产量分别5.30、0.74和12.62g/L，总溶剂(丙酮、乙醇、丁醇、丁酸、乙酸)产量达到19.63g/L。同样条件下，重组梭菌株WK::adh的葡萄糖消耗量和最大生物量分别为52.24g/L和13.0(OD_600nm)，最终发酵产生的丙酮、异丙醇、乙醇和丁醇分别为0.17g/L、6.14g/L、1.7g/L和14.29g/L，总溶剂(丙酮、异丙醇、乙醇、丁醇、丁酸、乙酸)产量为24.05g/L，实现将96.85％的丙酮转化为异丙醇，同时乙醇产量为对照组的2.3倍，丁醇和总溶剂产量分别提升13.23％和22.52％；通过与实施例2的结果比较，培养基中加入FeCl₃后，野生型菌株的葡萄糖的消耗量提升29.54％，丙酮产量提升20.73％，丁醇产量提升31.05％，总溶剂产量提升28.13％；重组梭菌株WK::adh的葡萄糖的消耗量提升24.29％，丁醇产量提升20.19％，总溶剂产量提升32％；表明培养基中加入FeCl₃可以提升梭菌的葡萄糖消耗量、生物量、丁醇、乙醇、异丙醇、总溶剂含量。

实施例5重组梭菌WK::adh以半乳糖为底物，添加20mM FeCl₃的IBE发酵

将实施例1获得的重组梭菌株WK::adh保存液按培养基总体积的4％接种到含250mg/mL壮观霉素、10g/L半乳糖的ACM培养基中，于37℃、150rpm的条件下厌氧培养12 小时获得菌浓度相同的种子液。向新的40mL ACM培养基中添加半乳糖母液使其初始浓度为 50g/L，添加50g/L无氧FeCl₃溶液使Fe³⁺的起始浓度为20mM，同时加入250mg/mL壮观霉素，并用无氧的4M NaOH调节培养基至初始pH值为6.7±0.3；然后将种子液按4％接种量转接至培养基中于30℃和150rpm条件下厌氧发酵96小时(以野生型菌株WK为对照组，对照组除不需要添加壮观霉素溶液外，其余条件均一致，重组梭菌WK::adh与野生型菌株 WK的种子液的菌浓度相等)；在整个发酵过程中，每间隔12或24小时进行取样，分别测定菌株生长曲线、葡萄糖消耗与发酵产物(丙酮、丁醇、乙醇、异丙醇、丁酸、乙酸等)生成情况。

实验结果如图9、10所示，在发酵结束时野生型菌株WK共消耗32.5g/L的半乳糖，最大生物量达到11.4(OD_600nm)，丙酮、乙醇和丁醇产量分别3.81g/L、0.76g/L和8.23g/L，总溶剂(丙酮、乙醇、丁醇、丁酸、乙酸)产量达到16.61g/L。在同样的发酵条件下，重组梭菌株WK::adh的半乳糖消耗量和最大生物量分别为35.28g/L和10.72(OD_600nm)，最终发酵产生的丙酮、异丙醇、乙醇和丁醇分别为0.12g/L、3.21g/L、0.93g/L和9.83g/L，总溶剂(丙酮、异丙醇、乙醇、丁醇、丁酸、乙酸)产量为17.4g/L，实现将96.62％的丙酮转化为异丙醇，同时乙醇及丁醇产量分别提升22.37％和19.44％，总溶剂产量提升4.76％；通过与实施例3的结果比较，培养基中加入FeCl₃后，野生型菌株的半乳糖的消耗量提升26.95％，丙酮产量提升35.59％，丁醇产量提升29％，总溶剂产量提升65.27％；重组梭菌株WK::adh 的半乳糖的消耗量提升22.08％，丙酮产量无明显变化，异丙醇产量提升38.96％，丁醇产量提升23.03％，总溶剂产量提升40.78％；表明培养基中加入FeCl₃可以提升梭菌的半乳糖消耗量、生物量、丙酮、丁醇、乙醇、异丙醇、总溶剂含量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州市乾相生物科技有限公司

<120> 一种重组梭菌及其构建方法与应用

<130>

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1056

<212> DNA

<213> C. beijerinckii NRRL B-593

<400> 1

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<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcggtacccg ggatgaaagg ttt 23

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 5953

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

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ccaagccaac caggaagggc agcccaccta tcaaggtgta ctgccttcca gacgaacgaa 5520

gagcgattga ggaaaaggcg gcggcggccg gcatgagcct gtcggcctac ctgctggccg 5580

tcggccaggg ctacaaaatc acgggcgtcg tggactatga gcacgtccgc gagctggccc 5640

gcatcaatgg cgacctgggc cgcctgggcg gcctgctgaa actctggctc accgacgacc 5700

cgcgcacggc gcggttcggt gatgccacga tcctcgccct gctggcgaag atcgaagaga 5760

agcaggacga gcttggcaag gtcatgatgg gcgtggtccg cccgagggca gagccatgac 5820

ttttttagcc gctaaaacgg ccggggggtg cgcgtgattg ccaagcacgt ccccatgcgc 5880

tccatcaaga agagcgactt cgcggagctg gtgaagtaca tcaccgacga gcaaggcaag 5940

accgatcggg ccc 5953

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tacggctacc ttgttacgac tt 22

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gggatgtgga atggctca 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gttgggtaac gccagggt 18

<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tatggacacg ggtaa 15

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtgcgaataa gggac 15

<210> 11

<211> 351

<212> PRT

<213> C. beijerinckii NRRL B-593

<400> 11

Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Gly Ile Asn Lys Leu Gly Trp Ile Glu

1               5                   10                  15

Lys Glu Arg Pro Val Ala Gly Ser Tyr Asp Ala Ile Val Arg Pro Leu

            20                  25                  30

Ala Val Ser Pro Cys Thr Ser Asp Ile His Thr Val Phe Glu Gly Ala

        35                  40                  45

Leu Gly Asp Arg Lys Asn Met Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Glu

    50                  55                  60

Val Val Glu Val Gly Ser Glu Val Lys Asp Phe Lys Pro Gly Asp Arg

65                  70                  75                  80

Val Ile Val Pro Cys Thr Thr Pro Asp Trp Arg Ser Leu Glu Val Gln

                85                  90                  95

Ala Gly Phe Gln Gln His Ser Asn Gly Met Leu Ala Gly Trp Lys Phe

            100                 105                 110

Ser Asn Phe Lys Asp Gly Val Phe Gly Glu Tyr Phe His Val Asn Asp

        115                 120                 125

Ala Asp Met Asn Leu Ala Ile Leu Pro Lys Asp Met Pro Leu Glu Asn

    130                 135                 140

Ala Val Met Ile Thr Asp Met Met Thr Thr Gly Phe His Gly Ala Glu

145                 150                 155                 160

Leu Ala Asp Ile Gln Met Gly Ser Ser Val Val Val Ile Gly Ile Gly

                165                 170                 175

Ala Val Gly Leu Met Gly Ile Ala Gly Ala Lys Leu Arg Gly Ala Gly

            180                 185                 190

Arg Ile Ile Gly Val Gly Ser Arg Pro Ile Cys Val Glu Ala Ala Lys

        195                 200                 205

Phe Tyr Gly Ala Thr Asp Ile Leu Asn Tyr Lys Asn Gly His Ile Val

    210                 215                 220

Asp Gln Val Met Lys Leu Thr Asn Gly Lys Gly Val Asp Arg Val Ile

225                 230                 235                 240

Met Ala Gly Gly Gly Ser Glu Thr Leu Ser Gln Ala Val Ser Met Val

                245                 250                 255

Lys Pro Gly Gly Ile Ile Ser Asn Ile Asn Tyr His Gly Ser Gly Asp

            260                 265                 270

Ala Leu Leu Ile Pro Arg Val Glu Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys

        275                 280                 285

Thr Ile Lys Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Ala Glu Met

    290                 295                 300

Leu Arg Asp Met Val Val Tyr Asn Arg Val Asp Leu Ser Lys Leu Val

305                 310                 315                 320

Thr His Val Tyr His Gly Phe Asp His Ile Glu Glu Ala Leu Leu Leu

                325                 330                 335

Met Lys Asp Lys Pro Lys Asp Leu Ile Lys Ala Val Val Ile Leu

            340                 345                 350

Claims (12)

1.二级醇脱氢酶在（a1）～（a4）中至少一种中的应用；

（a1）促进梭菌中丁醇的生成；

（a2）促进梭菌中乙醇的生成；

（a3）制备促进梭菌中丁醇的生成的产品；

（a4）制备促进梭菌中乙醇的生成的产品；

所述梭菌为Clostridium sp. WK，所述Clostridium sp. WK的保藏编号为GDMCC No:61493；

所述二级醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

2.与二级醇脱氢酶相关的生物材料在（a1）～（a4）中至少一种中的应用；

（a1）促进梭菌中丁醇的生成；

（a2）促进梭菌中乙醇的生成；

（a3）制备促进梭菌中丁醇的生成的产品；

（a4）制备促进梭菌中乙醇的生成的产品；

所述与二级醇脱氢酶相关的生物材料包含b1）～b12）中的至少一种：

b1）编码二级醇脱氢酶的核酸分子；

b2）含有b1）所述核酸分子的表达盒；

b3）含有b1）所述核酸分子的重组载体；

b4）含有b2）所述表达盒的重组载体；

b5）含有b1）所述核酸分子的重组细胞；

b6）含有b2）所述表达盒的重组细胞；

b7）含有b3）所述重组载体的重组细胞；

b8）含有b4）所述重组载体的重组细胞；

b9）含有b1）所述核酸分子的重组微生物；

b10）含有b2）所述表达盒的重组微生物；

b11）含有b3）所述重组载体的重组微生物；

b12）含有b4）所述重组载体的重组微生物；

所述梭菌为Clostridium sp. WK，所述Clostridium sp. WK的保藏编号为GDMCC No:61493；

所述二级醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

3.靶向上调二级醇脱氢酶的表达量和/或增强二级醇脱氢酶活性的试剂在（a1）～（a4）中至少一种中的应用；

（a1）促进梭菌中丁醇的生成；

（a2）促进梭菌中乙醇的生成；

（a3）制备促进梭菌中丁醇的生成的产品；

（a4）制备促进梭菌中乙醇的生成的产品；

所述梭菌为Clostridium sp. WK，所述Clostridium sp. WK的保藏编号为GDMCC No:61493；

所述二级醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

4.一种重组梭菌的构建方法，包括如下步骤：提高梭菌中二级醇脱氢酶的含量和/或活性；所述梭菌为Clostridium sp. WK，所述Clostridium sp. WK的保藏编号为GDMCC No:61493；

所述二级醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述提高梭菌中二级醇脱氢酶的含量和/或活性的方法为在梭菌中过表达二级醇脱氢酶。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述提高梭菌中二级醇脱氢酶的含量和/或活性的方法为将二级醇脱氢酶的编码基因导入梭菌中。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于：

所述二级醇脱氢酶的编码基因通过重组载体导入梭菌中；所述重组载体为将所述二级醇脱氢酶的编码基因插入表达载体的多克隆位点后得到的载体。

8.一种重组梭菌，通过权利要求4～7中任一种构建方法得到。

9.权利要求8所述的重组梭菌在制备溶剂中的应用，所述溶剂包含丁醇、异丙醇、乙醇中的至少一种。

10.一种制备溶剂的方法，将权利要求8所述的重组梭菌接种至厌氧培养基，发酵；所述溶剂包含丁醇、异丙醇、乙醇中的至少一种。

11.如下e1）～e5）中任一种方法：

e1）一种提高梭菌碳源消耗量的方法，将梭菌接种至厌氧培养基，发酵；所述厌氧培养基包含铁盐；

e2）一种促进梭菌生长的方法，将梭菌接种至厌氧培养基，发酵；所述厌氧培养基包含铁盐；

e3）一种促进梭菌中丁醇生成的方法，将梭菌接种至厌氧培养基，发酵；所述厌氧培养基包含铁盐；

e4）一种促进梭菌中乙醇生成的方法，将梭菌接种至厌氧培养基，发酵；所述厌氧培养基包含铁盐；

e5）一种促进梭菌中异丙醇生成的方法，将梭菌接种至厌氧培养基，发酵；所述厌氧培养基包含铁盐；

所述梭菌为权利要求8所述的重组梭菌。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：

所述铁盐包含FeCl₃、Fe₂(SO₄)₃中的至少一种。

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