CN113106113A - 一种重组菌及其构建与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种重组菌及其构建与应用。该重组菌包含重组质粒，重组质粒包含如下基因片段：琼胶酶基因、基因簇和新琼二糖水解酶基因。该重组菌通过将琼胶酶系导入梭菌并实现其分泌性表达，首次在梭菌中搭建琼胶酶的细胞外表达的体系，同时，提高了其直接利用琼胶多糖转化生物丁醇的能力；该重组菌通过将生物质酶解与丁醇发酵相结合，实现酶解与发酵的同步进行，不仅赋予野生型产溶剂梭菌原本没有的降解琼胶多糖的能力，也解决了酶解过程的反馈抑制作用，大大简化步骤和降低生产成本，效果也明显优于体外酶的物理混合处理。

Description

一种重组菌及其构建与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种重组菌及其构建与应用。

背景技术

伴随当今世界经济的飞速发展，人类对能源的需求日益增加，然而石油、天然气等不可再生的化石燃料能源不仅面临枯竭的危险，其开采和利用过程对环境污染的影响也同样不容忽视，因此，开发和利用新能源成为当前应对能源问题的迫切需求。生物燃料以其可循环性、环保性及可再生等优点，已成为替代化石燃料的最佳选择，而生物丁醇作为生物燃料的一员，以其低蒸发，高热值和低腐蚀性，可通过管道进行运输，且燃烧后不产生氮化物和硫化物等诸多优势优点，成为了继生物乙醇后的又一种新型的极富潜力的燃油替代品。目前，传统的生物丁醇发酵过程通常依赖人类可食用粮食作为原材料，如玉米、大豆等，这将不可避免地引发“与人争粮、与畜争食”的问题，而现阶段正在逐步开发的以木质纤维素材料作为原料的第二代生物质，则需要复杂的前处理工艺，在很大程度也增加了丁醇发酵的生产成本。为了实现向低原材料成本的经济型发酵工艺转换，寻找廉价的非粮食依赖型生物质资源则将是解决这一问题的关键。

相对于陆地资源，海洋生物资源极其丰富且具有可再生的特性。中国海岸线长，沿海拥有大量的可利用藻类资源，富含多糖类物质，并具备其他陆生原料所没有的优势如高光合效率、高生物量产值，不会和农作物竞争耕地、淡水资源，可在各种水域生活，显著吸收二氧化碳。此外，缺乏木质素和极少量的半纤维素等特点，进一步促使藻类生物质成为酶促水解的成功候选者，这也能极大提高了其发酵转化效率；若能建立高效体系实现利用藻类为原料转化生物燃料物质如生物丁醇的过程，将能有效缓解当前影响全球的能源危机及环境问题。但迄今为止未见相关报道。

发明内容

本发明第一方面的目的，在于提供一种重组质粒。

本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的重组质粒的构建方法。

本发明第三方面的目的，在于提供一种包含本发明第一方面的重组质粒的重组菌。

本发明第四方面的目的，在于提供本发明第三方面的重组菌在制备生物丁醇中的应用。

本发明第五方面的目的，在于提供一种生物丁醇的制备方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种重组质粒，包含如下基因片段：琼胶酶基因和新琼二糖水解酶基因。

优选地，所述琼胶酶基因的序列如SEQ ID NO.7所示。

优选地，所述新琼二糖水解酶基因的序列如SEQ ID NO.8所示。

优选地，所述重组质粒还包含如下基因片段：基因簇。

优选地，所述基因簇的序列如SEQ ID NO.9所示。

优选地，所述重组质粒以穿梭质粒为基础质粒；进一步地，所述重组质粒以大肠杆菌-梭菌穿梭质粒为基础质粒；更进一步地，所述重组质粒以pMTL83353为基础质粒。

优选地，所述重组质粒的序列如SEQ ID NO.13所示。

本发明的第二个方面，提供本发明第一方面的重组质粒的构建方法，在基础质粒中插入基因簇、琼胶酶基因和新琼二糖水解酶基因，具体如下：(1)采用限制性内切酶NdeI、Sac I分别对基因簇和基础质粒进行双酶切，将酶切后的基因簇连入酶切后的基础质粒，得到质粒A；(2)采用限制性内切酶Xma I、Sal I分别对琼胶酶基因和质粒A进行双酶切，将酶切后的琼胶酶基因连入酶切后的质粒A，得到质粒B；(3)采用限制性内切酶Xma I、Sal I分别对新琼二糖水解酶基因和质粒A进行双酶切，将酶切后的新琼二糖水解酶基因连入酶切后的质粒A，得到质粒C；(4)以fdx-eglA-NH2780F、fdx-eglA-NH2780R为引物、质粒C为模板，扩增得到包含Pfdx、eglA和NH2780的基因片段Pfdx-eglA-NH2780；(5)采用限制性内切酶Xho I、Hind II分别对基因片段Pfdx-eglA-NH2780和质粒B进行双酶切，将酶切后的Pfdx-eglA-NH2780连入酶切后的质粒B，得到重组质粒。

优选地，所述基础质粒为pMTL83353。

优选地，所述琼胶酶基因的序列如SEQ ID NO.7所示。

优选地，所述新琼二糖水解酶基因的序列如SEQ ID NO.8所示。

优选地，所述基因簇的序列如SEQ ID NO.9所示。

优选地，所述Pfdx-eglA-NH2780的序列如SEQ ID NO.12所示。

本发明的第三个方面，提供一种重组菌，包含本发明第一方面的重组质粒。

优选地，所述重组菌为梭菌；进一步为产溶剂梭菌；更进一步为Clostridiumsp.WK(Clostridium sp.WK于2021年2月1日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61493)。

优选地，所述重组菌通过如下方法构建：将本发明第一方面的重组质粒导入梭菌。

优选地，所述导入的方式为通过电转化技术导入。

本发明的第四个方面，提供本发明第三方面的重组菌在制备丁醇中的应用。

本发明的第五个方面，提供一种制备丁醇的方法，将本发明第三方面的重组菌接种于发酵培养基中，发酵。

优选地，所述发酵培养基包含葡萄糖和琼胶多糖；进一步地，所述发酵培养基包含13～17g/L琼胶多糖和8～12g/L葡萄糖；更进一步地，所述发酵培养基包含15g/L琼胶多糖和10g/L葡萄糖。

优选地，所述发酵培养基还包含酵母提取物、NaHCO₃、2-(N-吗啉基)乙磺酸、盐溶液、微量元素溶液、二硫苏糖醇、L-半胱氨酸、Na₂S·9H₂O、刃天青、壮观霉素。

优选地，所述盐溶液包括：NaCl、MgCl₂·6H₂O、KH₂PO₄、NH₄Cl、KCl、CaCl₂·2H₂O。

优选地，所述微量元素溶液包括：FeCl₂·4H₂O、CoCl₂·6H₂O、MnCl₂·4H₂O、ZnCl₂、H₃BO₃、Na₂MoO₄·2H₂O、NiCl₂·6H₂O、CuCl₂·2H₂O。

优选地，所述发酵的条件为25～35℃、100～200rpm下厌氧发酵90～150h。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种重组质粒，该重组质粒可以同时表达琼胶酶和新琼二糖水解酶，可以将琼胶多糖转化为半乳糖，进而用于生物燃料的制备。

本发明提供了一种重组菌，通过将琼胶酶系导入梭菌并实现其分泌性表达，首次在梭菌中搭建琼胶酶的细胞外表达的体系，同时，提高了其直接利用琼胶多糖转化生物丁醇的能力；该重组菌通过将生物质酶解与丁醇发酵相结合，实现酶解与发酵的同步进行，不仅赋予野生型梭菌原本没有的降解琼胶多糖的能力，也解决了酶解过程的反馈抑制作用，大大简化步骤和降低生产成本，效果也明显优于体外酶的物理混合处理。

本发明通过优化发酵体系(发酵培养基)，进一步提升利用琼胶多糖转化生物丁醇的水平，有效解决了现阶段生物丁醇依赖陆生植物作为原料进行生产而导致的与人争粮、争地的尴尬局面，扩大了利用丰富廉价的海洋生物质制备能源原料开发的途径。

附图说明

图1是本发明实施例的具体流程图。

图2是本发明实施例1构建的质粒pMTL-eglA-AN1的图谱。

图3是本发明实施例2中重组菌Clostridium sp.WK-AN1的琼胶酶和新琼二糖水解酶的活力测定图。

图4是本发明实施例3中野生型菌株Clostridium sp.WK与重组菌株Clostridiumsp.WK-AN1以琼胶多糖为底物发酵生物丁醇的发酵曲线图。

图5是本发明实施例3中重组菌株Clostridium sp.WK-AN1在不同碳源的培养基下发酵后的丁醇含量图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

本实施例中编码基因簇eglA的基因序列来自于菌株Clostridiumsaccharobutylicum基因组，其主要作用是负责调控下游蛋白的胞外表达，该基因簇序列包含核糖体绑定位点、启动子及梭菌特异性导肽序列，而琼胶酶Aga0283和新琼二糖水解酶NH2780基因序列则来自于菌株Aquimarina agarilytica ZC1基因组。本发明的具体流程图如图1所示。

实施例1重组菌的构建

合成基因片段eglA(基因簇)、Aga0283(琼胶酶)、NH2780(新琼二糖水解酶)：片段eglA、Aga0283、NH2780的密码子优化及基因合成均来由南京金斯瑞生物公司协助完成，方法如下：设计含有相应酶切位点的特异性引物(eglA-F:5’-GGGTTTCATATGTTTTATATATATT TG-3’(SEQ ID NO.1，下划线部分为Nde I酶切位点)、eglA-R:5’-ACCGAGCTCAGCTTCAGCTTTATAA-3’(SEQ ID NO.2，下划线部分为Sac I酶切位点)、Aga0283-F:5’-GTACCCGGGATGACAAGTTGTCAAA-3’(SEQ ID NO.3，下划线部分为Xma I酶切位点)、Aga0283-R:5’-GACGTCGACTTATTTTGCTGATCTT-3’(SEQ ID NO.4，下划线部分为Sal I酶切位点)、NH2780-F:5’-CATCCCGGGATGTTTTCACAAAAT-3’(SEQ ID NO.5，下划线部分为Xma I酶切位点)、NH2780-R:5’-GACGTCGACTTATTGTTTAACAAA-3’(SEQ ID NO.6，下划线部分为Sal I酶切位点))，使用高保真酶进行PCR从合成基因质粒中扩增获取目的片段：PCR反应体系如下：DNA模板(50-200ng)1μL、正反向引物(10μM)各1uL、dNTP 2μL、5×高保真酶反应缓冲液5μL、高保真DNA聚合酶0.5μL，补足ddH₂O至25μL；PCR反应程序为：95℃预变性5min，95℃30s，62～64℃30s，72℃0.5～2min，30个循环，最后72℃延伸10min；将扩增得到的目的片段通过琼脂糖凝胶电泳检测，并使用快速纯化试剂盒对基因片段进行纯化回收并计算基因浓度，得到基因片段eglA(SEQ ID NO.9)、Aga0283(SEQ ID NO.7)、NH2780(SEQ ID NO.8)。

采用限制性内切酶(Nde I、Sac I)分别对基因片段eglA和pMTL83353载体进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳检测双酶切产物，并使用DNA回收试剂盒回收双酶切产物，随后将酶切后的基因片段eglA和线性化载体pMTL83353进行连接反应，得到载体A(含eglA的pMTL83353载体)；然后采用限制性内切酶(Xma I、Sal I)对基因片段Aga0283和载体A进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳检测双酶切产物，并使用DNA回收试剂盒回收双酶切产物，随后将酶切后的基因片段Aga0283和线性化载体A进行连接反应，得到载体B(含eglA、Aga0283的pMTL83353载体)；同时采用限制性内切酶(Xma I、Sal I)对基因片段NH2780和载体A进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳检测双酶切产物，并使用DNA回收试剂盒回收双酶切产物，随后将酶切后的基因片段NH2780和线性化载体A进行连接反应，得到载体C(含eglA、NH2780的pMTL83353载体)；随后以fdx-eglA-NH2780F/R(Pfdx-eglA-NH2780F:5’-CCGCTCGAGGTGTAGTAGCCT-3’(SEQ ID NO.10，下划线部分为XhoI酶切位点)、Pfdx-eglA-NH2780R:5’-CCCAAGCTTTTATTGTTTAACA-3’(SEQ ID NO.11，下划线部分为Hind III酶切位点)为引物，载体C为模板，扩增得到包含Pfdx、eglA和NH2780的基因片段Pfdx-eglA-NH2780(SEQ ID NO.12)；最后采用限制性内切酶(Xho I、Hind II)对基因片段P fdx-eglA-NH2780和载体B进行双酶切，并使用DNA回收试剂盒回收双酶切产物，随后将酶切后的基因片段Pfdx-eglA-NH2780和线性化载体B进行连接反应，得到载体D。将载体D转化到大肠杆菌DH5α菌株，利用质粒具有的壮观霉素抗性对阳性单克隆进行筛选，挑取单克隆菌落，通过菌落PCR验证连接成功并测序核对，得到琼胶酶系外源表达载体，命名为p MTL-eglA-AN1(SEQID NO.13)，图谱如图2所示。

上述双酶切按照以下体系在冰上操作：目的DNA片段(1μg)、10×酶切通用缓冲液5μL、上下游DNA限制性内切酶各1μL，补足ddH₂O至50μL，37℃条件下反应12h；上述连接反应的酶连体系如下：载体片段0.03pmol、目的DNA片段0.3pmol、T4 DNA连接酶1μL、10×T4 DNA反应缓冲液1μL，补足ddH₂O至25μL，置于16℃反应30min。

采用电转化技术将质粒pMTL-eglA-AN1导入Clostridium sp.WK(Clostridiumsp.WK于2021年2月1日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61493)中(通过2mm电击杯和2～5ms的电转时间，电压1～3kV完成电转化过程)。将电转恢复的菌液涂布于含有250mg/mL壮观霉素的琼脂平板上培养过夜，挑选阳性单克隆菌落，使用蛋白酶K预处理，进行菌液PCR，验证质粒是否成功导入梭菌，并在平板上观察有无透明水解圈，若有明显透明水解圈，证明重组子分泌型琼胶酶具有酶活性，得到重组菌Clostridium sp.WK-AN1。

实施例2重组菌Clostridium sp.WK-AN1分泌琼胶酶的酶活分析

将重组菌Clostridium sp.WK-AN1种子液接种到含250mg/mL壮观霉素的基础培养基中(ACM，其包含：葡萄糖，10g/L；酵母提取物，10g/L；NaHCO₃，2.52g/L；2-(N-吗啉基)乙磺酸，2.132g/L；100×盐溶液，10mL/L；1000×微量元素溶液，1mL/L；去氧还原剂：二硫苏糖醇，0.077g/L；L-半胱氨酸，0.0242g/L；Na₂S·9H₂O，0.0156g/L；及厌氧指示剂：刃天青，0.001g/L；其中100×盐溶液包括NaCl，1.0g/L；MgCl₂·6H₂O，0.5g/L；KH₂PO₄，0.2g/L；NH₄Cl，0.3g/L；KCl，0.3g/L；CaCl₂·2H₂O，0.015g/L；1000×微量元素溶液包括FeCl₂·4H₂O，1.5g/L；CoCl₂·6H₂O，0.19g/L；MnCl₂·4H₂O，0.1g/L；ZnCl₂，0.07g/L；H₃BO₃，0.006g/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.036g/L；NiCl₂·6H₂O，0.024g/L；CuCl₂·2H₂O，0.002g/L)，于37℃、150rpm恒温培养12～14h，待菌液OD₆₀₀达到1.8～2.0后，将活化的种子液按4％接种量转接至含250mg/mL壮观霉素的发酵培养基(AFM，含有15g/L琼胶多糖的基础培养基)中，随发酵时间定点菌液供琼胶酶Aga0283和新琼二糖水解酶NH2780的酶活力测定，重复3次。

1.琼胶酶Aga0283的酶活力测定

琼胶酶Aga0283的酶活力测定利用其降解产物还原性末端与3,5-二硝基水杨酸结合发生显色反应，颜色变化与所生成的还原糖含量正比即酶活力，其酶活力单位U定义为每分钟催化产生1μmol还原糖所用酶量。

首先构建半乳糖标准曲线(横坐标为半乳糖浓度，纵坐标为OD_{540 nm})，然后以0.3％琼脂糖的20mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液为底物，反应体系为800μL反应底物加200μL酶液(阴性对照组加入等量经沸水浴加热15min灭活处理的酶液)，40℃反应20min，加入1mL DNS(3,5-二硝基水杨酸)沸水浴显色10min，立即冷却终止反应，向反应体系中加蒸馏水定容至10mL，于540nm处检测吸光度，将与阴性对照组吸光度差值带入标准曲线计算出生成的半乳糖浓度，然后定量计算出琼胶酶Aga0283的酶活力，结果如图3所示：培养至48h时，Aga0283酶活性呈现最强，为1.0U/mL，培养至96h时仍保持最高酶活力的74％琼胶酶活力。

2.新琼二糖水解酶NH2780的酶活力测定

新琼二糖水解酶的酶活力测定主要通过α-半乳糖苷酶活性检测试剂盒完成，α-半乳糖苷酶活性检测试剂盒是专门精密检测反应体系中半乳糖的生成量，在570nm处测定吸光度，颜色深浅与半乳糖生成量成正比，即与酶活性成正比。

首先构建半乳糖标准曲线(横坐标为半乳糖浓度，纵坐标为OD_570nm)，然后通过检测在新琼二糖水解酶NH2780作用下，以新琼二糖为底物释放出来半乳糖的含量，其酶活力单位U同样定义为每分钟转化1μmol的半乳糖所需要的酶量。反应体系为50μL样品反应液(25μL粗酶液(阴性对照组加入等量经沸水浴加热15min灭活处理的酶液)+25μL 2mM新琼二糖)，44μL半乳糖检测缓冲液，2μL半乳糖探针溶液，2μL半乳糖酶混合液，2μL辣根过氧化物酶，混合均匀后，37℃温水浴30min，于570nm检测吸光度值，将与阴性对照组吸光度差值带入标准曲线计算出半乳糖的生成量，然后定量计算出新琼二糖水解酶NH2780的酶活力。结果如图3所示：培养到24h时，NH2780酶活性最强，可达3.79mU/mL，但随着发酵时间的延长，酶活力则逐渐下降。

实施例3以琼胶多糖为底物发酵生物丁醇

本实施例通过优化琼脂发酵培养基，实行混合碳源发酵的模式，以实现工程菌株有效利用琼胶多糖转化生物丁醇的过程。配置以10g/L葡萄糖与15g/L琼胶多糖为碳源的发酵培养基(即实施例2中的含250mg/mL壮观霉素的发酵培养基)50mL，分装至厌氧血清瓶中，充氮气10min去除瓶内空气，盖紧胶塞和铝帽后，往培养基中注入已充氮气的1mL 1M HCl溶液；将配置好的培养基121℃灭菌，冷却至室温后调节pH至6.0，供后续发酵实验使用。

按接种量4％将实施例1得到的工程菌株Clostridium sp.WK-AN1菌液接种到上述发酵培养基中(以野生型菌株Clostridium sp.WK(Clostridium sp.WK于2021年2月1日保藏于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：61493)作为对比，以充分体现改造后工程菌株的转化能力)，于30℃、150rpm恒温发酵120h，，重复3次，分别在接种后的0、12、24、48、72、96和120h定时取样检测菌体生长量，以及收集发酵液经气相色谱分析检测发酵产物中生物丁醇的含量，并计算生物丁醇的产率，生物丁醇的产率计算方式如下：生物丁醇产率＝生物丁醇总产量(g)/底物总糖含量(g)。结果如图4所示：菌株Clostridium sp.WK-AN1可以明显提升其利用培养基中琼胶多糖的效率，继而提高生物丁醇的产量和转化效率：在同样发酵培养条件下，菌株Clostridiumsp.WK-AN1在发酵120h时的丁醇产量比对照野生菌株Clostridium sp.WK提高了127％(由2.6g/L提高到了5.9g/L)；转化效率也由对照野生菌的10％提高到了24％；表明本实施例已成功改造现有产溶剂梭菌，赋予其直接转化琼胶多糖生产生物丁醇的能力。

同时，按接种量4％将实施例1得到的工程菌株Clostridium sp.WK-AN1菌液接种到不同碳源的发酵培养基中(如图5所示：其中，“10g/L葡萄糖”表示与实施例2中的含250mg/mL壮观霉素的发酵培养基的区别在于：不含琼胶多糖，葡萄糖浓度为10g/L；“5g/L琼胶多糖+10g/L葡萄糖”表示与实施例2中的含250mg/mL壮观霉素的发酵培养基的区别在于：葡萄糖浓度为10g/L，琼胶多糖浓度为5g/L；“10g/L琼胶多糖+10g/L葡萄糖”表示与实施例2中的含250mg/mL壮观霉素的发酵培养基的区别在于：葡萄糖浓度为10g/L，琼胶多糖浓度为10g/L；“15g/L琼胶多糖+10g/L葡萄糖”表示与实施例2中的含250mg/mL壮观霉素的发酵培养基的区别在于：葡萄糖浓度为10g/L，琼胶多糖浓度为15g/L；“20g/L琼胶多糖+10g/L葡萄糖”表示与实施例2中的含250mg/mL壮观霉素的发酵培养基的区别在于：葡萄糖浓度为10g/L，琼胶多糖浓度为20g/L)于30℃、150rpm恒温发酵120h，，重复3次，收集发酵液经气相色谱分析检测发酵产物中生物丁醇的含量，结果如图5所示：“10g/L葡萄糖”、“5g/L琼胶多糖+10g/L葡萄糖”、“10g/L琼胶多糖+10g/L葡萄糖”、“15g/L琼胶多糖+10g/L葡萄糖”、“20g/L琼胶多糖+10g/L葡萄糖”对应的丁醇含量分别是：2.58g/L、3.19g/L、3.68g/L、5.90g/L、4.13g/L，可见实施例2中的含250mg/mL壮观霉素的发酵培养基的丁醇产量远高于其他培养基；在该优化体系下可以显著提升其底物利用效率及其丁醇转化效率。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 汕头大学

<120> 一种重组菌及其构建与应用

<130>

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gggtttcata tgttttatat atatttg 27

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

accgagctca gcttcagctt tataa 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtacccggga tgacaagttg tcaaa 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacgtcgact tattttgctg atctt 25

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

catcccggga tgttttcaca aaat 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gacgtcgact tattgtttaa caaa 24

<210> 7

<211> 2085

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgacaagtt gtcaaaataa tgcaccaaag aaaacagtta aaccaacaga aactaaaaat 60

tctaatgaat tagtattatt agattttaat aatggaatag atgcagctac agttaaaact 120

gatgatgcta aatttgaagt tgtaaaagat gataatggag cacaattatt agtttctaca 180

aattcaaata ttattaaacc aggattagta atacataaac cagctaataa aacttgggat 240

ttaaatggat attatcaagt aaaagcagat gttacaaatg taggagatac tccaatgcaa 300

gtagaatttt atgttggaaa tgatccagat gaattaataa aatggtattg ttcagattat 360

gctgatttag aaccaaaaga aagtaaaaca attactgtaa atttagcatg gtctgattgg 420

gttcatcaac cacaattaga tattgtagga atgagaggaa caccaggaaa attaaaaact 480

aatatagcag ctatagatga agttagtttt tattctagat atgctaaagt accaaatcaa 540

tttacagtta ataatgttag agcagttgga aaattagaaa ttaaagatac aactaatttc 600

tttccattta ttgataaatt tggacaatat gctcataaag aatggaaagg aaaaacacat 660

actgcagatg atataaagaa aaatgcagaa aaagaattag ctgaattagc agcttcacca 720

gaaccaaaaa atagaaataa atatggagga tggactgcag gaccaaaatt aaaagctaca 780

ggatttttca gaactgaaaa acatgatgga aaatggtgga tggttgatcc agaaggatat 840

ttattttgga gtaatggagt aaattgtgtt gcatctgatg ctgtatttac aggaactcaa 900

tatagagaaa aatattttga taatttacca acaaaagatg attcagaata tggacaattt 960

tatgaagttt caaaacatag tactcatgga ttttatcatg ataaagtacc ttatgatagt 1020

tataattttt atcaagcaaa tttatataaa aaatatggaa aagattggtt agaaaaattt 1080

agagaattat ctcataaaag attaagatca tggggattaa atacaattgg atttgtttca 1140

gataatggag cattagctaa aagaaaaaca ccttatgttg gatcaatatg gattaatgat 1200

actccaaaaa taaaaggaag tgttggattt tggggaaaat ttcatgatgt atttgatcca 1260

aaatttagaa aagcagtaaa taaatctgtt gcttcacaaa aatatggagc aggagatcca 1320

tggtgtattg gatattttat agataatgaa ttagcatggg gaagtgttgg atctttagca 1380

ataggagctt taaaatcacc agcaagtcaa ccagctaaaa ttgaatttat taaagattta 1440

aagaaaaaat atcaaacaat tgataaatta aataatcaat ggggaacaac tcatgcttct 1500

tggaaagcat tagctgattc aactagtgca ccagaaatgg caaaagctaa agaagattta 1560

gtaacatttt atgaaaaaat agctgatact tattttagaa ttataaaaga aggattaaat 1620

acaatagcac caaaacaaaa ttatttagga tgtagatttg catgggctaa taatgatgtt 1680

gtattaactg cagctagtaa atatatggat attatgtctt ttaataaata tgaatatagt 1740

gtagaaaatg ttggattacc aaaaggagtt gataaaccaa taatgatagg agaatttcat 1800

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<210> 8

<211> 2052

<212> DNA

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<400> 8

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ggagttgaag taactttatt agaagataat ttaaaaatga caactacaaa tacaggacaa 120

ttttcattta atgctttaag tgcaggagat aaaactttat attttaataa agaaggatat 180

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aagaaaataa gtactgcaac agttagatgg aataaatatt tagaatcatg tactaattat 300

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tataatgata aatattatgt ttggtattct agaaaattaa ctcaaacatc aacttatttt 480

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tattaacttg ttttcaaaaa tcaaaaaaat taattttttt aaaaaaacat tttctttttt 480

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

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aatagctgat acttatttta gaattataaa agaaggatta aatacaatag caccaaaaca 2220

aaattattta ggatgtagat ttgcatgggc taataatgat gttgtattaa ctgcagctag 2280

taaatatatg gatattatgt cttttaataa atatgaatat agtgtagaaa atgttggatt 2340

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gatcaaagta aagaaatact tatacaaaaa attagaccta tttcaaagaa aataggagat 7620

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aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 8580

accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 8640

gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt 8700

ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac 8760

gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 8820

gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 8880

ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 8940

aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 9000

gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 9060

tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 9120

agagcgccca atacgcaggg ccccctgctt cggggtcatt atagcgattt tttcggtata 9180

tccatccttt ttcgcacgat atacaggatt ttgccaaagg gttcgtgtag actttccttg 9240

gtgtatccaa cggcgtcagc cgggcaggat aggtgaagta ggcccacccg cgagcgggtg 9300

ttccttcttc actgtccctt attcgcacct ggcggtgctc aacgggaatc ctgctctgcg 9360

aggctggccg gctaccgccg gcgtaacaga tgagggcaag cggatggctg atgaaaccaa 9420

gccaaccagg aagggcagcc cacctatcaa ggtgtactgc cttccagacg aacgaagagc 9480

gattgaggaa aaggcggcgg cggccggcat gagcctgtcg gcctacctgc tggccgtcgg 9540

ccagggctac aaaatcacgg gcgtcgtgga ctatgagcac gtccgcgagc tggcccgcat 9600

caatggcgac ctgggccgcc tgggcggcct gctgaaactc tggctcaccg acgacccgcg 9660

cacggcgcgg ttcggtgatg ccacgatcct cgccctgctg gcgaagatcg aagagaagca 9720

ggacgagctt ggcaaggtca tgatgggcgt ggtccgcccg agggcagagc catgactttt 9780

ttagccgcta aaacggccgg ggggtgcgcg tgattgccaa gcacgtcccc atgcgctcca 9840

tcaagaagag cgacttcgcg gagctggtga agtacatcac cgacgagcaa ggcaagaccg 9900

atcgggcccc ctgcaggata aaaaaattgt agataaattt tataaaatag ttttatctac 9960

aattttttta t 9971

Claims (10)

1.一种重组质粒，包含如下基因片段：琼胶酶基因和新琼二糖水解酶基因。

2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于：

所述重组质粒还包含如下基因片段：基因簇；

优选地，所述基因簇的序列如SEQ ID NO.9所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组质粒，其特征在于：

所述琼胶酶基因的序列如SEQ ID NO.7所示；

所述新琼二糖水解酶基因的序列如SEQ ID NO.8所示。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于：

所述重组质粒以穿梭质粒为基础质粒。

5.权利要求4所述的重组质粒的构建方法，其特征在于：在基础质粒中插入基因簇、琼胶酶基因和新琼二糖水解酶基因。

6.一种重组菌，包含权利要求1～4中任一项所述的重组质粒。

7.根据权利要求6所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为梭菌。

8.权利要求6或7所述的重组菌在制备丁醇中的应用。

9.一种制备丁醇的方法，其特征在于：将权利要求6或7所述的重组菌接种于发酵培养基中，发酵。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

所述发酵培养基包含葡萄糖和琼胶多糖；

优选地，所述发酵的条件为25～35℃、100～200rpm下厌氧发酵90～150h。

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