CN103468661A - 一种新琼二糖水解酶及其应用 - Google Patents

一种新琼二糖水解酶及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103468661A
CN103468661A CN201310464165XA CN201310464165A CN103468661A CN 103468661 A CN103468661 A CN 103468661A CN 201310464165X A CN201310464165X A CN 201310464165XA CN 201310464165 A CN201310464165 A CN 201310464165A CN 103468661 A CN103468661 A CN 103468661A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fine jade
new fine
ahg
neoagarobiose
disaccharide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201310464165XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN103468661B (zh
Inventor
毛相朝
刘楠
杨孟
魏东芝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ocean University of China
Original Assignee
Ocean University of China
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ocean University of China filed Critical Ocean University of China
Priority to CN201310464165.XA priority Critical patent/CN103468661B/zh
Publication of CN103468661A publication Critical patent/CN103468661A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103468661B publication Critical patent/CN103468661B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

本发明的目的在于提供一种新琼二糖水解酶，其氨基酸序列为SEQ IDNO:1；本发明的新琼二糖水解酶能够降解新琼二糖产生L-3，6-内醚半乳糖(L-AHG)和D-半乳糖，因此可以用于纯的L-3，6-内醚半乳糖的制备。新琼二糖水解酶作为一种的可以生产L-AHG的生物催化剂，因其反应环境友好，催化活性高，对比化学方法有着一定优势，其具有良好的应用潜力和前景。L-AHG作为内醚糖的一种，有很好的美白和抗炎活性，在医药和化妆品方面有很好的潜在应用价值。本发明的大肠杆菌重组株，pETNA/BL21所表达的重组琼胶酶占总蛋白的28%，表达水平高，易于纯化，且连续传代后表达量未有所降低。所以可以通过本发明大量制备重组新琼二糖水解酶和L-3，6-内醚半乳糖。

Description

一种新琼二糖水解酶及其应用
技术领域
本发明属于功能基因筛选技术领域，具体涉及一种新琼二糖水解酶及应用。
技术背景
新琼二糖水解酶是一种降解新琼二糖的水解酶，水解断裂新琼二糖的α-1,3键，生成L-3，6-内醚半乳糖(L-AHG)和D-半乳糖。新琼二糖是某些琼胶酶水解琼胶的水解产物。L-AHG自然存在是作为琼脂糖中L-AHG和半乳糖的更替单元的一个单体，而琼脂糖是红色巨藻的主要组成成分(Rhodophyta)。迄今为止，即使是以试剂的形式，L-AHG没有市售，亦没有化学合成的报道。L-AHG作为内醚糖的一种，有很好的美白和抗炎活性，在医药和化妆品方面有很好的潜在应用价值。新琼二糖水解酶作为一种的可以生产L-AHG的生物催化剂，因其反应环境友好，催化活性高，对比化学方法有着一定优势，其具有良好的应用潜力和前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新琼二糖水解酶及其应用，从而弥补现有技术的不足。
本发明的新琼二糖水解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；
编码上述新琼二糖水解酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
本发明还提供一种重组表达载体，用于表达氨基酸序列为SEQ ID NO:1的新琼二糖水解酶；
本发明的新琼二糖水解酶用于降解新琼2糖来制备L-3，6-内醚半乳糖。
本发明的新琼二糖水解酶能够降解新琼二糖产生L-3，6-内醚半乳糖(L-AHG)和D-半乳糖，因此可以用于纯的L-3，6-内醚半乳糖的制备。新琼二糖水解酶作为一种可以生产L-AHG的生物催化剂，因其反应环境友好，催化活性高，对比化学方法有着较大优势，其具有良好的应用潜力和前景；该方法不仅避免了传统制备方法中强酸的使用带来的环境污染，而且避免了强酸过度降解L-AHG产生5-羟基-甲基糠醛（HMF）等毒副产物，因此，具有重要的开发价值。L-AHG作为内醚糖的一种，有很好的美白和抗炎活性，在医药和化妆品方面有很好的潜在应用价值。
附图说明
图1：本发明的新琼二糖水解酶亲和层系后的纯酶SDS-PAGE电泳图，M为Marker。
图2：本发明的新琼二糖水解酶水解产物TLC结果，表明新琼二糖被水解为L-3，6-内醚半乳糖和D-半乳糖新琼四糖被水解为L-3，6-内醚半乳糖和琼三糖；其中1为新琼二糖水解产物，2为新琼四糖水解产物。
图3：本发明的新琼二糖水解酶，pH变化对相对酶活的影响（数据均为最少三次重复取平均值）
图4：本发明的新琼二糖水解酶，温度变化对相对酶活的影响（数据均为最少三次重复取平均值），◆代表热稳定性，■代表最适温度。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实施例中所用到的实验条件可以根据已有技术进行选择。对于实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
对于本发明中的术语解释如下:
1、新琼二糖水解酶：糖苷水解酶，以新琼二糖为底物水解，产物为L-3，6-内醚半乳糖(L-AHG)和D-半乳糖两种单糖。
2、新琼2糖：两种单糖L-3，6-内醚半乳糖（AHG）和D-半乳糖（D-Gal）α-1,3键连接形成的二糖。
3、L-3，6-内醚半乳糖：3，6位羟基脱水形成内醚键的L型半乳糖。
实施例1新琼二糖水解酶基因的克隆
用简并引物PCR以及巢式PCR克隆淡黄色噬琼胶菌WH0801（=NRRLB-59247(T)=CGMCC1.10131(T)）中的新琼二糖水解酶基因。具体操作：在2216E海水培养基中培养淡黄色噬琼胶菌WH0801直到对数末期，提取DNA基因组。利用特定简并引物来进行扩增，简并引物的序列如下：5’-GGYDCSTAYGATGATCGYAGCGTKTTYACC-3’;5’-GGTRTTTTKTTCCGGRCCATCGGTG-3’，以基因组为模板，条件为：94℃5分钟，然后94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟3个步骤进行30个循环，进行PCR，得到了产物为新琼二糖水解酶基因的片段，再以片段末端序列设计引物，进行一次三轮的巢式PCR回收其中大小在500Kb-2000Kb的PCR产物片段(利用takara公司染色体步移试剂盒)。其中各步骤中的PCR产物均连接T-A克隆载体后转化DH5α挑去单克隆测序。最后拼接最初的片段和巢式PCR所得基因片段，得到新琼二糖水解酶基因的全长序列，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2，编码的新琼二糖水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。用全长序列以全长序列上游引物和下游引物（5’-CCGGAATTCATGACATTTACTAAAAGC-3’;5’-CGAGCTCTTTTTGTAACGCAGATTATATAGATC-3’）从DNA中进行扩增，多次测序结果表明全长片段测序确定序列无误。新琼二糖水解酶基因和NCBI中已知表征的基因相比对，和已结晶来源于Saccharophagus Degradans2-40的新琼二糖水解酶基因相似性为74%。说明在序列上此新琼二糖水解酶基因为一个全新的基因。
实施例2含新琼二糖水解酶基因表达质粒pETNA的构建
根据新琼二糖水解酶基因的全长序列设计基因的上游引物和下游引物（见实施例1），以淡黄色噬琼胶菌WH0801的基因组为模板，利用PCR扩增得到新琼二糖水解酶基因的全长序列。条件为94℃2分钟，然后94℃30秒，55℃30秒，72℃1.5分钟，30个循环最后72℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳显示在1.0kb的位置有明显单一条带，将单一条带切胶回收，并用Xho1和BamH1双酶切，将表达载体pET21a也用Xho1和BamH1双酶切，然后PCR产物和酶切载体都利用试剂盒进行DNA纯化。然后按一定摩尔比例进行DNA连接反应。连接结束后，按照标准的氯化钙法热激转化将重组质粒转入DH5α，筛选具有氨苄青霉素抗性的阳性转化子。用标准碱裂解法提取质粒，将质粒用Xho1和BamH1双酶切，凝胶电泳条带显示为1.0Kb和5.3Kb两条清晰条带和新琼二糖水解酶基因全长和质粒长度相对应。证明新琼二糖水解酶基因全长序列已经克隆到表达载体中，将此重组质粒命名为pETNA。
实施例3高效表达新琼二糖水解酶基因NABHwh的工程菌pETNA/BL21的构建
将表达载体质粒pETna按照标准氯化钙热激转化转入BL21（DE3）中，筛选具有氨苄青霉素抗性的阳性转化子。用标准碱裂解法提取质粒，将质粒用Xho1和BamH1双酶切，凝胶电泳条带显示为1.0Kb和5.3Kb两条清晰条带和新琼二糖水解酶基因全长和质粒长度相对应。证明含有新琼二糖水解酶基因的表达载体质粒pETNA已经转入BL21（DE3）。
实施例4利用大肠杆菌工程菌pETNA/BL21制备重组新琼二糖水解酶
挑取大肠杆菌重组株pETNA/BL21单克隆接种在5ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，230RPM培养12小时。按1：100转接入100ml含有氨苄青霉素的液体LB培养基。37℃培养OD值600到0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养8小时。4℃，8000g离心10分钟，细胞重悬于20mM pH=8.0Tirs-盐酸缓冲液，将菌悬液置于冰上，超声破碎15分钟，12000g15分钟除去不可溶成分，上清过0.22um滤膜，上亲和层析柱fastflow his*6（GE），然后用冲洗缓冲液1ml+1ml和洗脱缓冲液0.5ml*4冲洗柱子6次，将得到的溶液分别SDS-PAGE检测，合并含有单一目的条带的洗脱液（图1）。用Lowry法测定蛋白浓度，终浓度约为0.3mg/ml。
实施例5测定重组新琼二糖水解酶最适反应条件
利用高效液相色谱测定新琼二糖水解酶反应液中的新琼二糖含量，反应条件为：测定最适pH时，30度时，在4.0-10.0的pH范围内进行反应。测定最适温度时，pH=6.0时在20-80度反应。体系为0.1%新琼二糖99uL加入1uL酶液，反应10分钟，2分钟沸水浴灭活。以.1%新琼二糖为标样。测定条件为：WatersSugar-Pak I柱子，流动相为50mg/L EDTA钙水溶液，流速为0.5mL/min。结果如图3，图4所示,重组新琼二糖水解酶的相对活性在30度和pH=6时达到峰值,其在70度或在pH=9反应时仍保有大于40%的活性，所以最适反应温度为30度，最适pH值为6.0。以此结果确定重组新琼二糖水解酶的最适反应条件。
实施例6利用重组新琼二糖水解酶生产L-3，6-内醚半乳糖
利用重组新琼二糖水解酶生产L-3，6-内醚半乳糖时，将新琼二糖溶于pH=6.0的磷酸二氢钾–氢氧化钠缓冲液（0.05M/ml），配置成0.1-0.5%的溶液。按重量比0.1-1：100加入实施例4的重组新琼二糖水解酶溶液。混合均匀后在30度为温浴12-48小时。浓缩至小于1ml上硅胶色谱柱，以正丁醇，乙醇，水（3：1：1）为流动相过柱，以薄层层析为检测手段，第一个流出的糖峰为L-3，6-内醚半乳糖。收集，浓缩，得到L-3，6-内醚半乳糖（图2）。本新琼二糖水解酶具有良好的生物催化活性，催化活性和温度稳定性和已知的新琼二糖水解酶相比均有优势，在60℃反应时，还保有一定的生物学活性。此重组酶可将新琼二糖完全水解，经过硅胶层析的L-3，6-内醚半乳糖纯度约为80%，产率为45%。综上此新琼二糖水解酶具有生产L-3，6-内醚半乳糖的工业应用潜力。
Figure IDA0000392140850000011
Figure IDA0000392140850000021
Figure IDA0000392140850000031

Claims (6)

1.一种新琼二糖水解酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.一种编码权利要求1所述的新琼二糖水解酶的基因，其核苷酸序列为SEQID NO:2。
3.一种重组表达载体，所述的重组表达载体用于表达权利要求1所述的新琼二糖水解酶。
4.一种转化体，所述的转化体携带有权利要求3所述的重组表达载体。
5.权利要求1所述的新琼二糖水解酶在降解新琼2糖来制备L-3，6-内醚半乳糖中的应用。
6.权利要求4所述的转化体在降解新琼2糖来制备L-3，6-内醚半乳糖中的应用。
CN201310464165.XA 2013-10-08 2013-10-08 一种新琼二糖水解酶及其应用 Active CN103468661B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310464165.XA CN103468661B (zh) 2013-10-08 2013-10-08 一种新琼二糖水解酶及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310464165.XA CN103468661B (zh) 2013-10-08 2013-10-08 一种新琼二糖水解酶及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103468661A true CN103468661A (zh) 2013-12-25
CN103468661B CN103468661B (zh) 2014-11-05

Family

ID=49793702

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310464165.XA Active CN103468661B (zh) 2013-10-08 2013-10-08 一种新琼二糖水解酶及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103468661B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103881995A (zh) * 2014-04-14 2014-06-25 中国海洋大学 一种降解琼脂糖生成新琼四糖的β-琼胶酶
CN108715839A (zh) * 2018-06-06 2018-10-30 中国海洋大学 一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶
CN111629733A (zh) * 2017-11-16 2020-09-04 高丽大学校产学协力团 用于产生海藻衍生的琼胶三糖的方法和其作为益生菌的用途
CN113106113A (zh) * 2021-03-15 2021-07-13 汕头大学 一种重组菌及其构建与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102405282A (zh) * 2009-03-27 2012-04-04 高丽大学校产学协力团 新的α-新琼脂二糖水解酶及使用其获得单糖类的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102405282A (zh) * 2009-03-27 2012-04-04 高丽大学校产学协力团 新的α-新琼脂二糖水解酶及使用其获得单糖类的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
NCBI: "WP_017446558", 《GENBANK》 *
吕国强: "红藻附生琼胶降解细菌的分离鉴定及HQM9琼胶酶研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑 A006-213》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103881995A (zh) * 2014-04-14 2014-06-25 中国海洋大学 一种降解琼脂糖生成新琼四糖的β-琼胶酶
CN103881995B (zh) * 2014-04-14 2016-01-20 中国海洋大学 一种降解琼脂糖生成新琼四糖的β-琼胶酶
CN111629733A (zh) * 2017-11-16 2020-09-04 高丽大学校产学协力团 用于产生海藻衍生的琼胶三糖的方法和其作为益生菌的用途
US11872253B2 (en) 2017-11-16 2024-01-16 Korea University Research And Business Foundation Method for producing marine algae-derived agarotriose, and use thereof as prebiotic
CN108715839A (zh) * 2018-06-06 2018-10-30 中国海洋大学 一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶
CN108715839B (zh) * 2018-06-06 2022-03-29 中国海洋大学 一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶
CN113106113A (zh) * 2021-03-15 2021-07-13 汕头大学 一种重组菌及其构建与应用
CN113106113B (zh) * 2021-03-15 2022-12-06 汕头大学 一种重组菌及其构建与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN103468661B (zh) 2014-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103881995B (zh) 一种降解琼脂糖生成新琼四糖的β-琼胶酶
CN104762281B (zh) 一种α‑鼠李糖苷酶及其制备方法和应用
CN108330119B (zh) 一种壳聚糖酶及其在壳寡糖制备中的应用
CN103468661B (zh) 一种新琼二糖水解酶及其应用
CN103540579B (zh) 一种β-琼胶酶及其应用
CN108342374B (zh) 一种甲壳素酶及其应用
CN111500555B (zh) 壳聚糖酶OUC-CsnCA及其应用
CN108753747B (zh) 一种热稳定性和海藻糖产量提高的MTSase突变体
CN116024198A (zh) λ-卡拉胶酶CglA-FFWV33在制备λ-卡拉胶寡糖中的应用
CN114480350B (zh) 卡拉胶酶在降解κ-卡拉胶和红藻胶中的应用
CN112725319A (zh) polyG底物特异性的褐藻胶裂解酶FaAly7及其应用
CN108531470B (zh) 一种硫酸岩藻多糖裂解酶tflfm及其制备方法和应用
CN108165541A (zh) 一种具有β-半乳糖苷酶活性的酶蛋白及其应用
CN108753746B (zh) 一种热稳定性提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体
CN106754848B (zh) 一种热稳定性提高的碱性果胶酶突变体
CN111235131A (zh) 一种壳聚糖酶及其应用
CN108410843B (zh) 一种新普鲁兰酶与其编码基因和应用
CN110592119A (zh) 一种来源于类芽孢杆菌新型普鲁兰酶及其基因与应用
CN107779443B (zh) 纤维二糖水解酶突变体及其应用
CN114164224B (zh) 一种低温脱苦酶的制备方法
CN114015675B (zh) λ-卡拉胶酶OUC-LuV及其应用
CN109022397A (zh) 一种降解主产物为新琼二糖的内切型β-琼胶酶及其应用
CN111849949B (zh) 一种甘露糖醛酸c-5差向异构酶/海藻酸裂解酶编码基因及酶和制备与应用
CN116640747B (zh) 壳聚糖酶OUC-CsnA4-S49P及其应用
Han et al. Deletion of a non-catalytic region increases the enzymatic activity of a β-agarase from Flammeovirga sp. MY04

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant