CN108715839A - 一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶 - Google Patents
一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶 Download PDFInfo
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Abstract
本发明的目的是提供一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶，该新琼二糖水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。本发明所提供的热稳定性提高的新琼二糖水解酶，相比较原始酶而言，该突变子的最适温度提高了3℃，半衰温度提高了2.5℃，半衰期t1/2也有了显著提高，其热稳定性显著增强，在40℃保温40min仍然能够水解底物新琼二糖，且该突变子的酶活较原始酶提高了约15％。
Description
技术领域
本发明属于酶改造技术领域，具体涉及一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶。
背景技术
新琼二糖水解酶是一类能够水解新琼二糖或新琼寡糖生成单糖和琼寡糖的酶，对微生物的新陈代谢具有重要意义。其水解产物3,6-内醚-L-半乳糖(L-AHG)生理活性多样，在医药、生物领域都有巨大的应用价值。研究表明，在许多领域，奇数型琼寡糖的性质显著优于新琼寡糖，因此对新琼二糖水解酶的研究打破了目前琼寡糖无法工业化生产的困境。
温度是酶催化反应中的重要影响因素，在一定范围内随着温度的升高反应速率加快，但过高的温度会降低酶的活性甚至使酶失活。酶的热稳定性是指酶经过一定温度的孵育还能保存的酶活性。虽然自然界中存在嗜热菌，但数量极少，无法实现工业上的要求。提高酶的热稳定性可以使酶的作用环境更加广泛、延长酶反应的时间、降低成本，在工业上具有良好的应用前景。
新琼二糖水解酶AgWH117A是参与琼脂代谢的关键酶，保证了微生物对新琼二糖的降解利用，其能够降解新琼寡糖生成内醚半乳糖和奇数琼寡糖的性质也具有极大的工业价值。但在使用过程中发现，对该酶进行固定化时存在热稳定性差的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶，该新琼二糖水解酶相比于未改造的蛋白酶具有更好的热稳定性。
本发明所提供的热稳定性提高的新琼二糖水解酶，是氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶的第134位由K变为D；
所述的氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶，其编码基因的核苷酸序列为SEQ IDNO:2；
本发明所提供的热稳定性提高的新琼二糖水解酶,其氨基酸序列为SEQ ID NO:3；
编码本发明新琼二糖水解酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
本发明还提供一种重组表达载体，用于表达氨基酸序列为SEQ ID NO:3的新琼二糖水解酶。
本发明的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的新琼二糖水解酶用于降解新琼2糖来制备3,6-内醚-L-半乳糖(L-AHG)。
本发明所提供的热稳定性提高的新琼二糖水解酶，相比较原始酶而言，该突变子的最适温度提高了3℃，半衰温度提高了2.5℃，半衰期t1/2也有了显著提高，其热稳定性显著增强，在40℃保温40min仍然能够水解底物新琼二糖，且该突变子的酶活较原始酶提高了约15％。
附图说明
图1：各待筛选突变体位点的热稳定性结果图；
图2：K134D和原始酶的热稳定性曲线图；
图3：K134D和原始酶不同温度下酶失活实验结果图；
图4：AgWH117原始酶A和突变体K134D最适温度曲线图；
图5：AgWH117原始酶A和突变体K134D最适pH曲线图。
具体实施方式
新琼二糖水解酶AgWH117A(氨基酸序列为SEQ ID NO:1，一种编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2)是参与琼脂代谢的关键酶，保证了微生物对新琼二糖的降解利用，其能够降解新琼寡糖生成内醚半乳糖和奇数琼寡糖的性质也具有极大的工业价值。本发明对AgWH117A进行了定点饱和突变，筛选获得了热稳定性显著提高的酶。
本发明所使用的材料及试剂如下：
Luria-Bertani(LB)培养基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，去离子水溶解后，在121℃下高压灭菌20min。
相应的固体培养基的制作方法为在上述液体培养基中加入约1.5％的琼脂粉，经121℃高压灭菌20min。待培养基温度降至50℃左右加入氨苄青霉素，浓度为100mg/L。然后将其倒入已经过灭菌的的培养皿中，确认其冷却凝固后使用。
琼脂糖均购买自美国Sigma公司。氨苄青霉素和异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购买自上海生工生物工程有限公司。蛋白胨和酵母提取物购买自OXOID公司。引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。所有测序服务为华大基因公司提供。其他常规试剂均为国产分析纯。
大肠杆菌质粒小提试剂盒、考马斯亮蓝染液和Branford蛋白浓度定量试剂盒购买自北京天根生化科技有限公司。QuickChange Lightning Site-Dierected MutagenesisKits试剂盒购买自Stratagene公司(安捷伦)，用于点突变实验。消化酶DpnI购买自ThermoScientific公司。用于蛋白变性凝胶电泳SDS-PAGE的相应试剂购买自上海捷瑞生物科技有限公司。DNA Marker和Protein Marker购买自Takara公司。
所使用的检测方法如下：
1)酶活检测
标准反应条件为：20mM，pH 6.0的柠檬酸钠缓冲液(包含有0.1％(w/v)新琼二糖作为反应底物)99μL，酶液1μL，30℃水浴10min，然后加热煮沸2min用以终止整个反应。采用高效液相色谱(HPLC)检测底物减少量，最终确定酶活。新琼二糖水解酶的酶活定义如下：在标准反应条件下，每分钟水解1μM新琼二糖所需要的酶量定义为1个单位(U)酶活。
2)酶学性质检测
酶的最适温度考量通过检测酶液在不同温度(25-50℃)下的酶活以确定。最适pH的检测则通过更换不同pH的缓冲液(pH4.0-10.0)，分别检测其酶活以确定最适pH。酶的热稳定性检测条件为将酶液保存在不同温度(25-50℃)下，每隔10min(10、20、30、40min)取样在标准反应条件下检测酶的残余酶活。
3)新琼二糖含量
新琼二糖含量检测的HPLC条件为：采用Waters Sugar-Pak I柱(300×6.5mm，Waters，Milford)，流动相为50mg/L EDTA钙水溶液，流速0.5mL/min，柱温控制在65℃，检测器是视差检测器。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：热稳定性提高的新琼二糖水解酶的筛选
1、AgWH117A酶蛋白突变蛋白的筛选
通过分析AgWH117A酶蛋白中各个氨基酸的电荷分布引起的吉布斯自由能变化ΔGqq，从而衡量氨基酸的电荷分布对酶稳定性的影响。通过计算AgWH117A酶蛋白中各个氨基酸的ΔGqq，排除自由能较小的氨基酸位点。同时考虑到活性位点的氨基酸改变有极大可能性引起失活，因此也排除活性位点氨基酸。再者处于Loop环上的氨基酸对蛋白质折叠起关键作用，所以回避Loop环上的氨基酸。最终将剩下的氨基酸位点进行丙氨酸扫描以确定点定点饱和突变的氨基酸残基位点(表1)。
表1：部分选定的氨基酸突变位点
最后选取的氨基酸位点为56Lys、61Tyr、62His、94His、134Lys、136Tyr、139Tyr、201His、216Tyr、218Tyr、268His。对这些位点进行丙氨酸扫描实验，将其分别突变成为丙氨酸Ala并检测各个突变子在40℃下的热稳定性。
结果表明，AgWH117A原始酶和各突变子在40℃水浴中保温20min，通过比较原始酶和突变,的热稳定性可见，除Y261突变为丙氨酸后出现酶活消失的情况外，其余突变子都仍然保留有降解新琼二糖的能力。但是总体而言，突变子的酶活都有着不同程度的变化。除K134A突变子外，其他突变子的酶活都降低了，而且半数以上下降程度十分明显。突变子K134A初始酶活提高了约4％，并且保温20min后，仍保留有约24％的初始酶活，总体而言热稳定性也有着轻微幅度的提高。而这里值得注意的是突变子Y61A，虽然它的初始酶活只有原始酶的69％，但是在40℃保温20min后，其残余酶活是要明显高于原始酶和突变子K134A，这说明其热稳定性有所增强(图1)。
AgWH117A、Y61A和K134A在40℃下的半衰期分别为11min、9.5min和12min，其中K134A的半衰期比原始酶提高了9.1％。本实验初衷是筛选得到热稳定性提高并且酶活水平不受影响甚至有所提高的突变子，因此综上所述Y61和K134位点作为潜在的具有进一步研究意义的位点而成为接下来实验的研究对象。
2、定点突变
为了进一步考量这两个位点对新琼二糖水解酶AgWH117A的热稳定性及酶活的影响，分别对这两个突变位点进行了定点饱和突变实验。同样考量了各个突变子和原始酶在40℃下的酶活和热稳定性情况，结果表明Y61位氨基酸残基的改变对该酶活性的影响很大，除了Y61W酶活接近野生型的原始酶活以外，其余突变子的酶活均低于原始酶的80％，特别是Y61K、Y61R、Y61G、Y61Q、Y61M、Y61C酶活甚至低于原始酶的60％。而在热稳定性方面，该氨基酸残基的改变除了变成丙氨酸外，并没有筛选得到预想中的突变子能够明显提高该酶的热稳定性。而反观K134位点饱和突变结果，突变子酶活改变幅度均较小，有部分突变子的酶活要略高于原始酶的酶活，分别是K134D、K134N、K134M和K134A，其中突变子K134D的酶活最高，比原始酶酶活提高15％。而且让人欣喜的K134D表现出来的热稳定性也要明显优于原始酶AgWH117A。为了更为直观地比较突变子K134D和原始酶，分别检测了两者在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃下的保持10min、20min、30min、40min后的酶活变化情况，结果如图2所示。
从图2中可见无论是原始酶AgWH117A还是突变子K134D在各个温度下孵育，酶活均随着时间延长而明显降低，并且孵育温度越高，酶失活越迅速。而比较原始酶和突变子的酶活变化情况可知，K134D在各温度下的稳定性均明显优于原始酶。以40℃为例，当原始酶在该温度孵育30min后，该酶的酶活将基本丧失，也就是呈失活状态，但是突变子K134D仍然可以保留约25％的酶活水平，并且将保温时间延长到40min，K134D依然可以检测到其水解新琼二糖的能力。如图3所示，原始酶AgWH117A的半衰温度T50为42.5℃，突变子K134D的T50值则提高了2.5℃。以50℃为例，孵育10min后，原始酶的活性大幅度下降仅剩10％左右，而突变子K134D残留活性仍大于原始酶活的25％，耐高温能力显著高于来自菌株Vibriosp.Strain JT0107的α-新琼寡糖水解酶。AgWH117A和K134D在45℃和50℃下的半衰期t1/2分别为8.5min、10min和6.5min、7.5min，分别提高了17.6％、15.4％。可见K134D的确在热稳定性和酶活水平上相比较原始酶有了较大的提高。
实施例2：AgWH117A与K134D酶学性质比较
在筛选得到突变子K134D的基础上，对其进行了最适反应温度和最适反应pH的测定，如图4和5所示；突变子K134D的最适反应温度较原始酶提高了3℃左右，由最初的27℃上升到30℃。温度在35℃以下时酶活变化缓慢，曲线趋势平缓。K134D和原始酶的最适pH在6.0左右，pH的适应范围比较广，在pH5.0到8.0之间酶活均可保持在80％以上。
在确定了酶的最适反应条件之后，检测了K134D的部分动力学参数。通过固定酶量，持续提高底物新琼二糖的浓度，直到再继续增加底物浓度而酶活不能进一步提高。然后通过经典的双倒数作图法，拟合得到了动力学参数，结果见表2。
表2：原始酶AgWH117A和K134D的动力学参数表
相比较而言，突变子K134D的Km和kcat值均要大于原始酶AgWH117A，那么可以推测突变子酶活的提高是因为kcat值的升高，而K134D的Km值说明了活性中心与底物之间亲和力的减弱，从而导致新琼二糖水解产物从酶中的释放速度加快。
本发明的氨基酸序列为SEQ ID NO:3的新琼二糖水解酶可用于降解新琼2糖来制备3,6-内醚-L-半乳糖(L-AHG)。将本发明的热稳定性提高的新琼二糖水解酶制成固定化酶，结果表明，在相同反应温度下，固定化酶K134D的酶活比固定化酶AgWH117至少高10.0％。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 361
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Leu Lys Ser Ala Arg Lys Leu Ser Leu Ala Ser Lys Arg Ala Leu
1 5 10 15
Glu Arg Gly Tyr Asp Asn Lys Gly Pro Glu Trp Phe Ile Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Gln Glu Leu Leu Gly Asp Phe Ala Tyr Gln Glu Gly Val Ile Arg
35 40 45
Arg Asp Pro Thr Ala Val Ile Lys Val Asn Gly Ile Tyr His Cys Trp
50 55 60
Tyr Thr Lys Gly Glu Gly Glu Thr Val Gly Phe Gly Ser Asp Asn Pro
65 70 75 80
Glu Asp Lys Val Phe Pro Trp Asp Lys Thr Glu Val Trp His Ala Thr
85 90 95
Ser Asp Asp Gly Met Thr Trp Lys Glu Gln Gly Ser Ala Ile Thr Ala
100 105 110
Gly Glu Pro Gly Arg Tyr Asp Asp Arg Ala Val Phe Thr Pro Glu Val
115 120 125
Leu Val His Glu Gly Lys Phe Tyr Leu Val Tyr Gln Thr Val Lys Ala
130 135 140
Pro Tyr Thr Asn Arg Gln Ile Glu Glu Ile Ala Ile Ala Trp Ala Asp
145 150 155 160
Ser Pro Tyr Gly Pro Trp Thr Lys Ser Asp Ala Pro Ile Leu Ser Pro
165 170 175
Glu Gln Asp Gly Glu Trp Asp Gly Glu Glu Asp Asn Arg Phe Asn Val
180 185 190
Lys Ser Lys Gly Ser Phe Asp Ser His Lys Val His Asp Pro Cys Leu
195 200 205
Met Phe Phe Lys Gly Gln Phe Tyr Leu Tyr Tyr Lys Gly Glu Thr Met
210 215 220
Gly Glu Gly Met Asn Leu Gly Gly Arg Glu Ile Lys His Gly Val Ala
225 230 235 240
Ile Ala Asp Asn Ile Leu Gly Pro Tyr Arg Lys Ser Glu Tyr Asn Pro
245 250 255
Ile Ser Asn Ser Gly His Glu Val Ala Val Trp His Gln Asn Gly Gly
260 265 270
Ile Ala Ser Leu Ile Thr Thr Asp Gly Pro Glu Lys Asn Thr Val Gln
275 280 285
Trp Ala Ala Asp Gly Ile Asn Phe Glu Ile Met Ser His Ile Lys Gly
290 295 300
Ala Pro Glu Ala Leu Gly Ile Tyr Arg Pro Glu Ala Asp Glu Pro Leu
305 310 315 320
Glu Asp Pro Gly Leu His Trp Gly Leu Cys His Arg Tyr Asp Pro Ser
325 330 335
Trp Asn Trp Asn Tyr Ile Cys Arg Tyr Arg Val Lys Arg Gln Ile Met
340 345 350
Asp Ala Gly Thr Phe Gln Asn Thr Asn
355 360
<210> 2
<211> 1086
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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gcatatcaag agggagtcat tcgtcgcgac cctacagcag tcatcaaagt caatggtata 180
tatcactgct ggtataccaa aggcgaaggt gaaaccgtgg gctttggttc tgacaatcca 240
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atgacgtgga aagaacaagg aagcgcaatc accgctggag aacccggccg ctatgatgat 360
cgggcagtgt tcaccccaga ggtgctagtt catgaaggca agttttacct agtctatcaa 420
acggtcaaag ccccttacac taaccgacaa attgaagaaa ttgctattgc ttgggcagat 480
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gagtgggacg gagaagaaga caatcgcttc aatgtaaaaa gtaagggcag ctttgatagc 600
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atcgccgaca atattcttgg cccttaccgc aagtcagaat acaacccgat tagtaatagc 780
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ggccctgaga aaaataccgt gcagtgggcc gctgatggta tcaactttga aatcatgtcg 900
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Claims (7)
1.一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶，其特征在于，所述的新琼二糖水解酶使氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶的第134位由K变为D。
2.如权利要求1所述的新琼二糖水解酶，其特征在于，所述的氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白酶，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
3.如权利要求1所述的新琼二糖水解酶，其特征在于，所述的热稳定性提高的新琼二糖水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
4.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的新琼二糖水解酶。
5.如权利要求4所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。
6.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体用于表达权利要求1所述的新琼二糖水解酶。
7.权利要求1所述的新琼二糖水解酶在降解新琼2糖来制备3,6-内醚-L-半乳糖中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810572994.2A CN108715839B (zh) | 2018-06-06 | 2018-06-06 | 一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810572994.2A CN108715839B (zh) | 2018-06-06 | 2018-06-06 | 一种热稳定性提高的新琼二糖水解酶 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108715839A true CN108715839A (zh) | 2018-10-30 |
| CN108715839B CN108715839B (zh) | 2022-03-29 |
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ID=63911805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (1)
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Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| KR20110042577A (ko) * | 2009-10-19 | 2011-04-27 | 신라대학교 산학협력단 | 신규한 베타-아가라제 및 그 용도 |
| CN103468661A (zh) * | 2013-10-08 | 2013-12-25 | 中国海洋大学 | 一种新琼二糖水解酶及其应用 |
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-
2018
- 2018-06-06 CN CN201810572994.2A patent/CN108715839B/zh active Active
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| KR20110042577A (ko) * | 2009-10-19 | 2011-04-27 | 신라대학교 산학협력단 | 신규한 베타-아가라제 및 그 용도 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NCBI: "KC913198.1", 《NCBI GENBANK》 * |
| 杨孟: "β-琼胶酶的纯化及新琼二糖水解酶AgWH117A结构的研究", 《硕士学位论文：中国海洋大学》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108715839B (zh) | 2022-03-29 |
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