CN103540579B - 一种β-琼胶酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种β-琼胶酶及其应用，即一种能够降解琼脂糖产生单一的新琼2糖的β-琼胶酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明的β-琼胶酶能够降解琼脂糖产生单一的新琼2糖，因此可以用于纯的新琼2糖的制备。本发明的大肠杆菌重组株，pETC/BL21所表达的重组琼胶酶占总蛋白的30%，表达水平高，易于纯化，且连续传代后表达量未有所降低。所以可以通过本发明大量制备重组β-琼胶酶和新琼2糖。

Description

一种β-琼胶酶及其应用
技术领域
本发明属于功能基因筛选技术领域，具体涉及一种β-琼胶酶及其应用。
背景技术
研究发现海洋红藻细胞壁由两种不同的组份——琼脂糖和琼脂胶组成。其中琼脂糖是两种单糖的聚合物，是由L-3，6-脱水半乳糖（AHG）和D-半乳糖（D-Gal），以交替的1，3糖苷键和1，4糖苷键连接形成的。新琼寡糖作为琼胶酶水解琼脂胶或者琼脂糖的产物,拥有多种的生物功能，在食品化妆品和医药工业方面具有潜在的应用价值。琼胶酶是降解琼脂胶为寡糖的水解酶，依据水解位点的不同，琼胶酶被分α-琼胶酶(E.C.3.2.1.158)和β-琼胶酶(E.C.3.2.1.81)，α-琼胶酶(E.C.3.2.1.158)断裂α-1,3键来产生琼寡糖；β-琼胶酶(E.C.3.2.1.81)断裂β-1,4键产生新琼寡糖。但至今为止大部分的β-琼胶酶，都只能产生新琼寡糖的系列产物，不能产生单一聚合度的寡糖，因此，筛选出一种能够产生单一聚合度寡糖的β-琼胶酶就具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种β-琼胶酶及其应用，即一种能够降解琼脂糖产生单一的新琼2糖的β-琼胶酶，从而弥补现有技术的不足。
本发明的β-琼胶酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；
用于编码上述β-琼胶酶的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
本发明还提供一种重组表达载体，用于表达上述的β-琼胶酶；
本发明的β-琼胶酶用于降解琼胶制备新琼2糖。
本发明的β-琼胶酶能够降解琼脂糖产生单一的新琼2糖，因此可以用于纯的新琼2糖的制备。本发明的β-琼胶酶具有良好的生物催化活性，相对其它已知的大部分β-琼胶酶其特点为在反应过程中从始至终均只有单一的新琼2糖产生，这使得其产物中掺杂其他聚合度的新琼寡糖的量非常少，其产物新琼2糖纯度>90%，产率为约为60%。
附图说明
图1:本发明的β-琼胶酶亲和层系后的纯酶SDS-PAGE电泳图，M为Marker。
图2:本发明的β-琼胶酶，温度变化对相对酶活的影响（数据均为最少三次重复取平均值），◆代表热稳定性，■代表最适温度。
图3:本发明的β-琼胶酶，pH变化对相对酶活的影响（数据均为最少三次重复取平均值）
图4:本发明的β-琼胶酶，酶解产物的质谱图，
图5:本发明的β-琼胶酶，酶解产物的碳谱核磁图。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实施例中所用到的实验条件可以根据已有技术进行选择。对于实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。
对于本发明所涉及的术语解释如下：
1、β-琼胶酶：糖苷水解酶，一类水解琼脂糖β-1,4键产生新琼寡糖。
2、新琼2糖：两种单糖L-3，6-脱水半乳糖（AHG）和D-半乳糖（D-Gal）α-1,3键连接形成的二糖。
实施例1 β-琼胶酶基因agWH50C的克隆
用简并引物PCR以及巢式PCR克隆淡黄色噬琼胶菌WH0801（NRRLB-59247(T)或CGMCC1.10131(T)）中的β-琼胶酶基因agWH50C。具体操作：在2216E海水培养基中培养淡黄色噬琼胶菌WH0801直到对数末期，提取DNA基因组。利用简并引物（5’-HTRCCNAAYCAYHTRTAYHTRGGN-3’;5’-VACRAARCCVACRTTRTARTTTTC-3’），以基因组为模板,条件为：94℃ 5分钟，然后94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 3分钟3个步骤进行30个循环，进行PCR，得到了产物为β-琼胶酶基因的片段，再以片段末端序列设计引物，进行一次三轮的巢式PCR回收其中大小在500Kb-2000Kb的PCR产物片段(利用takara公司染色体步移试剂盒)。其中各步骤中的PCR产物均连接T-A克隆载体后转化DH5α挑去单克隆测序。最后拼接最初的片段和巢式PCR所得基因片段，得到β-琼胶酶基因的全长序列。测序表明基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。全长序列以全长序列上游引物和下游引物5’-CGAGCTCATGGAGCCAGCAAAT-3’;5’-CCCTCGAGAACACGAAAGCGTTT-3’）鉴定，结果表明获得的序列没有发生拼接错误。基因agWH50C和NCBI中已知基因相比对，和来源于Vibrio sp.EJY3全基因组测序的某琼胶酶基因相似性为64%。说明在序列上agWH50C为一个全新的基因。
实施例2含β-琼胶酶基因agWH50C表达质粒pETC的构建
根据已经得到的β-琼胶酶基因的全长序列设计基因的上游引物和下游引物（见实施例1），以淡黄色噬琼胶菌WH0801的基因组为模板，利用PCR扩增得到β-琼胶酶基因的全长序列。条件为94℃ 2分钟，然后94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 3分钟，30个循环最后72℃延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳显示在2.8kb的位置有明显单一条带，将单一条带切胶回收，测序结果表明实施例1拼接获得的序列没有错误。将回收的条带用Xho1和Sac1双酶切，将表达载体pET21a也用Xho1和Sac1双酶切，然后PCR产物和酶切载体都利用试剂盒进行DNA纯化。然后进行DNA连接反应。连接结束后，按照标准的氯化钙法热激转化将重组质粒转入DH5α，筛选具有氨苄青霉素抗性的阳性转化子。用标准碱裂解法提取质粒，将质粒用Xho1和Sac1双酶切，凝胶电泳条带显示为2.8Kb和5.3Kb两条清晰条带和β-琼胶酶基因全长和质粒长度相对应。证明β-琼胶酶基因全长序列已经克隆到表达载体中，将此重组质粒命名为pETC。
实施例3高效表达β-琼胶酶基因agWH50C的工程菌pETC/BL21的构建
将表达载体质粒pETC按照标准氯化钙热激转化转入BL21（DE3）中，筛选具有氨苄青霉素抗性的阳性转化子。用标准碱裂解法提取质粒，将质粒用Xho1和Sac1双酶切，凝胶电泳条带显示为2.8Kb和5.3Kb两条清晰条带和β-琼胶酶基因全长和质粒长度相对应。证明含有β-琼胶酶基因的表达载体质粒pETC已经转入BL21（DE3）。
实施例4利用大肠杆菌工程菌pETC/BL21制备重组β-琼胶酶
挑取大肠杆菌重组株pETC/BL21单克隆接种在5ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，230RPM培养12小时。按1∶100转接入100ml含有氨苄青霉素的液体LB培养基。37℃培养OD值600到0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养8小时，4℃，8000g离心10分钟，细胞重悬于20mM pH=8.0Tirs-盐酸缓冲液，将菌悬液置于冰上，超声破碎15分钟，12000g15分钟除去不可溶成分，上清过0.22um滤膜，上亲和层析柱fastflow his*6（GE），然后用冲洗缓冲液1ml+1ml和洗脱缓冲液0.5ml*4冲洗柱子6次，将得到的溶液分别SDS-PAGE检测，合并含有单一目的条带的洗脱液（图1）。用Lowry法测定蛋白浓度。终浓度约为0.3mg/ml。
实施例5测定重组β-琼胶酶的最适反应条件
反应条件为：测定最适pH时，30度时，在5.0-9.0的pH范围内进行反应。测定最适温度时，pH=6.0时在20-50度反应。反应条件为，90uL 0.2%琼脂糖加入10uL纯酶，反应1小时，沸水浴2分钟灭活，用DNS法测定。结果如图2，图3所示，重组β-琼胶酶的相对活性在30度和pH=6时达到峰值，在40度和pH=7时骤然下降，可以确定最适反应温度为30度，最适pH值为6。以此结果来确定重组β-琼胶酶的最适反应条件。
实施例6利用重组β-琼胶酶生产新琼2糖
利用实施例4制备的重组β-琼胶酶制备新琼寡糖，将琼脂糖溶于pH=6.0的磷酸二氢钾–氢氧化钠缓冲液（0.05M/ml），配置成0.1-0.5%的溶液。按重量比0.1-1：100加入重组琼胶酶溶液。混合均匀后在30℃温浴12-48小时。浓缩至小于10ml加入3倍体积乙醇，除去未分解琼脂糖，溶液冻干，为新琼2糖。利用质谱(图4)和核磁共振(图5)进行鉴定.本发明的β-琼胶酶具有良好的生物催化活性，相对其他已知的大部分β-琼胶酶其特点为在反应过程中从始至终均只有单一的新琼2糖产生，这使得其产物中掺杂其他聚合度的新琼寡糖的量非常少，其产物新琼2糖纯度>90%，产率为约为60%。本发明的β-琼胶酶其最适反应温度为30℃，最适pH为6.0，反应条件温和，对环境污染少，这些特点使得本发明筛选的β-琼胶酶具有生产新琼2糖的工业应用潜力。

Claims (5)

1.一种β-琼胶酶，所述的β-琼胶酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.一种基因，所述的基因用于编码权利要求1所述的β-琼胶酶。
3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
4.一种重组表达载体，所述的重组表达载体用于表达权利要求1所述的β-琼胶酶。
5.权利要求1所述的β-琼胶酶在降解琼胶制备新琼2糖中的应用。
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