CN104480125A - 一种卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了含有上述卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的表达载体和利用该载体转化的重组微生物，还公开了利用上述微生物制备卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的方法。

Description

一种卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及的是一种卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因及含有该基因的载体和重组菌株，以及利用重组菌株制备卵形鲳鲹硫氧还蛋白。

背景技术

硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)又称白细胞介素-1样细胞因子，是生物体内普遍存在的小分子还原蛋白，分子量在12kD左右，具有共同的特征：①所有Trx中均有一个外露的又两个Cys残基组成、高度保守的活性中心(CXXC)；②二级结构包括4个α螺旋和5个β折叠，β折叠被α螺旋包围构成紧密球形；③活性中心位于α螺旋起始端和β折叠尾部之间；④氧化态Trx活性中心有一个由Cys残基组成的二硫键(S-S)。Trx最开始是作为大肠杆菌(Escherichia coli)核糖核酸还原酶的电子供体。此后，由于发现其发挥多种中药生物学功能而受到人们重视，发现其广泛存在于原核生物和真核生物体内。植物的细胞质、叶绿素、线粒体和细胞核中都含有Trx。根据表达部位的不同，可把硫氧还蛋白为3类：(1)Trx1，主要存在于细胞质，在细胞核及胞外也有发现。Prx1缺少信号肽，但是以一种类似白介素1β的分泌方式释放胞外；(2)Trx2，N-端具有线粒体引导序列，是一种线粒体特异性蛋白，具有Trx保守型酶催化位点，缺少保守型的结构Cys残基，在清除活性氧(ROS)及线粒体凋亡信号通路调节中起重要作用；(3)Sptrx，是Trx家族中睾丸/精子细胞特异性表达的蛋白，无氧化还原酶活性；

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)隶属脊索动物门(Chordata)，硬骨鱼纲(Osteichthyes)，鲈形目(Perciformes)，鲈亚目(Percoidei)，鲹科(Carangidae)，为名贵食用鱼类，在我国南方海域已有相当的人工养殖规模。然而，近年来卵形鲳鲹病害频发，引起了较高的死亡率，成为制约卵形鲳鲹养殖产业可持续发展的技术瓶颈之一。目前还未有人进行卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因方面的研究。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的cDNA和由此推断的氨基酸序列。

本发明的第二个目的在于提供含上述卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的表达载体和利用该载体转化的重组微生物。

本发明的第三个目的在于提供一种从所述的微生物制备重组卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的过程。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中的卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因，其氨基酸序列如SEQ ID：2所示。

本发明的硫氧还蛋白全长基因是以转录组测序得到卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因部分序列，以卵形鲳鲹肝脏总RNA反转录得到的cDNA为模板，然后经Smart-RACE方法扩增得到末端序列，最后经序列拼接获得卵形鲳鲹硫氧还蛋白cDNA基因全长序列。

本发明用于表达卵形鲳鲹硫氧还蛋白重组蛋白的成熟肽基因序列是以卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因双链DNA为模板，经PCR方法扩增而得到的，它来源于卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的成熟肽区域所对应的基因片段。

按照上述的卵形鲳鲹硫氧还蛋白重组蛋白的成熟肽基因序列，它正好是卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因117 bp至440 bp(相当于第39至第147位氨基酸)的片段，其核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列如下所示。

卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的cDNA，它的核苷酸序列如下所示：

其中底部下划线部分为卵形鲳鲹硫氧还蛋白的成熟肽的DNA序列。

卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的氨基酸序列如下所示：

卵形鲳鲹硫氧还蛋白的成熟肽的氨基酸序列

本发明的氨基酸序列分析表明卵形鲳鲹硫氧还蛋白由107个氨基酸参加组成，无信号肽序列，107个氨基酸序列为成熟肽序列。

本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：一种表达载体，其为含有上述卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的cDNA的表达载体；以及利用上述载体转化的重组微生物。

本发明所述的表达载体的构建方法是按常规方法，将通过PCR方法合成的卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因经酶切和分离纯化后，连接到已有的相应载体的相应酶切位点(即BamH Ⅰ和EcoRI)之间，即构建成所需的含有卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的表达载体。

本发明上述含有卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的大肠杆菌表达载体优先由本发明合成的卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因与大肠杆菌表达载体pESET A构建成的重组表达载体，命名为pESET-Trx。

本发明的第三个目的是通过如下技术方案实现的：本发明提供的制备重组卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的方法，包括用上述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，获得重组的卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因。

其中寄主细胞优选自大肠杆菌，先构造一种重组工程菌株，其是含有卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的大肠杆菌。采用上述含有卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的相应表达载体构建了能高效表达卵形鲳鲹硫氧还蛋白的大肠杆菌重组菌株。

本发明的上述能表达卵形鲳鲹硫氧还蛋白的大肠杆菌重组菌株优先由含有卵形鲳鲹硫氧还蛋白肽基因的表达载体pESET-Trx转化大肠杆菌BL21而得到的菌株，命名为pESET-Trx-BL21。

本发明中的制备重组卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的方法，具体优选为：选取大肠杆菌重组菌株pESET-Trx-BL21接种在10mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，过夜，作为种子菌，次日再按1:100接种量接种于相同的培养基中，当重组菌生长进入对数期时，加100mM IPTG至终浓度为1.6mM，220rpm振荡培养，当重组菌生长进入平台期后收集菌体，经分离纯化得到重组卵形鲳鲹硫氧还蛋白产品。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明从卵形鲳鲹中获取卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的cDNA，包含该cDNA的表达载体和重组菌株，以及卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因；

(2)该重组卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因具有较好的还原活性和还原效果，有望开发和应用于卵形鲳鲹的疾病控制方面。

附图说明

图1是实施例1中卵形鲳鲹肝脏组织提取总RNA的电泳图；

图2是实施例1中PCR扩增卵形鲳鲹cDNA文库的扩增产物的电泳图；

图3是实施例2中卵形鲳鲹硫氧还蛋白成熟肽基因的合成PCR扩增产物的电泳图；

图4是实施例3中含卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因和大肠杆菌表达载体的pRSET-Trx的质粒酶切图；

图5是实施例5中显示经诱导的pRSET-Trx-BL21的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图6是实施例5中鼠抗6×His抗体的免疫印迹结果图；

图7是实施例6中纯化的重组卵形鲳鲹硫氧还蛋白蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图；

图8是实施例6中重组卵形鲳鲹硫氧还蛋白的还原活性检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1 卵形鲳鲹硫氧还蛋白cDNA基因的获得

本发明的硫氧还蛋白全长基因是以转录组测序得到卵形鲳鲹硫氧还蛋白cDNA序列，具体如SEQ ID NO.1所示。以卵形鲳鲹肝脏总RNA(图1所示)根据M-MLV反转录酶说明书，反转录得到的cDNA为模板如图2，反转录反应条件：70℃孵育5min，冰浴5min，加入M-MLV反转录酶预混液，42℃孵育90min，70℃灭活15min。

卵形鲳鲹硫氧还蛋白氨基酸序列由软件DNAStar7.1得到。

实施例2 卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的合成

根据实施例1卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因cDNA全序列，设计合成一对引物，上游引物是在第117位碱基起22个碱基前加上BamH I的限制性酶切位点以及3个保护碱基(5’-GGTGGATCCATGGTCCGCGAAGTGTCAGATC-3’)，共31bp；下游引物是在第419位碱基起的前22个碱基加上EcoRI的限制性酶切位点以及2个保护碱基(5’-GCGAATTCTCATTTATATTCATCCAGTTTC-3’)，共30bp。以卵形鲳鲹cDNA文库为模板，经PCR方法扩增卵形鲳鲹硫氧还蛋白第1位至第107位氨基酸序列相应的DNA序列，即为卵形鲳鲹硫氧还蛋白成熟肽相应序列，PCR扩增条件为：94℃预变性2min；然后94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸50S，共35个循环；最后72℃10min。

PCR扩增产物的电泳图如图3。从图3可见PCR扩增出了长约324的片段。

实施例3 含卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的大肠杆菌表达载体的构建

上述实施例2扩增得到的PCR产物经BamH I和EcoRI酶切后，酶切产物用AxyGen公司PCR产物纯化试剂盒回收，分离纯化约324bp的卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因片段；表达载体pRSET A也同样用BamH I和EcoRI酶切后，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化2.9kb的大片段，与324bp的卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因片段按1:3混合，用T4连接酶16℃连接过夜后用标准氯化钙转化法转入大肠杆菌BL21中，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，以标准方法提取质粒，筛选大小约3.2kb的重组质量，用限制性内切酶BamH I和EcoRI双酶切重组质量，得到324bp和2.9bp的两个片段，大小分别与卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因成熟肽和表达载体pRSET A大小相同，证明卵形鲳鲹硫氧还蛋白成熟肽已克隆入大肠杆菌表达载体pRSET A中，重组质量命名为pRSET-Trx。质粒酶切图如图4。

实施例4 高效表达卵形鲳鲹硫氧还蛋白的大肠杆菌重组菌株pRSET-Trx-BL21的构建

用标准氯化钙法将pRSET-Trx转化大肠杆菌BL21，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含有pRSET-Trx的重组转化子pRSET-Trx-BL21，最后测序验证，测序结果包含卵形鲳鲹硫氧还蛋白成熟肽序列，结果正确。

实施例5 利用重组大肠杆菌pRSET-Trx-BL21基因工程菌生产重组卵形鲳鲹硫氧还蛋白

挑取大肠杆菌重组菌株pRSET-Trx-BL21，先将菌种接种在10mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养过夜，作为种子菌，次日再按1:100接种量接种于相同的培养基中，当重组菌生长进入对数期时(A₆₀₀＝0.5-0.6)，加100mM IPTG至终浓度为0.4mM，37℃，220rpm振荡诱导培养3.5h后收菌。合成的卵形鲳鲹硫氧还蛋白在大肠杆菌基因工程菌pRSET-Trx-BL21中已获得高效表达。

取少量细胞加2×电泳上游缓冲液，煮沸10min后按标准方法跑SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图5，显示经诱导的pRSET-Trx-BL21在约18kDa的位置上出现一条新的融合蛋白带，未经诱导的该处条带非常淡。一抗为鼠抗6×His抗体，二抗为羊抗鼠IgG-HRP。结果如图6显示鼠抗6×His抗体能识别我们用大肠杆菌表达的融合硫氧还蛋白。这些结果证明得到的蛋白是重组卵形鲳鲹硫氧还蛋白。

实施例6 重组卵形鲳鲹硫氧还蛋白纯化和活性检测

按上述实施例5的方法，将大肠杆菌重组菌株pRSET-Trx-BL21基因工程菌进行扩大培养，10,000g离心10min收集菌体，经超声波破碎后，利用His-BindPurification Kit Protocol纯化重组卵形鲳鲹硫氧还蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果如图7，显示获得了纯度较高的卵形鲳鲹硫氧还蛋白重组蛋白。

在96孔板中依次加入底物胰岛素(1mg/mL)，设置4组，1组加入重组硫氧还蛋白和二硫苏糖醇(200mM)；2组加重组硫氧还蛋白不加二硫苏糖醇；3组以还原性谷胱甘肽(200mM)对照组；4组以蛋白缓冲液空白对照组。利用酶标仪测性还原剂二硫苏糖醇存在的情况下OD650处样品吸光值，样品重复3次，每一样品的最终吸收值取5次的平均结果。结果如图8所示。可以看出，在二硫苏糖醇存在情况下，其吸光值较高，现象表明胰岛素大量消耗，结果反映出pRSET-Trx-BL21具有较高的还原活性和还原效果。

Claims (7)

1.一种卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.包括权利要求1的cDNA的表达载体。

4.包括权利要求1的cDNA的表达载体pRSET-Trx。

5.重组卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的制备方法，其特征是：包括用权利要求3所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，获得重组的卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征是：所述的寄主细胞是大肠杆菌。

7.一种重组卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因，包括用权利要求3所述的表达载体转化的寄主细胞，培养转化体，从培养物获得重组的卵形鲳鲹硫氧还蛋白的步骤的方法制备。