CN110643612A - 一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因及应用 - Google Patents

一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因及应用 Download PDF

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Abstract

本发明的第一个目的在于提供一种卵形鲳鲹抗菌肽NK‑lysin基因及其编码蛋白。本发明的第二个目的在于提供含有所述卵形鲳鲹抗菌肽NK‑lysin基因的表达载体及利用该载体转化的重组菌株。本发明的第三个目的在于提供一种制备重组卵形鲳鲹抗菌肽NK‑lysin蛋白的方法。本发明的第四个目的在于提供所述卵形鲳鲹抗菌肽NK‑lysin基因的应用。

Description

一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因及应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因 及应用。
背景技术
抗菌肽(Antimicrobial Peptides，AMPs)是一种基因编码，核糖体合成的小 于10kDa，具有总净正电荷的小分子多肽。AMPs是生物体先天性免疫防御系统 的重要组成部分，在免疫方面发挥重要作用。
近年来，抗菌肽的开发和应用研究已成为国内外饲料科学和药理学的研究热 点，在动植物转基因工程及药物开发领域具有广阔的应用前景。目前，在鱼类中 已经发现80多种抗菌肽，其中NK-lysin是鞘脂激活蛋白样蛋白(SALIP)家族 的成员，首次在猪毒性淋巴细胞中发现，是由细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和 自然杀伤(NK)细胞产生抗微生物阳离子蛋白，并储存在溶细胞颗粒中，具有 广谱抗菌性。
NK-lysin具有保守的鞘脂激活蛋白B结构域和六个半胱氨酸，六个半胱氨 酸形成三个分子内二硫键，可通过其螺旋结构在细胞膜中形成孔，使得微生物的 脂质双层膜以非特异性方式渗透。在大黄鱼、大菱鲆、罗非鱼等硬骨鱼类研究表 明，NK-lysin不仅对细菌、真菌具有抗菌活性，对病毒和寄生虫同样也具有生物 活性。
卵形鲳鲹(Trachinotus Ovatus)具有生长速度快，经济价值高，适合网箱养 殖等优点，已成为我国南方池塘和网箱养殖的主要品种，养殖年产量已超过10 万吨。然而，随着卵形鲳鲹养殖产业发展，再加上养殖环境日益恶化，卵形鲳鲹 养殖病害频发，常引起较高死亡率，严重制约了卵形鲳鲹养殖产业的可持续发展。 传统养殖过程中多采用抗生素进行治疗，但长期使用抗生素不但污染养殖环境， 同时还会导致病原体产生抗药性。因此，开发一种安全、高效的抗菌剂尤为重要。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因及其编码 蛋白。
本发明的第二个目的在于提供含有所述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的表 达载体及利用该载体转化的重组菌株。
本发明的第三个目的在于提供一种制备重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白 的方法。
本发明的第四个目的在于提供所述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的应用。
本发明的第一个目的通过以下技术方案实现：
一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
如SEQ ID NO.3所示为卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的cDNA，其全长是通 过卵形鲳鲹转录组测序和基因组测序结果综合检索分析获得。
上述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
表达上述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的编码蛋白的抗菌肽成熟肽的基因 序列是以卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的全长双链cDNA为模板，经PCR方法 扩增获得，它来源于卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的成熟肽区域所对应的的基 因片段，其为所述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的cDNA序列210bp至506bp (相当于第50至第147位氨基酸)的片段。
上述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的编码蛋白的氨基酸序列分析表明，卵形 鲳鲹抗菌肽NK-lysin由147个氨基酸残基组成，其中前49个氨基残基为信号肽 序列，后98个氨基酸残基为成熟肽序列，成熟肽是由抗菌肽切除信号肽形成的， 对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌均具有抑菌活性。革兰氏阴性菌包括溶藻 弧菌、副溶血弧菌、哈维弧菌、大肠杆菌、美人鱼发光杆菌等；革兰氏阳性菌包 括无乳链球菌、金黄葡萄球菌和芽孢杆菌等。
本发明的第二个目的通过以下技术方案实现：包含上述卵形鲳鲹抗菌肽 NK-lysin基因的表达载体。
本发明所述的表达载体的构建方法是按常规方法，将通过PCR方法合成的 卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因经酶切和分离纯化后，接入到已有的表达载体的 相应酶切位点(即EcoR I和HindⅢ)之间，即构建含有卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin 基因的表达载体。
上述包含卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的表达载体优选由卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因与大肠杆菌表达载体PGEX-6P-1构建成的重组表达载体，命名为 PGEX-6P-1/mNK-lysin。
本发明还包括由上述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的表达载体转化的重组 菌株。利用所述的包括卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的表达载体转化寄主细胞， 培养转化体，获得重组的卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因。
其中所述的寄主细胞优选为大肠杆菌。该重组微生物由含有卵形鲳鲹 NK-lysin基因的大肠杆菌表达载体PGEX-6P-1/mNK-lysin转化大肠杆菌BL21而 得到的菌株，命名为PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21。
本发明的第三个目的通过以下技术方案实现：
一种制备重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白的方法，利用所述的包括卵形鲳 鲹抗菌肽NK-lysin基因的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，得到重组菌株， 再将重组菌株培养至对数期后分离纯化，得到重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋 白。其具体过程如下：
选取大肠杆菌重组菌株PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21接种在10mL含有氨苄 青霉素的LB液体培养基中，37℃，过夜，作为种子菌，次日再按1:100接种 量接种于相同的培养基中，当重组菌生长进入对数期时，加100mM IPTG至最 终浓度为0.1mM，220rpm振荡培养，当重组菌生长进入平台期后收集菌体，经 分离纯化得到重组卵形鲳鲹抗菌肽LEAP-2蛋白。
本发明的第四个目的通过以下技术方案实现：所述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin 基因在制备抗革兰氏阴性细菌/或真菌、以及抗革兰氏阳性细菌/或真菌的药物中 的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明编码了卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的cDNA的核苷酸序列，并将该 基因构建重组表达载体和该表达载体重组菌株，利用该重组菌株获得大量表达的 重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白，该重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白能进 一步应用于制备抗革兰氏阴性细菌/或真菌、以及抗革兰氏阳性细菌/或真菌的卵 形鲳鲹等海水鱼类抗菌剂或杀菌剂，有效解决目前卵形鲳鲹养殖过程中的病害问 题。
附图说明
以下通过附图对本发明作进一步的说明。
图1卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin成熟肽基因的合成PCR扩增产物电泳图。
图2经诱导的卵形鲳鲹PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21的SDS-PAGE凝胶电 泳图(依次为蛋白Maker，pGEX-6P-1，全菌，上清，沉淀；B纯化的蛋白)。
图3GST抗体的免疫印迹结果图。
图4纯化的重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳图。
图5重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白活性检测结果图(A溶藻弧菌，B 鳗弧菌，C无乳链球菌，D芽孢杆菌)。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因全长获得
本发明的卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因全长是利用本实验室完成的卵形鲳 鲹转录组测序和全基因组测序结果综合筛选分析获得，其中转录组在NCBI编号 为PRJNA406847，基因组在GenBank中的编号GCA_900607315.1。通过对比 GenBank数据库，发现其与其他鱼类的LEAP-2基因具有较高的同源性。
使用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站上的ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)和BLASTX程序分析起始密码子和 终止密码子；利用NCBI网站上的BLASTP程序进行相似性搜索分析，预测 LEAP-2基因的开放阅读框。
采用HiPure Universal RNA Mini Kit(MAGEN)试剂盒提取卵形鲳鲹各组织 总RNA，按照PrimeScriptTMReverse Transcriptase Kit(TaKaRa)的说明书反转 录得到的双链cDNA模板。反应分为两个阶段，包括：①cDNA第一条链合成： 反应条件为42℃，2min，4℃冷却；②双链cDNA合成：以合成cDNA第一 条链为模板，反应条件为37℃，15min；85℃，5s；4℃冷却。
该卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的cDNA核苷酸序列如下所示：
Figure BDA0002186148850000041
Figure BDA0002186148850000051
其中方框内为卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin的信号肽DNA序列，下划线部分为 卵形鲳鲹抗菌肽的成熟肽DNA序列。
其编码蛋白的氨基酸序列如下所示：
Figure BDA0002186148850000061
经氨基酸序列分析表明，该编码蛋白由147个氨基酸残疾组成，其中前49 个氨基残基为信号肽序列，后98个氨基酸残基为成熟肽序列，成熟肽是由抗菌 肽切除信号肽和前体肽形成的。
实施例2
利用PCR技术扩增卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因成熟肽序列
根据获得卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin的cDNA全序列和pET-32a载体质粒(抗 氨苄)序列，设计两对引物对卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因成熟肽序列进行巢 式PCR技术扩增，第一对引物的上游引物为5’-ACGGGAGACGCCTTGAGATT-3’， 下游引物为5’-ACCACCACAAAGCACCTACG-3’；第二对引物中上游引物是在第213 位碱基起18个碱基前加入EocR I的限制酶切位点以及3个保护碱基(5’- CCGGAATTCTGCTGGGCATGCAAGTGG-3’)，下游引物是在第490位碱基起 20个碱基前加入HindⅢ的限制酶切位点以及3个保护碱基(5’-CCCAAGCTTCTAATAGTTTACGGGCTCTG-3’)。经PCR方法扩增卵形鲳鲹抗 菌肽第50位至第147位氨基酸序列相应的DNA序列，即为卵形鲳鲹抗菌肽成 熟肽相应序列。
PCR扩增条件为：94℃预变性2min；然后94℃变性40s，55℃退火40s， 72℃延伸45S，共35个循环；最后72℃10min。
PCR扩增产物的电泳图如图1所示。
实施例3
含卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的大肠杆菌表达载体的构建
上述实施例2扩增得到的PCR产物经EocR I和HindⅢ酶切后，酶切产物 用AxyGen公司PCR产物纯化试剂盒回收，分离纯化约297bp的卵形鲳鲹抗菌 肽NK-lysin基因片段；表达载体PGEX-6P-1同样用EocR I和HindⅢ酶切 后，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离纯化后，与297bp的卵形鲳鲹抗菌肽基 因片段按1：3混合，用T4连接酶16℃连接过夜后用标准氯化钙转化法转入 大肠杆菌BL21中，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，以标准方法提取质粒， 筛选重组质粒进行测序鉴定，测序序列正确表明卵形鲳鲹抗菌肽基因已克隆入大肠杆菌表达载体PGEX-6P-1中，重组质粒命名为PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21。
实施例4
高效表达卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin的大肠杆菌重组菌株 PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21的构建
用热激法将PGEX-6P-1/mNK-lysin转化大肠杆菌BL21，在含氨苄青霉素的 LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含有PGEX-6P-1/mNK-lysin 的重组转化子PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21，最后通过测序进行验证。
实施例5
利用大肠杆菌重组菌株PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21生产重组卵形鲳鲹抗 菌肽NK-lysin蛋白
选取大肠杆菌重组菌株PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21，将其接种在10mL含 有氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、220rpm的条件下振荡培养过夜， 作为种子菌，次日再按1:100接种量接种于LB液体培养基中，当重组菌生长进 入对数期时(A600＝0.5～0.6)，加100mM IPTG至终浓度为0.1mM，在37℃， 220rpm的条件下振荡诱导培养8h后收菌。
取少量诱导培养后的菌加2×电泳上游缓冲液，煮沸5min后按标准方法跑 SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图2，显示经诱导的PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21 在约37kDa的位置上出现新的融合蛋白带，而未经诱导的菌则不出现此带。
利用常规方法进行免疫印迹(Western blot)分析，抗体为组氨酸标签抗体 (His抗体),结果如图3所示：His抗体能识别用大肠杆菌重组菌株 PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21表达的融合抗菌肽蛋白，这些结果证明得到的蛋白 是重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白。
实施例6
重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白的纯化和活性检测
采用上述实施例5中的方法，将大肠杆菌重组菌株 PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21基因工程菌进行扩大培养，10,000g离心10min后 收集菌体，经超声波破碎后，利用His-BindPurification Kit Protocol纯化重组卵 形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果如图4所示， 结果表明获得了纯度较高的重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白。
琼脂扩散法检测体外抑菌活性：取溶藻弧菌、鳗弧菌、无乳链球菌、芽孢 杆菌菌种，分别涂布在营养琼脂培养基上，37℃培养16～18h活化，再用接种 棒分别从四种菌的营养琼脂培养基上取菌，用三步分区稀释法在固体营养琼脂培 养基上划线，37℃，培养16～18h，分别挑取3个单菌落于LB培养基中，37℃ 培养16～18h活化增菌，取0.1mL置于LB琼脂平板上，用灭菌的L形曲玻棒均 匀涂布，在涂有细菌的平板培养基表面放置3个牛津杯，3个牛津杯内分别加入 30μL等量重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白、作为对照组的PGEX-6P-1蛋白和 PBS。铺好后将平板正置温箱内37℃培养16～18h，检测结果如图5，重组卵 形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白周围出现明显的抑菌圈，表明重组卵形鲳鲹抗菌肽 NK-lysin蛋白对革兰氏阴性菌(溶藻弧菌、鳗弧菌)、革兰氏阳性菌(无乳链球 菌、芽孢杆菌)均具有抑菌活性。
实施例7
重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白最小抑菌浓度检测
选取革兰氏阳性菌(无乳链球菌、金黄葡萄球菌、芽孢杆菌)、革兰氏阴性 菌(溶藻弧菌、副溶血弧菌、哈维弧菌、鳗弧菌、美人鱼发光杆菌、大肠杆菌) 以及真菌(酵母菌)，分别取新鲜活化的各种菌的悬液，用LB液体培养基稀释 至1×106CFU/mL，然后依次加入96孔板的第1～12孔，每孔100μL。配制质 量浓度分别为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、 3.13μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL和0.39μg/mL的重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin 蛋白溶液，然后取各浓度的重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白溶液100μL分别 加入到第2～11孔中，即各孔中重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白的浓度分别 为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL、1.56μg/mL、 0.78μg/mL、0.39μg/mL和0.195μg/mL。其中，在第11孔添加等量空白LB液体 培养基，第12孔添加等量200μL/mL卡那霉素溶液，分别作为阴性对照和阳性 对照。37℃培养20h后，用酶标仪测定各孔600nm处吸光度值。结果如表1 所示，显示重组卵形鲳鲹抗菌肽蛋白对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌均 有抑菌效果。
表1
Figure BDA0002186148850000081
Figure BDA0002186148850000091
需要指出的是，上述实施例仅是对本发明的进一步说明，而不是限制，本领 域技术人员在与本发明技术方案的相当的含义和范围内的任何调整或改变，都应 认为是包括在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所
<120> 一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 444
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggaaacgt cttcagtcct ccttgtgtgc atcctggtgt catgttcagt ctggacagtc 60
cacgggagac gccttgagat taacattgat gatcaggagc cggtggaggt ggaaagctcc 120
atggaggccc aagggcttcc aggtatatgc tgggcatgca agtgggcctt aaacaaggtg 180
aagaaagtca ttggatcaaa cgccacggca gagagtgtga aatcaaagtt gagttccatc 240
tgcaatgaac ttggcctctt aaaatctatg tgtcacaaat ttgttaaaaa acacctcgga 300
gaattgattg aggagctcac aaccaccgat gatgtgagga cgatctgtgt gaacaccaaa 360
gcctgcaagc caaaggagct gtctcacctg atcctttata caagagatga agagtcacac 420
attgaagttg atgattttcc ctga 444
<210> 2
<211> 147
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Glu Thr Ser Ser Val Leu Leu Val Cys Ile Leu Val Ser Cys Ser
1 5 10 15
Val Trp Thr Val His Gly Arg Arg Leu Glu Ile Asn Ile Asp Asp Gln
20 25 30
Glu Pro Val Glu Val Glu Ser Ser Met Glu Ala Gln Gly Leu Pro Gly
35 40 45
Ile Cys Trp Ala Cys Lys Trp Ala Leu Asn Lys Val Lys Lys Val Ile
50 55 60
Gly Ser Asn Ala Thr Ala Glu Ser Val Lys Ser Lys Leu Ser Ser Ile
65 70 75 80
Cys Asn Glu Leu Gly Leu Leu Lys Ser Met Cys His Lys Pro Val Lys
85 90 95
Lys His Leu Gly Glu Leu Ile Glu Glu Leu Thr Thr Thr Asp Asp Val
100 105 110
Arg Thr Ile Cys Val Asn Thr Lys Ala Cys Lys Pro Lys Glu Leu Ser
115 120 125
His Leu Ile Leu Tyr Thr Arg Asp Glu Glu Ser His Ile Glu Val Asp
130 135 140
Asp Phe Pro
145
<210> 3
<211> 733
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaggagagg gttatgagca gacacactca cgctcagaga ctagagatca ctgctccctg 60
ttgcaatgga aacgtcttca gtcctccttg tgtgcatcct ggtgtcatgt tcagtctgga 120
cagtccacgg gagacgcctt gagattaaca ttgatgatca ggagccggtg gaggtggaaa 180
gctccatgga ggcccaaggg cttccaggta tatgctgggc atgcaagtgg gccttaaaca 240
aggtgaagaa agtcattgga tcaaacgcca cggcagagag tgtgaaatca aagttgagtt 300
ccatctgcaa tgaacttggc ctcttaaaat ctatgtgtca caaatttgtt aaaaaacacc 360
tcggagaatt gattgaggag ctcacaacca ccgatgatgt gaggacgatc tgtgtgaaca 420
ccaaagcctg caagccaaag gagctgtctc acctgatcct ttatacaaga gatgaagagt 480
cacacattga agttgatgat tttccctgat cttatatgca tgaataaaaa tcaaactgct 540
gcattaatgc ataagaaaaa actttaaccg taggtgcttt gtggtggtga gcgaccccac 600
actcagcaat taaaagtaca cgatcaaaaa tctatttcag ctttctttta attatgacat 660
ctgctttgcg ttgcactttt tcctgtacca tgctttagtt ttcagtgcag gatttcaatt 720
tattttcaat aaa 733

Claims (9)

1.一种卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种包含权利要求1所述卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的表达载体。
4.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求1所述的卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因。
5.权利要求4所述的重组菌株的制备方法，其特征在于，所述菌株由权利要求3所述的卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的表达载体转化寄主细胞，形成含有卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的重组菌株。
6.如权利要求5所述的重组菌株的制备方法，其特征在于，所述的寄主细胞为大肠杆菌BL21，形成的重组菌株为PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21。
7.一种制备重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白的方法，其特征在于，利用所述的包括卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，得到PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21重组菌株，再将PGEX-6P-1/mNK-lysin-BL21重组菌株培养至对数期后分离纯化，得到重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白。
8.权利要求1所述的卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin基因在制备抗革兰氏阴性细菌/或真菌、以及抗革兰氏阳性细菌/或真菌的药物中的应用。
9.重组卵形鲳鲹抗菌肽NK-lysin蛋白在制备抗革兰氏阴性细菌/或真菌、以及抗革兰氏阳性细菌/或真菌的药物中的应用。
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